鬼佬大哥大
  • / 127
  • 下載費用:30 金幣  

咔唑化合物及其治療用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN200980140333.1

申請日:

2009.10.05

公開號:

CN102203063B

公開日:

2014.11.26

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 專利權的轉移IPC(主分類):C07D 209/86登記生效日:20181018變更事項:專利權人變更前權利人:英丘倫有限責任公司變更后權利人:英丘倫公司變更事項:地址變更前權利人:俄羅斯莫斯科變更后權利人:美國特拉華州|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07D 209/86申請日:20091005|||公開
IPC分類號: C07D209/86; C07D209/88; C07D401/04; C07D487/04; A61K31/403; A61P33/00; A61P31/00; A61P35/00; A61P29/00 主分類號: C07D209/86
申請人: 英丘倫有限責任公司
發明人: J·塔克; S·斯維里多夫; L·布羅斯基; C·伯克哈特; A·珀馬爾; K·古羅瓦; A·古科夫
地址: 俄羅斯莫斯科
優先權: 2008.10.06 US 61/102913
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 72001 代理人: 李進;艾尼瓦爾
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN200980140333.1

授權公告號:

|||102203063B||||||

法律狀態公告日:

2018.11.06|||2014.11.26|||2011.11.23|||2011.09.28

法律狀態類型:

專利申請權、專利權的轉移|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了通用結構式(I)和(II)的化合物以及所述化合物及其鹽和水合物作為治療藥的用途。可治療的疾病和病癥包括癌癥、炎性疾病和病癥、和免疫缺陷疾病。

權利要求書

1.一種化合物或其藥學上可接受的鹽或水合物,所述化合物具有以下結構式:其中Ra選自氫、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、ORe、N(Re)2和SRe;兩者中擇一地,或者Ra和R1或者NRe和R1與它們所連接的碳原子一起形成5元或6元脂肪族碳環或雜環;Rb選自氫、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、ORe、N(Re)2和SRe,兩者中擇一地,或者Rb和R6或者NRe和R6與它們所連接的碳原子一起形成5元或6元脂肪族碳環或5元或6元脂肪族碳環或雜環;Rc選自氫、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基和C(=O)Re,或者Rc和Rd結合在一起形成任選含有氧原子的5元、6元或7元脂肪族環;Rd選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基和C(=O)Re,或者Rd和R7與它們所連接的原子一起形成5元或6元脂肪族環;Re獨立選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基,或者兩個Re基團與它們所連接的氮結合在一起形成5元或6元脂肪族環;R1、R2、R3、R4、R5和R6獨立選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、鹵素、ORe、C(=O)Re、C(=O)ORe、OC(=O)Re、C(=O)N(Re)2、C(=O)NReSO2Re、N(Re)2、NReC(=O)Re、ReC(=O)N(Re)2、CN、NO2、CF3、OCF3、SRe、SORe、SO2Re、SO2N(Re)2和OSO2CF3;R7選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基;且n為0、1、2、3、4或5。2.權利要求1的化合物或其藥學上可接受的鹽或水合物,其中所述化合物具有通用結構式(Ia):其中Ra為C1-3烷基、C1-4鹵代烷基、C3-5環烷基、N(Re)2或ORe,或者Ra和R1與它們所連接的碳原子一起形成5元或6元脂肪族碳環;Rb為C1-4烷基、C1-4鹵代烷基、C3-5環烷基、N(Re)2或ORe,或者Rb和R6與它們所連接的碳原子一起形成5元或6元脂肪族碳環或者含有一個氮原子的5元或6元脂肪族環;Rc為C1-6烷基、C3-5環烷基或C1-3羥基烷基;Rd為氫、C1-4烷基或C3-5環烷基,或者Rd和R7與它們所連接的原子一起形成含有一個氮原子的5元或6元脂肪族環,或者Rc和Rd結合在一起形成6元或7元脂肪族環,任選含有氧原子;Re獨立地為氫或C1-3烷基;R1為氫或C1-3烷基;R2為氫、羥基或C1-3烷氧基;R3和R4獨立地為氫或C1-3烷基;R5為氫、羥基、C1-3烷氧基或鹵素;R6為氫、C1-3烷基、C1-3烷氧基或鹵素;R7為氫或C1-3烷基;且n為0、1、2、3、4或5。3.權利要求1的化合物或其藥學上可接受的鹽或水合物,其中所述化合物具有通用結構式(Ib):其中Ra為甲基、乙基、正丙基、環丙基、NH(CH3)或OCH3,或者Ra和R1與它們所連接的碳原子一起形成5元脂肪族碳環;Rb為甲基、乙基、正丙基、環丙基、NH(CH3)或OCH3,或者Rb和R6與它們所連接的碳原子一起形成5元脂肪族碳環或含有一個氮原子的5元脂肪族環;Rc為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丁基或2-羥基乙基;Rd為氫、甲基、乙基或環丁基,或者Rd和R7與它們所連接的原子一起形成含有一個氮原子的5元脂肪族環;或者Rc和Rd結合在一起形成嗎啉代部分、四氫呋喃基部分、哌啶基部分、部分或部分;R1為氫;R2為氫、羥基或甲氧基;R3和R4為氫;R5為氫、羥基、甲氧基或氟;R6為氫、甲基、甲氧基或氟;R7為氫;且n為1或2。4.一種化合物或其藥學上可接受的鹽或水合物,所述化合物具有以下結構式:其中Rf選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基和C(=O)Rh,或者Rf和Rg結合在一起形成任選含有氧原子的5元、6元或7元脂肪族環;Rg選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基和C(=O)Rh,或者Rg和R8與它們所連接的原子一起形成5元或6元脂肪族環;Rh獨立選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基,或者兩個Rh基團與它們所連接的氮結合在一起形成5元或6元脂肪族環;R8選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基;R9、R10、R11、R12、R13和R14獨立選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、鹵素、ORh、C(=O)Rh、C(=O)ORh、OC(=O)Rh、C(=O)N(Rh)2、C(=O)NRhSO2Rh、N(Rh)2、NReC(=O)Rh、NRhC(=O)N(Rh)2、CN、NO2、CF3、OCF3、SRh、SORh、SO2Rh、SO2N(Rh)2和OSO2CF3;p為0、1、2、3、4或5,前提條件是當p為2時,Rf和Rg中的一個不為乙基。5.權利要求4的化合物或其藥學上可接受的鹽或水合物,其中所述化合物具有通用結構式(IIa):其中Rf為C1-6烷基;Rg為氫或C1-4烷基,或者Rg和R8與它們所連接的原子一起形成含有一個氮原子的5元或6元脂肪族環;R9為氫或C1-3烷基;R10為氫、羥基或C1-3烷氧基;R11和R12獨立地為氫或C1-3烷基;R13為氫、羥基、C1-3烷氧基或鹵素;R14為氫、C1-3烷基或C1-3烷氧基;R8為氫或C1-3烷基;且p為0、1、2、3、4或5,前提條件是當p為2時,Rf和Rg中的一個不為乙基。6.權利要求4的化合物或其藥學上可接受的鹽或水合物,其中所述化合物具有結構式(IIb):其中Rf為甲基或乙基;Rg為氫或甲基,或者Rg和R8與它們所連接的原子一起形成含有一個氮原子的5元脂肪族環;R8為氫;且p為1或2。7.權利要求1的化合物,其中Ra為甲基、乙基、NH(CH3)、OCH3,或與R1形成5元脂肪族環,Rb為甲基、乙基、NH(CH3)、OCH3,與R6形成5元脂肪族環,或與R6形成5元含氮脂肪族環,且Rd為氫、甲基、乙基,或與R7形成5元脂肪族環。8.權利要求1的化合物,其中R1為氫或與Ra形成5元脂肪族環,R2為氫或羥基,R3為氫,R4為氫,R5為氫或羥基,R6為氫、與Rb形成5元脂肪族環、或與Rb形成5元含氮脂肪族環,R7為氫或與Rd形成5元環,且n為2或3。9.權利要求4的化合物,其中Rf為甲基或乙基,Rg為氫、甲基、乙基,或與Rf和R8形成5元含氮脂肪族環,或者R8為氫;R9、R10、R11、R12、R13和R14為氫,p為2或3。10.一種具有以下結構式的化合物:11.權利要求1或4的化合物,其對p53活化的EC50值小于約1.35μM。12.一種化合物,其從本發明說明書中段落[0238]中公開的組中選出。13.一種治療癌癥的方法,該方法包括將治療有效量的權利要求1、4或10的化合物、或化合物100給予有需要的個體。14.權利要求13的方法,其中所述癌癥選自本發明說明書中段落[0270]、[0273]、[0274]和[0275]中公開的癌癥。15.權利要求13的方法,其中權利要求1、4或10的化合物、或化合物100與化療藥、放療、影響微管的藥物、細胞生長抑制藥、TNF多肽及其混合物聯合給予。16.一種治療炎性疾病的方法,該方法包括將治療有效量的權利要求1、4或10的化合物、或化合物100給予有需要的個體。17.權利要求16的方法,其中所述炎性疾病選自本發明說明書中段落[0277]中公開的疾病。18.權利要求16的方法,其中權利要求1、4或10的化合物、或化合物100與免疫抑制藥聯合給予。19.一種治療微生物感染、原生動物感染或病毒感染的方法,該方法包括將治療有效量的權利要求1、4或10的化合物、或化合物100給予有需要的個體。20.權利要求19的方法,其中所述疾病是瘧疾。21.一種治療疾病或病癥的方法,所述疾病或病癥選自本發明說明書中段落[0278]中公開的疾病和病癥。

說明書

咔唑化合物及其治療用途

相關申請的交叉引用

本申請要求于2008年10月6日提交的美國臨時專利申請第61/102,913號的權益,該臨時專利申請通過引用其全文結合到本文中。

發明領域

本發明涉及咔唑化合物、制備所述化合物的方法、含有所述化合物的藥物組合物和它們作為治療藥的用途。具體地說,本發明涉及咔唑化合物及其在多個治療領域中的用途,包括癌癥的治療。

發明背景

在發達國家的世界中,隨著人口的老齡化,人類癌癥的頻率不斷增加。對于某些類型的癌癥和在診斷上疾病的分期,近年來盡管進行了廣泛深入的研究,但是發病率和死亡率一直沒有顯著地改善。細胞死亡的誘導是最引人注目的癌癥治療策略之一。存在鑒定能夠誘導腫瘤細胞中的細胞死亡和/或增強化療和放療的藥物的巨大需求。

發明概述

本發明涉及誘導細胞死亡的化合物和組合物,還涉及所述化合物在需要這種治療的個體中用于治療癌癥和其它病癥的治療用途。本發明還涉及制備所述治療用化合物的方法。

更具體地說,本發明涉及用于治療諸如癌癥、炎性疾病、微生物感染、病毒感染和原生動物感染等疾病和病癥的化合物和方法。所述化合物可用于包括將治療有效量的結構式(I)化合物給予有需要的個體的方法。

具體地說,本發明涉及具有結構式(I)的咔唑化合物或其藥學上可接受的鹽或水合物:

其中Ra選自氫、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、ORe、N(Re)2和SRe;兩者中擇一地,或者Ra和R1或者NRe和R1與它們所連接的碳原子一起形成5元或6元脂肪族碳環或雜環;

Rb選自氫、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、ORe、N(Re)2和SRe,兩者中擇一地,或者Rb和R6或者NRe和R6與它們所連接的碳原子一起形成5元或6元脂肪族碳環或5元或6元脂肪族碳環或雜環;

Rc選自氫、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基和C(=O)Re,或者Rc和Rd結合在一起形成5元、6元或7元脂肪族環,任選含有氧原子;

Rd選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基和C(=O)Re,或者Rd和R7與它們所連接的原子一起形成5元或6元脂肪族環;

Re獨立選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基,或者兩個Re基團與它們所連接的氮結合在一起形成5元或6元脂肪族環;

R1、R2、R3、R4、R5和R6獨立選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、鹵素、ORe、C(=O)Re、C(=O)ORe、OC(=O)Re、C(=O)N(Re)2、C(=O)NReSO2Re、N(Re)2、NReC(=O)Re、NReC(=O)N(Re)2、CN、NO2、CF3、OCF3、SRe、SORe、SO2Re、SO2N(Re)2和OSO2CF3;

R7選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基;且

n為0、1、2、3、4或5。

本發明還涉及具有結構式(II)的咔唑化合物或其藥學上可接受的鹽或水合物:

其中Rf選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基和C(=O)Rh,或者Rf和Rg結合在一起形成任選含有氧原子的5元、6元或7元脂肪族環;

Rg選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基和C(=O)Rh,或者Rg和R8與它們所連接的原子一起形成5元或6元脂肪族環;

Rh獨立選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基,或者兩個Rh基團與它們所連接的氮結合在一起形成5元或6元脂肪族環;

R8選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基;

R9、R10、R11、R12、R13和R14獨立選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、鹵素、ORh、C(=O)Rh、C(=O)ORh、OC(=O)Rh、C(=O)N(Rh)2、C(=O)NRhSO2Rh、N(Rh)2、NReC(=O)Rh、NRhC(=O)N(Rh)2、CN、NO2、CF3、OCF3、SRh、SORh、SO2Rh、SO2N(Rh)2和OSO2CF3;

p為0、1、2、3、4或5,

前提條件是當p為2時,Rf和Rg中的一個不為乙基。

可以按照本發明進行治療的疾病或病癥包括例如癌癥、炎癥、自身免疫性疾病、微生物感染、原生動物感染、病毒感染、移植物抗宿主病、與HIV感染相關的疾病或癌變前的細胞。可以治療的癌癥形式包括但不限于腎細胞癌、肉瘤、前列腺癌、乳癌、胰腺癌、骨髓瘤、骨髓性白血病和淋巴母細胞性白血病、成神經細胞瘤、成膠質細胞瘤或由HTLV感染引起的癌癥。

在一些實施方案中,所述化合物具有通用結構式(Ia):

其中Ra為C1-3烷基、C1-4鹵代烷基、C3-5環烷基、N(Re)2或ORe,或者Ra和R1與它們所連接的碳原子一起形成5元或6元脂肪族碳環;

Rb為C1-4烷基、C1-4鹵代烷基、C3-5環烷基、N(Re)2或ORe,或者Rb和R6與它們所連接的碳原子一起形成5元或6元脂肪族碳環或者含有一個氮原子的5元或6元脂肪族環;

Rc為C1-6烷基、C3-5環烷基或C1-3羥基烷基;

Rd為氫、C1-4烷基或C3-5環烷基,或者Rd和R7與它們所連接的原子一起形成含有一個氮原子的5元或6元脂肪族環,或者Rc和Rd結合在一起形成6元或7元脂肪族環,任選含有氧原子;

Re獨立地為氫或C1-3烷基;

R1為氫或C1-3烷基;

R2為氫、羥基或C1-3烷氧基;

R3和R4獨立地為氫或C1-3烷基;

R5為氫、羥基、C1-3烷氧基或鹵素;

R6為氫、C1-3烷基、C1-3烷氧基或鹵素;

R7為氫或C1-3烷基;且

n為0、1、2、3、4或5,

或其藥學上可接受的鹽或水合物。

在其它的實施方案中,所述化合物具有通用結構式(Ib):

其中Ra為甲基、乙基、正丙基、環丙基、NH(CH3)或OCH3,或者Ra和R1與它們所連接的碳原子一起形成5元脂肪族碳環;

Rb為甲基、乙基、正丙基、環丙基、NH(CH3)或OCH3,或者Rb和R6與它們所連接的碳原子一起形成5元脂肪族碳環或含有一個氮原子的5元脂肪族環;

Rc為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丁基或2-羥基乙基;

Rd為氫、甲基、乙基或環丁基,或者Rd和R7與它們所連接的原子一起形成含有一個氮原子的5元脂肪族環;或者Rc和Rd結合在一起形成嗎啉代部分、四氫呋喃基部分、哌啶基部分、部分或部分;

R1為氫;

R2為氫、羥基或甲氧基;

R3和R4為氫;

R5為氫、羥基、甲氧基或氟;

R6為氫、甲基、甲氧基或氟;

R7為氫;且

n為1或2,

或其藥學上可接受的鹽或水合物。

在其它的實施方案中,所述化合物具有通用結構式(IIa):

其中Rf為C1-6烷基;

Rg為氫或C1-4烷基,或者Rg和R8與它們所連接的原子一起形成含有一個氮原子的5元或6元脂肪族環;

R9為氫或C1-3烷基;

R10為氫、羥基或C1-3烷氧基;

R11和R12獨立地為氫或C1-3烷基;

R13為氫、羥基、C1-3烷氧基或鹵素;

R14為氫、C1-3烷基或C1-3烷氧基;

R8為氫或C1-3烷基;且

p為0、1、2、3、4或5,

前提條件是當p為2時,Rf和Rg中的一個不為乙基,

或其藥學上可接受的鹽或水合物。

在又一些實施方案中,所述化合物具有結構式(IIb):

其中Rf為甲基或乙基;

Rg為氫或甲基,或者Rg和R8與它們所連接的原子一起形成含有一個氮原子的5元脂肪族環;

R8為氫;且

p為1或2,

或其藥學上可接受的鹽或水合物。

本發明的一個方面是提供一種治療病癥或疾病的方法,即通過將治療有效量的結構式(I)、(Ia)、(Ib)、(II)、(IIa)或(IIb)的一種或多種化合物或包含結構式(I)、(Ia)、(Ib)、(II)、(IIa)或(IIb)化合物中的一種或多種的組合物給予有需要的個體。所述組合物可以還包含TNF家族多肽的死亡受體激活劑。所述激活劑可以是TNF多肽,例如NGF、CD40L、CD137L/4-1BBL、TNF-α、CD134L/OX40L、CD27L/CD70、FasL/CD95、CD30L、TNF-β/LT-α、LT-β和TRAIL中的一種或多種。

本發明的另一個方面是提供包含結構式(I)或(II)的一種或多種化合物的藥物組合物,及所述組合物在治療性治療疾病或病癥中的用途。

本發明的又一個方面是提供一種治療正在進行化學治療性治療或放射治療性治療的個體的醫學病癥的方法,該方法包括將結構式(I)和/或(II)化合物與化療藥、放療藥或化療藥和放療藥兩者一起給予所述個體。用該方法治療的一種非限制性適應癥是癌癥。

根據下面對本發明的優選實施方案的非限制性詳細描述,本發明的上述各方面和另外的方面將會變得顯而易見。

附圖簡述

圖1a是NF-κB活性相對于DMSO對照的倍數對本發明咔唑的濃度繪制的曲線圖;

圖1b是本發明咔唑對p53活化和NF-κB抑制的EC50(μM)的柱狀圖;

圖2a至圖2k是%細胞生存率對用本發明咔唑處理的各種腫瘤細胞的濃度(μM)繪制的曲線圖;

圖3含有在HCT?116皮下(sc)異種移植物模型中使用實施例7的化合物后腫瘤體積對治療天數繪制的曲線圖;

圖4是顯示有活性的咔唑化合物的三維分析的示意圖;

圖5是顯示無活性的咔唑化合物的三維分析的示意圖;

圖6是顯示有活性的咔唑化合物即實施例2的三維結構的示意圖;

圖7是顯示無活性的咔唑化合物即化合物200的三維結構的示意圖;

圖8含有在用對照溶媒治療的小鼠(圖8a)中和在用實施例7的化合物治療的小鼠(圖8b)中個體腫瘤生長的腫瘤體積(mm3)對治療天數的曲線圖;

圖9含有用對照溶媒和用實施例7的化合物后腫瘤體積(mm3)對治療天數的曲線圖;

圖10含有在用對照溶媒治療的小鼠(圖10a)中和在用實施例7的化合物治療的小鼠(圖10b)中個體小鼠的相對體重對細胞接種后天數的曲線圖;和

圖11含有化合物100的濃度(μM)對13種癌細胞系的相對細胞存活的曲線圖,顯示本發明咔唑化合物對多種類型的癌癥是有效的藥物;

圖12含有顯示各種咔唑化合物針對惡性瘧原蟲(Plasmodium?falciparum)(品系D10)的抗寄生蟲活性的柱狀圖;和

圖13含有顯示各種咔唑化合物針對革蘭氏陰性菌(圖13a)和革蘭氏陽性菌(圖13b)的抗細菌活性。

優選實施方案的詳細描述

關于本文中公開的化合物、組合物和方法,所使用的術語是為了描述具體的實施方案,而不是意欲受到限制。本說明書和所附權利要求書中所用的單數形式“一”、“一個”和“該”包括復數形式,除非在上下文中另有明確說明。

本發明涉及具有通用結構式(I)和(II)的化合物。本文中公開的咔唑化合物可用于治療諸如癌癥、炎性疾病、微生物感染、病毒感染、原生動物感染或自身免疫性疾病的疾病和病癥。

其中Ra選自氫、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、ORe、N(Re)2和SRe,或者Ra和R1或NRe和R1與它們所連接的碳原子一起形成5元或6元脂肪族碳環或雜環;

Rb選自氫、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、ORe、N(Re)2和SRe,或者Rb和R6或NRe和R6與它們所連接的碳原子一起形成5元或6元脂肪族碳環或5元或6元脂肪族碳環或雜環;

Rc選自氫、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基和C(=O)Re,或者Rc和Rd結合在一起形成5元、6元或7元脂肪族環,任選含有氧原子;

Rd選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基和C(=O)Re,或者Rd和R7與它們所連接的原子一起形成5元或6元脂肪族環;

Re獨立選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基,或者兩個Re基團與它們所連接的氮結合在一起形成5元或6元脂肪族環;

R1、R2、R3、R4、R5和R6獨立選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、鹵素、ORe、C(=O)Re、C(=O)ORe、OC(=O)Re、C(=O)N(Re)2、C(=O)NReSO2Re、N(Re)2、NReC(=O)Re、NReC(=O)N(Re)2、CN、NO2、CF3、OCF3、SRe、SORe、SO2Re、SO2N(Re)2和OSO2CF3;

R7選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基;且

n為0、1、2、3、4或5,

或其藥學上可接受的鹽或水合物。

在優選的實施方案中,所述化合物具有通用結構式(Ia):

其中Ra為C1-3烷基、C1-4鹵代烷基、C3-5環烷基、N(Re)2或ORe,或者Ra和R1與它們所連接的碳原子一起形成5元或6元脂肪族碳環;

Rb為C1-4烷基、C1-4鹵代烷基、C3-5環烷基、N(Re)2或ORe,或者Rb和R6與它們所連接的碳原子一起形成5元或6元脂肪族碳環或者含有一個氮原子的5元或6元脂肪族環;

Rc為C1-6烷基、C3-5環烷基或C1-3羥基烷基;

Rd為氫、C1-4烷基或C3-5環烷基,或者Rd和R7與它們所連接的原子一起形成含有一個氮原子的5元或6元脂肪族環或者Rc和Rd結合在一起形成任選含有氧原子的6元或7元脂肪族環;

Re獨立地為氫或C1-3烷基;

R1為氫或C1-3烷基;

R2為氫、羥基或C1-3烷氧基;

R3和R4獨立地為氫或C1-3烷基;

R5為氫、羥基、C1-3烷氧基或鹵素;

R6為氫、C1-3烷基、C1-3烷氧基或鹵素;

R7為氫或C1-3烷基;且

n為0、1、2、3、4或5,

或其藥學上可接受的鹽或水合物。

在更優選的實施方案中,所述化合物具有通用結構式(Ib):

其中Ra為甲基、乙基、正丙基、環丙基、NH(CH3)或OCH3,或者Ra和R1與它們所連接的碳原子一起形成5元脂肪族碳環;

Rb為甲基、乙基、正丙基、環丙基、NH(CH3)或OCH3,或者Rb和R6與它們所連接的碳原子一起形成5元脂肪族碳環或含有一個氮原子的5元脂肪族環;

Rc為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丁基或2-羥基乙基;

Rd為氫、甲基、乙基或環丁基,或者Rd和R7與它們所連接的原子一起形成含有一個氮原子的5元脂肪族環,或者Rc和Rd結合在一起形成嗎啉代部分、四氫呋喃基部分、哌啶基部分或部分、部分;

R1為氫;

R2為氫、羥基或甲氧基;

R3和R4為氫;

R5為氫、羥基、甲氧基或氟;

R6為氫、甲基、甲氧基或氟;

R7為氫;且

n為1或2,

或其藥學上可接受的鹽或水合物。

在另一個實施方案中,本發明還涉及具有結構式(II)的咔唑化合物:

其中Rf選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基和C(=O)Rh,或者Rf和Rg結合在一起形成任選含有氧原子的5元、6元或7元脂肪族環;

Rg選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基和C(=O)Rh,或者Rg和Rh與它們所連接的原子一起形成5元、6元或7元脂肪族環;

Rh獨立選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基,或者兩個Rh基團與它們所連接的氮結合在一起形成5元或6元脂肪族環;

R9、R10、R11、R12、R13和R14獨立選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、鹵素、ORh、C(=O)Rh、C(=O)ORh、OC(=O)Rh、C(=O)N(Rh)2、C(=O)NRhSO2Rh、N(Rh)2、NRhC(=O)Rh、NRhC(=O)N(Rh)2、CN、NO2、CF3、OCF3、SRh、SORh、SO2Rh、SO2N(Rh)2和OSO2CF3;

R8選自氫、C1-6烷基、環烷基、雜環烷基、芳基和雜芳基;且

p為0、1、2、3、4或5,

前提條件是當p為2時,Rf和Rg中的一個不為乙基,

或其藥學上可接受的鹽或水合物。

在其它的實施方案中,所述化合物具有通用結構式(IIa):

其中Rf為C1-6烷基;

Rg為氫或C1-4烷基,或者Rg和R8與它們所連接的原子一起形成含有一個氮原子的5元或6元脂肪族環;

R9為氫或C1-3烷基;

R10為氫、羥基或C1-3烷氧基;

R11和R12獨立地為氫或C1-3烷基;

R13為氫、羥基、C1-3烷氧基或鹵素;

R14為氫、C1-3烷基或C1-3烷氧基;

R8為氫或C1-3烷基;且

p為0、1、2、3、4或5,

前提條件是當p為2時,Rf和Rg中的一個不為乙基,

或其藥學上可接受的鹽或水合物。

在又一些實施方案中,所述化合物具有結構式(IIb):

其中Rf為甲基或乙基;

Rg為氫或甲基,或者Rg和R8與它們所連接的原子一起形成含有一個氮原子的5元脂肪族環;

R8為氫;且

p為1或2,

或其藥學上可接受的鹽或水合物。

本文所用的術語“烷基”是指含有指定數目的碳原子的直鏈和支鏈烴基,通常是甲基、乙基和直鏈和支鏈丙基和丁基。術語“環烷基”定義為含有指定數目的碳原子的環狀烴基,例如環丙基、環丁基、環己基和環戊基。

術語“雜環烷基”是指環結構中含有一個或多個選自氧、氮和硫的雜原子的單環、雙環和三環環烷基。“雜環烷基”基團也可含有與環相連的氧代基團(=O)。雜環烷基的非限制性實施例包括但不限于1,3-二氧雜環戊烷、2-吡唑啉、吡唑烷、吡咯烷、哌嗪、吡咯啉、2H-吡喃、4H-吡喃、嗎啉、硫代嗎啉(thiopholine)、哌啶、1,4-二噻烷和1,4-二氧雜環己烷。

術語“鹵代”或“鹵素”是指氟、溴、氯和碘。

術語“鹵代烷基”是指被一個或多個(例如1-3個)鹵代取代基(或為氟、氯、溴、碘或為它們的組合)取代的烷基。同樣地,“鹵代環烷基”定義為具有一個或多個鹵代取代基的環烷基。

術語“芳基”,單用或聯用時都是指單環或多環芳香族基團,優選單環或雙環芳香族基團,例如苯基或萘基。除非另有說明,否則“芳基”基團可以是未取代的或者例如被一個或多個且特別是1-3個鹵素、烷基、羥基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、鹵代烷基、硝基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、烷基硫基、烷基亞磺酰基和烷基磺酰基取代。示例性芳基包括苯基、萘基、四氫萘基、2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基、2-甲基苯基、4-甲氧基苯基、3-三氟甲基苯基、4-硝基苯基等。

術語“雜芳基”是指在芳環中含有一個或兩個芳環并含有至少一個氮、氧或硫原子的單環或雙環環系,并且該環系可以是未取代的或者例如被一個或多個且特別是1-3個取代基如鹵素、烷基、羥基、羥基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、鹵代烷基、硝基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、烷基硫基、烷基亞磺酰基和烷基磺酰基取代。雜芳基的實例包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡啶基、唑基、喹啉基、異喹啉基、吲哚基、三唑基、異噻唑基、異唑基、咪唑基(imidizolyl)、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基(thiazonyl)和噻二唑基(thiadiazolyl)。

術語“亞烷基”是指具有取代基的烷基。例如,術語“C1-3亞烷基芳基”是指含有1-3個碳原子且被芳基取代的烷基。

術語“羥基”是指-OH。

術語“烷氧基”是指-OR,其中R為烷基。

術語“氨基”是指-NH2,術語“烷基氨基”是指-NR2,其中至少一個R為烷基,而第二個R為烷基或氫。

術語“酰基氨基”是指R(=O)N-,其中R為烷基或芳基。

術語“烷基硫基”是指-SR,其中R為烷基。

術語“硝基”是指-NO2。

術語“三氟甲基”是指-CF3。

術語“三氟甲氧基”是指-OCF3。

術語“氰基”是指-CN。

術語“烷氧基烷基”是指其中氫被烷氧基置換的烷基。

術語“羥基烷基”是指其中氫被羥基置換的烷基。

術語“烷基亞磺酰基”是指R-SO2-,其中R為烷基。

術語“烷基磺酰基”是指R-SO3-,其中R為烷基。

術語“嗎啉代部分”是指

術語“四氫呋喃基部分”是指

術語“哌啶基部分”是指任選被-OH或-CH2OH基團取代。

術語“有效量”和“治療有效量”,當涉及化合物或組合物使用時,是指化合物或組合物能提供所需結果的足夠量。所需要或要求的精確量將會根據所使用的具體化合物或組合物、其給藥方式等因素而變化。因此,不可能總是規定精確的“有效量”或“治療有效量”。然而,適當的有效量可以由本領域普通技術人員根據本發明的公開內容僅僅使用常規的實驗手段來確定。

術語“合適的”是指實體(例如部分、取代基或化合物)與本文為了說明目的而提供的化合物或組合物相容。用于說明目的的合適性可以由本領域普通技術人員僅僅使用常規的實驗手段來確定。

術語“給予”,當用來描述化合物或組合物的劑量時,是指化合物或組合物的單劑量或多劑量。

“體內(in?vivo)”是指在有生命的受治療者(subject)體內,如在動物或人體內。在本文中,藥物可以治療性地用于受治療者以治療其病癥或疾病、或其癥狀。所述藥物也可以作為預防藥用來防止與之相關的疾病狀態或癥狀的發生或復發。

“離體(ex?vivo)”是指在有生命的受治療者身體之外。離體細胞群體的實例包括來自人或動物的體外(in?vitro)細胞培養物和生物樣品例如體液樣品或組織樣品。這樣的樣品可以通過本領域眾所周知的方法獲取。示例性的生物體液樣品包括血液、腦脊液、尿液、唾液。示例性的組織樣品包括腫瘤及其活檢樣品。在本文中,本發明化合物可以有多種用途,既有治療用途,也有實驗用途。

術語“放射增敏劑”是指按治療有效量給予人或其它動物以增加細胞對電磁輻射的敏感性和/或促進可用電磁輻射治療的疾病的治療的化合物。

術語“電磁輻射”和“輻射”是指但不限于其波長為10-20至100米的輻射。

術語“細胞死亡”是指細胞內其功能、增殖和代謝停止的過程。

術語“癌癥治療”是指本領域已知的任何用于癌癥的治療,包括但不限于化學治療和放射治療。

術語“與……聯用”,當用來描述給予本發明的咔唑化合物和任何另外的治療時,是指所述咔唑化合物可以在給予另外的治療之前給予、與另外的治療同時給予,或者在給予另外的治療之后給予,或者它們的組合。

本文所用的術語“治療”、“醫治”、“處理”等是指消除、減輕或緩解疾病或病癥和/或與其相關的癥狀。雖然沒有被阻止,但是疾病或病癥的治療并不要求疾病、病癥或與其相關的癥狀完全消除。本文所用的術語“治療”、“醫治”、“處理”等可包括“預防性治療”,“預防性治療”是指在現在沒有但處于疾病或病癥再發生或疾病或病癥復發的危險之中或者對疾病或病癥再發生或疾病或病癥復發敏感的受治療者中降低疾病或病癥再發生的可能性、或先前已得到控制的疾病或病癥復發的可能性。術語“治療”及其同義詞包括將本發明的化合物給予需要這種治療的個體。

在本發明的含義之內,“治療”也包括復發性(relapse)預防或階段性(phase)預防,以及急性或慢性體征、癥狀和/或功能失常的治療。治療可以是對癥治療,例如抑制癥狀。它可以在短期內實現,在中期內調整,或者可以是長期治療,例如在維持療法里面。

術語“哺乳動物”包括人、陪伴動物(例如狗、貓和馬)、動物園動物(例如斑馬、大象和大型貓科動物)、食用動物(例如牛、豬、山羊和綿羊)和研究用動物(例如大鼠、小鼠、山羊和豚鼠)。

本發明部分地涉及以下發現:包含通用結構式(I)和(II)咔唑化合物的藥物組合物可用于調節NF-κB活性,例如NF-κB介導的免疫應答和在國際專利申請PCT/US05/25884(指定美國)中描述的病癥,該專利申請的內容通過引用結合到本文中。

在結構式(I)咔唑化合物的優選實施方案中,Ra為甲基、乙基、NH(CH3)、OCH3,或與R1形成5元脂肪族環。在其它優選的實施方案中,Rb為甲基、乙基、NH(CH3)、OCH3,與R6形成5元脂肪族環,或與R6形成5元含氮脂肪族環。在另一個優選的實施方案中,Rd為氫、甲基、乙基,或與R7形成5元脂肪族環。

在優選的實施方案中,R1為氫或與Ra形成5元脂肪族環。在其它優選的實施方案中,R2為氫或羥基。在又一些優選的實施方案中,R3為氫。在進一步優選的實施方案中,R4為氫。在再進一步優選的實施方案中,R5為氫或羥基。在一些優選的實施方案中,R6為氫,與Rb形成5元脂肪族環,或與Rb形成5元含氮脂肪族環。在優選的實施方案中,R7為氫或與Rd形成5元環。在再進一步優選的實施方案中,n為2或3。

在結構式(II)咔唑化合物的優選實施方案中,Rf為甲基或乙基,Rg為氫、甲基、乙基,或與Rf和R8形成5元含氮脂肪族環,或者R8為氫,R9、R10、R11、R12、R13和R14為氫。在再進一步的實施方案中,p為2或3。

另外兩種可用于治療多種病癥和疾病的咔唑化合物是:

本發明包括結構式(I)和(II)化合物的所有可能的立體異構體和幾何異構體。本發明既包括外消旋化合物又包括旋光異構體。當要求結構式(I)或(II)化合物為單一對映體時,其可通過最終產物的拆分獲得,或者通過由異構體純的起始原料進行立體有擇合成或者使用手性助劑來獲得,例如,參見Z.Ma等,Tetrahedron:Asymmetry,8(6),第883-888頁(1997)。最終產物、中間體或起始原料的拆分可通過本領域已知的任何合適方法實現。另外,在結構式(I)或(II)化合物的互變異構體是可能的情況下,本發明意欲包括所述化合物的所有互變異構體形式。

結構式(I)和(II)化合物的前藥也可用作本發明方法中的化合物。已充分確定,前藥方法一直成功地應用于暫時地(例如生物可逆地)改變化合物的理化性質,其中化合物衍生成適合于劑型制備和/或給藥的形式,然后在體內釋放作為藥物(參見H.Bundgaard,Ed.,“Design?of?Prodrugs(前藥的設計),”Elsevier,Amsterdam,(1985);R.B.Silverman,“The?Organic?Chemistry?of?Drug?Design?and?Drug?Action(藥物設計和藥物作用的有機化學),”Academic?Press,San?Diego,第8章,(1992);K.M.Hillgren等,Med.Res.Rev.,15,83(1995))。

本發明的化合物可含有一個或多個官能團。所述官能團(如果需要或必要)可以進行修飾以提供前藥。合適的前藥包括例如酸衍生物,例如酰胺和酯。本領域技術人員也知道,N-氧化物可用作前藥。

本發明的化合物可作為鹽存在。一般而言,在本發明的方法中優選本發明化合物的藥學上可接受的鹽。本文所用的術語“藥學上可接受的鹽”是指結構式(I)和(II)化合物的鹽或兩性離子形式。式(I)和式(II)化合物的鹽可以在化合物的分離和純化期間制備或者使化合物與具有合適陽離子的酸反應后獨立制備。結構式(I)和(II)化合物的藥學上可接受的鹽是與藥學上可接受的酸形成的酸加成鹽。可用于形成藥學上可接受的鹽的酸的實例包括無機酸(例如硝酸、硼酸、鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸)和有機酸(例如草酸、馬來酸、琥珀酸和檸檬酸)。本發明化合物的鹽的非限制性實例包括但不限于鹽酸鹽、氫溴化物、氫碘化物、硫酸鹽、硫酸氫鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、醋酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、甲酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、抗壞血酸鹽、羥乙磺酸鹽、水楊酸鹽、甲烷磺酸鹽、均三甲苯磺酸鹽、亞萘基磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、三氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、磷酸鹽、谷氨酸鹽、碳酸氫鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、葡糖酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙烷二磺酸鹽、苯磺酸鹽和對甲苯磺酸鹽。另外,本發明化合物中存在的可利用的氨基可以用下列化合物季銨化:甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物;硫酸二甲基酯、二乙基酯、二丁基酯和二戊基酯;癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物;和芐基和苯乙基溴化物。根據上文,任何提及本文中出現的本發明的化合物時,意欲包括結構式(I)和/或(II)化合物以及它們的藥學上可接受的鹽、水合物或前藥。

在治療用途的方法中,結構式(I)和(II)化合物也可綴合或連接到促進化合物的有益特性的輔助部分上。這樣的綴合物可增強化合物遞送到特殊的目標解剖部位或區域(例如腫瘤),使得化合物在靶細胞內處于持久的治療濃度,改變化合物的藥代動力學和藥效動力學,和/或提高化合物的治療指數或安全性分布(profile)。合適的輔助部分包括例如氨基酸、寡肽或多肽,例如抗體,例如單克隆抗體和其它工程抗體;和靶細胞或組織中受體的天然或合成配體。其它合適的輔助部分包括促進化合物的生物分布和/或被靶細胞攝取的脂肪酸或脂質部分(參見例如Bradley等,Clin.Cancer?Res.(2001)7:3229)。

本發明的化合物是強效NF-κB抑制劑。因此,式(I)和式(II)化合物在治療用途中是有價值的,準確地說在治療NF-κB的抑制被認為是有益的各種疾病當中是有價值的。NF-κB抑制是特別引人注意的靶標,因為這樣的抑制提供了諸如細胞凋亡、抗微生物、抗原生動物、抗病毒和抗炎等效果,所有這些效果在治療各種疾病狀態中都是有益的。因此,式(I)和式(II)化合物在治療多種障礙、疾病和病癥中具有實用性。

本發明咔唑化合物的功效可通過測定化合物抑制NF-κB活性或激活p53的能力來確定。p53的活化通常使用劑量-反應試驗來測定,其中敏感的測定系統與一定范圍內的不同濃度的目標化合物相接觸,所述濃度包括觀察到沒有效果或最小效果的濃度,到觀察到部分效果的較高濃度,一直到觀察到最大效果的飽和濃度。理論上講,激活劑化合物的劑量-反應效應的這類測定可以用表示活化程度為濃度的函數的S形曲線進行說明。該曲線也在理論上通過濃度足以使活性增加到某一水平即50%的點,它是所述測定中基線活性和最大活性之間的差。這種濃度被定義為有效濃度(50%)或EC50值。可以使用常規的生物化學(無細胞)測定技術或基于細胞的測定技術確定EC50值。

通常用對比EC50值來提供激活劑功效的比較,其中較高的EC50表示試驗化合物比參比化合物的功效低,而較低的EC50表示試驗化合物比參比化合物的功效高。在螢光素酶報道細胞系測定中,本發明的化合物表現出預料不到的好功效,即p53活化。經過下述基于細胞的測定的本發明化合物表現出對p53活化的EC50值小于約1.35μM。在某些實施方案中,本發明的化合物顯示EC50值小于約1.0μM。在其它的實施方案中,本發明化合物顯示IC50值小于約0.75μM、約0.50μM、約0.30μM、小于約0.20μM或小于0.05μM。

本發明咔唑化合物尤其重要的用途是治療癌癥、炎癥、自身免疫性疾病、微生物感染、原生動物感染或病毒感染、移植物抗宿主病、與HIV感染相關的疾病或已獲取依賴于組成型活性NF-κB的癌變前細胞。可按照本發明治療的各種癌癥包括但不限于腎細胞癌、肉瘤、前列腺癌、乳癌、胰腺癌、骨髓瘤、骨髓性白血病、淋巴母細胞性白血病、成神經細胞瘤、成膠質細胞瘤和由HTLV感染引起的癌癥。

因此,設想式(I)和式(II)化合物可用于治療各種病癥和疾病。所以,本發明涉及式(I)和式(II)化合物、或其藥學上可接受的鹽、或含有任一實體的藥物組合物在制備用于治療此類病癥和疾病的藥物中的用途。

本發明的化合物可作為純化學藥品治療性給予,但優選結構式(I)或(II)化合物作為藥物組合物或制劑給予。因此,本發明提供包含式(I)或式(II)化合物以及藥學上可接受的合適稀釋劑或載體的藥物組合物。也提供藥物組合物的制備方法,包括將式(I)或式(II)化合物與藥學上可接受的合適稀釋劑或載體混合。

因此,本發明還提供包含結構式(I)或(II)化合物、或其藥學上可接受的鹽、前藥或水合物、以及一種或多種藥學上可接受的載體和任選的其它治療和/或預防成分的藥物制劑。所述載體在與制劑中的其它成分配伍并對其接受者無害的意義上是“可接受的”。

為了治療所指定的疾病,可以按標準方式給予本發明的制劑,例如口服、胃腸外、經粘膜(例如舌下或通過含服給藥)、局部、經皮、直腸或通過吸入(例如鼻或經肺深吸)。胃腸外給藥包括但不限于靜脈內、動脈內、腹膜內、皮下、肌內、鞘內和關節內。也可采用高壓技術,如POWDERJECTTM(Powderject?Pharmaceuticals,Plc,Oxford,England),完成胃腸外給藥。所述組合物也可以植入物(其使所述組合物緩慢釋放)的形式以及緩慢控制靜脈內滴注的形式給予。

對于口服給藥,包括含服給藥,所述組合物可以呈按常規方式配制的片劑或錠劑形式。例如,口服給藥用片劑和膠囊劑可含有常規賦形劑例如粘合劑(例如糖漿、阿拉伯膠(acacia)、明膠、山梨醇、西黃蓍膠、淀粉膠漿劑或聚乙烯吡咯烷酮)、填充劑(例如乳糖、蔗糖、微晶纖維素、玉米淀粉、磷酸鈣或山梨醇)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石粉、聚乙二醇或二氧化硅)、崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉乙醇酸鈉)或潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉)。片劑還可按照本領域眾所周知的方法進行包衣。

或者,舉例來說,本發明的化合物可以摻入到口服液體制劑例如水性或油性混懸劑、溶液劑、乳劑、糖漿劑或酏劑中。此外,含有這些化合物的制劑也可以制成干產品,在臨用前用水或其它合適溶媒進行配制。這樣的液體制劑可含有常規添加劑,例如助懸劑,例如山梨醇糖漿、甲基纖維素、葡萄糖/蔗糖糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠和氫化食用脂;乳化劑,例如卵磷脂、脫水山梨醇單油酸酯或阿拉伯膠;非水溶媒(其可包括食用油),例如杏仁油、分餾椰子油、油性酯、丙二醇和乙醇;和防腐劑,例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯和山梨酸。

這樣的制劑也可配制成栓劑,例如含有常規栓劑基質,例如可可脂或其它甘油酯。吸入用組合物通常可以以溶液劑、混懸劑或乳劑形式提供,其可使用常規拋射劑(例如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷),以干粉或氣溶膠形式給藥。常用的局部和經皮制劑包含常規水性或非水溶媒,例如滴眼劑、乳膏劑、軟膏劑、洗劑和糊劑,或者呈藥用硬膏劑、貼劑或膜劑的形式。

另外,本發明的組合物也可配制成供通過注射或連續輸注進行胃腸外給藥。注射用制劑可以呈在油性或水性溶媒中的混懸劑、溶液劑或乳劑,而且可含有諸如助懸劑、穩定劑和/或分散劑等配方劑(formulation?agent)。或者,活性成分可以呈粉末狀形式,其在使用前可用合適的溶媒(例如無菌、無熱源水)進行配制。

本發明的組合物也可配制成包埋貯庫(depot)制劑。這樣的長效制劑可經植入(例如皮下或肌內)或通過肌內注射給藥。因此,本發明的化合物可與合適聚合物或疏水材料(例如在可接受的油中的乳劑)、離子交換樹脂或微溶的衍生物(例如微溶的鹽)一起配制。

所述組合物也可配制成脂質體制劑。所述脂質體制劑可包含穿透目標細胞或角質層并且與細胞膜融合的脂質體,導致脂質體的內容物遞送到細胞內。脂質體描述于例如美國專利第5,077,211號、美國專利第4,621,023號和美國專利第4,508,703號,所述各專利通過引用結合到本文中。

對于獸用而言,可以按照常規獸醫實踐,以適當的可接受制劑給予式(I)或式(II)化合物、或藥學上可接受的鹽或前藥。獸醫可以容易地確定對特定動物最適合的給藥方案和給藥途徑。本發明化合物和方法可治療的動物包括但不限于寵物、家畜、表演動物和動物園樣本。

合成方法

式(I)和式(II)化合物可以通過本領域已知的任何合適方法或者通過構成本發明組成部分的下述方法制得。具體地說,結構式(I)和(II)化合物可以按照以下的合成流程制得。

在這些合成方法、實施例和整個說明書中,所用縮寫具有以下含義:

??DMF
??二甲基甲酰胺
??NaH
??氫化鈉
??min
??分鐘
??TLC
??薄層色譜法
??CH2Cl2
??二氯甲烷
??CHCl3
??氯仿
??MeOH
??甲醇
??Na2SO4
??硫酸鈉
??AlCl3
??氯化鋁
??AcCl
??乙酰氯
??LC-MS
??液相色譜法-質譜法

??Et2O
??乙醚
??Na2CO3
??碳酸鈉
??HPLC
??高效液相色譜法
??h
??小時
??NaHCO3
??碳酸氫鈉
??NaCl
??氯化鈉
??HCl
??鹽酸
??g
??克
??eq
??當量
??mol
??摩爾
?mmol
??毫摩爾
?mL
??毫升
?H2SO4
??硫酸
?K2CO3
??碳酸鉀
?Pd(OAc)2
??乙酸鈀
?Pd(PPh3)4
??四(三苯基膦基)合鈀
?P(OEt)3
??三乙氧基膦
?NaH
??氫化鈉
?TfOH
??三氟甲磺酸
?EtOH
??乙醇
?NMR
??核磁共振譜法
?EtOAc
??乙酸乙酯
?THF
??四氫呋喃
?NaOH
??氫氧化鈉

?NMP
??N-甲基吡咯烷酮
?DBU
??1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯
?MsCl
??甲磺酰氯
?TEA
??三乙醇胺
?Na2SO4
??硫酸鈉
?(Boc)2O
??碳酸二叔丁酯
?Py
??吡啶
?PdCl2(PPh)3
??二氯-三苯基膦基-鈀(II)
?PhNO2
??硝基苯
?KOAc
??乙酸鉀
?Pd(dppf)Cl2
??二氯化((雙二苯基膦基)二茂鐵基)合鈀(II)
?AcOK
??乙酸鉀
?PPh3
??三苯基膦
??PPh3O
??氧化三苯基膦
??BBr3
??三溴化硼
??CH3CN
??乙腈
??PhSH
??苯硫酚
??Cs2CO3
??碳酸銫
??STAB
??三乙酰氧基硼氫化鈉
??NEt3
??三乙胺
??DMF
??二甲基甲酰胺

應當理解,保護基以按照合成有機化學的一般原則來使用,以提供結構式(I)和(II)化合物。生成保護基的試劑是本領域技術人員眾所周知的,例如參見T.W.Greene等,“Protective?Groups?in?Organic?Synthesis,Third?Edition(《有機合成中的保護基》第三版),”John?Wiley?and?Sons,Inc.,NY,N.Y.(1999)。當需要時,這些保護基通過本領域技術人員已知的適當的堿解、酸解或氫解條件脫去。因此,本領域技術人員可以制備本文中未具體例舉的結構式(I)和(II)化合物。

另外,式(I)和式(II)化合物可以轉化成其它式(I)和式(II)化合物。因此,例如,特定的R取代基可以相互轉變以制備另一種適當取代的式(I)或式(II)化合物。適當互變的實例包括但不限于通過合適的手段把ORa變成羥基(例如使用例如SnCl2的試劑或鈀催化劑,如披鈀碳),或者使用標準酰化或磺酰化條件把氨基變成取代的氨基(例如酰氨基或磺酰氨基)。

式(I)和式(II)化合物可制備成各個立體異構體作為外消旋混合物。可以使用本領域已知的把外消旋混合物分離成它們的組成立體異構體的方法,例如,使用HPLC(在手性柱上,例如Hypersil萘基脲),或者使用立體異構體的鹽的分離法,通過拆分由外消旋物制備本發明化合物的各個立體異構體。可以通過從適當的溶劑結晶或蒸發掉適當的溶劑,把以溶劑分子締合的本發明的化合物分離出來。

通用合成程序

流程1

用于咔唑烷基化的通用程序

將咔唑1溶于或懸浮于DMF中。然后,加入NaH(3eq)。將混合物在室溫下在5-10min的時間內攪拌直到泡沫產生停止。加入氯化物的鹽酸鹽(chloride?hydrochloride)(1.3eq),使反應混合物在2-16h的時間內保持在50-60℃(TLC監測;洗脫劑:CH2Cl2/乙酸乙酯,1∶1對于存在起始咔唑;CHCl3/MeOH,9∶1對于產物純度)。所得混合物用水稀釋。如果有沉淀物生成,則將其濾出后風干。如果沒有沉淀物生成(表1),則混合物用乙酸乙酯萃取。萃取液經Na2SO4干燥,蒸發,殘余物通過色譜法純化(硅膠,CHCl3/MeOH)。產物2a和2b的收率示于表1。

用于烷基化咔唑的酰化的通用程序

將咔唑2溶于硝基苯中。將溶液在冰浴中冷卻,然后加入AlCl3(5eq)和AcCl(5eq)。將反應混合物維持2-16h的時間(LC-MS監測)。反應混合物的樣品用Et2O稀釋,把后者從沉淀物中潷析出來,然后溶于MeOH中。所得混合物用水稀釋,用Na2CO3中和,并用CHCl3萃取。蒸發萃取液。殘余物先在短硅膠柱中通過色譜法純化(CHCl3/MeOH)以去除硝基苯;然后,必要時,在硅膠柱中通過色譜法純化或者通過HPLC純化。產物3a和3b的收率示于表1。

流程2

3,6-二乙酰基咔唑(4)

將咔唑1(16.9g,0.1mol)溶于硝基苯(300mL)中。在攪拌下并用冰浴冷卻的同時加入無水AlCl3(54.0g,0.4mol)。然后,慢慢地滴加AcCl(55.5g,0.7mol)。使反應混合物在攪拌下升溫至室溫并保持13h的時間。在用冰浴冷卻下分小批量加入水(500mL)。去除冷浴,并將混合物在2h的時間內回流并用CHCl3(3×150mL)萃取。合并的萃取液依次用飽和NaHCO3溶液和飽和NaCl溶液洗滌,用無水Na2SO4干燥,和蒸發。殘余物通過柱色譜法純化(硅膠,CHCl3/MeOH),得到12.5g(50%)3,6-二乙酰基咔唑(4)。

對于化合物4的烷基化,采用了用于使咔唑烷基化的通用程序。產物3c-f的收率示于表1。

流程3

溴烷基二乙酰基咔唑5a-c的制備

將二乙酰基咔唑4溶于DMF中,然后加入NaH(3eq)。將混合物在室溫下攪拌10min。加入二溴烷烴(7eq)。將反應混合物保持1h的時間(5a在室溫下;5b在40℃;5c保持20min在70℃;TLC監測,CH2Cl2/乙酸乙酯,乙酸乙酯4∶1)。混合物再用水稀釋并用乙酸乙酯萃取。合并的萃取液用水和鹽水洗滌,用Na2SO4干燥,和蒸發。殘余物通過柱色譜法純化(硅膠,CHCl3),得到5a(21%)、5b(29%)和5c(74%)。

胺與溴烷基二乙酰基咔唑5a-c的烷基化

將溴化物5溶于DMF中,加入胺(過量,見表3)。將混合物保持在60℃過夜。(TLC監測,CH2Cl2/乙酸乙酯,1∶1對于存在起始咔唑;CHCl3/MeOH,9∶1對于產物純度)。反應混合物用水稀釋并用乙酸乙酯萃取。合并的萃取液用Na2SO4干燥。殘余物通過柱色譜法純化(硅膠,CHCl3/MeOH)。將產物溶于CH2Cl2和MeOH的混合物中。加入4M?HCl的二烷溶液,并蒸發混合物。殘余物用Et2O研磨,必要時用乙酸乙酯或丙酮研磨。產物6a-h的收率示于表3。

流程4

對于2的酰化,采用了類似于流程1中所描述的步驟。產物7a-d的收率示于表4。

流程5

3,6-雙(氯丙酰基)-9-N,N-二乙基氨基乙基咔唑(8)

將1-N,N-二乙基氨基乙基咔唑(0.23g,0.86mmol)與2mL硝基苯的溶液在冰浴中冷卻。加入AlCl3(0.57g,4.3mmol)和3-氯丙酰基氯(0.4mL,4.2mmol)。將反應混合物攪拌過夜(LC-MS監測)并用HCl水溶液稀釋。產物用CHCl3萃取,蒸發濾液。殘余物色譜法在短硅膠柱中通過色譜法快速純化(CHCl3/MeOH),得到0.38g(91%)化合物8,為其鹽酸鹽。

1,2,10,11-四氫-6-N,N-二甲基氨基乙基-6H-二環戊二烯并[c,g]咔唑-3,9-二酮(9)

將化合物2(0.38g,0.79mmol)溶于98%H2SO4(3mL)中。將反應混合物加熱到95C,在2.5h的時間內保持在該溫度下(TLC監測,CHCl3/MeOH,4∶1),再倒入冰中。所得混合物用無水Na2CO3中和并用CHCl3萃取。將萃取液蒸發,殘余物通過柱色譜法純化(CHCl3/MeOH)。將所獲得的粗產物(0.08g)溶于MeOH中。加入4M?HCl的二烷溶液,并蒸發混合物。將殘余物懸浮于MeOH中,并將懸浮液回流。(在此過程中固體不溶解)。將懸浮液冷卻后濾出固體,得到0.007g(2%)化合物9,為其鹽酸鹽。

流程6

2-甲基-2′-硝基-1,1′-聯苯(10a)

將2-甲基苯基硼酸(0.64g,4.7mmol)和2-硝基碘苯(2-nitroidobenzene)(1.0g,4.0mmol)溶于MeOH(20mL)和水(4mL)的混合物中。加入K2CO3(1.1g,8.0mmol)和Pd(OAc)2(0.018g,0.08mmol)。反應混合物用氬氣吹掃,加熱到50℃,在該溫度下保持過夜,通過Celite牌硅藻土過濾。后者用MeOH洗滌。蒸發濾液,殘余物無需進一步純化就可使用。

4,4′-二甲氧基-2-硝基-1,1′-聯苯(10h)

將4-甲氧基苯基硼酸(3.00g,19.7mmol)和4-氯-3-硝基茴香醚(3.69g,11.6mmol)溶于二烷(40mL)和水(10mL)的混合物中。加入K2CO3(5.44g,23.2mmol)和Pd(PPh3)4(1.14g,0.6mmol)。將反應混合物在氬氣中加熱到80℃,在該溫度下保持過夜(TLC監測:己烷/乙酸乙酯,4∶1),冷卻,通過Celite牌硅藻土過濾。后者用CH2Cl2洗滌,蒸發濾液。將殘余物溶于CH2Cl2中,蒸發溶液后得到6.0g粗制聯苯10h,其無需純化就可直接進行環化。

采用類似的程序獲得了聯苯10b-g。

用于咔唑合成的通用程序

將粗制聯苯10溶于(EtO)3P中。反應混合物在氬氣流中保持在125-140℃約48h的時間(TLC監測:己烷/乙酸乙酯,1∶1)并用水稀釋。將沉淀物濾出并用Et2O洗滌。如果沒有沉淀物生成,則產物用乙酸乙酯萃取,蒸發萃取液,殘余物在短硅膠柱中純化(己烷/乙酸乙酯)。產物11a-g的收率示于表5。

2,7-二甲氧基-9H-咔唑(11h)

在一個小瓶中進行反應。將粗制聯苯10h(6.0g)溶于P(OEt)3(36mL)中。該小瓶用氬氣吹掃。將反應混合物加熱到90℃,保持在該溫度下過夜,和冷卻。結果,咔唑沉淀出來。加入Et2O/CH2Cl2混合物。將沉淀物濾出并用CH2Cl2洗滌。蒸發濾液。再次加入P(OEt)3,并將混合物留下進行環化達24h。重復這些操作直到沉淀物生成停止,TLC表明起始聯苯消失。得到咔唑共2.9g(65%,用兩個步驟計算得出)。

對于化合物11的烷基化,采用了咔唑烷基化的通用程序。化合物12a-i的收率示于表1。

對于12的酰化,采用了類似于流程1所描述的程序。然而,對于單乙酰化,AcCl和AlCl3的用量減少至1.5eq。化合物13a-j的收率示于表2。

流程7

4,4,5,5-四甲基-2-(4-茚滿酮-1-基)-[1,3,2]-二氧雜硼雜環戊烷(14aX=CH2)

將4-三氟甲基磺酰氧基-1-茚滿酮(9.7g,34.6mmol)和二硼酸二頻哪醇酯(bis(pinacolato)diboron)(11.4g,45.0mmol)溶于二烷(100mL)中。加入AcOK(6.8g,69.2mmol)和Pd(dppf)2Cl2(1.3g,1.8mmol)。將反應混合物在氬氣流中加熱到80℃,保持在該溫度下過夜,冷卻,通過Celite牌硅藻土過濾。蒸發濾液。將殘余物溶于CH2Cl2中并在短硅膠柱中純化(己烷/乙酸乙酯),得到9.5g含有20%(質量)二硼酸二頻哪醇酯的產物。產物無需額外的純化就可用于下一步驟。

按同樣的方式由溴化物制得所述硼酸酯。如果使用了二硼酸二頻哪醇酯1eq,則得到更多純產物。

4,4,5,5-四甲基-2-[4-(2-甲基異吲哚啉-1-酮)-基]-[1,3,2]-二氧雜硼雜環戊烷(14b?X=NMe)

將4-溴-2-甲基異吲哚啉-1-酮(3.23g,14.3mmol)和二硼酸二頻哪醇酯(4.72g,18.6mmol)溶于二烷(60mL)中。加入AcOK(2.80g,28.6mmol)和Pd(dppf)2Cl2(0.5g,0.7mmol)。將反應混合物在氬氣流中加熱到80℃,在該溫度下保持過夜,冷卻,通過Celite牌硅藻土過濾。蒸發濾液。將殘余物溶于CH2Cl2中并在短硅膠柱中純化(己烷/乙酸乙酯),得到4.2g含有20%(質量)二硼酸二頻哪醇酯的產物。產物無需額外的純化就可用于下一步驟。

聯苯15a(X=CH2,R=H)

將4,4,5,5-四甲基-2-(4-茚滿酮-1-基)-[1,3,2]-二氧雜硼雜環戊烷(2.17g,8.4mmol)和鄰硝基碘苯(2.70g,10.9mmol)溶于二烷(30mL)和水(5mL)的混合物中。加入K2CO3(2.30g,16.7mmol)和Pd(PPh3)4(0.48g,0.4mmol)。將反應混合物在氬氣流中加熱到80℃,在24h的時間內保持在該溫度下(TLC監測:己烷/乙酸乙酯,4∶1),冷卻,通過Celite牌硅藻土過濾。蒸發濾液。將殘余物溶于CH2Cl2中。將未溶解的沉淀物濾出。部分地蒸發濾液后,產物在短硅膠柱中純化(己烷/乙酸乙酯),得到2.5g含有PPh3O的產物。產物無需額外的純化就直接用于環化。

聯苯15b(X=CH2,R=OMe)

將4,4,5,5-四甲基-2-(4-茚滿酮-1-基)-[1,3,2]-二氧雜硼雜環戊烷(1.20g,4.6mmol)和鄰硝基碘苯(0.87g,4.6mmol)溶于二烷(10mL)和水(2mL)的混合物中。加入K2CO3(1.28g,9.2mmol)和Pd(PPh3)4(0.27g,0.2mmol)。將反應混合物在氬氣流中加熱到80℃,在24h的時間內保持在該溫度下(TLC監測:己烷/乙酸乙酯,4∶1),冷卻,通過Celite牌硅藻土過濾。蒸發濾液。將殘余物溶于CH2Cl2中。將未溶解的沉淀物濾出。部分地蒸發濾液,產物在短硅膠柱中純化(己烷/乙酸乙酯),得到1.25g含有PPh3O的產物。產物無需額外的純化就可直接環化。

聯苯15c(X=NMe,R=H)

將4,4,5,5-四甲基-2-[4-(2-甲基異吲哚啉-1-酮)-基]-[1,3,2]-二氧雜硼雜環戊烷(2.43g,8.9mmol)和鄰硝基碘苯(2.44g,9.80mmol)溶于二烷(30mL)和水(6mL)的混合物中。加入K2CO3(2.50g,18.1mmol)和Pd(PPh3)4(0.51g,0.4mmol)。將反應混合物在氬氣流中加熱到80℃,在24h的時間內保持在該溫度下(TLC監測:己烷/乙酸乙酯,4∶1),冷卻,通過Celite牌硅藻土過濾。蒸發濾液。將殘余物溶于CH2Cl2中。將未溶解的沉淀物濾出。部分地蒸發濾液,產物在短硅膠柱中純化(己烷/乙酸乙酯),得到2.3g含有PPh3O的產物。產物無需額外的純化就可直接環化。

聯苯15d(X=NMe,R=OMe)

將4,4,5,5-四甲基-2-[4-(2-甲基異吲哚啉-1-酮)-基]-1,3,2]-二氧雜硼雜環戊烷(0.97g,3.6mmol)和4-氯-3-硝基茴香醚(0.67g,3.6mmol)溶于二烷(10mL)和水(2mL)的混合物中。加入K2CO3(0.98g,7.2mmol)和Pd(PPh3)4(0.21g,0.2mmol)。將反應混合物在氬氣流中加熱到80℃,在24h的時間內保持在該溫度下(TLC監測:己烷/乙酸乙酯,4∶1),冷卻,通過Celite牌硅藻土過濾。蒸發濾液。將殘余物溶于CH2Cl2中。將未溶解的沉淀物濾出。部分地蒸發濾液,產物在短硅膠柱中純化(己烷/乙酸乙酯),得到0.76g含有PPh3O的產物。產物無需額外的純化就可直接環化。

咔唑16a(X=CH2,R=H)

在一個小瓶中進行反應。將4-(2-硝基苯基)茚滿酮-1(2.54g,10.0mmol)溶于P(OEt)3(8mL)中。該小瓶用氬氣吹掃。將反應混合物加熱到90℃,保持在該溫度下過夜,和冷卻。結果,咔唑沉淀出來。加入CH2Cl2。將沉淀物濾出后用CH2Cl2洗滌。蒸發濾液。再次加入P(OEt)3(2mL),將混合物留下進行環化達24h。重復這些操作直到沉淀物生成停止,TLC表明起始聯苯消失。得到咔唑共0.58g。

咔唑16b(X=CH2,R=OMe)

在一個小瓶中進行反應。將4-(4-甲氧基-2-硝基苯基)-茚滿酮-1(1.25g,4.4mmol)溶于P(OEt)3(8mL)中。該小瓶用氬氣吹掃。將反應混合物加熱到90℃,保持在該溫度下過夜,和冷卻。結果,咔唑沉淀出來。加入CH2Cl2。將沉淀物濾出后用CH2Cl2洗滌。蒸發濾液。再次加入P(OEt)3(1mL),并將混合物留下進行環化達24h。重復這些操作直到沉淀物生成停止,TLC表明起始聯苯消失。得到咔唑共0.39g。咔唑16c(X=NMe,R=H)

在一個小瓶中進行反應。將4-(2-硝基苯基)-2-甲基異吲哚啉(isoinolin)-1-酮(2.29g,8.5mmol)溶于P(OEt)3(10mL)中。該小瓶用氬氣吹掃。將反應混合物加熱到90℃,保持在該溫度下過夜,和冷卻。結果,咔唑沉淀出來。加入CH2Cl2。將沉淀物濾出后用CH2Cl2洗滌。蒸發濾液。再次加入P(OEt)3(0.5mL),并將混合物留下進行環化達24h。重復這些操作直到沉淀物生成停止,TLC表明起始聯苯消失。得到咔唑共0.4g。

咔唑16d(X=NMe,R=OMe)

在一個小瓶中進行反應。將4-(4-甲氧基-2-硝基苯基)-2-甲基異吲哚啉(isoinolin)-1-酮(0.76g,2.6mmol)溶于P(OEt)3(6mL)中。該小瓶用氬氣吹掃。將反應混合物加熱到90℃,保持在該溫度下過夜,和冷卻。結果,咔唑沉淀出來。加入CH2Cl2。將沉淀物濾出后用CH2Cl2洗滌。蒸發濾液。再次加入P(OEt)3(0.5mL),并將混合物留下進行環化達24h。重復這些操作直到沉淀物生成停止,TLC表明起始聯苯消失。得到咔唑共0.34g。

對于16的烷基化,采用了咔唑烷基化的通用程序。產物17a-f的收率示于表1。

對于17的酰化,采用了類似于流程1所描述的程序。產物18a-d的收率示于表2。

流程8

用于二甲基化的通用程序

將甲氧基化合物溶于CH2Cl2中。將溶液冷卻至-40℃。在氬氣流中加入0.5M?BBr3的DCM溶液(4eq,對于一個甲氧基)。在10min之后,去除冷浴。將反應混合物加熱到室溫,保持1h的時間(TLC監測,CHCl3/MeOH,4∶1),再倒入NaHCO3水溶液和CH2Cl2的混合物中。分離有機層,水層用CH2Cl2萃取多一次。合并的萃取液用Na2SO4干燥并蒸發。產物通過柱色譜法純化(CHCl3/MeOH)。產物19a-h的收率示于表6。

流程9

2-羥基-9-N,N-二乙基氨基乙基咔唑(20)

將2-甲氧基-9-N,N-二乙基氨基乙基咔唑12g溶于CH2Cl2(10mL)中。將溶液冷卻至-40℃。在氬氣流中加入0.5M?BBr3的DCM溶液(6mL,3.00mmol)。結果,生成橙色懸浮液。將反應混合物加熱到室溫,保持1.5h的時間,再倒入NaHCO3水溶液和CH2Cl2的混合物中。分離有機層,水層用CH2Cl2萃取多一次。合并的萃取液用Na2SO4干燥并蒸發。產物通過柱色譜法純化(CHCl3/MeOH),得到0.176g(92%)產物。

2-乙酰氧基-9-N,N-二乙基氨基乙基咔唑(21)

將化合物20(0.176g,0.62mmol)的Ac2O(2mL)溶液在30min的時間內回流后倒入水中。所得混合物用NaHCO3中和后用乙酸乙酯萃取。蒸發萃取液,得到0.16g(79%)產物。

3-乙酰基-2-羥基-9-N,N-二乙基氨基乙基咔唑(22)

將化合物21(0.16g,0.49mmol)溶于PhNO2(2mL)中,再加入AlCl3(0.1g,0.75mmol)。將反應混合物在油浴中加熱到100℃,在2h的時間內保持在該溫度下,用水稀釋,用Na2CO3中和,并用CHCl3萃取。蒸發萃取液。殘余物通過短硅膠柱色譜法純化(CHCl3/MeOH),得到0.044g(28%)化合物22。

表1.咔唑的烷基化

a含有DMF。b收率并不精確。粗制咔唑用來制備。通過鹽酸鹽純化。c通過鹽酸鹽純化。d緊接在用水稀釋反應混合物之后作為結晶物質被分離出來。

表2.烷基化咔唑的乙酰化

a在HPLC純化之后。b含起始化合物的混合物分離后無需再分離就可使用。

表3.咔唑用溴烷基二乙酰基咔唑進行烷基化

表4.

a在HPLC純化之后。

表5.

a析出后為晶體。b產物含有(EtO)3PO并且無需純化就可使用。c僅給出了目標區域異構體(regioisomer)的收率。

表6.

a在HPLC純化之后。b在用混合物工作后獲得并通過HPLC分離。c通過鹽酸鹽純化。

實施例

實施例1

[3-(9H-咔唑-9-基)丙基]二甲胺(30)。

將咔唑3.0g(18.0mmol)溶于DMF(20mL)中。然后,加入60%NaH/石蠟(2.5g,62.5mmol),并將混合物攪拌10min。分批加入2-N,N-二甲基氨基丙基氯3.0g(19.0mmol),隨后使溫度升高到45-50℃。在該溫度下保持反應混合物2.5h(TLC監測,CHCl3/MeOH,9∶1)。將所獲得的物質小心地倒入冰/水混合物中并用乙酸乙酯萃取。萃取液用Na2SO4干燥后蒸發,得到化合物30(4.8g,100%),為褐色液體油狀物。

1,1′-{9-[3-(二甲基氨基)丙基]-9H-咔唑-3,6-二基}雙(2-甲基丙-1-酮)(實施例1)。

將化合物30(0.25g,1.0mmol)溶于硝基苯(5mL)中。依次分批加入AlCl3(0.6g,4.5mmol)和異丁酰氯(0.6mL,5.7mmol)。將反應混合物攪拌40min(LC/MS監測)。將所獲得的混合物倒入冰/水混合物中并用CHCl3萃取。將合并的萃取液蒸發,殘余物在短厚硅膠柱中通過色譜法純化(洗脫劑:CHCl3/MeOH?99∶1→90∶10),得到0.189g(47%)產物。1H?NMR(DMSO-d6):δ1.20(12H,d,J=6.7Hz);1.90-1.97(2H,m);2.11(6H,s);2.18(2H,t,J=6.7Hz);3.91(2H,七重峰,J=6.7Hz),4.50(2H,t,J=6.6Hz);7.76(2H,d,J=8.7Hz);8.14(2H,dd,J=8.7Hz,J=1.5Hz);9.11(2H,d,J=1.5Hz)。ELSD:100%,ESI-MS:m/z?392[M+H]+。

實施例2

1,1′-(9H-咔唑-3,6-二基)二乙酮(31)。

將咔唑(16.9g,0.1mol)溶于硝基苯(300mL)中。在冰浴中在攪拌下加入無水AlCl3(54.0g,0.4mol)。然后慢慢地滴加AcCl(55.5g,0.7mol)。在攪拌下使反應混合物升溫至室溫并保持13h。在冰浴中在冷卻下分小批量加入水(500mL)以避免急劇起泡沫。去除冷浴,混合物用冷凝器回流2h。產物用氯仿(3×150mL)萃取。合并的萃取液依次用飽和NaHCO3溶液和飽和NaCl溶液洗滌,用無水Na2SO4干燥,和蒸發。殘余物通過柱色譜法純化(硅膠,CHCl3-MeOH),得到112.5g(50%)。

1,1′-{9-[2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙基]-9H-咔唑-3,6-二基}二乙酮(實施例2,3c)。

將二乙酰基衍生物31(0.97g,3.86mmol)溶于DMF(7mL)中。加入NaH(0.54g,13.5mmol),并將混合物在室溫下攪拌3-5分鐘。加入2-(2-氯乙基)-1-甲基吡咯烷鹽酸鹽(1.07g,5.8mmol)。將反應混合物在60℃下攪拌24h(TLC監測,CHCl3/MeOH,9∶1),用水稀釋,并用乙酸乙酯萃取。萃取液用Na2SO4干燥后蒸發。殘余物通過柱色譜法純化(硅膠,CHCl3/MeOH?99∶1→90∶10),得到0.90g(64%)產物。1H?NMR(DMSO-d6):δ1.41-1.49(1H,m);1.54-1.73(3H,m);1.76-1.85(1H,m);1.97-2.13(3H,m);2.14(3H,s);2.70(6H,s);2.86-2.93(1H,m);4.46-4.50(2H,m);7.72(2H,d,J=8.8Hz);8.12(2H,dd,J=8.8Hz,J=1.6Hz);9.04(2H,d,J=1.6Hz)。ELSD:100%,ESI-MS:m/z?363[M+H]+。

實施例3

[2-(9H-咔唑-9-基)乙基]二乙胺(32)。

將咔唑(10.0g,59.8mmol)溶于DMF(60mL)中。然后,分批加入60%NaH/石蠟(7.2g,180.0mmol)。將混合物攪拌10min。分批加入2-N,N-二乙基氨基乙基氯鹽酸鹽(10.5g,61.0mmol),隨后使溫度升高到50℃。將反應混合物在該溫度下保持2.5h(TLC監測,己烷/乙酸乙酯4∶1)。將所得物質小心地倒入冰/水混合物中并用乙酸乙酯萃取。萃取液用Na2SO4干燥后蒸發,得到化合物1(16.0g,100%),為液體褐色油狀物。

1,1′-{9-[2-(二乙基氨基)乙基]-9H-咔唑-3,6-二基}雙(3-氯丙-1-酮)鹽酸鹽(33)。

將化合物32(17.9g,67.3mmol)的硝基苯(150mL)溶液在冰浴中冷卻。分批加入AlCl3(45.0g,337.1mmol)。然后滴加3-氯丙酰基氯(32.4mL,336.7mmol)達10min。將反應混合物攪拌40min(LC/MS監測),倒入冰與稀HCl的混合物中,并用CHCl3萃取。將萃取液蒸發。殘余物在厚短柱中用色譜法純化(硅膠,CHCl3/MeOH?99∶1→90∶10),得到22.9g(76.3%)鹽酸鹽33。

6-[2-(二乙基氨基)乙基]-10,11-二氫-1H-二環戊二烯并[c,g]咔唑-3,9(2H,6H)-二酮鹽酸鹽(實施例3)。

將鹽酸鹽2(22.9g,51.3mmol)溶于98%H2SO4(150mL)中。將溶液在80℃下保持4h(TLC監測,CHCl3/MeOH?4∶1)后倒入冰中。所得混合物用Na2CO3中和并用CHCl3萃取。將萃取液蒸發。殘余物在短厚柱中通過色譜法純化(硅膠,CHCl3/MeOH?99∶1→90∶10)并用MeOH重結晶,得到0.562g(3%)產物。將后者溶于CH2Cl2中,加入HCl的二烷溶液,并將混合物蒸發至干。殘余物用乙醚洗滌后干燥,得到0.6358g鹽酸鹽。1H?NMR(DMSO-d6):δ1.26(6H,t,J=7.4Hz);2.77-2.80(4H,m);3.42-3.47(2H,m);3.23-3.34(4H,m);3.83-3.85(4H,m);5.88(2H,t,J=7.8Hz);7.84(2H,d,J=8.6Hz);7.97(2H,d,J=8.6Hz);10.75(1H,br.s)。ELSD:100%,ESI-MS:m/z?375[M+H]+。

實施例4

4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)茚滿-1-酮(34)。

將乙酸鉀(17.8g,181.6mmol)和Pd(dppf)Cl2(3.3g,4.5mmol)加入到4-溴-1-茚滿酮(19.3g,91.5mmol)和二硼酸二頻哪醇酯(23.2g,91.3mmol)的二烷(300mL)的溶液中。將混合物在氬氣中加熱到80℃,在該溫度下保持16h,冷卻,通過Celite牌硅藻土過濾,和蒸發。將殘余物溶于CH2Cl2中。產物在短厚柱上用硅膠純化(洗脫劑:己烷-乙酸乙酯100∶0→50∶50)。34的產量:23.4g。含有二硼酸二頻哪醇酯(約7molar%)的產物無需額外的純化就可用于下一步驟。

4-(4-甲氧基-2-硝基苯基)茚滿-1-酮(35)。

將鉀堿(7.5g,54.3mmol)和Pd(PPh3)4(1.6g,1.4mmol)加入到4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)茚滿-1-酮34(7.0g,27.1mmol)和4-氯-3-硝基茴香醚(5.1g,27.1mmol)在二烷(80mL)和水(20mL)混合物的溶液中。將所獲得的混合物在氬氣中加熱到80℃,在該溫度下保持16h(TLC監測,洗脫劑:己烷-乙酸乙酯,1∶1),冷卻,通過Celite牌硅藻土過濾,蒸發,溶于CH2Cl2。然后從不溶的部分中濾出該混合物,與硅膠一起蒸發,在短厚柱上用硅膠純化(洗脫劑:己烷-CH2Cl2?100∶0→0∶100,CH2Cl2-乙酸乙酯100∶0→50∶50)。35的產量:5.59g。產物無需額外的純化就可用于下一步驟。

8-甲氧基-1,6-二氫環戊二烯并[c]咔唑-3(2H)-酮(36)。

將所獲得的聯苯35(5.59g)分成五份(各1.11g);然后向每一份中加入P(OEt)3(每份7mL)。所得混合物在燒瓶中進行氬氣吹掃,加熱到最高90℃,在該溫度下保持3天,和冷卻。使咔唑沉淀出來。然后反應混合物用乙醚稀釋;將沉淀物濾出并用CH2Cl2洗滌。如果初始聯苯化合物仍保留在濾液中(TLC監測,洗脫劑:己烷-乙酸乙酯,1∶1),則將該濾液蒸發后加入P(OEt)3(每個燒瓶中加入1mL)。混合物進行重復環化一天。重復該程序直到停止沉淀為止,TLC數據表明不存在初始聯苯化合物。咔唑36的總產量:2.16g。

6-[3-(二甲基氨基)丙基]-8-甲氧基-1,6-二氫環戊二烯并[c]咔唑-3(2H)-酮(37)。

將化合物36(1.0g,3.98mmol)懸浮于CH2Cl2(10mL)中;加入NaH(0.75g,12.0mmol,3eq.)。將混合物在室溫下攪拌5-10min;然后加入3-二甲基氨基-1-丙基氯鹽酸鹽(0.75g,4.74mmol,1.2eq.)。將反應混合物加熱到70℃,在該溫度下保持2h(TLC監測,洗脫劑:CH2Cl2-乙酸乙酯,1∶1-存在初始咔唑,CHCl3-MeOH,9∶1-產物的純度)。所得混合物用水稀釋,用乙酸乙酯萃取,蒸發,在短厚柱上用硅膠純化,洗脫劑:CHCl3-MeOH?99∶1→90∶10。37的產量:0.84g(63%)。

9-乙酰基-6-[3-(二甲基氨基)丙基]-8-甲氧基-1,6-二氫環戊二烯并[c]咔唑-3(2H)-酮(38)。

將化合物37(0.84g,2.51mmol)的PhNO2(20mL)溶液在冰浴中冷卻。然后加入AlCl3(1.7g,12.7mmol,5eq.),此后再加入AcCl(0.9mL,12.7mmol,5eq.)。將混合物保持40min(LC/MS監測),用水稀釋,用Na2CO3中和,用CHCl3萃取,和蒸發。產物在短厚柱上純化,洗脫劑:CHCl3-MeOH?99∶1→90∶10。38的產量:0.658g(69%)。

9-乙酰基-6-[3-(二甲基氨基)丙基]-8-羥基-1,6-二氫環戊二烯并[c]咔唑-3(2H)-酮(實施例4;19c)。

將0.5M?BBr3溶液(16.5mL,5eq.)在氬氣中滴加到化合物38(0.658g,1.74mmol)的CH2Cl2(100mL)溶液(冷卻至-40℃)中。將混合物保持10min;然后去除冷浴后將混合物加熱到室溫并保持1-2h(TLC監測,洗脫劑:CHCl3/NH3-MeOH,9∶1)。將所得混合物倒在NaHCO3水溶液和CH2Cl2的混合物中。分離有機層;水層用CH2Cl2萃取,經Na2SO4干燥,蒸發,溶于CHCl3-MeOH-水(40∶9∶1)混合物中。產物在硅膠柱中純化,用后一混合物作為洗脫劑。實施例4的產量:0.258g(41%)。為了制備鹽酸鹽,將分離出的產物溶于CH2Cl2-MeOH混合物中;加入HCl的二烷溶液。將所得混合物蒸發至干;殘余物用乙醚洗滌。

1H?NMR譜(DMSO-d6):δ2.14-2.20(2H,m);2.70(6H,d,J=4.9Hz);2.78-2.81(2H,m);3.12-3.17(2H,m);3.60-3.62(2H,m);4.51(2H,t,J=7.1Hz);7.28(1H,s);7.73(2H,s-降級的AB體系);8.55(1H,s);10.40(1H,br.s);12.76(1H,s)。ELSD:100%,ESI-MS:m/z?364[M+H]+。

實施例5

4,4′-二甲氧基-2-硝基聯苯(39)

將鉀堿(Potash)(9.10g,65.9mmol)和Pd(PPh3)4(1.90g,1.6mmol)加入到4-甲氧基苯基硼酸(5.0g,32.9mmol)和4-氯-3-硝基茴香醚(anizole)(6.17g,32.9mmol)在二烷(80mL)和水(20mL)的混合物的溶液中。將所得混合物在氬氣中加熱到80℃,在該溫度下保持16h(TLC監測,洗脫劑:己烷-乙酸乙酯,4∶1),冷卻,通過Celite牌硅藻土過濾。產物用CH2Cl2洗出來。將殘余物溶于CH2Cl2中并在短厚柱上純化(洗脫劑:己烷-CH2Cl2100∶0→0∶100,CH2Cl2-乙酸乙酯100∶0→50∶50)。1的產量:8.47g。

2,7-二甲氧基-9H-咔唑(40)

將化合物39(8.47g)分成8份(各1.06g)。然后,向每一份中加入P(OEt)3(每份7mL)。所得混合物進行氬氣吹掃,加熱到90℃,在該溫度下保持3天,冷卻,用乙醚稀釋。將所獲得的沉淀物過濾并用CH2Cl2洗滌。咔唑40的產量:3.33g。

[3-(2,7-二甲氧基-9H-咔唑-9-基)丙基]二甲胺(40)

將化合物40(0.7g,3.1mmol)懸浮于DMF(6mL)中。加入氫化鈉(0.4g,10.0mmol),將混合物在室溫下攪拌5-10min。然后加入3-二甲基氨基-1-丙基氯鹽酸鹽(0.73g,4.6mmol)。將所獲得的混合物加熱到50-60℃,在該溫度下保持16h(TLC監測,洗脫劑:CH2Cl2-乙酸乙酯,1∶1-存在初始咔唑;CH2Cl2-MeOH,9∶1-產物的純度),并用水稀釋。放置所獲得的白色沉淀物沉降1h,濾出后風干。41的產量:0.96g(100%)。

1,1′-{9-[3-(二甲基氨基)丙基]-2,7-二甲氧基-9H-咔唑-3,6-二基}二乙酮(42)

將化合物41(0.96g,3.2mmol)溶于PhNO2(20mL)中;溶液在冰浴上冷卻。然后,分批加入AcCl(1.1mL,15.4mmol),再分批加入AlCl3(2.1g,15.7mmol)。將所得混合物保持40min(LC/MS監測),用水稀釋,用Na2CO3中和,用CHCl3萃取,和蒸發。產物在短厚柱上用硅膠純化。42的產量:0.787g(62%)。

1,1′-{9-[3-(二甲基氨基)丙基]-2,7-二羥基-9H-咔唑-3,6-二基}二乙酮(實施例5;19b)。

將0.5M的BBr3溶液(22.5mL)在氬氣中滴加到化合物42(0.787g,1.99mmol)的CH2Cl2(90mL)溶液中,冷卻至-40℃。在10min之后,去除冷浴;將混合物加熱至室溫并保持1-2h(TLC監測,洗脫劑:氯仿-甲醇,4∶1)。把所得混合物倒入蘇打水溶液和CH2Cl2的混合物中。分離有機層。水層用CH2Cl2萃取,經Na2SO4干燥,蒸發,溶于CHCl3-MeOH-水(40∶9∶1)混合物。產物在柱上純化。實施例5的產量:0.379g(52%)。

然后,將產物溶于CH2Cl2-MeOH混合物中。加入HCl的二烷溶液。將所得溶液蒸發至干;殘余物用CH3CN和乙醚洗滌。自產物(0.379g)的堿形式分離得到0.339g鹽酸鹽。

1H?NMR(DMSO-d6)δ:2.09-2.13(2H,m);2.72(6H,s);2.77(6H,s);3.13-3.16(2H,m);4.34(2H,t,J=7.1Hz);7.13(2H,s);8.84(2H,s);10.17(1H,br.s);12.82(2H,s)。ELSD:100%,ESI-MS:m/z?369[M+H]+。

實施例6

4-(2-硝基苯基)茚滿-1-酮(45)。

將鉀堿(8.1g,58.7mmol)和Pd(PPh3)4(1.7g,1.5mmol)加入到化合物44(7.51g,29.1mmol)和4-氯-3-硝基苯(4.6g,29.1mmol)在二烷(80mL)和水(20mL)混合物中的溶液中。所獲得的混合物在氬氣中加熱到80℃,并在該溫度下保持16h(TLC監測,洗脫劑:己烷-乙酸乙酯,1∶1),冷卻,通過Celite牌硅藻土過濾,和蒸發。將所得產物溶于CH2Cl2中并將不溶的殘余物濾出。所得產物與硅膠一起蒸發并在短厚柱上純化(洗脫劑:己烷-CH2Cl2?100∶0→0∶100,CH2Cl2-乙酸乙酯100∶0→50∶50)。化合物45(5.0g)分離后無需純化而用于下一步驟。

1,6-二氫環戊二烯并[c]咔唑-3(2H)-酮(46)。

把化合物45(5.0g)分成五份(各1.0g)。向每一份中加入P(OEt)3(每份7mL)。所得產物在燒瓶中進行氬氣吹掃,加熱到90℃,在該溫度下保持3天,然后冷卻。咔唑沉淀物用乙醚稀釋。將沉淀物過濾并用乙醚洗滌。如果在濾液中存在初始聯苯(TLC監測,洗脫劑:己烷-乙酸乙酯,1∶1),則蒸發該濾液,然后加入P(OEt)3(每個燒瓶各加1mL)并進行環化1天。重復該程序直到沉淀停止并且TLC顯示不存在初始聯苯。得到咔唑46(2.7g)。

2-硝基-N-丙基苯磺酰胺(49)。

在室溫下,將2-硝基苯基磺基氯(8g,36mmol)的乙酸乙酯(25mL)溶液滴加到丙胺(3mL,36.0mmol)、乙酸乙酯(15mL)、Na2CO3(4g,37.7mmol)和水(25mL)的混合物中。將所得溶液攪拌2h(TLC監測,洗脫劑:CH2Cl2)。分離有機層,用水、檸檬酸溶液洗滌,經Na2SO4干燥,和蒸發。結晶出沉淀物,為白色物質,再用己烷洗出。49的產量:(7.47g,85%)。

N-(3-溴丙基)-2-硝基-N-丙基苯磺酰胺(50)。

將1,3-二溴丙烷(8.5mL,82.0mmol,10eq.)加入到化合物49(2.0g,8.2mmol)的DMF(20mL)溶液中。然后分批加入NaH(0.6g,15.0mmol)。使溫度升高到50-60℃。將混合物在該溫度下攪拌20min(TLC監測,洗脫劑:CH2Cl2)。然后將混合物小心地倒入冰中。產物用乙酸乙酯萃取,蒸發萃取液。殘余物用己烷從1,3-二溴丙烷中洗出。將所得產物溶于CH2Cl2中并在短厚柱上用硅膠純化,洗脫劑:己烷-CH2Cl2?100∶0→0∶100。分離得到化合物50(1.87g,62%),為可快速結晶的油狀物。

2-硝基-N-[3-(3-氧代-2,3-二氫環戊二烯并[c]咔唑-6(1H)-基)丙基]-N-丙基苯磺酰胺(47)。

將化合物46(0.538g,2.43mmol)和溴化物50(0.9g,2.46mmol)溶于CH2Cl2(30mL)中。然后加入NaH(0.15g,3.75mmol,1.5eq.)。將反應混合物攪拌20min(TLC監測,洗脫劑:己烷-乙酸乙酯,1∶1)。然后,把混合物倒在冰上。產物用乙酸乙酯萃取,萃取液在旋轉蒸發器內蒸發。在高真空下去除CH2Cl2的殘余物。將甲醇加入到硬化沉淀物中。產物進行研磨;沉淀物濾出。47的產量:0.638g(52%)。

N-[3-(9-乙酰基-3-氧代-2,3-二氫環戊二烯并[c]咔唑-6(1H)-基)丙基]-2-硝基-N-丙基苯磺酰胺(48)。

將化合物47(0.638g,1.26mmol)溶于PhNO2(7mL)中。將溶液在冰浴上冷卻,加入AlCl3(0.67g,5.02mmol),然后再加入AcCl(0.45mL,6.31mmol)。將混合物保持40min(LC/MS監測),用水稀釋。產物用CH2Cl2萃取。蒸發萃取液。蒸發殘余物,使產物通過Celite牌硅藻土,洗脫劑:CH2Cl2-乙酸乙酯100∶0→50∶50。48的產量:0.453g(66%)。

9-乙酰基-6-[3-(丙基氨基)丙基]-1,6-二氫環戊二烯并[c]咔唑-3(2H)-酮(實施例6)。

將化合物48(0.496g,0.91mmol)懸浮于MeOH(10mL)和CHCl3(15mL)的混合物中。將混合物加熱到沸騰。然后加入Cs2CO3(0.6g,1.82mmol),立即倒入PhSH(0.2mL,1.96mmol)(溶液變成藍色)。將所得溶液回流2h(TLC監測,洗脫劑:CHCl3-MeOH,9∶1)。在此期間,反應混合物變成綠色。然后,將混合物蒸發至干。加入稀檸檬酸溶液。將黃色沉淀物濾出,用乙醚洗滌,懸浮于CH3CN中,和回流。在冷卻之后,由黃色濾液濾出米色沉淀物,然后用乙醚洗滌。分離得到的產物(0.251g,76%)。為了將堿形式轉化成鹽酸鹽,將產物溶于CH2Cl2-甲醇混合物中。(加入混合物直到產物完全溶解)。然后,加入鹽酸的二烷溶液。將溶液蒸發至干。所獲得的深紫色(dark-lilac)沉淀物用甲醇和乙腈洗滌。實施例6作為鹽酸鹽的產量:0.118g。

H1-NMR(400MHz,DMSO-d6)譜:δ0.88(3H,t,J=7.32Hz);1.53-1.62(2H,m);2.13-2.20(2H,m);2.73(2H,s);2.80-2.83(4H,m);2.95-2.96(2H,m);3.65-3.68(2H,m);4.68(2H,t,J=7.3Hz);7.81(1H,d,J=8.6Hz);7.85(1H,d,J=8.6Hz);8.15(1H,dd,J=8.6Hz,J=1.3Hz);8.70(1H,br.s);8.71(1H,d,J=1.3Hz)。ELSD:100%,ESI-MS:m/z362[M+H]+。

實施例7

N-(2-羥基乙基)-2-硝基苯磺酰胺(54)。

將乙醇胺(10mL,165mmol)溶于乙酸乙酯(60mL)中。然后加入Na2CO3(22.7g,214.2mmol)的水(100mL)溶液。然后,在攪拌下滴加2-硝基苯磺酰基氯(35.0g,157.9mmol)的乙酸乙酯(100mL)溶液。將所得溶液在室溫下攪拌2h(TLC監測,洗脫劑:CH2Cl2)。分離有機層,用水和檸檬酸溶液洗滌,經Na2SO4干燥,和蒸發。54的產量:29.5g(73%),為白色晶體。

甲烷磺酸2-{[(2-硝基苯基)磺酰基]氨基}乙基酯(55)。

將三乙胺(20mL,144.6mmol)加入到化合物54(29.5g,119.9mmol)的乙酸乙酯(300mL)溶液中。混合物在冰浴中冷卻至10℃。然后,在溫度≤20℃下滴加甲磺酰氯(10.2mL,131.8mmol)的乙酸乙酯(50mL)溶液。將所得溶液在室溫下攪拌3h(TLC監測,洗脫劑:己烷-乙酸乙酯,4∶1)。過濾反應混合物以去除沉淀物-三乙胺鹽酸鹽。濾液用NaHCO3水溶液、水洗滌后蒸發。55的產量:32.2g(83%),為晶體。

1-[(2-硝基苯基)磺酰基]氮丙啶(56)。

將KOH(1.73g,31mmol)的水(50mL)溶液加入到化合物55(10g,31mmol)的乙酸乙酯(100mL)溶液中。水層染成黃色。將混合物在室溫下攪拌1h(TLC監測,洗脫劑:CH2Cl2-乙酸乙酯,1∶1)。必要時,另外分批加入KOH溶液(0.5eq.)。分離有機層,用水、檸檬酸溶液(至pH?7)充分洗滌,再次用水洗滌,經Na2SO4干燥,和蒸發。56的產量:6.6g(93%),為帶黃色的液體油狀物。

N-[2-(9H-咔唑-9-基)乙基]-2-硝基苯磺酰胺(51)。

將咔唑(1.10g,6.59mmol)溶于CH3CN(40mL)中。然后加入氫氧化鈉(sodium?hydrate)(0.33g,8.25mmol),將混合物在室溫下攪拌15-20min。然后,一次性加入氮丙啶56(1.5g,7.89mmol)的CH3CN(30mL)溶液。將所得混合物攪拌1h(TLC監測,洗脫劑:己烷-乙酸乙酯,1∶1),倒入水中,用HCl酸化至pH為1,再次在室溫下攪拌。橙色產物逐漸地從渾濁溶液中沉淀出來。將沉淀物過濾,再用MeOH和乙醚洗滌。51的產量:2.15g(83%),為橙色晶體。

N-[2-(3,6-二乙酰基-9H-咔唑-9-基)乙基]-2-硝基苯磺酰胺(52)。

將化合物51(5.0g,12.7mmol)溶于PhNO2(30mL)中。將溶液在冰浴中冷卻。然后加入AlCl3(8.5g,63.7mmol),此后再加入AcCl(4.5mL,63.1mmol)。將混合物保持40min(LC/MS監測),用水稀釋,用氯仿萃取,和蒸發。產物在短厚柱上用硅膠純化,洗脫劑:CH2Cl2-乙酸乙酯100∶0→50∶50。將乙醇和25%氨水(4∶1)的混合物加入到殘余物中。將所得產物回流1.5-2h。將熱的懸浮液濾出。分離得到產物52(4.11g,68%),為米色晶體。

1,1′-[9-(2-氨基乙基)-9H-咔唑-3,6-二基]二乙酮(53)。

將化合物52(4.11g,8.58mmol)在回流下溶于CH3CN(150mL)和甲醇(50mL)的混合物中。然后,加入Cs2CO3(8.4g,25.78mmol)后立即倒入PhSH(2.6mL,25.48mmol)。所得混合物回流2.5h(TLC監測,洗脫劑:氯仿-甲醇,9∶1)后蒸發至干。然后,加入水和HCl溶液。結果,所有的固體產物都溶解了。酸性水溶液用乙酸乙酯萃取直到后者停止變成黃色。水層用飽和NaHCO3溶液中和,用CH2Cl2-MeOH混合物(4∶1)萃取,蒸發萃取液。殘余物用MeCN洗出后,再用乙醚洗滌。53的產量:1.25g(50%),為米色晶體。

1,1′-{9-[2-(異丙基氨基)乙基]-9H-咔唑-3,6-二基}二乙酮(實施例7;6h)。

將丙酮(5mL,68.10mmol)加入到化合物53(1.25g,4.25mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液中。然后加入STAB(3.0g,14.15mmol)。將所獲得的混合物在室溫下攪拌4.5h(TLC監測,洗脫劑:CHCl3-MeOH,9∶1),然后倒入NaHCO3水溶液中。分離有機層。水層用CH2Cl2萃取。產物經Na2SO4干燥后蒸發。殘余物在柱上純化,洗脫劑:CHCl3-MeOH99∶1→90∶10。分離得到實施例7(1.04g,73%),為快速結晶的油狀物。對于其鹽酸鹽的制備,將所述堿溶于CH2Cl2中。然后,加入HCl的二烷溶液。將混合物蒸發至干。產物用乙醚洗滌。

1H?NMR(DMSO-d6)譜:δ1.25(6H,d,J=6.6Hz);2.72(6H,s);3.33-3.39(3H,m);4.87(2H,t,J=7.3Hz);7.92(2H,d,J=8.7Hz);8.17(2H,dd,J=8.7Hz,J=1.6Hz);9.01(2H,d,J=1.6Hz);9.24(1H,br.s);9.33(1H,br.s)。ELSD:100%,ESI-MS:m/z?336[M+H]+。

實施例8

化合物51的合成法描述于實施例7中。

N-{2-[3,6-雙(3-氯丙酰基)-9H-咔唑-9-基]乙基}-2-硝基苯磺酰胺(57)

將化合物51(20.0g,50.6mmol)溶于PhNO2(130mL)中并將溶液在冰浴中冷卻。然后加入AlCl3(34.0g,254.7mmol),此后再加入3-氯丙酰基氯(25.0mL,259.8mmol)。將混合物保持40min(LC/MS監測),倒入稀HCl和冰的混合物中,用CHCl3萃取,并保持16h。將所獲得的草黃色(straw-colored)沉淀物過濾后用乙醚洗滌。57的產量:18.47g(63%)。

N-[2-(3,9-二氧代-1,2,3,9,10,11-六氫-6H-二環戊二烯并[c,g]咔唑-6-基)乙基]-2-硝基苯磺酰胺(58)

將硫酸(200mL)加熱到40℃。然后,分批加入化合物57(18.47g,32.12mmol)。將混合物加熱到90℃并保持在該溫度下達1.5-2h(TLC監測,洗脫劑:CH2Cl2-乙酸乙酯,4∶1)。把所得混合物倒在冰上。將灰色沉淀物濾出,在濾器上用CHCl3-MeOH(4∶1)混合物洗滌。剩下的沉淀物(在濾器上)用DMF重結晶,用CH3CN和乙醚洗滌。純58的產量:2.2g(14%)。

6-(2-氨基乙基)-10,11-二氫-1H-二環戊二烯并[c,g]咔唑-3,9(2H,6H)-二酮(59)

將化合物58(2.2g,4.38mmol)懸浮于氯仿(200mL)和甲醇(200mL)的混合物中。然后加入Cs2CO3(4.3g,13.20mmol),并立即再加入PhSH(1.3mL,12.74mmol)。將溶液回流18h(LC/MS監測)并蒸發至干。然后,加入檸檬酸水溶液。所獲得的溶液用NaHCO3水溶液中和。將沉淀物濾出,用CH3CN和乙醚洗滌。分離出的產物無需純化就可用于下一步驟。

6-[2-(異丙基氨基)乙基]-10,11-二氫-1H-二環戊二烯并[c,g]咔唑-3,9(2H,6H)-二酮(實施例8)

將粗制化合物59(1.69g)懸浮于CH2Cl2(200mL)中。然后加入丙酮(4mL)和STAB(3.4g)。將混合物攪拌24h(TLC監測,洗脫劑:CHCl3-MeOH,9∶1),然后倒入NaHCO3水溶液中。然后,加入另一份CH2Cl2和MeOH。分離有機層,蒸發,用MeCN和乙醚洗滌。實施例8的產量:0.759g。對于鹽酸鹽的制備,將所分離的產物懸浮于CH2Cl2和MeOH的混合物中,然后加入HCl的二烷溶液。所得混合物蒸發至干,將乙醇加入到殘余物中。將乙醇溶液回流和冷卻,沉淀物進行過濾。化合物實施例8鹽酸鹽的產量:0.684g。1H-NMR(DMSO-D6)譜:δ1.24(6H,d,J=6.6Hz);2.77-2.79(4H,m);3.34-3.43(3H,m);3.81-3.84(4H,m);4.91(2H,t,J=7.3Hz);7.83(2H,d,J=8.6Hz);7.91(2H,d,J=8.6Hz);9.11(2H,br.s)。ELSD:100%,ESI-MS:m/z?360[M+H]+。

實施例9

N-乙基-2-硝基苯磺酰胺(63)。

在室溫下,將2-硝基苯磺酰基氯(140g,361mmol)的乙酸乙酯(250mL)溶液滴加到70%乙胺水溶液(50mL,630mmol)、乙酸乙酯(100mL)、Na2CO3(67g,632mmol)和水(250mL)的混合物中。將反應混合物攪拌4h(TLC監測,CH2Cl2)。分離有機層,依次用水、檸檬酸溶液洗滌,用Na2SO4干燥,和蒸發。殘余物固化成白色結晶物質。后者用己烷研磨、濾出和干燥,得到134g(92%)產物。

N-(3-溴丙基)-N-乙基-2-硝基苯磺酰胺(64)。

將化合物63(7.8g,33.9mmol)溶于DMF(100mL)中。加入1,3-二溴丙烷(35mL,343.0mmol),然后分批加入NaH(2.7g,67.5mmol),隨后使溫度升高到50-60℃。將反應混合物在該溫度下攪拌1h(TLC監測,CH2Cl2),小心地倒入冰/水混合物中,用乙酸乙酯萃取。蒸發萃取液。殘余物用己烷洗滌以去除1,3-二溴丙烷。得到化合物64(9.7g,82%),為粘稠的黃色油狀物。

N-[3-(9H-咔唑-9-基)丙基]-N-乙基-2-硝基苯磺酰胺(60)。

將咔唑(4.15g,24.8mmol)和溴化物64(9.7g,27.6mmol)溶于DMF(30mL)中。分批加入NaH(2.0g,50.0mmol,2eq),隨后使溫度升高到60℃。將反應混合物攪拌1h(TLC監測,己烷/乙酸乙酯3∶2),倒入冰/水混合物中,用乙酸乙酯萃取。殘余物用乙醚研磨。將黃色沉淀物濾出后干燥,得到6.65g(61%)產物。

N-{3-[3,6-雙(3-氯丙酰基)-9H-咔唑-9-基]丙基}-N-乙基-2-硝基苯磺酰胺(61)。

將化合物63(6.65g,15.2mmol)溶于PhNO2(70mL)中。所得溶液在冰浴中冷卻。加入AlCl3(12.2g,91.4mmol),然后加入2-氯丙酰基氯(8.8mL,91.4mmol)。將反應混合物保持40min(LC/MS監測),用水稀釋,用CH2Cl2萃取。蒸發萃取液。殘余物在短厚柱中通過色譜法純化(洗脫劑:CH2Cl2/乙酸乙酯0∶100→50∶50)。殘余物用乙醚研磨、濾出和干燥,得到7.60g(81%)帶綠色的結晶產物。

N-[3-(3,9-二氧代-1,2,3,9,10,11-六氫-6H-二環戊二烯并[c,g]咔唑-6-基)丙基]-N-乙基-2-硝基苯磺酰胺(62)。

將H2SO4(110mL)加熱到40℃。分批加入化合物61(7.6g,12.3mmol)。將反應混合物加熱到100℃,在該溫度下保持2h(TLC監測,CH2Cl2/乙酸乙酯4∶1)后倒入冰中。將生成的灰色沉淀物濾出。然后將CHCl3/MeOH?4∶1(500mL)倒入濾器中。將濾器上的固體溶解,所生成的溶液移入分液漏斗內。加入Na2CO3水溶液。分離有機層,用Na2SO4干燥,和蒸發。將乙腈加入到殘余物中。將米色沉淀物濾出,依次用乙腈、乙醚洗滌后干燥,得到1.56g(23%)米色結晶產物。

6-[3-(乙基氨基)丙基]-10,11-二氫-1H-二環戊二烯并[c,g]咔唑-3,9(2H,6H)-二酮(實施例9)。

將化合物62(1.56g,2.86mmol)懸浮于CHCl3(80mL)和MeOH(80mL)的混合物中。加入Cs2CO3(2.8g,8.59mmol),然后馬上加入PhSH(0.87mL,8.53mmol)。將反應混合物回流6h(TLC監測,CHCl3/MeOH?9∶1)并蒸發至干。加入檸檬酸水溶液。所得溶液用NaHCO3的溶液中和。將生成的沉淀物濾出,依次用乙酸乙酯、乙腈、水洗滌、再次用乙腈洗滌,然后用乙醚洗滌,得到0.75g(73%)產物。后者轉化成它的鹽酸鹽。在與4M?HCl的二烷溶液一起蒸發之后,殘余物用MeOH洗滌,得到0.59g鹽酸鹽。1H?NMR(DMSO-d6):δ1.66(3H,t,J=7.3Hz);2.09-2.17(2H,m);2.73-2.77(4H,m);2.86-2.91(2H,m);2.95-3.10(2H,m);3.77-3.80(4H,m);4.70(2H,t,J=7.3Hz);7.80(2H,d,J=8.6Hz);7.89(2H,d,J=8.6Hz);8.83(2H,br.s)。ELSD:100%,ESI-MS:m/z?360[M+H]+。

實施例10和11

化合物46的合成法描述于實施例6中。

6-[2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙基]-1,6-二氫環戊二烯并[c]咔唑-3(2H)-酮(65)。

將咔唑46(0.4g,1.81mmol)溶于CH2Cl2(7mL)中,然后加入NaH(0.22g,5.50mmol)。將混合物在室溫下攪拌5-10min,再加入2-(2-氯乙基)-1-甲基吡咯烷鹽酸鹽(0.4g,2.17mmol)。將混合物加熱到60℃并保持在該溫度下達4h(TLC監測,洗脫劑:CHCl3-MeOH,9∶1)。將所得混合物倒入水中。產物用乙酸乙酯萃取,經Na2SO4干燥,和蒸發。殘余物用乙醚研磨。將沉淀物濾出。65的產量:0.365g(61%)-S-異構體和0.336g(55%)-R-異構體。

9-乙酰基-6-[2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙基]-1,6-二氫環戊二烯并[c]咔唑-3(2H)-酮(實施例10和11)。

將化合物65(0.336g,1.00mmol)溶于PhNO2(7mL)中。所得溶液在冰浴中冷卻。然后,加入AlCl3(0.67g,5.02mmol),此后再加入AcCl(0.36mL,5.04mmol)。將所得混合物保持40min(LC/MS監測),用水稀釋,用NaHCO3水溶液中和,用CHCl3萃取,和蒸發。產物在短厚柱上純化,洗脫劑:100∶0→90∶10。產物的產量:0.307g(82%)(R);類似地得到S-異構體(77%)。

實施例10

1H-NMR(DMSO-D6)譜:δ1.69-1.79(1H,m);1.86-2.01(2H,m);2.07-2.24(2H,m);2.42-2.56(1H,m);2.73(3H,s);2.75(3H,d,J=5.12Hz);2.79-2.82(2H,m);2.96-3.05(1H,m);3.36-3.43(1H,m);3.49-3.57(1H,m);3.64-3.67(2H,m);4.62-4.75(2H,m);7.80(1H,d,J=8.6Hz);7.87(1H,d,J=8.6Hz);7.96(1H,d,J=8.6Hz);8.19(1H,dd,J=8.6Hz,J=1.5Hz);8.70(1H,d,J=1.5Hz);10.63(1H,br.s)。ELSD:100%,ESI-MS:m/z?374[M+H]+。

實施例11

1H-NMR(DMSO-D6):δ1.69-1.79(1H,m);1.86-2.01(2H,m);2.05-2.24(2H,m);2.40-2.46(1H,m);2.73(3H,s);2.75(3H,d,J=5.12Hz);2.79-2.82(2H,m);2.98-3.02(1H,m);3.36-3.43(1H,m);3.47-3.57(1H,m);3.63-3.66(2H,m);4.62-4.75(2H,m);7.80(1H,d,J=8.6Hz);7.87(1H,d,J=8.6Hz);7.96(1H,d,J=8.8Hz);8.18(1H,dd,J=8.8Hz,J=1.4Hz);8.69(1H,d,J=1.4Hz);10.72(1H,br.s)。ELSD:100%,ESI-MS:m/z?374[M+H]+。

實施例50的合成法

步驟1.4-羥基茚滿-1-酮(86)

在150℃,將色滿酮85(100g,0.68mol)滴加到150g?NaCl和500g?AlCl3的混合物中。將所得混合物加熱到180℃,然后攪拌8h。然后將混合物冷卻至室溫,并在充分攪拌下加入1kg碎冰。在勻化之后,將混合物過濾,用1L冷水洗滌后干燥,得到約80g(80%)4-羥基茚滿-1-酮(86),為灰色固體。

步驟2.三氟甲烷磺酸1-氧代-2,3-二氫-1H-茚-4-基酯(87)

在0℃,將三氟甲磺酸酐(152g,0.54mol)滴加到80g化合物86和60g?NEt3在1L?CH2Cl2中的溶液中。所得混合物回流2h,冷卻至室溫,過濾,用水(0.5L)、檸檬酸水溶液(50g/0.5L)、鹽水(0.5L)洗滌,在Na2SO4上干燥,和蒸發,得到約100g(67%)化合物87,為深色液體。

步驟3.4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)茚滿-1-酮(88)

將由乙酸鉀(48g,0.5mol,1.5eq)、三氟甲磺酸酯87(100g,0.36mol,1.1eq)、雙(頻哪基)二硼烷(bis(pinacolo)diborane)(100g,0.38mol,1.2eq)、PPh3(5g,0.02mol,0.06eq)和PdCl2(PPh3)2(6.9g,0.01mol,0.03eq)與脫氣甲苯(2L)組成的混合物在氬氣氛下回流過夜。所得混合物蒸發至干后經色譜純化(用EtOAc/己烷(1/5)洗脫)。收集含有所需產物的流分并蒸發,得到約50g(57%)化合物88,為淺黃色固體。

步驟4.4-(2-硝基苯基)-茚滿-1-酮(89)

將脫氣甲苯(0.5L)、硼雜環戊烷(borolan)88(10g,39mmol)、2-氯-1-硝基苯(6.3g,40mmol)、Pd(PPh3)4(3g,2.6mmol)和2M?Na2CO3(200mL)在氬氣的快速流中混合,所得混合物回流過夜。加入水(200mL)和EtOAc(500mL)。分離水層,用EtOAc(2x500mL)萃取,合并的萃取液經Na2SO4干燥。減壓蒸發溶劑,粗產物通過柱色譜法純化(20%EtOAc/己烷),得到9g(91%)聯苯中間體89,為黃色固體。

步驟5.1,2-二氫-6H-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮(90)

將聯苯89(9g,35mmol)和亞磷酸三乙酯加入到密封的彈狀容器(sealed?bomb)中,在120℃下加熱過夜。在冷卻至室溫之后,將混合物過濾,得到4g?1,2-二氫-6H-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮。用乙醚沉淀后另外得到2g所需產物。90作為黃色粉末的總收率為77.5%。

步驟6.9-乙酰基-1,2-二氫-6H-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮(91)

將1,2-二氫-6H-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮90(6g,27.1mmol)懸浮于無水CH2Cl2(100mL)中。在冰浴上邊攪拌邊加入無水AlCl3(6g,45mmol),然后滴加AcCl(2.4mL,33.2mmoL)。將反應混合物在5℃左右攪拌24h,再倒入冰水中。將析出的灰色固體濾出,用水(2x100mL)、丙酮(3x50mL)、乙醚(3x50mL)洗滌,得到4g(56.3%)9-乙酰基-1,2-二氫-6H-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮91。

步驟7.9-乙酰基-1,2-二氫-6-(2-溴乙基)-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮(92)

將NaH(2g,60%,50mmol)加入到化合物91(4g,15.2mmol)的無水DMF(100mL)懸浮液中,將混合物在室溫下攪拌約1h直到氫氣的放出停止。在氮氣氛下滴加1,2-二溴甲烷(1,2-dibromethane)(20g,106mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌30min,然后在60℃下攪拌24h,再倒入冰水(300mL)中。將析出的灰色固體濾出,粗產物通過柱色譜法純化(CHCl3),得到2g起始材料和約1g(2.7mmol,35.5%,自轉化的材料)烷基化咔唑92,為乳白色固體。

步驟8.9-乙酰基-1,2-二氫-6-(2-(2-丙基)氨基乙基a)-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮鹽酸鹽(實施例50)

將溴化物92(1g,2.7mmol)和2-丙胺加入到密封的彈狀容器中并在180℃下加熱過夜。在冷卻至室溫之后,將混合物蒸發至干,殘余物用100ml飽和碳酸氫鈉水溶液處理后過濾。濾餅通過柱色譜法純化(CHCl3/MeOH?10/1)。把含有所需產物的流分收集起來,蒸發至干,用40%HCl水溶液(10mL)稀釋,蒸發至干,再與甲苯(2x100mL)一起重新蒸發,得到200mg(0.52mmol,19%)9-乙酰基-1,2-二氫-6-(2-(2-丙基)氨基乙基)-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮鹽酸鹽(實施例50),為灰色固體。

1H-NMR(DMSO-d6):1.23d(6H),2.74s(3H),2.83m(2H),3.67m(2H),4.87m(2H),7.85dd(2H),7.97d(1H),8.22d(1H),8.71s(1H),8.9-9.2寬s(2H).

實施例51的合成法

步驟1.9-(3-二甲基氨基丙基)-咔唑(2b)

在氬氣氛下,將NaH(14.4g,60%,360mmol)分批加入到咔唑1(20g,119.8mmol)的無水DMF(200mL)懸浮液中。將混合物在室溫下攪拌約1h直到氫氣的放出停止。在室溫下分批加入3-二甲基氨基丙基氯鹽酸鹽(28g,180mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌20min,然后在60℃下攪拌3小時,再倒入冷水(500mL)中。產物用EtOAc(2x500mL)萃取。有機層用10%HCl(200mL)反萃取,酸性層用EtOAc萃取以去除未反應的咔唑。加入飽和氨(200mL),產物再次用EtOAc萃取。蒸發溶劑,得到25g(99mmol,83%)9-(2-二甲基氨基丙基)咔唑2b,為褐色油狀物。

步驟2.3,6-二(4-氯丙-2-酮-基)-9-(2-二甲基氨基丙基)咔唑(93)

將9-(2-二甲基氨基丙基)咔唑2b(25g,99mmol)溶于無水CH2Cl2(150mL)中。在攪拌和冷卻下,在冰浴中分批加入無水AlCl3(40g,300mmol)。滴加3-氯-丙酰基氯(30mL,312mmol),同時保持內部溫度低于5℃。將反應混合物在該溫度下攪拌過夜,倒入碎冰中并用CHCl3/MeOH?1/1(3x500mL)萃取。將萃取液蒸發至干,所得綠色油狀物用乙醚(2x250mL)研磨,得到20g(46mmol,47%)3,6-二(3-氯丙酰基)-9-(2-二甲基氨基丙基)-咔唑93,為灰色粉末。

步驟3.6-(3-二甲基氨基丙基)-1,2,10,11-四氫-6H-雙(環戊二烯并[c]咔唑-3,9-二酮(實施例51)

在室溫下,邊攪拌邊將3,6-二-(3-氯丙酰基)-9-(2-二甲基氨基丙基)咔唑93(20g,46mmol)分批加入到三氟甲烷磺酸(100g)中,將反應混合物加熱到95℃過夜。在冷卻至室溫之后,將反應混合物倒入冰水中。將沉淀物濾出,用飽和碳酸氫鈉處理,再次濾出。所得濾餅含有約80%所需產物和20%異構體。在用甲醇單結晶之后,沉淀物用4NHCl/二烷(100ml)后處理,蒸發至干,再用EtOH重結晶,得到約2.8g(7.1mmol,15.4%)95%實施例51,為白色固體。

LCMS:100%;1H-NMR(DMSO-d6)95%:2.18m(2H),2.71s(6H),2.78m(4H),3.15m(2H),3.83m(4H),4.68m(2H),7.85dd(4H),10.0br?s(1H).

實施例15和17的替代合成法及實施例20的合成法

除非另有說明,否則試劑和溶劑按照從商業供應商購得時的原樣使用。質子核磁共振譜在Bruker?ARX?400光譜儀(400MHz)上獲得。用溶劑峰作為質子譜的參比峰。反應進程通過TLC或/和LC-MS分析來控制。

9-(2-二乙基氨基乙基)-咔唑(68)

在氬氣氛下,將NaH(14.4g,60%,360mmol,3eq)分批加入到咔唑(1)(20g,119.8mmol,1eq)的無水DMF(200mL)懸浮液中。將混合物在室溫下攪拌30min直到氫氣的放出停止。在室溫下分批加入2-二乙基氨基乙基氯鹽酸鹽(31g,180mmol,1.5eq)。將反應混合物在室溫下攪拌20min,然后在60℃下攪拌3小時(TLC監測),再倒入冷水(1L)中。產物用EtOAc(5x200mL)萃取;有機層用10%HCl(400mL)反萃取,酸性層用EtOAc萃取以去除未反應的咔唑。用K2CO3把水層的pH調到9左右,產物再次用EtOAc萃取。蒸發溶劑,得到29.5g(93%)9-(2-二乙基氨基乙基)咔唑(68),為褐色油狀物。

3,6-二(4-氯丙-2-酮-基)-9-(2-二乙基氨基乙基)咔唑鹽酸鹽(69)

將9-(2-二乙基氨基乙基)咔唑(68)(17.9g,67.3mmol,1eq)溶于無水二氯甲烷(150mL)中。在冰浴中,在攪拌和冷卻下分批加入無水AlCl3(45g,337mmol,5eq)。滴加3-氯-丙酰基氯(32.4mL,337mmol,5eq),同時保持內部溫度低于5℃。將反應混合物在該溫度下攪拌15h,倒入冷3%HCl(應當避免急劇起泡沫)后用CHCl3(5x500mL)萃取。蒸發萃取液,所得的綠色油狀物用乙醚(5x50mL)研磨,得到24g(74%)3,6-二(3-氯丙酰基)-9-(2-二乙基氨基乙基)-咔唑鹽酸鹽(69),為深灰色固體。

1H-NMR(DMSO-d6):1.27(t,6H),2.72(q,4H),3.75(m,6H),4.02(m,4H),5.00(t,2H),8.00(d,2H),8.17(d,2H),9.16(s.2H),11.42(s,1H).

6-(3-二乙基氨基乙基)-1,2,10,11-四氫-6H-雙(環戊二烯并[c]咔唑-3,9-二酮(70)

在室溫、攪拌下,將3,6-二-(3-氯丙酰基)-9-(2-二乙基氨基乙基)咔唑鹽酸鹽(69)(5g,10.33mmol,1eq)分批加入到三氟甲烷磺酸(50g,333mmol,32eq)中,將反應混合物加熱到95℃過夜。在冷卻至室溫之后,將反應混合物倒入冰水中。用10%NaOH把水溶液的pH調到9,產物用EtOAc/THF=3/1混合物萃取。將溶劑蒸發出來,粗產物通過柱色譜法純化(10%EtOH/EtOAc),得到1.12g(29%)純的中間體70,為白色固體。

MS(ESI):m/z=375.3[M+H]+;1H-NMR(DMSO-d6):0.70(t,6H),2.41(q,4H),2.68(m,6H),3.73(m,4H),4.55(t,2H),7.77(s,4H).

實施例15

將中間體70(1.12g,2.99mmol,1eq)溶于CH2Cl2(20mL)中,加入10%HCl的乙醇溶液(3.4g,93.15mmol,30eq),引起大量沉淀物的生成。減壓蒸發溶劑,殘余物用熱MeOH研磨,得到1.17g(98%)實施例15,為灰白色固體。

純度:97.3%(通過HPLC);MS(ESI):m/z=375.3[M-HCl+H]+;m.p.=312.1-314.7℃。

實施例17和20用相同的方法制備,但使用適當的氯胺即(CH3)2CH-NH-CH2CH2-Cl或(C2H5)NHCH2CH2-Cl。

實施例7(化合物6h)的替代合成法

實驗部分

除非另有說明,否則試劑和溶劑按照從商業供應商購買時的原樣使用。質子核磁共振譜在Bruker?ARX?400光譜儀(400MHz)上獲得。用溶劑峰作為質子譜的參比峰。TLC在硅膠上運行,除非另有說明。

3,6-二乙酰基咔唑(4)

在氬氣氛下,將咔唑(20g,0.12mol,1eq)懸浮于無水CH2Cl2(300mL)中,使所得混合物冷卻至0℃。將AlCl3(95.5g,0.72mol,6eq)加入到混合物中,然后再滴加乙酰氯(25.5mL,0.36mol,3eq),同時保持內部溫度在0℃左右。在0℃攪拌3小時之后,加入另一份乙酰氯(5mL,0.07mol,0.6eq),繼續再攪拌2小時。

邊攪拌邊將反應混合物倒入冰中。固體經過濾收集起來,依次用CH2Cl2、水洗滌,在真空爐中于50℃干燥,得到16.3g(54%)咔唑4。把濾液和洗滌液合并后用CH2Cl2(3×300mL)萃取。CH2Cl2萃取液用飽和NaHCO3(1×300mL)和鹽水(1×300mL)洗滌。在經Na2SO4干燥之后,把濾液蒸發至干,得到粗產物,其無需進一步純化就可直接使用。

MS(ESI):m/z=252.0[M+H]+

2-N-Boc-2-N-異丙基氨基乙醇(14)

將(Boc)2O(50.8g,0.23mol,2eq)加入到2-N-異丙基氨基乙醇(72)(22.3mL,70%,0.136mol)的MeOH(200mL)溶液中。將反應混合物在環境溫度下攪拌4小時,然后用水(1.2L)稀釋,產物用EtOAc(4×400mL)萃取。合并的EtOAc萃取液用鹽水(1×400mL)洗滌后經Na2SO4干燥。將溶劑蒸發出來,粗產物通過柱純化(洗脫劑:己烷∶EtOAc,4∶1-1∶1),得到19.5g(收率70.5%)純的73,為粘稠油狀物。

3-異丙基-2-唑烷酮(74)

在劇烈攪拌下,將MsCl(8.5mL,0.109mol)滴加到冷卻至-20℃的醇(73)(18.5g,0.091mol)和TEA(19mL,0.137mol)在無水THF(200mL)中的溶液中。讓反應物慢慢地升溫到環境溫度(3小時)。通過過濾取出固體并用THF(20mL)洗滌。將飽和Na2CO3(100mL)加入到濾液中,所得混合物在環境溫度下攪拌過夜,然后用水(200mL)稀釋并用EtOAc(3×200mL)萃取。合并的EtOAc萃取液用1%HCl(1×200mL)、鹽水(1×200mL)洗滌,經Na2SO4干燥。將溶劑蒸發出來,得到8.8g(收率75%)環狀氨基甲酸酯(74),其無需進一步純化就可直接使用。

MS(ESI):m/z=130.1[M+H]+

3,6-二乙酰基-9-(2-N-異丙基(isopopyl)氨基乙基)-咔唑(71)

將3,6-二乙酰基咔唑(4)(15.12g,0.06mol)、3-異丙基-2-唑烷酮(74)(7.80g,0.06mol)、Cs2CO3(39.2g,0.12mol)和DBU(9mL,0.06mol)在NMP(150mL)中的混合物在190℃下攪拌24小時,然后倒入H2O(500mL)中并用EtOAc(3×300mL)萃取。合并的EtOAc萃取液用鹽水(2×200mL)洗滌后經Na2SO4干燥。蒸發溶劑,粗產物通過柱色譜法純化(洗脫劑-(5-20%)MeOH(含有0.1%的NH3H2O)/EtOAc)。第一流分含有未反應的起始材料(~1.7g)。把純流分合并,溶劑蒸發至干,得到9.36g(含有20%EtOAc,通過NMR)純的(71)。把較少的純流分合并,蒸發至干,殘余物用EtOAc研磨,另外得到3.47g純產物。總收率-54.5%(在減去EtOAc的量之后);(收率61.6%,基于反應的起始材料)。

MS(ESI):m/z=337.1[M+H]+

化合物6h

將中間體(71)(3.47g,0.0103mol)溶于CH2Cl2(30mL)中,所得溶液冷卻至5℃左右。邊攪拌邊滴加10%HCl/EtOH溶液(5.6g,0.0153mol)。在40分鐘之后,真空去除溶劑,殘余物在高真空下于40℃干燥,得到3.5g(收率93%)6h。同樣地,將71的另一批(9.36g,20%EtOAc)轉化成6h。

分析數據:純度:99.5%(通過HPLC);MS(ESI):m/z=337.3[M-HCl+H]+;m.p.=292.7-294.1℃。

實施例4的替代合成法

步驟1.4-羥基-1-茚滿酮(76)如下合成:通過氯化鋁誘發的二氫香豆素(75)的再環化,按照Org.Lett.,2007,9(15),p.2915-2918。在100g(75)上進行反應,得到(76),收率85%。

步驟2.茚滿酮(76)如下轉化成三氟甲磺酸酯(77)(收率90%):使茚滿酮(76)與三氟甲磺酸酐在Py存在下在CH2Cl2中反應,然后通過快速色譜法純化。

步驟3.三氟甲磺酸酯(79)按同樣的方法合成(定量收率),只是從50g?4-甲氧基-2-硝基苯酚(78)開始。

步驟4和5.根據聯苯化合物的一鍋合成法(one-pot?synthesis)中的方案(Synthetic?Communications,2006,36,p.3809-3820),從60g三氟甲磺酸酯(77)開始,得到中間體(81),收率80%。

步驟6.首先小規模地進行聯苯中間體(81)的環化,即與過量的三苯基膦的1,2-二氯苯溶液一起加熱,在反應混合物用乙醚沉淀后得到預期的咔唑(82)(收率~50%,未優化)。相同的反應擴大規模到42g(81),從而得到27g(收率73%)純的(82)。

步驟7.按照標準方案,在CH2Cl2中進行中間體(82)的乙酰化(27.8g規模),得到26g(收率80%)中間體(83)。

步驟8.在用EtOAc/THF的1∶1混合物徹底萃取之后,得到粗產物(84),收率約68%,含有基線雜質(通過TLC)。粗產物(84)無需進一步純化就可直接用于脫甲基步驟。

步驟9.將底物(substrate)在Py*HCl/NMP的1∶1混合物中于190℃加熱10h,完成從(84)脫去甲基。在通過柱色譜法純化之后得到7.8g(收率37%)實施例4(游離堿),再用10%HCl的EtOH溶液處理后得到8.4g純的實施例4。

實驗部分

除非另有說明,否則試劑和溶劑按照從商業供應商購買時的原樣使用。質子核磁共振譜在Bruker?ARX?400光譜儀(400MHz)上獲得。用溶劑峰作為質子譜的參比峰。反應進程通過TLC或/和LCMS分析來控制。

4-羥基-1-茚滿酮(76)

將無水氯化鋁(550g,4.135mol,4eq)和氯化鈉(105g,1.795mol,2.7eq)混合并加熱到150℃。慢慢地加入二氫香豆素(75)(100g,675.7mol,1eq),同時保持內部溫度介于150-160℃之間。在加入之后,把溫度升高到200℃,將反應混合物攪拌1.5h,趁熱倒入瓷皿內冷卻。把固化物質弄碎后加入到劇烈攪拌的冰水混合物(4L)(含有400mL濃HCl)。將所得懸浮液攪拌1h、過濾、用水洗滌和干燥,得到85g(85%)粗制4-羥基-1-茚滿酮(76),為灰色固體。它足夠純可直接用于下一步驟。

三氟甲烷磺酸1-氧代茚滿-4-基酯(77)

將三氟甲烷磺酸酐(72.3mL,429.7mmol,1.2eq)加入到4-羥基-1-茚滿酮(77)(53g,358.1mmol,1eq)在無水CH2Cl2(450mL)和吡啶(87mL,1074mmol,3eq)中的懸浮液中,同時保持內部溫度低于5℃。使反應混合物升溫到室溫并繼續攪拌1h。將CH2Cl2(300mL)和水(100mL)加入到反應混合物中,分離有機層,依次用2%HCl溶液(3x100mL)和飽和NaHCO3(2x100mL)洗滌,然后經Na2SO4干燥。將CH2Cl2蒸發出來,粗產物通過快速色譜法純化(5%~10%EtOAc/己烷),得到90g(90%)純的77,為褐色液體。

1H-NMR(DMSO-d6):2.76(t,2H),3.19(t,2H),7.65(dd,1H),7.94(2d,2H).

三氟甲烷磺酸4-甲氧基-2-硝基苯基酯(78)

將三氟甲烷磺酸酐(60mL,350mmol,1.2eq)加入到4-甲氧基-2-硝基苯酚(78)(50.57g,298.9mmol,1eq)在無水CH2Cl2(550mL)和吡啶(72.5mL,897mmol,3eq)中的溶液中,同時保持內部溫度低于5℃。使反應混合物升溫至室溫并攪拌過夜。將水(100mL)加入到反應混合物中,分離有機層,依次用7%HCl溶液、飽和NaHCO3溶液洗滌,經Na2SO4干燥。CH2Cl2溶液通過SiO2墊過濾,真空下去除溶劑,得到89g(99%)純三氟甲磺酸酯79,為淡黃色液體。

1H-NMR(DMSO-d6):3.92(s,3H),7.49(dd,1H),7.71(d,1H),7.81(d,1H).

4-(4-甲氧基-2-硝基苯基)-茚滿-1-酮(81)

將由乙酸鉀(29.44g,0.3mol,1.5eq)、三氟甲磺酸酯(77)(61.44g,0.22mol,1.1eq)、雙(頻哪基)二硼烷(60.94g,0.24mol,1.2eq)、PPh3(3.15g,0.012mol,0.06eq)和PdCl2(PPh3)2(4.21g,0.006mol,0.03eq)與脫氣甲苯(2L)組成的混合物在氬氣氛下回流過夜。在氬氣的快速流動下,將三氟甲磺酸酯(79)(60.24g,0.2mol,1eq)、Pd(PPh3)4(11.55g,0.01mol,0.05eq)和2M?Na2CO3(800mL)連續地加入到同一燒瓶中,所得溶液回流過夜。加入水(200mL)和EtOAc(500mL),分離出水層并用EtOAc(2x500mL)萃取,合并的萃取液經Na2SO4干燥。減壓蒸發溶劑,粗產物通過柱色譜法純化(20%EtOAc/己烷),得到44g(80%)聯苯中間體(81),為黃色固體。

8-甲氧基-1,2-二氫-6H-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮(82)

4-(4-甲氧基-2-硝基苯基)-茚滿-1-酮(81)(42g,148.4mmol,1eq)和三苯基膦(116g,445mmol,3eq)在鄰二氯苯(400mL)中的溶液在劇烈攪拌下回流4h,然后冷卻至0℃。加入乙醚(4L),濾出沉淀物,用乙醚(3x100mL)洗滌后干燥,得到17g(46%)(82)。蒸發出濾液,殘余物用冷MeOH(5x100ml)洗滌,另外得到10g(27%)咔唑(82)。總產量為27g(73%)。

1H-NMR(DMSO-d6):2.74(m,2H),3.50(m,2H),3.88(s,3H),6.90(d,1H),7.08(s,1H),7.47(d,1H),7.58(d,1H),7.97(d,1H),11.79(s,1H).

9-乙酰基-8-甲氧基-1,2-二氫-6H-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮(83)

將8-甲氧基-1,2-二氫-6H-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮(82)(27.8g,110.8mmol,1eq)溶于無水二氯甲烷(300mL)中。在攪拌和冷卻下分批加入無水AlCl3(29.5g,221.5mmol,2eq),再滴加AcCl(24mL,332.4mmol,3eq)。將反應混合物在約5℃下攪拌24h后倒入冰水中(應當避免急劇起泡沫)。將析出的橙色固體濾出,用水(10x100mL)、CH2Cl2(3x50mL)、丙酮(3x50mL)洗滌,得到26g(80%)9-乙酰基-8-甲氧基-1,2-二氫-6H-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮(83)。

9-乙酰基-8-甲氧基-1,2-二氫-6-(3-二甲基氨基丙基)-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮(84)

將NaH(6.88g,60%,171.95mmol,2.5eq)加入到9-乙酰基-8-甲氧基-1,2-二氫-6H-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮(83)(26g,68.78mmol,1eq)的無水CH2Cl2(300mL)懸浮液中,并將混合物在室溫下攪拌20-30min直到氫氣的放出停止。在氮氣氛下分批加入3-二甲基氨基丙基氯鹽酸鹽(16.3g,103.16mmol,1.5eq)。將反應混合物在室溫下攪拌30min,然后在60℃下攪拌24h,再倒入冰水(4L)中。水溶液用濃HCl酸化至pH約為2,未反應的起始材料用EtOAc/THF=3/1混合物萃取。在將水層的pH調到9左右時,產物用1∶1EtOAc∶THF混合物(10x500mL)萃取。合并的萃取液用鹽水洗滌,經Na2SO4干燥,蒸發出溶劑,得到22g(68%)粗制咔唑(84),為相當純的(通過LC/MS)。其無需進一步純化就可用于下一步驟。

1H-NMR(DMSO-d6):1.88(t,2H),2.13(s,6H),2.16(t,2H),2.62(s,3H),2.75(m,2H),3.47(m,2H),4.01(s,3H),4.52(t,2H),7.32(s,2H),7.65(dd,4H),8.32(s,2H).

9-乙酰基-8-羥基-1,2-二氫-6-(3-二甲基氨基丙基)-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮

將9-乙酰基-8-甲氧基-1,2-二氫-6-(3-二甲基氨基丙基)-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮(84)(22g,58.2mmol,1eq)和吡啶鹽酸鹽(134.4g,1164mmol,20eq)的NMP(150mL)溶液回流10h。反應混合物冷卻至室溫后倒入10%K2CO3水溶液(3L)中。將析出的暗綠色固體濾出,用水(5x100mL)洗滌后干燥。粗產物通過柱色譜法純化(洗脫劑10%-20%MeOH/EtOAc),得到7.81(37%)純的9-乙酰基-8-羥基-1,2-二氫-6-(3-二甲基氨基丙基)-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮,為淡黃色固體。

MS(ESI):m/z=363.3[M+H]+

NMR?1H(DMSO):1.86(t,2H),2.17(s,6H),2.20(t,2H),2.79(m,2H),2.81(s,3H),3.52(m,2H),4.43(t,2H),7.15(s,2H),7.66(dd,4H),8.50(s,2H),12.71(s,1H).

實施例4

將9-乙酰基-8-羥基-1,2-二氫-6-(3-二甲基氨基丙基)-環戊二烯并[c]咔唑-3-酮(7.81g,21.46mmol,1eq)溶于水(20mL)和10%HCl溶液(20mL)與乙醇(200mL)的混合物中,均質溶液蒸發至干。殘余物真空下干燥過夜,得到8.47g實施例4,為灰色固體。

純度:99.2%(通過HPLC);MS(ESI):m/z=363.3[M-HCl+H]+;m.p.=241.3℃(分解);1H-NMR(DMSO-d6):2.15t(2H),2.68s(3H),2.69s(3H),2.80m(2H),2.82s(3H),3.11m(2H),3.55m(2H),4.53t(2H),7.29s(2H),7.73dd(4H),8.52s(2H),11.00s(1H),12.76s(1H).

結構式(II)化合物按與結構式(I)化合物類似的方法制備并且包括例如,

另外的本發明的咔唑化合物是:

可用于本發明方法的化合物具有以下結構:

另外的實施例具有結構式(I)包括但不限于:

本發明的化合物因此包括但不限于:

咔唑化合物的功效通過測定化合物激活p53的能力來確定。具體地說,用p53應答性螢光素酶報道細胞系來鑒定能夠激活p53的化合物。p53的活化報告為EC50值,EC50值是增加p53活性超過基線p53活性50%所需要的化合物的有效濃度。

用于確定EC50值的p53活化測定如下進行:

定義和術語

ConALuc:p53應答性螢光素酶報道構建體

DMSO:二甲基亞砜

FBS:胎牛血清

設備

96孔發光計-熒光掃描(例如Fluoroscan,LabSystems,Inc,設定程序,積分時間為0.1秒,PMT電壓為1000,零滯后時間)

多道移液管50-300uL范圍

96孔板

材料

報道細胞系:

HT1080-L(含ConALuc報道基因的人纖維肉瘤細胞)

RCC45ConALuc(含ConALuc報道基因的人腎細胞癌細胞系)

標準DMEM培養基

標準RPMI培養基

青霉素/鏈霉素100x

胰蛋白酶-EDTA?10x-用無菌PBS稀釋到1X

PBS

Bright-Glo螢光素酶測定系統(Fisher?PR-E2620)

9-氨基吖啶(9aa)20mM/DMSO(Sigma?A38401),p53激活劑(陽性對照)

化合物10020mM/DMSO(Chembridge),p53激活劑(陽性對照)

DMSO(Fisher?D128-500)(陰性對照)

方法

1.使用兩種標準細胞類型,或為HT1080-L細胞或為RCC45ConALuc細胞。這兩種細胞系均穩定地表達p53應答性螢光素酶報道基因構建體。

2.讓HT1080-L細胞生長在含有10%FBS的DMEM培養基中。讓RCC45ConALuc細胞生長在含有10%FBS的RPMI培養基(必要時可以加入青霉素/鏈霉素至終濃度為1%)中。讓這兩種細胞系均生長在濕潤培養箱(37℃,5%CO2)中。對于正常培養,這兩種細胞系均用1X胰蛋白酶-EDTA按1∶20(對于HT1080-L細胞)和1∶5(對于RCC45ConALuc細胞)的比率每3-4天進行分傳(split)(當細胞為80-90%匯合時)。

3.實驗前一天,所述細胞在1X胰蛋白酶(tripsin)/EDTA溶液中進行胰蛋白酶消化約5分鐘(在37℃培養箱中),然后接種到96孔板。HT1080-L細胞按密度為1X104/孔接種到標準DMEM培養基中,體積為50μl。RCC45ConALuc按密度為2X104/孔、體積為50uL接種到標準RPMI培養基中。

4.第二天,用標準DMEM培養基稀釋貯液來制備不同的咔唑化合物,使得細胞用下表1的最終化合物濃度處理。貯液用DMSO制得。典型地,將化學藥品制成20mM貯液。然而,這種濃度取決于給定化合物的溶解度,因此實驗時要注意實際貯液濃度(例如溶解度較小的化合物的貯液濃度可以是5mM或10mM)。

5.每一種被測化合物用了96孔板中的兩行,因此4種化合物(例如W,X,Y,Z)可以在一個板中同時進行試驗。除了試驗化合物之外,每個板還包括陽性對照和陰性對照。用9aa作為陽性對照,劑量為3μM。用DMSO作為陰性對照,終濃度為0.1%。

表1.實驗板與化學藥品終濃度的方案

1.把加到板中的化學藥品稀釋液在標準DMEM中制成2X濃度,然后按體積為50μl加到相應孔中。

2.化學藥品在標準DMEM中按兩倍系列稀釋度從40μM開始稀釋(最高濃度的2X,例如20μM)。對于一個細胞系,最小體積是125μL的每種濃度的化學藥品在標準DMEM中的2X工作液。

3.除了在每個板中以一個濃度加入的陽性對照之外,還在每個篩選階段,在全部濃度范圍內進行的每個測定中加入了陽性對照化合物100或活性最高的化合物,以確保既正確又穩健的測定性能(在操作中通過比較p53活化的劑量反應曲線來估計)。

4.化合物加入后16小時,用顯微鏡檢查所有具有最高化合物濃度的孔中毒性效應的存在,因為由化合物引起的細胞死亡導致不能檢出螢光素酶活性。如果細胞毒性明顯,則檢查相同化合物的其它劑量中毒性的存在。記錄引起毒性效應的最低劑量。假如在3-4個最低化合物劑量都觀察到細胞毒性(在當前的劑量方案,在0.3uM和0.3uM以下),那么所述化合物在較低濃度范圍內重新進行獨立測試,使得至少4個兩倍不同劑量的待測化合物沒有細胞毒性征兆)。

5.在顯微鏡檢查之后,向各孔中加入15μl?Bright?Glo螢光素酶測定系統,在室溫孵育5分鐘后,在96孔板發光計上讀板,測量時間為0.1秒。在測量之前包括一個振蕩步驟。

6.把每種化學藥品濃度的所測螢光素酶活性除以同一板上DMSO對照的螢光素酶活性平均值,計算出每種化學藥品的每種濃度的螢光素酶活化倍數。然后,把倍數對化學藥品的濃度作圖以確定化合物是否有活性。根據數據,確定最大活化倍數和Emax(引起最大p53活化的濃度)。

7.對于每一種化合物,這種測定都另外重復兩次。一旦完成三次測定,就用原始數據計算出EC50值。

當滿足下列條件時,認為測定無效:

多于10%的讀數中兩個重復之間的差異上升了10%;

觀察到DMSO處理的細胞死亡;

用陽性對照(化合物3a,0.4uM)處理的細胞中螢光素酶誘導相對于DMSO處理的細胞的螢光素酶活性小于3倍;

用陽性對照(例如化合物100,0.03-20uM)無法獲得螢光素酶誘導的劑量依賴性曲線。

下面是用于本發明方法的各種咔唑化合物EC50值的非限制性實例:

??化合物
??EC50值(p53活化,μM)
??化合物100
??1.30
??實施例21
??0.83
??實施例22
??0.53
??化合物3a
??0.29
??化合物3b
??0.49
??化合物7d
??0.64
??實施例23
??0.88
??實施例24
??0.78
??實施例25
??0.88
??實施例2
??0.64
??實施例27
??0.54
??實施例15
??0.03
??化合物19a
??0.40
??化合物3e
??0.78
??實施例7
??0.37

??實施例4
??0.07
??化合物18c-1
??0.08
??化合物18c-2
??0.10
??化合物19e
??0.07
??實施例13
??0.22
??實施例14
??0.05
??實施例6
??0.24
??實施例17
??0.04
??實施例18
??0.09
??實施例38
??0.12

本發明的化合物和藥物組合物包括其中活性成分按治療有效量給予能達到其預定目的的那些化合物和藥物組合物。“治療有效量”是指本發明咔唑化合物導致達到所需效果的量。所述咔唑化合物的毒性和治療功效可以用標準藥學程序在細胞培養物或實驗動物中測得,例如,測定LD50(使50%群體死亡的劑量)和ED50(使50%群體治療上有效的劑量)。毒性效應和治療效應間的劑量比就是治療指數,其表示為LD50和ED50之比值。優選顯示高治療指數的化合物。由這樣的數據所獲得的數據可用來制定人用劑量范圍。劑量優選在循環化合物濃度的范圍之內,包括沒有或幾乎沒有毒性的ED50。劑量可以在該范圍內變化,取決于所用的劑型和所用的給藥途徑。治療有效量的測定是在本領域技術人員的能力范圍之內,尤其根據本文提供的詳細公開內容。

治療應用中所需結構式(I)或(II)咔唑化合物的治療有效量視待治療疾病的性質、活性所需要的時間長短、患者年齡和身體狀況的不同而異,最終由主治醫師來判定。劑量和間隔可作個性化調整以提供足以維持所需治療效果的咔唑化合物的血漿水平。所需劑量可適宜以單劑量給予,或以多劑量按適當的間隔給予,例如,每天1、2、3、4或更多次分次劑量。通常需要或者要求多劑量。例如,本發明的咔唑化合物可以按以下頻率給予:每隔4天每天用藥4次為一個劑量(q4d?x4);每隔3天每天用藥4次為一個劑量(q3d?x?4);每隔5天每天用藥一次(qd?x?5);每周用藥一次持續3周(qwk3);每天用藥5次,停藥2天,再每天用藥5次(5/2/5);或者,根據實際情況確定任何適宜的劑量方案。

含有結構式(I)或(II)咔唑化合物的組合物、或含有它們的組合物的劑量可以是約1ng/kg至約200mg/kg、約1μg/kg至約100mg/kg或約1mg/kg至約50mg/kg。組合物的劑量可以是任何劑量,包括但不限于約1μg/kg。組合物的劑量可能是任何劑量,包括但不限于約1μg/kg、10μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、100μg/kg、125μg/kg、150μg/kg、175μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、425μg/kg、450μg/kg、475μg/kg、500μg/kg、525μg/kg、550μg/kg、575μg/kg、600μg/kg、625μg/kg、650μg/kg、675μg/kg、700μg/kg、725μg/kg、750μg/kg、775μg/kg、800μg/kg、825μg/kg、850μg/kg、875μg/kg、900μg/kg、925μg/kg、950μg/kg、975μg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg或200mg/kg。上述劑量是示例性的一般情況,但在個別情況下可能需要較高或較低的劑量,這都在本發明的范圍之內。

當與其它治療藥聯用時,本發明的咔唑化合物可以相對較低的劑量給予。另外,靶向劑的應用可以使必需劑量比較低。由于包括但不限于低毒性和高清除率在內的因素,某些化合物可以相對高劑量給予。

對于人用,結構式(I)或(II)化合物可以單獨給予,但一般與藥物載體混合后給予,所述藥物載體根據預定的給藥途徑和標準藥物實踐來選擇。按照本發明使用的藥物組合物可以按常規方式,使用一種或多種生理可接受的載體來配制,所述生理可接受的載體包括便于式(I)或式(II)化合物加工成藥物制劑的賦形劑和輔料。

本發明的咔唑化合物可以與其它抗癌治療法(例如化療和/或放療)同時或按節奏(metronomically)給予。術語“同時”或“同時地”是指其它抗癌治療和所述咔唑化合物彼此在6小時以內、3小時以內或者在更短的時間內給予。術語“按節奏”是指相對于重復給藥和/或抗癌治療編組(regiment),有時給予不同于所述抗癌治療的其它抗癌治療并且以某種頻率給予。

所述咔唑化合物或含有所述咔唑化合物的組合物可以按任何方式給予,所述方式包括但不限于口服、胃腸外、舌下、經皮、直腸、經粘膜、局部、通過吸入、通過含服給藥或它們的組合。胃腸外給藥包括但不限于靜脈內、動脈內、腹膜內、皮下、肌內、鞘內和關節內。所述咔唑化合物也可以植入物(其使所述化合物緩慢釋放)的形式以及緩慢控制靜脈內滴注的形式給予。

本發明的咔唑化合物可用于治療多種疾病和病癥。例如,本發明的化合物可以與輻射和/或化療藥聯合用于治療癌癥。例如,所述咔唑化合物可用于增強對習慣用抗代謝藥(例如甲氨蝶呤或5-氟尿嘧啶(5-FU))治療的腫瘤的治療。

應用本發明的咔唑化合物可以導致癌細胞的部分或完全消退,即來自細胞群體的這類細胞的部分或完全消失。例如,本發明的方法可用于減慢腫瘤生長的速率、減少腫瘤的大小或數量、或誘導腫瘤部分或完全消退。

本發明的咔唑化合物通過給予有需要的個體可用于治療其體內的疾病或病癥。所述疾病或病癥可以是癌癥。各種各樣的可治療的癌癥包括但不限于:癌,包括膀胱癌(包括惡化和轉移的膀胱癌)、乳癌、結腸癌(包括結腸直腸癌)、腎癌、肝癌、肺癌(包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、泌尿生殖道癌、淋巴系統癌、直腸癌、喉癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、食管癌、胃癌、膽囊癌、宮頸癌、甲狀腺癌、腎癌和皮膚癌(包括鱗狀細胞癌);淋巴系造血系統腫瘤,包括白血病、急性淋巴細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkins?lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins?lymphoma)、毛細胞淋巴瘤、組織細胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤(Burketts?lymphoma);髓系造血系統腫瘤,包括急慢性骨髓性白血病、骨髓異常增生綜合征、骨髓性白血病和早幼粒細胞白血病;中樞和周圍神經系統腫瘤,包括星形細胞瘤、成神經細胞瘤、膠質瘤和神經鞘瘤(Schwannomas);間充質細胞起源的腫瘤,包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤;和其它腫瘤,包括黑素瘤、著色性干皮病(xenoderma?pigmentosum)、角化棘皮瘤(keratoactanthoma)、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌、畸胎癌、腎細胞癌(RCC)、胰腺癌、骨髓瘤、骨髓性白血病和淋巴母細胞性白血病、成神經細胞瘤和成膠質細胞瘤。

由HTLV的tax所誘導的轉化是成人T淋巴母細胞白血病(ATL)的一種致病因子,可以共享相同的參與RCC的分子靶標。例如,NF-κB在tax轉化的細胞內有組成型活性。與RCC相類似,在tax轉化的細胞中,p53活性通過NF-κB的活化而抑制,p53抑制不涉及p300的螯合。根據p53活化的共享機制,所述組合物也可用于治療HTLV誘導的白血病。無論其p53狀態如何,人類癌癥的大多數都具有組成型超活化NF-κB。所述組合物也能夠通過使反式活化NF-κB復合物重新編程為反式阻抑復合物而抑制NF-κB,反式阻抑復合物可用來治療與其p53狀態無關的任何腫瘤。所述組合物還可用來治療HIV感染,因為HIV?LTRs強烈地依賴于NF-κB活性。

所述組合物也可用作輔助療法以克服可能由組成型NF-κB活化引起的抗癌藥物抗性。所述抗癌藥物可以是如本文所述的化療藥或放療。

本發明的一種方法包括治療有效量的本發明咔唑化合物與可造成單鏈或雙鏈DNA斷裂的化療藥或者可阻斷DNA復制或細胞增殖的化療藥聯合給藥。或者,本發明的一種方法包括治療有效量的至少一種本發明咔唑化合物與包括使用抗體(例如赫賽汀(herceptin),它在抑制癌細胞的增殖方面有活性)在內的療法聯合給藥。因此,癌癥例如結腸直腸癌、頭頸部癌癥、胰腺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、外陰癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、腎細胞癌、卵巢癌、腦腫瘤、骨肉瘤和肺癌通過聯合給予本發明咔唑和化療藥或抗體而對強化治療敏感。

本發明可治療的癌癥也包括實體腫瘤,即癌和肉瘤。癌包括衍生自上皮細胞的惡性贅生物,其浸潤(即侵入)周圍組織并引起轉移瘤。腺癌是衍生自腺體組織的癌,或者是衍生自構成可識別腺體結構的組織的癌。癌癥的另一大類包括肉瘤,肉瘤是其細胞埋在原纖維或均質物質(如胚胎結締組織)中的腫瘤。本發明也能夠治療骨髓系統或淋巴系統的癌癥,包括白血病、淋巴瘤和其它通常不以腫瘤塊存在但分布在血管系統或淋巴網狀系統的癌癥。

本發明咔唑化合物可治療的癌癥的其它形式包括例如成人和兒科腫瘤、實體腫瘤/惡性腫瘤的生長、粘液樣和圓形(round)細胞癌、局部晚期腫瘤、轉移性癌癥、人軟組織肉瘤(包括尤因肉瘤(Ewing′s?sarcoma))、癌癥轉移(包括淋巴癌轉移)、鱗狀細胞癌(特別是頭頸部的鱗狀細胞癌)、食管鱗狀細胞癌、口腔癌、血細胞惡性腫瘤(包括多發性骨髓瘤)、白血病(包括急性淋巴細胞白血病、急性非淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓細胞白血病和毛細胞白血病)、彌散性淋巴瘤(基于體腔的淋巴瘤)、胸腺淋巴瘤性肺癌(包括小細胞癌、皮膚T細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、腎上腺皮質的癌癥、產生ACTH的腫瘤、非小細胞癌、乳癌(包括小細胞癌和導管癌)、胃腸癌(包括胃癌、結腸癌、結腸直腸癌和與結腸直腸瘤形成相關的息肉)、胰腺癌、肝癌、泌尿系統癌癥(包括膀胱癌,例如原發性淺層膀胱腫瘤、膀胱的侵襲性過渡性細胞癌和侵襲肌肉的膀胱癌)、前列腺癌、女性生殖道惡性腫瘤(包括卵巢癌、原發性腹膜上皮贅生物、宮頸癌、子宮內膜癌癥、陰道癌、外陰癌、子宮癌和卵泡內的實體瘤)、男性生殖道惡性腫瘤(包括睪丸癌和陰莖癌)、腎癌(包括腎細胞癌、腦癌(包括內源性腦腫瘤、成神經細胞瘤、星形細胞性腦腫瘤、膠質瘤和中樞神經系統內的轉移性腫瘤細胞侵襲)、骨癌(包括骨瘤和骨肉瘤)、皮膚癌(包括惡性黑素瘤、人皮膚角質化細胞的腫瘤進程和鱗狀細胞癌)、甲狀腺癌、成視網膜細胞瘤、成神經細胞瘤、彌散性腹膜癌、惡性彌散性胸膜癌、間皮瘤、維爾姆斯瘤(Wilms′s?tumor)、膽囊癌、絨毛膜上皮腫瘤(trophoblastic?neoplasm)、血管外皮細胞瘤和卡波西肉瘤(Kaposi′s?sarcoma)。因此,預期給予本發明的咔唑化合物能強化治療方案。

本發明的化合物也可以增強藥物在治療炎性疾病中的功效。本發明的咔唑化合物是NF-κB應答的強效抑制劑,NF-κB應答涉及促炎NF-κB靶(例如TNF、IL-1、IL-6、IL-8等)的表達/分泌的阻抑。因此,本發明咔唑對NF-κB的抑制將導致局部和系統性炎癥反應的阻抑。奎納克林(Quinacrine),假設它是通過非常類似于本發明咔唑的機制起作用,在治療自身免疫性疾病和慢性炎癥時它被廣泛用作抗炎藥物。

可以從與適合于本發明方法的化合物的聯合療法中受益的疾病實例是類風濕性關節炎、銀屑病、白斑、韋格納肉芽腫病(Wegener′s?granulomatosis)和系統性紅斑狼瘡(SLE)。關節炎、韋格納肉芽腫病和SLE的治療常常包括使用免疫抑制療法,例如電離輻射、甲氨蝶呤和環磷酰胺。這樣的治療通常直接或間接地誘導DNA損傷。在攻擊性(offending)免疫細胞內NF-κB的抑制和/或p53的活化使細胞對受這些標準治療的控制更敏感。銀屑病和白斑通常都用紫外輻射(UV)并結合補骨脂素進行治療。本發明的咔唑化合物誘導UV和補骨脂素的殺傷作用,并增加該治療方案的治療指數。一般而言,用于本發明方法的咔唑化合物當與目前使用的免疫抑制藥物聯用時,增強了對炎性疾病細胞的控制。

除了上述病癥之外,本發明還可用于治療例如但不限于以下病癥的方法之中:動脈粥樣硬化、再狹窄、血管炎、腎炎、視網膜病、腎病、增生性皮膚病、銀屑病、瘢痕瘤性疤痕形成(keloid?scarring)、光化性角化病、斯蒂文斯-約翰遜綜合征(Stevens-Johnson?Syndrome)、類風濕性關節炎(RA)、系統性起病型青少年慢性關節炎(JCA)、骨質疏松癥、系統性紅斑狼瘡、眼的過度增殖性疾病(包括上皮向內生長)、增殖性玻璃體視網膜病(PVR)、糖尿病性視網膜病、血管性增殖性疾病、魚鱗病和乳頭瘤。

本發明咔唑也表現出抗微生物活性,例如抗革蘭氏陽性菌和抗革蘭氏陰性菌,包括沙門氏菌屬(Salmonella);抗原生動物活性;和抗病毒活性。

正如本領域技術人員所了解的,在本文描述的方法中可以使用另外的活性或輔助藥物。本文提及治療時也延伸至預防,以及已確立的疾病或癥狀的治療。

本發明可應用于離體細胞群體。例如,本發明的咔唑化合物可離體地用來確定針對給定適應癥、細胞類型、患者和其它參數給予本發明咔唑化合物的最佳時間表和/或劑量。從這類使用搜集到的信息可用于實驗目的或用于臨床以制定用于體內治療的方案。本發明適用的其它離體用途對于本領域技術人員來說是顯而易見的。

本發明的咔唑化合物也可與輻射聯合給予。可用電磁輻射治療的疾病包括瘤性疾病、良性腫瘤、惡性腫瘤和癌細胞。

本發明也考慮了本文未列出的其它疾病的電磁輻射治療。本發明優選的實施方案使用了以下的電磁輻射:γ-輻射(10-20m~10-13m)、X-射線輻射(10-12m~10-9m)、紫外光(10nm~400nm)、可見光(400nm~700nm)、紅外輻射(700nm~1mm)和微波輻射(1mm~30cm)。

目前,許多癌癥治療方案都使用了由電磁輻射(例如X-射線)活化的放射增敏劑。X-射線活化的放射增敏劑的實例包括但不限于下列:雙唑泰栓、米索硝唑、去甲米索硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、尼莫唑、絲裂霉素C、RSU?1069、SR?4233、EO9、RB?6145、煙酰胺、5-溴脫氧尿苷(BUdR)、5-碘脫氧尿苷(IUdR)、溴脫氧胞苷、氟脫氧尿苷(FUdR)、羥基脲、順鉑及其治療上有效的類似物和衍生物。

癌癥的光動力療法(PDT)使用可見光作為增敏劑的輻射激活劑。光動力放射增敏劑的實例包括但不限于下列:血卟啉衍生物、光敏素(PHOTOFRIN)、苯并卟啉衍生物、NPe6、初卟啉錫(SnET2)、pheoborbide-a、細菌葉綠素-a、萘酞菁類(naphthalocyanines)、酞花菁類(phthalocyanines)、酞花菁鋅及其治療上有效的類似物和衍生物。

放射增敏劑可以與除了本發明的咔唑化合物之外的治療有效量的一種或多種化合物聯合給予,這樣的化合物包括但不限于促進放射增敏劑摻入到靶細胞內的化合物,控制治療物、營養物和/或氧氣流入到靶細胞內的化合物,與或不與另外的輻射一起對腫瘤起作用的化療藥,或其它治療上有效的用于治療癌癥或其它疾病的化合物。可與放射增敏劑聯用的另外的治療藥實例包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、亞葉酸、氧氣、卡波金(carbogen)、紅細胞輸注、全氟化碳(例如FLUOSOLW-DA)、2,3-DPG、BW12C、鈣通道阻斷藥、己酮可可堿、抗血管生成化合物、肼屈嗪和L-BSO。

所述化療藥可以是任何誘導細胞凋亡的藥物或化合物。所述藥物或化合物可以是例如有機小分子、肽、多肽、核酸或抗體。可以使用的化療藥包括但不限于烷化劑、抗代謝藥、激素及其拮抗劑、天然產物及其衍生物、放射性同位素、抗體以及天然產物,和它們的組合。例如,本發明的咔唑化合物可以與抗生素一起給藥,所述抗生素有例如多柔比星和其它蒽環霉素類似物、氮芥(例如環磷酰胺)、嘧啶類似物(例如5-氟尿嘧啶)、順鉑、羥基脲、紫杉醇及其天然和合成衍生物等。作為另一個實例,就混合腫瘤(例如乳腺癌)而言,所述化合物可以與亮丙立德或戈舍瑞林(LH-RH的合成肽類似物)一起給藥,其中所述腫瘤包括依賴促性腺激素的細胞和不依賴促性腺激素的細胞。其它抗腫瘤方案包括同時使用抑制劑化合物和其它治療方式(modality)(例如外科手術或輻射,本文亦稱“輔助抗腫瘤方式”)。可用于本發明的另外的化療藥包括激素及其拮抗劑、放射性同位素、抗體、天然產物和它們的組合。

在下列表格中列出了可用于本發明方法的化療藥的多個實例。

表1

具體與放射增敏劑聯用的化療藥的實例包括例如喜樹堿、卡鉑、順鉑、柔紅霉素、多柔比星、干擾素(α,β,γ)、伊立替康、羥基脲、苯丁酸氮芥、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤、2-氯腺苷、氟達拉濱、阿扎胞苷、吉西他濱、培美曲塞、白介素2、伊立替康、多西他賽、紫杉醇、托泊替康、CPT-11、阿那曲唑(anastrazole)、來曲唑(letrazole)、卡培他濱(capecitabine)、雷洛昔芬(reloxafine)、環磷酰胺、異環磷酰胺(ifosamide)、屈洛昔芬(droloxafine)及其治療上有效的類似物和衍生物。

影響微管的藥物能干擾細胞的有絲分裂,其細胞毒活性是本領域眾所周知的。可用于本發明的影響微管的藥物包括但不限于別秋水仙素(NSC?406042)、軟海綿素B(halichondrin?B)(NSC?609395)、秋水仙素(NSC?757)、秋水仙素衍生物(例如NSC?33410)、多拉司他汀10(NSC376128)、美登素(NSC?153858)、根霉素(NSC?332598)、紫杉醇(NSC?125973)、紫杉醇衍生物(例如NSC?608832)、硫秋水仙素NSC361792)、三苯甲基半胱氨酸(NSC?83265)、硫酸長春堿(NSC?49842)、硫酸長春新堿(NSC?67574)、天然和合成埃博霉素(包括但不限于埃博霉素A、埃博霉素B和盤皮海綿內酯(參見Service,(1996)Science,274:2009))雌莫司汀、諾考達唑、MAP4等。這類藥物的實例也可參見Bulinski(1997)J.Cell?Sci.110:3055?3064;Panda(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA?94:10560-10564;Muhlradt(1997)Cancer?Res.57:3344-3346;Nicolaou(1997)Nature?397:268-272;Vasquez(1997)Mol.Biol.Cell.8:973-985;和Panda(1996)J.Biol.Chem?271:29807-29812。

可使用的細胞生長抑制藥包括但不限于激素和類固醇(包括合成類似物):17-α-炔雌醇、己烯雌酚、睪酮、潑尼松、氟甲睪酮、丙酸屈他雄酮、睪內酯、醋酸甲地孕酮、甲潑尼龍、甲睪酮、潑尼松龍、曲安西龍、hlorotrianisene、羥孕酮、氨魯米特、雌莫司汀、醋酸甲羥孕酮、亮丙立德、氟他胺、托瑞米芬、諾雷德。

其它細胞生長抑制藥是抗血管生成藥(例如基質金屬蛋白酶抑制劑)和其它VEGF抑制劑(例如抗VEGF抗體和小分子(例如ZD6474和SU668))。也可使用抗Her2抗體。一種EGFR抑制劑是EKB-569(一種不可逆的抑制劑)。也包括對EGFR和Src抑制劑具有免疫特異性的抗體C225。

適宜用作細胞生長抑制藥的還有康士德(CASODEX)(比卡魯胺,Astra?Zeneca),其賦予雄激素依賴性癌非增殖性。細胞生長抑制藥的再一個實例是抗雌激素藥他莫昔芬,其抑制雌激素依賴的乳癌的增殖或生長。細胞增殖信號轉導的抑制劑是細胞生長抑制藥。代表性實例包括表皮生長因子抑制劑、Her-2抑制劑、MEK-1激酶抑制劑、MAPK激酶抑制劑、PI3抑制劑、Src激酶抑制劑和PDGF抑制劑。

由于TNF家族成員誘導腫瘤細胞凋亡的獨特能力,因此它們被認為是潛在的抗癌藥物。然而,許多腫瘤細胞逃避了死亡配體的促凋亡酸(proapoptotic?acid),從而降低了這些藥物對死亡配體敏感性癌癥的應用并使得腫瘤可以逃避宿主免疫應答。使用NF-κB抑制劑可用來使腫瘤細胞對死亡配體(例如TNF多肽)的殺傷力敏感。

所述TNF多肽可以是配體的TNF超家族中的一個成員。TNF多肽的代表性實例包括但不限于NGF、CD40L、CD137L/4-1BBL、TNF-α、CD134L/OX40L、CD27L/CD70、FasL/CD95、CD30L、TNF-β/LT-α、LT-β和TRAIL。所述TNF超家族的成員都是天然蛋白質,它們涉及免疫系統的維持和功能并且可以觸發細胞凋亡。所述TNF多肽可以是TRAIL,TRAIL主要在腫瘤細胞而不是在正常細胞中誘導凋亡。據信,這些所謂的“死亡配體”的活性是通過與TNF受體家族成員結合而介導的,TNF受體家族成員在它們的細胞內部分含有結構上類似的死亡域。這些受體(其對各自的死亡配體有特異性)的連接觸發了一系列事件的活化,導致半胱天冬酶(caspase)的活化。所述TNF多肽所結合的TNF-R受體的代表性實例包括但不限于LNGFR/p75、CD40、CD137/4-1BB/ILA、TNFRI/p55/CD120a、TNFRII/p75/CD120b、CD134/OX40/ACT35、CD27、Fas/CD95/APO-1、CD30/Ki-1、LT-βR、DR3、DR4、DR5、DcR1/TRID、TR2、GITR和護骨蛋白(osteoprotegerin)。

也考慮了可以用其它藥物替代TNF多肽。例如,可以使用模擬TNF多肽活性的抗體。這類抗體的代表性實例包括但不限于抗FAS、TRAIL受體或TNFR的激動劑抗體。另外,可以使用適體(aptamer)和其它能激活相應受體的合成配體。

確診患者的腫瘤是否能夠用本發明的咔唑化合物治療也是可能的。從患者獲取腫瘤樣品。然后,腫瘤細胞用p53報道系統(例如應答p53的lacZ報道基因)轉導。轉導后的細胞再與所述化合物一起溫育。p53介導的信號超出對照的產生,說明腫瘤可以用所述咔唑化合物進行治療。

圖1a和圖1b是顯示在TNF處理細胞中本發明咔唑抑制NF-κB轉錄活性的曲線圖(圖1a)和對p53活化和NF-κB抑制的有效濃度(EC50值)比較的柱狀圖(圖1b)。

本發明的咔唑化合物在體外(圖2)和體內(圖3)都具有顯著的抗癌特性。圖2顯示各種咔唑化合物對腫瘤細胞的影響,腫瘤細胞在用不同濃度的4種本發明咔唑化合物處理1小時后,其p53狀態各不相同。在72小時用亞甲基藍染色來評價細胞存活情況。因此,推測但不依賴于,p53被本發明咔唑化合物的活化可能不是主要的死亡誘導信號,而可能是反應出由組成型活性NF-κB失活引起的細胞應激類型。

被測的腫瘤細胞是HCT116結腸腺癌p53wt(圖2a),MDA-MB-231乳腺癌p53mut(圖2b),DLD1結腸癌p53wt(圖2c),A549肺腺癌p53wt(圖2d),Caki1腎細胞癌p53wt(圖2e),HT29結腸腺癌p53mut(圖2f),H1299肺腺癌p53缺失(圖2g),MCF7乳腺癌p53wt(圖2h),RCC45腎細胞癌p53wt(圖2i),ACHN腎細胞癌(圖2j),和HT1080肺纖維肉瘤(圖2k)。圖3中被測的腫瘤細胞是HCT116sc異種移植物模型。

經過分析的本發明咔唑化合物不誘導DNA損傷(表I)。因此,推測本發明咔唑化合物的細胞毒性由非基因毒性細胞應激的獨特類型所引起,包括癌細胞比正常細胞更敏感的NF-κB阻抑。這說明本發明咔唑類化合物是一類新的高效抗癌治療藥。

表I

本發明咔唑化合物和多柔比星的效果匯總以比較DNA和DNA損傷應答性信號傳導。

ND-未測

根據本發明的重要特征,有活性咔唑分子和無活性咔唑分子的構象異構體的三維(3D)疊加(superimposition)揭示出所述化合物的特征在于對其活性的貢獻。一個重要特征是咔唑核心的平面性(planarity)。比較了構象異構體的多個三維排列,發現在所有有活性的咔唑化合物中,咔唑核心區都是平面的(圖4)。無活性化合物可以是平面或非平面的(圖5)。具有相似原子分布的化合物與分子構型(architecture)的其它結構研究證實,咔唑環區域的平面性在決定所述咔唑化合物對p53活化的功效方面是重要的(圖6和圖7)。有活性的咔唑即實施例2示于圖6。無活性的咔唑即化合物200示于圖7。化合物200具有下列結構式:

我們發現能夠激活p53的咔唑化合物具有導致不依賴于下列假設的平面結構:這些化合物的作用機制是通過DNA嵌入而介導的。我們假設p53活化功效和咔唑核心的平面結構之間的關系反映出嵌入DNA的能力。為了檢驗這一假設,使咔唑化合物實際上嵌入到取自p53-DNA復合物的三維DNA結構(1TUP?PDB結構)中。初始嵌入如下進行。有活性的咔唑分子即化合物300疊加在DNA結構之上,使得平面環區域位于兩個堆積堿基對之間且與它們平行。嵌入的分子則處于p53的Arg280對面。Arg280殘基被認為是對p53-DNA相互作用至關重要的。參見M.Kitayner等,Molecular?Cell,22,第741-753頁,2006年6月。這樣的暴力式疊加違反了兩個結構的原子間范德華(Van?der?Waals)相互作用。采用MOLOC分子力學軟件包,DNA-咔唑類似物-p53三元復合物被優化,降低了合并的DNA-分子結構中范德華和扭轉角張力。在優化之后,活性分子的位置適合于DNA與平行于DNA堆積堿基對的環平面中的空腔。作為該優化程序的結果,定位于咔唑環取代基的氫鍵接受體(HBA)位于大溝內,而與咔唑氮相連的側鏈位于窄窄的小溝內。化合物300的結構式是:

作為本研究的結果,創建了其內部空腔形狀更好地容納p53激活咔唑化合物的dsDNA片段。采用GOLD軟件包,對已知具有p53活性的各種咔唑化合物進行了分子對接(docking)。結果表明,平均來說,高活性分子(p53活化EC50<130μM)擬合該空腔比EC50>130μM的分子要好得多。高活性咔唑化合物的構象異構體一致地位于所述空腔內,而擬合的質量在p53活化功效弱的咔唑化合物中有削弱。大多數的無活性分子的特征在于擬合的質量極差。

與咔唑氮相連的取代基正確地定位到DNA的小溝內對于獲得好的p53活性可能是重要的。簡單地說,側鏈擬合到小溝內改進了所述咔唑化合物的總體擬合。另外,活性咔唑化合物三維疊加的原子表決(atom?voting)分析表明,側鏈中帶正電荷的氨基對獲得活性是重要的。

咔唑取代基上HBA(氫鍵合)原子的位置及其同一性(identity)對獲得p53活性是重要的。低質量的HBA原子(即氮)導致咔唑化合物的弱活性。咔唑取代基上不存在HBA原子使得化合物無活性。所有的高活性化合物都具有非旋轉的咔唑取代基。高活性分子(EC50<130nM)和活性分子(EC50約1nM)停靠到DNA空腔內,表明具有好的HBA原子的旋轉咔唑取代基可以與DNA原子一起產生氫鍵。相比之下,非旋轉的咔唑取代基與DNA一起不產生氫鍵,于是導致其高活性。

使用B16黑素瘤singenic腫瘤模型如下證明了實施例7(化合物6h)的抗腫瘤活性。在C57BL/6小鼠腹部的兩個部位真皮內接種5x104鼠B16黑素瘤細胞。當腫瘤接種部位中的至少一個發生腫瘤(平均大小約6mm3)時,開始治療。小鼠通過經口管飼法每天用0.5%甲基纖維素溶媒對照或30mg/kg實施例7(n=5只小鼠/治療組)進行治療,長達14天。每1-2天用數字測徑器采集腫瘤測量值。對各個腫瘤的治療效果見圖8a和圖8b。除了來自實施例7治療組的一只小鼠以外,對于任一治療組都沒有觀察到對整個小鼠體重的影響(<10%變化)。到第9天,在實施例7治療組中的腫瘤生長與溶媒對照組相比較有3倍左右的減少(68%生長抑制)。

為了證實實施例7的抗腫瘤活性,使用HCT116異種移植物模型經口遞送所述咔唑化合物(30mg/kg)。在本試驗中,在無胸腺裸鼠的兩個部位接種了5X106HCT116腫瘤細胞。接種后第7~11天之間90%出現腫瘤。當每只小鼠至少有一個腫瘤的大小達到20-25mm3時,開始用0.5%甲基纖維素中的30mg/kg實施例7的化合物或用0.5%甲基纖維素溶媒對照每天口服治療。小鼠進行治療直到對照腫瘤達到1000mm3為止。開始治療后,監測小鼠的總體情況、體重減輕和存活,以及每隔一天測量的腫瘤大小。

表2:實驗組

D-天

在本試驗中,第2組中的小鼠100%在實驗中存活。在對照溶媒治療組1中未觀察到體重減輕,而在第2組中,3只小鼠到實驗結束時體重減輕了15-20%。第2組中剩余的小鼠的體重波動范圍為原始體重的95-105%。在第2組的小鼠外觀、活動或行為方面都沒有出現任何其它異常體征。

在對照組1中,HCT116腫瘤呈指數生長,較快和較慢生長腫瘤間的正常偏差在預期范圍內。在實施例7治療組2中,所有腫瘤的生長與溶媒對照治療組1相比較都延遲了。在治療開始后的第14天,經治療的腫瘤都沒有達到最慢生長對照腫瘤的大小(530mm3)。在腫瘤平均生長方面,用實施例7治療能抑制腫瘤生長達到溶媒對照組1相比的約3.5倍(抑制73%)。重要的是,有一個經治療的腫瘤完全治愈,尸檢時,在有腫瘤的地方只發現了最小結締組織類型形成。幾個經治療的腫瘤的大小不僅比對照腫瘤增加得更慢,而且還有減少,這說明由于用實施例7的化合物治療而導致了腫瘤細胞死亡和腫瘤破壞。這一結果在治療的頭3-5天就可觀察到,然后經治療的腫瘤繼續緩慢生長。

本實驗表明,實施例7的化合物對裸鼠體內的HCT116皮下異種移植物腫瘤生長有抑制作用。生長抑制值為73%,根據NCI標準,73%被認為是具有顯著抗癌活性(≥42%)。上述結果詳見圖3和圖8-10。

圖3是顯示用實施例7的化合物和對照(MC)治療HCT116結腸癌異種移植物腫瘤的平均腫瘤生長曲線圖。用實施例7的化合物治療的腫瘤表現出腫瘤體積明顯減少。在腫瘤體積對治療天數的曲線圖中,小棒代表標準差。圖8表示小鼠中用對照溶媒(圖8a)和用實施例7的化合物(圖8b)治療的各個腫瘤生長的曲線圖。

圖9顯示用實施例7的化合物治療的小鼠中各個腫瘤最多生長到100mm3。圖10顯示腫瘤大小在治療頭幾天內就有減少,還有腫瘤被治愈。

圖11證明上述測定中激活p53的一種咔唑化合物即化合物100表現出針對多種被測癌細胞的顯著抗癌活性。將圖11中給出的細胞系中的每一種接種到96孔板中。第二天,細胞用不同濃度的化合物100進行處理。處理持續24小時,此時把含化合物的培養基更換為無化合物的培養基,讓細胞生長直到僅用溶媒對照(DMSO)處理的對照孔達到單層(通常在48小時內)。然后,將細胞固定,用50%甲醇中的0.5%亞甲基藍染色。染料用1%SDS洗脫,在650nm測量吸光度。數據用于650nm的吸光度對化合物100的濃度表示。

實施例7、15和13的化合物顯示出有效的抗癌活性。在采用這三種化合物的功效試驗中,在無胸腺裸鼠的兩個后脅腹皮下接種Caki1人腎細胞癌細胞懸液。當小鼠中至少有一個腫瘤達到20-50mm3時,開始治療。小鼠通過管飼法經口給予配制在0.2%羥甲基纖維素中的30mg/kg實施例7、5mg/kg實施例15或25mg/kg實施例13進行治療。作為陽性對照,一個組用40mg/kg舒尼替尼(Sunitinib)治療,舒尼替尼是一種批準用于治療腎細胞癌的藥物。治療持續4周,時間表是用藥5天/停藥2天。治療完成后,再監測小鼠4周以判定腫瘤生長怎樣快速回到正常。所有三種化合物相對于溶媒對照都引起顯著的腫瘤生長抑制(第24天(治療結束)實施例7?73%抑制、實施例15?50%抑制、實施例13?62%抑制)。實施例7和13的這種抗腫瘤作用及較低程度的實施例15都明顯高于舒尼替尼對照(42%)。有趣的是,停止用任何本發明化合物治療后不會導致腫瘤的快速重新生長。相比之下,結束舒尼替尼治療會立即導致腫瘤生長,致使到第40天,在舒尼替尼和溶媒對照組之間觀察不到腫瘤體積的顯著差異。

總之,甚至在治療完成后,所有三種咔唑化合物都引起腫瘤生長被持續抑制。功效等級是實施例7大于或等于實施例13,實施例13大于實施例15。用實施例7治療相對于實施例13和15不引起明顯的副作用。用實施例13觀察到最嚴重的副作用,其中有兩只小鼠不得不放棄短期治療,有一只小鼠由于體重減輕而永久地去掉,導致過早安樂死。因此,在本試驗中,實施例7似乎是“最安全的”咔唑。在這個腫瘤模型中,因為實施例15僅引起短期體重減輕10-15%,所以這種化合物是第二個最安全的。根據這些結果,實施例7是優選的化合物,具有有效的抗腫瘤活性(70-80%抑制),沒有副作用。

在另一個試驗中,評價了在攜帶人HCT-8回腸盲腸腺癌異種移植物的裸鼠中和在攜帶人HT-29結腸腺癌異種移植物的裸鼠中實施例7、15和13在最大耐受劑量(MTD)時的抗腫瘤活性和毒性。也對實施例7、15和13在MTD并排針對人HCT-8和HT-29結腸異種移植物的抗腫瘤功效和毒性進行了比較。

如上所述,實施例7、15和13證明在裸鼠或SCID小鼠(例如HCT-116、DLD1、Caki1和MDA-MB-231腫瘤,腫瘤細胞作為細胞懸液接種到小鼠體內)中具有針對多種人腫瘤異種移植物的抗腫瘤功效。評價了這三種化合物以其重復MTD針對HCT-8(對化療比較敏感,例如5-FU和伊立替康)和HT-29(相對抵抗化療)異種移植物(通過把約50mg腫瘤塊移植到裸鼠體內而建立的)的體內抗腫瘤功效和毒性。在本研究中,比較了這三種咔唑針對HCT-8和HT29結腸癌腫瘤的抗腫瘤效果和毒性,其中當腫瘤大小達到150-200mg(在腫瘤移植后7天左右)時治療開始。

材料與方法

動物:8-12周齡雌性無胸腺裸鼠(nu/nu,體重22-25g)得自Harlan?Sprague?Dawley?Inc.(Indianapolis,IN),每個籠子裝5只小鼠,水和食物自由攝取,遵循公共機構批準的動物方案。

藥物:所有三種化合物都配制在0.2%羥丙基甲基纖維素中,對實施例15,濃度為0.5mg/ml;對實施例7,濃度為3mg/ml;對實施例13,濃度為2.5mg/ml。

腫瘤:使用人回腸盲腸腺癌HCT-8和結腸腺癌HT-29異種移植物。最初通過皮下注射106個培養細胞建立了異種移植物,腫瘤傳代若干次,當腫瘤達到1-1.5g時,從傳代腫瘤中取約50mg非壞死腫瘤(2-3塊)通過套針進行移植。

藥物劑量和時間表:所有所述化合物都以MTD口服(p.o.)給予,其中實施例15:5mg/kg/天;實施例7:30mg/kg/天;實施例13:25mg/kg/天,一周5天持續4周(5天/周x?5)或直到小鼠不得不由于大腫瘤而處死。腫瘤移植后7天開始治療,當腫瘤達到150-200mg時。對照組中的小鼠接受溶媒(0.2%羥丙基甲基纖維素),每20g小鼠體重給予200μl(同治療組)。每個實驗組使用5只小鼠,共10個腫瘤(在左側和右側脅腹各有1個腫瘤)。

腫瘤測量:借助Vernier測徑器測量腫瘤的兩個軸(mm)(L,最長軸;W,最短軸)。用公式:腫瘤重量=1/2(L?x?W2)來估算腫瘤重量(mg)。在藥物治療的同時每天進行腫瘤測量,在治療結束后一周3-4次。

最大耐受劑量(MTD)和毒性評價:MTD定義為小鼠中不引起藥物相關致死的最高藥物劑量,體重減輕小于原體重的20%,毒性為可逆的。藥物誘導的毒性(體重減輕、腹瀉和死亡)的動力學在治療后的頭10天每天進行測定,此后每兩天測定一次。

抗腫瘤活性:抗腫瘤活性通過最大腫瘤生長抑制(MTRI)進行評價,最大腫瘤生長抑制(MTRI)是治療組(MTWTG)與未治療對照組(MTWCG)在同一時間點相比較的平均腫瘤重量(MTRI=MTWTG-MTWCG)÷MTWCG?x?100%)。腫瘤倍增時間(TDT)定義為腫瘤達到其初始重量兩倍的平均時間。腫瘤應答表示為當腫瘤重量減少到初始腫瘤大小的至少50%時的部分腫瘤應答(PR),而完全腫瘤應答(CR)定義為在腫瘤外觀的原部位在觸診時無法檢出腫瘤。

結果

(a)實施例15、7和13在攜帶HCT-8異種移植物的裸鼠中的抗腫瘤活性和毒性。

下表中的數據表明在攜帶HCT-8異種移植物的裸鼠中每周口服用藥5天停藥2天后,溶媒對照、實施例15、實施例7和實施例13的抗腫瘤活性和毒性。數據表明,與溶媒對照相比,實施例13和15針對HCT-8異種移植物具有中等抗腫瘤活性,抑制率為35-40%,延遲腫瘤生長分別為17%(實施例13)和57%(實施例15)(倍增時間:4.8天)。對于實施例13和15,計劃的4個療程未完成,因為大的腫瘤體積要求把小鼠處死。實施例7比實施例13和15針對HCT-8異種移植物的活性高得多,抑制率為65.9%,腫瘤生長有142%延遲。實施例7不產生任何PR或CR。關于毒性,在單獨的HCT-8腫瘤的動物組中,一周口服用藥5天停藥2天持續2-4周后,溶媒產生很弱的毒性。

實施例15、7和13在攜帶人HCT-8回腸盲腸腺癌異種移植物的裸鼠中的抗腫瘤活性和毒性

MTRI:最大腫瘤生長抑制;TDT:腫瘤倍增時間;PR:部分腫瘤應答;CR:完全腫瘤應答;MWL:預治療體重的最大體重減輕。對照組給予0.2%羥丙基甲基纖維素(溶媒),每20g小鼠體重給予200μl。每個實驗組使用5只小鼠,共10個腫瘤(在左側和右側脅腹)。

(b)實施例15、7和13在攜帶HT-29異種移植物的裸鼠中的抗腫瘤活性和毒性。

下表中的數據表明在攜帶HT-29異種移植物的裸鼠中每周口服用藥5天停藥2天后,溶媒對照、實施例15、實施例7和實施例13的抗腫瘤活性和毒性,其中HT-29異種移植物比HCT-8對大多數化療藥的耐藥性高。數據表明,所有三種化合物都是抗該腫瘤比抗HCT-8的活性高。同樣地,在這三種化合物當中,實施例13是活性最小的化合物,抑制率為48%,延遲腫瘤生長為50%(對照的腫瘤倍增時間是7.8天)。盡管實施例15產生了類似的腫瘤生長抑制(58%),但是它對腫瘤生長延遲的作用(延遲76%vs?122%)比實施例7的小。這三種藥物都不產生PR或CR。關于毒性,實施例7和13產生很小的體重減輕。實施例7在HT-29實驗中比在HCT-8實驗中的毒性高,體重減輕18%,及致死率40%。

實施例15、7和13在攜帶人HT-29結腸腺癌異種移植物的裸鼠中的抗腫瘤活性和毒性

MTRI:最大腫瘤生長抑制;TDT:腫瘤倍增時間;PR:部分腫瘤應答;CR:完全腫瘤應答;MWL:預治療體重的最大體重減輕。對照組給予0.2%羥丙基甲基纖維素(溶媒),每20g小鼠體重給予200μl。每個實驗組使用5只小鼠,共10個腫瘤(在左側和右側脅腹)。

結論

得出的結論是,實施例15和13顯示有中等抗腫瘤活性,盡管實施例7針對HCT-8和HT-29異種移植物兩者具有更好的抗腫瘤功效。

在HT-29研究中,實施例15的毒性大于實施例7和15。

與對大多數其它化療藥的反應不同,與用HCT-8異種移植物觀察到的反應相比,HT-29異種移植物對所有三種咔唑化合物更敏感。

數據表明,實施例7對HCT-8和HT-29異種移植物都是優選的化合物。

在另一個實驗中,證明了實施例7在成神經細胞瘤鼠模型中的抗腫瘤活性。N-myc(TH-MYCN)轉基因小鼠攜帶有處于酪氨酸羥化酶啟動子控制之下的人N-myc癌基因,它在早期發育期間在神經外胚層細胞中表達,該小鼠發生人成神經細胞瘤的鼠對應瘤。這些小鼠被證明是極好的模型,享有人類疾病的若干重要特征,包括腫瘤及其轉移瘤的部位、腫瘤的組織結構、成神經細胞瘤相關標記蛋白的陽性染色、突觸和神經分泌顆粒的存在、染色體在與人成神經細胞瘤中觀察到的區域同線(syntenic)的區域中獲得和丟失、和發生的腫瘤中特異性N-myc拷貝數的擴增。

現代化療顯著提高了許多癌癥的存活率。然而,對于成神經細胞瘤,臨床環境中多藥耐藥性的發生是治療失敗的主要原因之一,防止多藥耐藥性的發生具有巨大的臨床潛力。靶向以前沒有涉及成神經細胞瘤的新途徑的藥物可以為治療方案提供一種新的途徑。

這些試驗結果表明,實施例7的化合物在成神經細胞瘤的這個模型中具有不同尋常的抗腫瘤活性,盡管高劑量在一些小鼠中證明有毒性。用30mg/kg實施例7治療的小鼠快速且預料不到地體重減輕(在一些情況下2g過夜),并發現由于小的脾臟和脫水體征引起的死亡。治療后存活的小鼠在延長15-47天的時間內沒有腫瘤,然而所有小鼠并沒有按照相同的時間表進行治療。劑量按照減輕的體重進行修改。根據這些結果,實施例7在成神經細胞瘤的TH-MYCN模型中表現出良好功效。

現代化療顯著提高了許多癌癥的存活率。然而,對于成神經細胞瘤,臨床環境中多藥耐藥性的發生是治療失敗的主要原因之一,防止多藥耐藥性的發生具有巨大的臨床潛力。靶向以前沒有涉及成神經細胞瘤的新途徑的藥物可以為治療方案提供一種新的途徑。

在哺乳動物癌發生的MMTV-neu轉基因小鼠模型中,每天給予實施例7也可防止腫瘤發作。

乳癌(BC)是一種嚴重的公共健康問題,因為這種惡性腫瘤的高發和可利用治療的有限成功。已經知道,這種疾病的家族史以及若干特定遺傳因子與相當大程度的概率素因使個體易患BC。因此,來自BC高危人群的婦女在理論上講可因預防性抗BC療法而受益。本發明的咔唑化合物可以在導致腫瘤生長抑制的方向上調節若干癌癥相關的細胞途徑。實施例7的化合物在小鼠中當以治療劑量(20-25mg/kg)給予時不引起嚴重的副作用。實施例7表明在Ames測定中沒有致突變活性。在該項研究中,實施例7經測試為小鼠BC的預防藥。

動物模型:背景為FVB品系的MMTV-neu雌性小鼠在對雌激素刺激應答時表達處于MMTV啟動子下的非活化Her2原癌基因。小鼠從24周齡開始發生自發的哺乳動物腫瘤,到10月齡有70-80%的動物正常發生腫瘤。本試驗的目的是(a)比較用實施例7與用溶媒對照(水)治療的小鼠中的腫瘤發生率,和(b)比較用實施例7與用溶媒對照治療的小鼠體重增加和一般外觀。

研究設計:把40只雌性小鼠在21日齡時與其哺乳母鼠分開來進行斷奶,并置于單獨的籠子(4只小鼠/籠)內。此刻,小鼠做好標記后分配到治療組或對照組(每組20只小鼠)。兩組的體重一周測量一次。從4周齡開始,給來自治療組的小鼠提供含有實施例7的水。每天估計治療組和對照組中的液體消耗。根據這些測量結果,計算出每克小鼠體重的液體消耗,并把飲用水中的實施例7濃度調整到理想的治療劑量。每周準備實施例7的新鮮溶液。通過乳腺觸診來監控小鼠的腫瘤形成情況,一周一次。當累積腫瘤大小達到體積為1000mm3時,立刻處死小鼠。

??組別
??小鼠數目
??靶向劑量
??遞藥方式
??1
??20
??無(水)
??每天飲用
??2
??20
??約25mg/kg實施例7
??每天飲用

初步結果:來自治療組的小鼠按平均速率為每天20mg/kg消耗實施例7。變異性是由于通過飲用水遞藥的有限精確性所致。在體重分布或動物外觀的異常方面沒有觀察到治療組和對照組之間的差異。

在實驗過程中,在治療組和對照組中都出現了幾只自發死亡。死亡原因不清楚,因為動物都沒有腫瘤,死后的總體病理檢查顯示沒有明顯的異常。沒有小鼠死亡早于實施例7給藥開始后幾周。在試驗期間,3只對照小鼠死亡年齡分別在15周齡、41周齡和42周齡左右。在實施例7組中死亡的7只小鼠處在不同的年齡范圍,從12周齡到45周齡(自從實驗性治療開始后的7-41周)。

在對照組和治療組中分別有21只小鼠和19只小鼠達到了荷瘤年齡。在它們中間,對照小鼠中有14只(67%)發生腫瘤,接受實施例7的小鼠中有7只(37%)發生腫瘤。

本試驗表明:

(a)用飲用水按每天約20mg/kg長期給予實施例7不引起小鼠體重的改變;

(b)實施例7治療組相對于對照組中的死亡率較高,但是差異沒有統計學上的顯著性并在治療周期長短和小鼠死亡之間沒有相關性;和

(c)用實施例7治療的小鼠相對于對照動物中負擔的腫瘤率較低。

本發明的咔唑化合物也表現出抗寄生蟲活性。具體地說,通過在體外、在試驗化合物存在或不存在下培養惡性瘧原蟲(品系D10),檢驗了咔唑化合物對瘧疾寄生蟲的影響。根據試驗,篩選出了有活性的和無活性的咔唑化合物(根據激活p53),正如奎納克林(一種常用的抗瘧疾藥物)一樣。表3匯總了化合物的結構以及它們在p53活化測定中的EC50值。

表3.試驗化合物

實施例2、化合物400和實施例7在29nM、57nM和143nM濃度時進行了試驗。化合物500、實施例18和奎納克林僅在143nM時進行了試驗。

在每個實驗中,用顯微鏡法評價了1000個紅細胞以判定受感染細胞的數量。在對照實驗(不加試驗化合物或加PBS)中,受感染細胞的百分比在1.6%和6.4%之間變動。該研究中確定的感染性降低指數見圖12。p53活化測定的功效清楚地但間接地與惡性瘧原蟲體外抑制相關聯。在p53活化測定中有活性的三種化合物(實施例2、7和18)證明其抗瘧疾活性與奎納克林相當。在p53活化測定中無活性的化合物(化合物400和500)顯示出沒有寄生蟲血癥降低。

實施例7、13和15的化合物也顯示有抗原生動物活性。人非洲錐蟲病(HAT)或“睡眠病”是一種最重要的但同時最易被忽略的熱帶傳染病。該病由原生動物一布氏錐蟲(Trypanosoma?brucei)引起,布氏錐蟲通過采采蠅(tsetse?fly)(舌蠅(Glossina?spp))叮咬傳播給人。雖然HAT早在20世紀60年代(1960s)已被消滅,但是HAT在有采采蠅棲息的撒哈拉以南非洲多個地區以流行規模重新出現。根據世界衛生組織,目前大約有500,000人攜帶錐蟲,若不治療,都將會死亡。與HAT相關的高死亡率是由于、至少部分由于缺乏可容易地給予的有效藥物。

目前用于治療HAT的藥物在本領域中都是老的、有毒的、難以給藥的。蘇拉明(Suramin)和噴他脒,它們都是用來治療早期疾病,必須在診所注射。然而,到衛生所去對于在該病十分流行的非洲農村地區卻不是一件普通的事情。而且,許多早期患者不去治療是因為他們并不知道自已被感染了。這是由于在危險人群中不好篩選,以及早期HAT癥狀的性質可變、間歇性和相對輕微。到明顯癥狀出現時,患者常常已經處于該病的晚期。晚期HAT的治療尤其麻煩,因為它包括注射美拉胂醇,美拉胂醇是一種注射時確實會灼傷患者的砷劑。這種治療十分疼痛,許多患者會拒絕治療,因此不得不進行身體約束,強迫接受這種藥物。而且,美拉胂醇還有明顯的毒副作用,會導致經治療的患者有5-20%死亡。鑒于這些原因以及預期的耐藥性問題,急需找到一種新的、可口服生物利用的藥物來替代目前古老的藥物。

試驗表明,實施例7、13和15的化合物具有體外不同尋常的抗布氏錐蟲(T.brucei)活性(低納摩爾濃度IC50)。在體外進行了初步布氏錐蟲失活實驗。布氏錐蟲的生活史包括采采蠅體內的“前循環(procyclic)”發育階段和人體內的“血流”形式。所有的研究都是用該寄生蟲的血流階段進行的,因為它才是引起該病的發育階段。

為了評價實施例7、13和15的相對抗錐蟲活性,也為了確定每種化合物殺死50%寄生蟲的濃度(IC50),使布氏錐蟲暴露在不同的化合物濃度范圍。用蘇拉明(一種常用的抗HAT藥物)作為陽性對照。

將血流布氏錐蟲按3x103細胞/mL接種到24孔(每孔裝有500uL培養基)板中。向各細胞(一式兩份培養物)中加入不同濃度的化合物(0-200nM,對于實施例7;0-20nM,對于實施例13;和0-3nM,對于實施例15)。對照培養物接受等體積的DMSO。所有三種試驗化合物完全消除了布氏錐蟲,因為在這些藥物存在下,在培養48小時之后沒有檢出寄生蟲。用DMSO(溶媒)處理的對照培養物含有寄生蟲,密度為3x106/mL。

殺錐蟲活性按下列等級增加:實施例7小于實施例13,實施例13小于實施例15,IC50值分別為約43nM、約6-11nM和約0.5nM。蘇拉明的IC50大于300nM。

因此,本發明的化合物用于開發成為殺錐蟲藥物是極好的。

測試了實施例15的化合物對抗不同真菌菌株的活性。采用CLSIM27A3和M38A2方法,進行了實施例15對31種臨床和實驗室真菌菌株的體外敏感性試驗。一般而言,所選出的菌株證明對目前的抗真菌藥物有不同的敏感性模式。為了評價實施例15,測試了8個曲霉(Aspergillus?spp.)、21個念珠菌(Candida?spp.)、1個新型隱球菌(Cryptococcus?neoformans)和1個漢遜德巴利酵母(Debaryomyces?hansenii)菌株。

曲霉菌株:整個研究中使用了8個曲霉菌株。也使用了6個煙曲霉(A.fumigatus)、1個黃曲霉(A.flavus)和1個土曲霉(A.terreus)。煙曲霉組包括2個伊曲康唑抗性菌株(RIT13和RIT5菌株)(1)、1個三唑交叉抗性菌株(MUT10)(2,3)、1個棘白菌素(echinocandin)交叉抗性菌株(EMFRS678P)(4)和2個野生型敏感分離株(R21和ATCC13073)。“非煙曲霉(non-fumigatus)”菌株對所有可利用的抗真菌藥敏感,只是土曲霉分離株(對兩性霉素B(amphotericin?B)天然不太敏感)例外(5)。

念珠菌菌株:在研究中使用了20個念珠菌臨床分離株和1個實驗室對照菌株(白色念珠菌SC5314)。在采集時包括:

5個白色念珠菌(C.albicans)分離株、2個野生型菌株(SC5314和ATCC?36082)、1個棘白菌素抗性分離株(M205)(6)和2個氟康唑抗性臨床分離株(3795和3184)(7)。

3個克魯斯念珠菌(C.krusei)菌株、1個ATCC對照菌株(ATCC6258?CLSI對照)和2個等基因臨床菌株(98和100)。100是棘白菌素交叉抗性(8,9)。

2個光滑念珠菌(C.glabrata)菌株、1個野生型臨床菌株(3168)和1個棘白菌素交叉抗性分離株(3830)(10)。

2個熱帶念珠菌(C.tropicalis)菌株、1個ATCC對照菌株(ATCC750)和1個棘白菌素交叉抗性(T3)(11)。

2個都柏林念珠菌(C.dubliniensis)菌株、1個野生型菌株(3949)和具有棘白菌素反常(paradoxical)作用的其它菌株(M204)。

4個棘白菌素敏感性天然降低的念珠菌(12):1個C.orthopsilosis(981224)、1個C.metapsilosis(2006-113)、1個近平滑念珠菌(C.parapsilosis)(ATCC?22019?CLSI對照)和1個季也蒙念珠菌(C.guilliermondii)(ATCC6260)(13)。

其它的念珠菌種和屬:1個皺落念珠菌(C.rugosa)(M83)、1個解脂念珠菌(C.lipolytica)(M159)、1個葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)(200450)、1個新型隱球菌(Cryptococcus?neoformans)(499)和1個漢遜德巴利酵母(Debaryomyces?hansenii)。

敏感性試驗:采用CLSI標準化方法,進行了實施例15對酵母(M27A3)(14)和霉菌(M38A2)(15)的體外敏感性試驗。在24小時和48小時進行了MIC(最小抑制濃度)讀數。

表1:真菌菌株針對實施例15的體外敏感性

*兩個重復的幾何平均值,單位μM。

a對應于白色念珠菌等同物的氨基酸數量。

曲霉對實施例15的敏感性:黃曲霉和土曲霉菌株比煙曲霉菌株對實施例15更敏感(24小時MIC幾何平均值分別為0.40μM和1.59μM)。而且,在敏感菌株和唑類或棘白菌素抗性菌株之間沒有MIC差異(表1)。

酵母對實施例15的敏感性:在唑類或棘白菌素抗性或敏感分離株之間沒有實施例15MIC差異。平均來說,酵母MIC為曲霉MIC的八分之一(1/8)(表1)。用實施例15獲得的MIC與常規抗真菌藥的MIC相當,或者好于常規抗真菌藥的MIC。唑類和棘白菌素抗性菌株均對實施例15敏感。

實施例15對煙曲霉(Aspergillus?fumigatus)生存力的影響:采用XTT生存力測定,評價了實施例15對煙曲霉Af293菌株的抗真菌活性。選擇該菌株,是因為它是一個表征得最好的菌株,也是用于測定煙曲霉基因組序列的菌株。XTT生存力測定基于在作為電子偶合劑(electron-coupling?agent)的甲萘醌存在下,四唑鹽(XTT)的減少。活的真菌數量和XTT減少的量之間存在相關性(16)。

方法

采用了先前在進行XTT測定(17)中描述的相同方法。把Af293分生孢子接種到含有氯霉素和慶大霉素(Becton?Dickinson,MD)的Sabouraud?BHI斜面上,室溫下孵育7-10天,用10ml含0.05%吐溫(Tween)20的生理鹽水(NS)洗斜面進行收獲。然后,將分生孢子懸液通過100μm濾器過濾,在血細胞計數器上計數,再稀釋至2.0×106CFU/ml。然后,分生孢子用MOPS(嗎啉丙烷磺酸)緩沖的RPMI(pH?7.0)按1∶50稀釋。使用實施例15溶于DMSO中的貯液。將實施例15稀釋在MOPS緩沖的RPMI(pH?7.0)中(在加到真菌懸液之前,DMSO的終濃度為2%)。在將含藥物培養基加到各孔之后,加入分生孢子懸液(100μl)(t=0h)。對照孔含有分生孢子、培養基和溶媒,但不含藥物。空白孔僅由培養基組成,不含分生孢子。使用不同濃度的實施例15但不加真菌的初始實驗表明,實施例15試劑不影響XTT測定中的光密度。將板在37℃孵育,在24h時基本上同前(16)所述進行XTT測定,但有一點小改動。將XTT(Sigma?Chemical,St.Louis,MO)的貯液溶于NS(1mg/mL)中。在丙酮中制備電子偶合劑甲萘醌(Sigma?Chemical)的10mM溶液,然后用NS按1∶10稀釋。臨用前制備由4.0ml?XTT和0.5ml甲萘醌組成的工作液。向各孔中加入50微升的組合溶液,將板在37℃孵育2小時。把100微升的上清液轉移到一塊新板中,再用Labsystems?Multiskan?Plus讀板器測定450nm的光密度(OD450)。各孔中XTT和甲萘醌的終濃度分別為200μg/ml和25μM。

實施例15具有針對Af293的抗真菌活性。IC50大約為2.5μM。在實施例15濃度大于12.5μM時出現了真菌生長被完全抑制,基于對各孔的肉眼檢查。

1.A.M.Nascimento等,2003,47:1719-26.

2.G.Garcia-Effron等,2008,J?Clin?Microbiol,46:1200-6.

3.S.J.Howard等,2006,Int?J?Antimicrob?Agents,28:450-3.

4.E.M.Rocha等,2007,Antimicrob?Agents?Chemother,51:4174-6.

5.W.J.Steinbach等,2004,Clin?Infect?Dis.,39:192-8.

6.G.S.Garcia-Effron等,Antimicrob?Agents?Chemother.

7.S.Perea等,2001,Antimicrob?Agents?Chemother,45:2676-84.

8.M.Hakki等,2006,Antimicrob?Agents?Chemother,50:2522-4.

9.J.N.Kahn等,2007,Antimicrob?Agents?Chemother,51:1876-8.

10.J.D.Cleary等,2008,Antimicrob?Agents?Chemother,52:2263-5.

11.G.Garcia-Effron等,2008,Antimicrob?Agents?Chemother,52:4181-3.

12.G.Garcia-Effron等,2008,Antimicrob?Agents?Chemotger,52:2305-12.

13.D.S.Perlin,2007,Drug?Resist?Update,10:121-30.

14.Clinical?Laboratory?Standard?Institute(臨床實驗室標準研究所),C.L.S.I.,2008,第3版,28(14).

15.Clinical?Laboratory?Standard?Institute(臨床實驗室標準研究所),C.L.S.I.,2008,第2版,28(16).

16.J.Meletiadis等,2001,J?Clin?Microbiol,39:3402-8.

17.Y.F.Brun等,2007,Antimicrob?Agents?Chemother,51(5):1804-12.

本發明的咔唑化合物也表現出抗細菌活性。具體地說,本發明的咔唑化合物對革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis))和革蘭氏陰性菌(DH5-α)的效果可用下列方法來測定,并匯總于圖13a和圖13b中。

體外試驗評價了咔唑化合物對革蘭氏陰性菌(-)和革蘭氏陽性菌(+)的效果。

設備

96孔讀板器(例如Multiscan,Lab?Systems,Inc)

多道移液管50-300uL范圍

濾器尖(Filter?tips)

96孔板(Corning?Costar?Cat.No.:3598)

100mm陪替氏培養皿(petri?dish)

無菌1μl接種環(Fisher?22-170-209)

14ml帶快速壓緊帽(snap-cap)的圓底管(Falcon?352059)

材料

DH5-α(大腸桿菌(E.coli)-革蘭氏陰性(-)菌)

枯草芽孢桿菌(革蘭氏陽性(+)菌)

Difco?LB瓊脂(BD?244510-對于DH5-α)

Difco?LB肉湯(BD?244610-對于DH5-α)

Difco營養肉湯(BD?233000-對于枯草芽孢桿菌(B.subtilis))

Difco營養瓊脂(BD?212000-對于枯草芽孢桿菌(B.subtilis))

方法

試劑的準備

為了準備供DH5-α生長用的平板,在每1公升MilliQ水中加入40g?Difco?LB瓊脂。對液體環境(liquid?setting)進行高壓滅菌。當裝有溶液的容器冷卻時,倒入100mm陪替氏培養皿內,讓蓋子稍稍合上一些以防水分隨著瓊脂凝結越聚越多(leave?lids?slightly?off?to?prevent?build?up?of?moisture?as?agar?gels)。使在瓊脂凝固之前形成的氣泡劈劈啪啪地破掉(Pop?bubbles?that?form?prior?to?the?agar?setting)。4℃保存。

為了準備供DH5-α生長用的培養基,在每1公升MilliQ水中加入25g?Difco?LB肉湯。對液體環境進行高壓滅菌。

為了準備供枯草芽孢桿菌生長用的平板,在每1公升MilliQ水中加入23g?Difco營養瓊脂。對液體環境進行高壓滅菌。當裝有溶液的容器冷卻時,倒入100mm培養皿內,讓蓋子稍稍合上一些以防水分隨著瓊脂凝結越聚越多。使在瓊脂凝固之前形成的氣泡劈劈啪啪地破掉。4℃保存。

為了準備供枯草芽孢桿菌生長用的培養基,在每1公升MilliQ水中加入8g?Difco營養肉湯。對液體環境進行高壓滅菌。

細菌的準備

在細胞毒性測定開始前兩天,把DH5-α和枯草芽孢桿菌接種到1ml相應培養基(來自甘油貯液)中,讓其在振蕩下于37℃生長一整天。

每種細菌用無菌接種環在適當的瓊脂平板上劃線,讓其在細菌培養箱中于37℃生長過夜。

用無菌接種環挑取細菌的一個單菌落,接種5ml相應培養基(在14ml帶快速壓緊帽的管(snap?cap?tube)內)中。在振蕩下于37℃生長過夜(~16h)。

第二天,測量培養物的OD600nm,以確保細菌處于指數生長期(OD600nm=0.4-0.8)。

細胞毒性測定(1)

把5ml?DH5-α和枯草芽孢桿菌的培養物稀釋至OD600nm為0.002,OD600nm為0.002相當于足夠完成實驗的體積中有約2x106細胞/ml(取決于板的數量)。取50μl加到X?96孔板的各孔(X=給定實驗所需的板的數量)。

化合物將按表2從0.005-50μM開始以3倍稀釋度加入到各板中。

將貯液在LB肉湯或營養肉湯中稀釋(分別用于DH5-α和枯草芽孢桿菌研究),制備用于試驗的化學藥品。細胞用以下方案中給出的最終化學藥品濃度(表2)進行處理。貯液在DMSO中制得。典型地,將化學藥品制成20mM貯液。然而,這種濃度取決于給定化學藥品的溶解度,因此在實驗時必須注意實際貯液濃度。

表4.實驗板與化學藥品終濃度的方案

每種待測的文庫化學藥品在96孔板中要求有兩行,因此4種化學藥品(例如W,X,Y,Z)可以在一個板中同時進行試驗。除了試驗化學藥品之外,每個板還應當包括陽性對照和陰性對照。用100μg/ml氨芐西林作為陽性對照。用DMSO作為陰性對照,其用量等于所用試驗化合物的最大體積(~0.25%DMSO,對于50μM)。

把待加到板中的化學藥品稀釋液用適當的細菌培養基制成2X濃度,然后按體積為50μl加到相應孔中。

化學藥品用適當的細菌培養基從50μM開始稀釋成3倍系列稀釋液(例如最高濃度的2X,例如50μM的2X=100μM)。需要最高2X濃度300μl以便使用1/3來得到第1稀釋度,而對于所有后續稀釋都用200μl培養基。最高2X濃度100μl與200μl培養基混合,然后將第1稀釋度100μl與200μl培養基混合產生下一個稀釋度。重復這個過程直到所有10個2X劑量全都制得。

除了在每個板的一個濃度中加入的陽性對照物之外,還在全部濃度范圍內向各測定操作中加入了陽性對照氨芐西林(3倍稀釋液),以確保既正確又穩健的測定性能(在操作中通過比較劑量反應曲線來估計)。

在向含有細菌的96孔板中加入咔唑化合物之后,把板移到37℃細菌培養箱孵育48小時。在孵育之后,測量96孔板中每個孔的OD600mm。

數據分析

將試驗化合物溶液的平均OD600nm與DMSO對照的平均OD600nm進行比較,即把試驗溶液的平均OD600nm除以DMSO對照的平均OD600nm,再乘以100,得出%DMSO對照(即%細胞毒性)。把%DMSO對照對化合物濃度作圖,繪出S形曲線。在三輪試驗完成之后,所有三輪試驗的原始數據全都用來進行IC50計算。

試驗結果表明,實施例15、7、4、12、13、17和18咔唑化合物和化合物18c-1都證明有不同功效的對抗枯草芽孢桿菌和HB?101大腸桿菌的抗菌效果。革蘭氏陽性(+)菌似乎對本發明的咔唑化合物更敏感。另外,所述咔唑化合物中的幾種,例如實施例15和17,抗細菌比抗氨芐西林對照更有效。因此,本發明的咔唑化合物證明有確定的抗細菌活性。

關 鍵 詞:
化合物 及其 治療 用途
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:咔唑化合物及其治療用途.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6418647.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大