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來自人單核細胞的治療用干細胞及其誘導方法.pdf

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來自 單核 細胞 治療 干細胞 及其 誘導 方法
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摘要
申請專利號:

CN200980146977.1

申請日:

2009.11.19

公開號:

CN102245757B

公開日:

2014.11.26

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 5/078申請日:20091119|||公開
IPC分類號: C12N5/078; A61K35/28; A61P43/00; C12N15/09 主分類號: C12N5/078
申請人: 大塚制藥株式會社
發明人: 平野尚伸; 大久保悌; 佐佐木賢次郎; 石山廣信
地址: 日本東京都
優先權: 2008.11.25 JP 2008-299359
專利代理機構: 北京市金杜律師事務所 11256 代理人: 楊宏軍
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200980146977.1

授權公告號:

102245757B||||||

法律狀態公告日:

2014.11.26|||2012.02.08|||2011.11.16

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種干細胞,是在(i)M-CSF及(ii)選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種存在下培養單核細胞,使其去分化而得到的。另外本發明還涉及與細胞、組織或器官的損傷有關的疾病的治療劑、細胞藥物用劑、干細胞的生產方法、單核細胞的去分化誘導培養基、去分化誘導劑、細胞藥物用試劑盒或產生去分化細胞的試劑盒及藥物組合物。

權利要求書

1.一種干細胞,是在(i)M-CSF及(ii)選自神經節苷脂及水溶性
植物提取物中的至少1種存在下培養單核細胞,使其去分化而得到
的。
2.如權利要求1所述的干細胞,其中,水溶性植物提取物的使
單核細胞去分化的有效成分為糖或含糖復合物。
3.如權利要求1所述的干細胞,其中,水溶性植物提取物的使
單核細胞去分化的有效成分的分子量為1000~500000。
4.如權利要求1所述的干細胞,其中,水溶性植物提取物的使
單核細胞去分化的有效成分吸附在ConA柱上。
5.如權利要求1所述的干細胞,其中,水溶性植物提取物的使
單核細胞去分化的有效成分吸附在陰離子交換樹脂上。
6.如權利要求1所述的干細胞,其中,水溶性植物提取物是來
自植物的Folch提取的水相級分或其純化物。
7.如權利要求1所述的干細胞,其中單核細胞為人單核細胞。
8.如權利要求1~7中任一項所述的干細胞,其特征在于,未
分化標記Nanog、Nestin、c-Kit、CD9、Oct3/4中的至少一種被表達,
且與在M-CSF單獨存在下培養單核細胞時所得的干細胞相比,
CXCR4基因顯著地強表達。
9.一種干細胞,其特征在于,未分化標記Nanog、Nestin、c-Kit、
CD9、Oct3/4中的至少1種被表達,且CXCR4基因顯著地強表達。
10.一種干細胞的生產方法,其特征在于,在(i)M-CSF及(ii)
選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種存在下培養單核
細胞。
11.如權利要求10所述的方法,其中,培養時間為7天~14天。
12.一種單核細胞的去分化誘導培養基,含有(i)M-CSF及(ii)
選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種。
13.一種藥物組合物,含有權利要求1~9中任一項所述的干細
胞作為有效成分。
14.一種細胞藥物用劑,含有權利要求1~9中任一項所述的干
細胞作為有效成分。
15.一種去分化誘導劑,含有(i)M-CSF及(ii)選自神經節苷脂
及水溶性植物提取物中的至少1種作為有效成分。
16.一種與細胞、組織或器官的損傷有關的疾病的治療劑,以
選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種作為有效成分。
17.如權利要求16所述的治療劑,其中,所述疾病選自外傷、
炎癥性疾病、骨·軟骨的損傷、循環系統疾病、神經障礙、肝病及腎
病、糖尿病、特應性皮炎、GVHD。
18.如權利要求16所述的治療劑,其中,所述疾病選自外傷、
胰腺炎、放射線損傷、皮肌炎、多發性肌炎、壞死性筋膜炎、慢性
支氣管炎、骨折、骨質疏松癥、骨軟骨骨折、骨軟骨炎、擴張型心
肌病、心肌梗塞、缺血性心肌病、心功能不全、心肌肥大、充血性
心功能不全、再狹窄、心律不齊、動脈粥樣硬化、血管炎、周圍神
經病變、神經病理性疼痛、腦卒中、腦炎、腦膜炎、糖尿病性神經
病、注意缺陷障礙、自閉癥、阿爾茨海默病、帕金森病、克雅氏病、
腦或脊髓外傷或缺血、肝硬化、慢性肝炎、慢性腎功能不全、腎小
球腎炎、腎缺血、糖尿病、特應性皮炎、GVHD。
19.一種細胞藥物用試劑盒,至少含有權利要求1~9中任一項
所述的干細胞作為必要構成成分。
20.一種產生去分化細胞的試劑盒,以(i)M-CSF及(ii)選自神
經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種作為必要構成成分。
21.如權利要求20所述的試劑盒,進一步含有單核細胞作為構
成成分。
22.如權利要求1~21中任一項所述的干細胞、干細胞的生產
方法、單核細胞的去分化誘導培養基、細胞藥物用劑、治療劑、去
分化誘導劑、細胞藥物用試劑盒或產生去分化細胞的試劑盒,其中,
神經節苷脂為選自GD1a、GD1b、GD2、GD3、GM1、GM2、GM3、
GT1b及GQ1b中的至少1種。

說明書

來自人單核細胞的治療用干細胞及其誘導方法

技術領域

本發明涉及一種通過使在生物體內正常分化的細胞在短時間內
去分化而提供能夠用于細胞藥物的細胞的方法。另外,本發明涉及
一種與細胞、組織或器官的損傷有關的疾病的治療劑。進而,本發
明涉及有效誘導細胞去分化的細胞藥物用劑、干細胞的生產方法、
單核細胞(monocytes)的去分化誘導培養基、去分化誘導劑、細胞
藥物用試劑盒或產生去分化細胞的試劑盒、藥物組合物,并涉及一
種干細胞。

背景技術

作為對疾病的根本的治療方法,補充由于某些原因引起的組織
中喪失的細胞的方法即再生醫療很久以來備受關注。但是,近年細
胞藥物的概念更加廣受關注,所述細胞藥物是通過注入干細胞或者
組織細胞的前體細胞而在疾病部位再生并通過細胞間生理活性物質
的相互作用修復組織。

與此相對應,已經出現了許多關于下述內容的報道:組織中的
分化細胞例如來自末梢血的單核細胞通過在特定的細胞因子的存在
下進行培養,去分化為干細胞。

但是,當以干細胞或組織前體細胞作為細胞藥物給與生物體時,
細胞到達目標損傷部位的百分率未必高,而且不恒定。因此,存在
必須準備大量細胞的問題。另外,還未詳細研究分布在目標部位之
外的部分的細胞在該部位如何作用,存在產生副作用的問題。進而,
為了提高治療效果必須給與大量細胞,但認為難以在短時間內得到
自體細胞。

近年,已經明確了下述現象的產生:在損傷部位在缺血狀態下
SDF1(來自基質細胞的因子1)或VEGF(血管內皮細胞生長因子)
表達,這些分子成為生物體內修復系統的一個環節的誘導分子,與
這些誘導分子對應的表達受體的細胞被引到損傷部位(所謂歸巢)。
關于上述受體,與SDF1對應的為CXCR4,與VEGF對應的為
VEGFR。例如,非專利文獻1報道了在缺血部位阻擋SDF1、或從血
液中除去CXCR4表達細胞時,傷不能治愈。

Fandrich和Huberman(非專利文獻2、3)等已經報道了通過對
人單核細胞進行去分化誘導而得到具有多分化能的干細胞的技術。
上述技術均使用以M-CSF為代表的各種細胞因子用于培養。上述培
養方法中,均確認了一些未分化標記轉化為陽性。另外,桑名等(非
專利文獻4)報道了使用涂布有纖連蛋白的培養皿能夠由人單個核細
胞(mononuclear?cells)誘導多能干細胞MOMC。

非專利文獻1:Nat.Med.2004?Aug;10(8):858-64

非專利文獻2:Ruhnke?M,Fandrich?F.,Differentiation?of?in?
vitro-modified?human?peripheral?blood?monocytes?into?hepatocyte-like?
and?pancreatic?islet-like?cells.,Gastroenterology.128(2005)1774

非專利文獻3:Yong?Zhao,Eliezer?Huberman,A?human?peripheral?
blood?monocyte-derived?subset?acts?as?pluripotent?stem?cells,PNAS?
100(2003)2426

非專利文獻4:Kuwana?M.et?al.,Human?circulating?CD14+?
monocytes?as?a?source?of?progenitors?that?exhibit?mesenchymal?cell?
differentiation.

J?Leukoc?Biol.74(2003)833

非專利文獻5:Folch?J.,Lees?M.,Sloane-Stanley?G.H.:A?simple?
method?for?the?isolation?and?purification?of?total?lipids?from?animal?
tissues,J.Biol.Chem.,226,497-509(1957).

發明內容

本發明的目的在于提供一種干細胞、干細胞的短期大量制造方
法、及用于誘導該細胞的藥物組合物,所述干細胞已經成為細胞藥
物領域中的挑戰,能夠有效地到達目標部位。

另外,本發明的目的在于提供一種與細胞、組織或器官的損傷
有關的疾病的治療劑。

進而,本發明的目的在于提供去分化誘導培養基、去分化誘導
劑、細胞藥物用試劑盒或產生去分化細胞的試劑盒及干細胞。

作為解決上述課題的方法,本發明發現通過使用末梢血單核細
胞、在本發明去分化誘導劑的存在下進行短時間培養,能夠大量誘
導去分化細胞。另外發現通過直接對生物體給與本發明的藥物組合
物,能夠有效地治療與損傷有關的疾病。進而發現通過給與選自神
經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種,可能與生物體內的
M-CSF協作,能夠將單核細胞誘導為干細胞等能夠修復細胞、組織
或器官的損傷的細胞,由此,本發明能夠提供與細胞、組織或器官
的損傷有關的疾病的治療劑。

即,具體而言,本發明提供以下發明。

項1.一種干細胞,所述干細胞是在(i)M-CSF及(ii)選自神經節
苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種存在下培養單核細胞,使其
去分化而得到的。

項2.如項1所述的干細胞,其中,水溶性植物提取物的使單核
細胞去分化的有效成分為糖或含糖復合物。

項3.如項1所述的干細胞,其中,水溶性植物提取物的使單核
細胞去分化的有效成分的分子量為1000~500000。

項4.如項1所述的干細胞,其中,水溶性植物提取物的使單核
細胞去分化的有效成分吸附在ConA柱上。

項5.如項1所述的干細胞,其中,水溶性植物提取物的使單核
細胞去分化的有效成分吸附在陰離子交換樹脂上。

項6.如項1所述的干細胞,其中,水溶性植物提取物是來自植
物的Folch提取的水相級分(fraction)或其純化物。

項7.如項1所述的干細胞,其中單核細胞為人單核細胞。

項8.如項1~7中任一項所述的干細胞,其特征在于,表達未
分化標記Nanog,Nestin,c-Kit,CD9,Oct3/4中的至少一種,與在
M-CSF單獨存在下培養單核細胞時所得的干細胞相比,CXCR4基因
顯著地強表達。

項9.一種干細胞,其特征在于,表達未分化標記Nanog,Nestin,
c-Kit,CD9,Oct3/4中的至少1種,并且CXCR4基因顯著地強表達。

項10.一種干細胞的生產方法,其特征在于,在(i)M-CSF及
(ii)選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種存在下培養單
核細胞。

項11.如項10所述的方法,其中,培養時間為7天~14天。

項12.一種單核細胞的去分化誘導培養基,含有(i)M-CSF及
(ii)選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種。

項13.一種藥物組合物,含有項1~9中任一項所述的干細胞作
為有效成分。

項14.一種細胞藥物用劑,含有項1~9中任一項所述的干細胞
作為有效成分。

項15.一種去分化誘導劑,含有(i)M-CSF及(ii)選自神經節苷
脂及水溶性植物提取物中的至少1種作為有效成分。

項16.一種與細胞、組織或器官的損傷有關的疾病的治療劑,
含有選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種作為有效成
分。

項17.如項16所述的治療劑,其中,所述疾病選自外傷、炎癥
性疾病、骨·軟骨的損傷、循環系統疾病、神經障礙、肝病及腎病、
糖尿病、特應性皮炎、GVHD。

項18.如項16所述的治療劑,其中,所述疾病選自外傷、胰腺
炎、放射線損傷、皮肌炎、多發性肌炎、壞死性筋膜炎、慢性支氣
管炎、骨折、骨質疏松癥、骨軟骨骨折、骨軟骨炎、擴張型心肌病、
心肌梗塞、缺血性心肌病、心功能不全、心肌肥大、充血性心功能
不全、再狹窄、心律不齊、動脈粥樣硬化、血管炎、周圍神經病變、
神經病理性疼痛、腦卒中、腦炎、腦膜炎、糖尿病性神經病、注意
缺陷障礙、自閉癥、阿爾茨海默病、帕金森病、克雅氏病
(Creutzfeldt-Jakob?disease)、腦或脊髓外傷或缺血、肝硬化、慢性
肝炎、慢性腎功能不全、腎小球腎炎、腎缺血、糖尿病、特應性皮
炎、GVHD。

項19.一種細胞藥物用試劑盒,含有至少項1~9中任一項所述
的干細胞作為必要構成成分。

項20.一種產生去分化細胞的試劑盒,含有(i)M-CSF及(ii)選
自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種作為必要構成成分。

項21.如項20所述的試劑盒,進一步含有單核細胞作為構成成
分。

項22.如項1~21中任一項所述的干細胞、干細胞的生產方法、
單核細胞的去分化誘導培養基、細胞藥物用劑、治療劑、去分化誘
導劑、細胞藥物用試劑盒或產生去分化細胞的試劑盒,其中,神經
節苷脂為選自GD1a、GD1b、GD2、GD3、GM1、GM2、GM3、GT1b
及GQ1b中的至少1種。

根據本發明,能夠使用單核細胞在短時間內大量供給能夠到達
組織損傷部位的干細胞。另外,本發明也能夠提供該干細胞誘導劑,
能夠期待本發明為細胞藥物領域做出貢獻。

進而,證明了神經節苷脂及水溶性植物提取物例如來自植物的
Folch提取的水相級分(fraction)或其純化物能夠作為與細胞、組織
或器官的損傷有關的疾病的治療劑。

附圖說明

[圖1]表示通過在培養基1~培養基5中培養由單核細胞誘導
得到的干細胞的增殖曲線。

[圖2]表示利用RT-PCR的基因表達的結果。

[圖3]表示通過添加各神經節苷脂對去分化為干細胞的作用。

[圖4]表示添加各神經節苷脂后的細胞形態。

[圖5]表示各植物提取成分中的去分化誘導活性。

[圖6]表示來自甘薯莖提取物的去分化誘導成分的利用各種色
譜法得到的餾化的活性結果。

[圖7]表示小鼠肝組織中的抗膠原抗體的染色圖像。

具體實施方式

本發明使用單核細胞例如末梢血單核細胞作為被去分化的細
胞。

本發明中使用的單核細胞來自哺乳動物。作為哺乳動物,可以
舉出人、馬、牛、猿、黑猩猩、豬、羊、兔、小鼠、大鼠、狗、貓
等,優選可以舉出人、猿、黑猩猩等靈長類,特別優選人單核細胞。
單核細胞來自骨髓、血液等,優選使用來自血液的單核細胞,特別
優選使用末梢血單核細胞。

從血液等樣品中分離單核細胞的方法是公知的,例如存在下述
方法:使用血細胞分離溶液LymphoprepTM(Cosmo?Bio?Co.Ltd.)分
離單個核細胞(mononuclear?cells),使用能夠識別CD14的表面抗
原的抗體磁珠(Miltenyi?Viotec公司)處理所得的單個核細胞;或者
也可以將單個核細胞直接用作本發明的單核細胞的供給源。

或者,人單核細胞也可以使用市售品。作為市售品,例如可以
舉出PT038(LONZA公司)等。

本發明設想如下:將單核細胞去分化為干細胞,使其增殖后將
其返回到人等受檢體。此時,由于從患者分離單核細胞,所以需要
由盡可能少的量的單核細胞得到大量的干細胞。根據本發明,去分
化單核細胞得到干細胞的增殖效率高,能夠由少量的單核細胞制備
大量的干細胞,故優選。

作為單核細胞,包含具有M-CSF受體(c-fms)的單核細胞類細
胞(單核細胞、單個核細胞、原單核細胞(monoblasts))。由于同
時使用單核細胞和單個核細胞時,只有增殖單核細胞,所以不僅可
以使用單核細胞而且可以使用單個核細胞作為去分化的對象細胞。

本說明書中,所謂“干細胞”是指表達未分化標記并且具有自
我復制能力的細胞。本發明的干細胞可以由單核細胞大量地獲得。
另外,本發明的干細胞能夠誘導分化,優選具有多能分化能。本發
明中得到的干細胞為CD14及CD45陽性。

作為本發明的干細胞的特征,可以舉出CXCR4基因的顯著的強
表達;和Nanog,Nestin,c-Kit,CD9及Oct3/4的至少1種、優選至少
2種、較優選至少3種、更優選至少4種、特別優選Nanog,Nestin,c-Kit,
CD9及Oct3/4全部基因被表達。

優選的本發明的干細胞,與在M-CSF單獨存在下培養單核細胞
時所得的干細胞相比,CXCR4基因顯著地強表達,并且Nanog,Nestin,
c-Kit,CD9及Oct3/4基因的至少1種、優選至少2種、較優選至少3
種、更優選至少4種、特別優選5種全部被表達。

在較優選的實施方案中,本發明干細胞的特征列舉如下:

(i)與在M-CSF單獨存在下培養單核細胞時得到的干細胞相比,
CXCR4基因顯著地強表達;

(ii)表達c-Kit;及

(iii)表達選自Nanog,Nestin,CD9及Oct3/4中的至少1種的未分
化標記。

本發明的來自單核細胞的干細胞與其他的去分化干細胞的區別
特征為與細胞的歸巢作用有關的CXCR4基因的強表達。本發明干細
胞與在M-CSF單獨存在下培養單核細胞所得的干細胞相比,CXCR4
基因顯著地強表達。例如,本發明的優選實施方案之一中,本發明
的干細胞用RT-PCR解析時,CXCR4基因的表達量為在M-CSF單獨、
M-CSF+IL-3、M-CSF+IL-6&LIF等存在下培養單核細胞所得的表達
量的3倍以上、特別為4倍以上。另外,本發明的優選實施方案之
一中,本發明的干細胞即使與來自骨髓的間充質干細胞相比,CXCR4
基因也顯著地強表達,具體而言,用RT-PCR解析時,CXCR4基因
的表達量為來自骨髓的間充質干細胞的2倍以上,優選為3倍以上。

本發明的來自單核細胞的干細胞的特征在于與其他的去分化干
細胞同樣表達作為干細胞標記的c-Kit。

已知CXCR4受體的配體SDF1在骨折和循環系統疾病造成的損
傷組織、或神經組織的損傷部位等表達,從細胞藥物的觀點考慮,
本細胞具有更強的向損傷部位歸巢的效果,因此是有效的。

本發明中得到的干細胞可以通過直接給與/注入患部而用于疾
病的治療。在注入患部之前,優選在適當的培養基中培養干細胞,
在數量增加后直接給與/注入患部。作為干細胞的培養用培養基,
可以使用普通的細胞培養用培養基,但優選在本發明的去分化誘導
培養基中進行培養。

根據本發明的方案之一,作為使用本發明的干細胞能夠治療的
疾病,可以舉出外傷、炎癥性疾病(胰腺炎、放射線損傷、皮肌炎、
多發性肌炎、壞死性筋膜炎、慢性支氣管炎)、骨·軟骨的損傷(例
如骨折、骨質疏松癥、骨軟骨骨折、骨軟骨炎)、循環系統疾病(例
如擴張型心肌病、心肌梗塞、缺血性心肌病、心功能不全、心肌肥
大、充血性心功能不全、再狹窄、心律不齊、動脈粥樣硬化、血管
炎等)、神經障礙(例如周圍神經病變、神經病理性疼痛、腦卒中、
腦炎、腦膜炎、糖尿病性神經病、注意缺陷障礙、自閉癥、阿爾茨
海默病、帕金森病、克雅氏病、腦或脊髓外傷或缺血)、肝病(肝
硬化、慢性肝炎)、腎病(慢性腎功能不全、腎小球腎炎、腎缺血)、
糖尿病、特應性皮炎、GVHD等。

需要說明的是,本發明去分化干細胞于2009年9月30日保藏
在日本國305-8566茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6的獨
立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心。受理編號為
FERM?ABP-11184。

如上所述,可以通過在(i)M-CSF及(ii)選自神經節苷脂及水溶
性植物提取物中的至少1種存在下培養單核細胞,將單核細胞誘導
為干細胞。

本說明書中,所謂水溶性植物提取物是指植物的整體或其一部
分(例如葉、莖、地下莖、根莖、塊莖、藤、根、花、花蕾、花瓣、
子房、果實、莢、蒴果、種子、纖維、胚珠)的提取物。作為提取溶
劑,可以舉出水或含水溶劑(例如含水甲醇、含水乙醇、含水丙醇等
含水醇、含水THF、含水丙酮)、DMF、DMSO、二甲基乙酰胺等極
性溶劑。所謂水溶性植物提取物是指由上述水、含水溶劑或對極性
物質的溶解度大的極性溶劑提取的物質。水溶性植物提取物也可以
如下得到:利用下述溶劑對植物進行提取,之后用水或含水溶劑提
取作為目標的水溶性物質,所述溶劑為氯仿、二氯甲烷等氯化烴;
甲醇、乙醇、丙醇等醇;苯、甲苯等芳香族烴;乙酸乙酯等酯;THF、
乙醚等醚;丙酮、甲基乙基酮等酮;己烷、環己烷等脂肪族或脂環
族烴等。水或含水溶劑、極性溶劑等的提取物,根據需要也可以用
下述溶劑洗滌除去脂溶性成分,所述溶劑為氯仿、二氯甲烷等氯化
烴;苯、甲苯等芳香族烴;乙酸乙酯等酯;THF、乙醚等醚;己烷、
環己烷等脂肪族或脂環族烴。水溶性植物提取物優選為來自植物的
Folch提取的水相級分或其純化物。

Folch提取是指將植物用氯仿∶甲醇=2∶1提取,用水洗滌該混
合溶劑而轉移到水相中的級分。可以使用二氯甲烷、四氯化碳、1,
2-二氯乙烷等其他的氯化烴代替氯仿,也可以使用乙醇、正丙醇、
異丙醇、丁醇等低級醇代替甲醇。另外,氯化烴和醇的比也不限于
上述的2∶1,可以舉出較廣的范圍。此處,氯化烴和醇的混合溶劑對
物質具有較高的溶解能力,可以有效地進行提取。氯化烴和醇的比
率優選為如下比率,即在其中加入水時能夠分離為水相和有機相,
并且能夠將活性物質提取到水相中的比率。加入水不分離為2相時,
也可以加入有機溶劑使其分離為二層。本說明書中,將加入水分離
為二層的水相稱作“來自植物的Folch提取的水相級分”。需要說明
的是,“來自植物的Folch提取的水相級分”,只要具有與其相同的
活性物質即可,包括利用其他方法提取的水相級分。

本發明的水溶性植物提取物含有糖脂樣物質(包括糖脂和糖中
的一者或兩者)作為有效成分。由于該糖脂樣物質在有機溶劑中的
溶解度低,所以水溶性植物提取物優選作為水相級分被分離。進而,
水溶性植物提取物能夠使用離子交換色譜法、親合色譜法等色譜法
進一步純化,可以使用上述純化物作為有效成分。

水溶性植物提取物的有效成分可以只由糖構成,也可以含有糖
和除糖之外的成分(脂質等)兩者。作為糖的構成成分,可以舉出
葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、巖藻糖、脫氧核糖、甘
露糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、纖維二糖、蔗糖、海藻糖、
棉籽糖、蜜二糖、麥芽三糖、松三糖、松二糖、葡萄糖醛酸、半乳
糖醛酸、甘露糖醛酸、艾杜糖醛酸、氨基葡萄糖、半乳糖胺、甘露
糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰甘露糖
胺、神經氨酸、N-乙酰神經氨酸等,它們也可以被硫酸化。優選
它們以低聚糖、多糖、苷或糖脂的形式存在。作為多糖,具體而言
可以舉出糖胺聚糖、α-葡聚糖、β-葡聚糖、果聚糖(levan)、果
聚糖(fructan)、半乳聚糖、甘露聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、果膠
酸、藻酸、果膠物質、瓜爾糖(guaran)、硫酸化多糖、結合有1種或
2種以上的糖殘基的多糖、或以1種或2種以上的上述糖殘基為重復
單元的多糖、多個糖殘基復雜結合的多糖。優選水溶性植物提取物
在提取后用陽離子交換樹脂處理。在實施方案之一中,本發明的水
溶性植物提取物優選含有被陰離子交換樹脂吸附的(在水中具有陰
離子基團)成分作為有效成分。在其他的實施方案中,本發明的水
溶性植物提取物優選含有與Con?A瓊脂糖結合的成分作為有效成
分。在本發明的優選實施方案中,水溶性植物提取物含有被陰離子
交換樹脂吸附、且與Con?A瓊脂糖結合的成分作為有效成分。作為
與Con?A瓊脂糖結合的有效成分,優選含有葡萄糖殘基及/或甘露糖
殘基的多糖或糖(包括糖脂等含糖復合物),特別優選含有甘露糖殘基
的多糖或糖(包括糖脂等含糖復合物)。在優選實施方案中,水溶性植
物提取物含有具有糖殘基且在冷水或熱水中為可溶性(可提取)的成
分,優選舉出分子量的下限為500、1000、2000、3000、4000或5000
左右、上限為500000、300000、200000、100000、80000、60000、
50000、40000、30000或20000左右的含有多糖或復合多糖的成分。

可以通過在選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種
存在下培養單核細胞而將其誘導為干細胞。

生物體內(例如人),由于已經存在M-CSF,所以選自神經節苷
脂及水溶性植物提取物中的至少1種可以作為由單核細胞誘導為干
細胞的誘導劑發揮作用,該干細胞到達疾病部位,作為各種疾病的
治療劑發揮作用。以選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1
種為有效成分的治療劑對下述疾病的治療是有用的:外傷、炎癥性
疾病(胰腺炎、放射線損傷、皮肌炎、多發性肌炎、壞死性筋膜炎、
慢性支氣管炎)、骨·軟骨的損傷(例如骨折、骨質疏松癥、骨軟骨
骨折、骨軟骨炎)、循環系統疾病(例如擴張型心肌病、心肌梗塞、
缺血性心肌病、心功能不全、心肌肥大、充血性心功能不全、再狹
窄、心律不齊、動脈粥樣硬化、血管炎等)、神經障礙(例如周圍
神經病變、神經病理性疼痛、腦卒中、腦炎、腦膜炎、糖尿病性神
經病、注意缺陷障礙、自閉癥、阿爾茨海默病、帕金森病、克雅氏
病、腦或脊髓外傷或缺血)、肝病(肝硬化、慢性肝炎)、腎病(慢
性腎功能不全、腎小球腎炎、腎缺血)、糖尿病、特應性皮炎、GVHD。

以選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種作為有效
成分的治療劑的有效量根據其用法、患者的年齡、性別、疾病的程
度等適當選擇,通常,相對于成人每1kg體重,有效成分的量為
0.0001~100mg左右,優選為0.001~10mg左右,較優選為0.01~5mg
左右。該治療劑可以1天分1~4次給與。

來自植物的Folch提取的水相級分廣泛包括利用同樣的方法提
取得到的植物提取物。需要說明的是,含有來自植物的Folch提取的
水相級分的水溶性植物提取物的有效成分具有與陰離子交換樹脂、
Con?A瓊脂糖結合的性質,可以通過使其經過陽離子交換樹脂來提
高活性。

將本發明的治療劑或藥物組合物以藥物制劑的形式實際使用
時,可以同時使用含有下述成分的有效成分和制劑載體制成通常的
劑型(dosage?form),所述成分含有選自神經節苷脂及水溶性植物提取
物中的至少1種和根據需要使用的M-CSF。該制劑載體根據劑型和
給與方法適當選擇使用,可以舉出通常使用的填充劑、增量劑、粘
合劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑等稀釋劑或賦形劑。

作為本發明劑型,可以根據治療目的選擇各種形式,作為其代
表,可以舉出片劑、丸劑、散劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑、
膠囊劑、栓劑、注射劑(溶液劑、懸浮劑等)、軟膏劑等,它們均
可以通過常規方法、使用上述合適的載體制備。另外,根據需要片
劑可以為進行了通常包衣的片劑,例如可以為糖衣片、明膠衣片、
腸溶衣片、薄膜衣片或雙層片、多層片。本發明藥物以溶液劑、乳
劑、懸浮劑等形式制成注射劑時,優選它們被滅菌且與血液等滲,
因此,本發明藥物組合物中可以含有用于調節等滲性溶液的充足量
的食鹽、葡萄糖或甘油,另外也可以添加通常的助溶劑、緩沖劑、
鎮痛劑等。進而,本發明的藥物組合物中,根據需要也可以含有著
色劑、防腐劑、香料、調味劑、甜味劑等或其他藥物。另外,給與
選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種和M-CSF兩者
時,它們可以同時給與,也可以分別給與。

選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種可以以食品
形式攝取,例如以飲料類或棒(補充棒)等形式攝取。所述食品組合物
可以按照常規方法制備,在其制備中可以適當使用通常熟知的其他
的食品原料(原料成分)、賦形劑、稀釋劑等。

去分化干細胞可以通過在(i)M-CSF及(ii)選自神經節苷脂及水溶
性植物提取物中的至少1種共存下將上述原料細胞培養一定時間進
行去分化誘導而得到。

M-CSF存在分子量約22000的膜結合型和分子量約42000的分
泌型,通過二硫鍵,它們的分子量變為約45000(22000的二聚體)、
約85000(42000的二聚體),也存在85kDa型進一步與蛋白聚糖結合
所得的高分子量型,可以使用上述任一種M-CSF。優選使用分子量
約42000的分泌型、分子量約85000(42000的二聚體)、85kDa型進
一步與蛋白聚糖結合所得的高分子量型。另外,M-CSF的由來,可
以舉出哺乳動物(人、馬、牛、猿、黑猩猩、豬、羊、兔、小鼠、
大鼠、狗、貓),可以優選舉出人、猿、黑猩猩等靈長類,特別優
選人。可以使用通過純化天然物得到的M-CSF,但優選使用通過基
因重組制造的M-CSF。例如,由于已知M-CSF具有至少從N末端
到第153位的氨基酸時,具有與天然型相同程度的比活度,所以可
以使用不具有上述糖鏈的大腸桿菌表達的重組體等。

作為神經節苷脂的種類,只要為GM1,GD1a,GT1b等以下記載
的種類即可,沒有特殊限制。進而可以使用它們的混合物。進而,
來自植物的提取成分(來自植物的糖脂樣物質)也可以顯著地誘導
去分化。另外,也可以使用來自動物組織的提取物(來自動物的糖
脂樣物質)。該提取物可以在用于提取糖脂樣物質的通常的條件下
制備。本發明的藥物的有效成分為神經節苷脂或水溶性植物提取物,
也可以使用含有上述成分的植物提取物、動物組織提取物中的任一
種。例如,動物的腦·神經組織中富含神經節苷脂,可以使用來自
動物的腦·神經組織的提取物作為神經節苷脂。被提取的神經節苷
脂可以被純化。在級分含有具有神經節苷脂的糖脂成分的范圍內,
可以改變純化度。作為提取成分,通常情況下可以使用在糖脂樣物
質被提取的條件下得到的級分。作為天然的提取成分,例如可以舉
出利用了Folch提取法(非專利文獻5)的水相級分。作為動物,可
以優選舉出哺乳動物(牛、豬、兔、羊、馬等),特別優選來自豬的腦·神
經組織的神經節苷脂。另外,也可以使用來自牛奶之類的哺乳動物
的奶的神經節苷脂。

作為神經節苷脂或用作糖脂樣物質的材料的水溶性植物提取
物,可以優選舉出甘薯(sweet?potato)、番薯(Ipomea?Batatas?sp)、牽牛
花(morning-glory)、空心菜(swamp?morning-glory)、槭葉牽牛
(Ivy-leaved?morning?glory)、七爪龍(fingerleaf?morning?glory)、蔦
蘿(cardinal?climber)、藍色牽牛花(blue?morning?glory)、銳葉牽牛
(Ipomoea?congesta)等旋花科、蓮(Nelumbo?nucifera)(蓮藕(lotus?
root))、黃蓮(Nelumbo?lutea)等蓮科、光果龍葵(Solanum?americanum)、
番茄(Solanum?lycopersicum)、乳茄(Solanum?mammosum)、茄子
(Solanum?melongena)、龍葵(Solanum?nigrum)、馬鈴薯(Solanum?
tuberosum)、辣椒(Capsicum?annuum)、小米椒(Capsicum?frutescens)、
洋金花(Datura?metel)、Datura?meteloides、曼陀羅(Datura?stramonium)、
曼陀羅木(Brugmansia?arborea)、大花曼陀羅(Brugmansia?suaveolens)、
掛金燈(Physalis?alkekengi?var.franchetii)、日本走燈蘚(P.japonicum)、
矮牽牛(Petunia?x?hybrida)等茄科植物的提取物。上述植物僅僅是列
舉,可以廣泛使用神經節苷脂或具有糖或糖脂的水溶性植物提取物。
植物可以為葉、莖、地下莖、根莖、塊莖、藤、根、花、花蕾、花
瓣、子房、果實、莢、蒴果、種子、纖維、胚珠、全草等,也可以
提取它們中的任一種。

例如,甘薯、馬鈴薯等薯類未必一定使用球莖部分,也可以使
用它們的葉、莖、地下莖、根莖、塊莖、藤、根、花、花蕾、花瓣、
子房、果實、莢、蒴果、種子、纖維、胚珠、全草等中的任一種。

作為植物,例如為了大量地制造神經節苷脂或糖脂樣物質,也
可以使用引入了必要的基因及/或剔除了非必要基因的基因重組植
物。

神經節苷脂是具有唾液酸的鞘糖脂的總稱,具有GD1a、GD1b、
GD2、GD3、GM1、GM2、GM3、GT1b及GQ1b等種類。另外,各
神經節苷脂具有以下結構。

GD1a=aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-3)]b
DGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer

GD1b=bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]b
DGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer

GD2=bDGalpNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)b
DGlcp(1-1)Cer

GD3=aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer

GM1=bDGalp(1-3)bDGalNAc[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(
1-1)Cer

GM2=bDGalpNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)C
er

GM3=aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer

GT1b=aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)a
Neu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer

GQ?1b=aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[a
Neu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer

aNeu5Ac=5-乙酰基-α-神經氨酸(5-acetyl-α-neuraminic?
acid)

aNeu5Ac9Ac=5,9-二乙酰基-α-神經氨酸
(5,9-diacetyl-α-neuraminic?acid)

bDGalp=β-D-吡喃半乳糖(β-D-galactopyranose)7

bDGalpNAc=N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖
(N-acetyl-β-D-galactopyranose)

bDGlcp=β-D-吡喃葡萄糖(β-D-glucopyranose)

0Cer=神經酰胺(general?N-acylated?sphingoid)

使用的培養基只要是哺乳動物細胞用培養基即可,沒有特殊限
制,例如,可以通過在RPMI?1640,DMEM,EagleMEM,αMEM,IMEM,
M199各培養基中加入1~20%左右的例如FBS,FCS,CS,HS等血清
成分進行培養。作為優選例,可以舉出在含有10%左右FBS的DMEM
培養基中進行培養,但不限于此。進而也可以使用無血清培養基。
作為無血清培養基的例子,可以舉出作為哺乳動物培養用的
UltraCULTURETM,沒有特殊限制。

可以通過在下述培養條件下培養單核細胞而得到去分化干細
胞,所述培養條件為在含有(i)M-CSF及(ii)選自神經節苷脂及水溶
性植物提取物中的至少1種的培養基中,優選在5%CO2存在下、在
37℃下培養7天~14天左右。即,通過在該培養過程中進行去分化,
能夠得到上述本發明的特定的表達未分化標記的干細胞。進而,在
該培養過程中為本發明干細胞的特征的CXCR4基因的表達顯著上
升,即使延長該培養過程,只要CXCR4基因高度表達,則也屬于本
發明干細胞。

另外,在上述條件下培養原料細胞時,最終得到的干細胞數與
在M-CSF單獨或與其他細胞因子組合的情況下進行培養相比,能夠
得到約5倍的干細胞。

需要說明的是,也可以使用M-CSF和選自神經節苷脂及水溶性
植物提取物中的至少1種的以共價或非共價的形式鍵合的復合物作
為去分化誘導劑。

雖然已經報道了即使在M-CSF單獨存在下培養單核細胞也能得
到去分化干細胞,但本發明通過組合(i)M-CSF和(ii)選自神經節苷脂
及水溶性植物提取物中的至少1種,能夠得到顯著強表達CXCR4基
因的干細胞。作為培養條件,可以使用5-100ng/ml濃度的M-CSF、
優選使用25ng/ml的M-CSF進行培養。神經節苷脂可以使用來自植
物、動物等的提取物等的混合物,也可以使用純化天然的神經節苷
脂含有材料得到的物質或化學合成物。

神經節苷脂可以以最終濃度1-100μg/ml左右用于培養基。水溶
性植物提取物可以以最終濃度0.1-100μg/ml左右用于培養基。

選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種的最終濃度
為1-100ug/ml左右。需要說明的是,本說明書中“神經節苷脂”是
指GD1a、GD1b、GD2、GD3、GM1、GM2、GM3、GT1b、GQ1b
等神經節苷脂單品、或它們的混合物。神經節苷脂的量是指其中的
神經節苷脂量,神經節苷脂為多種時是指其總量。

試劑盒

本發明還提供以本發明的干細胞為必要構成成分的細胞藥物用
試劑盒、及以(i)M-CSF及(ii)神經節苷脂或水溶性植物提取物為必要
構成成分的產生去分化細胞的試劑盒。

細胞藥物用試劑盒含有本發明的來自單核細胞的干細胞作為必
要構成成分,根據需要還可以進一步含有下述培養基及培養容器等,
所述培養基含有(i)M-CSF和(ii)選自神經節苷脂及水溶性植物提取物
中的至少1種。或者,試劑盒也可以為填充有來自單核細胞的干細
胞的注射器。

細胞藥物用試劑盒中含有的來自單核細胞的干細胞數為每1個
試劑盒中例如為1×104~1×107個左右。

本發明的產生去分化細胞的試劑盒以(i)M-CSF及(ii)選自神經節
苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種為必要構成成分,進而根據
需要還可以進一步含有細胞培養用培養基、培養容器、單核細胞等。

[產業上的可利用性]

·本細胞的適用領域

本發明可以適用于干細胞能夠適用的全部領域。特別是能夠用
于近年來備受關注的細胞藥物領域,用于該領域時需要短時間內制
備使用細胞。并且,如果考慮到排斥反應的問題,使用自體細胞制
備去分化干細胞然后返還到生物體的方法在安全方面是重要的。因
此,在攝取自體細胞后能夠在短時間以某種程度生產干細胞是重要
的。本發明從該觀點考慮是重要的。

作為本發明的具體使用方案之一,可以進行去分化細胞的靜脈
內給藥。

關于細胞的給與形式,可以為在通過培養得到目標細胞后,按
照合適的常規方法給與使用的細胞。例如,胰蛋白酶處理后,通過
離心分離回收細胞,之后使其分散在適當的等滲液中,然后例如進
行靜脈內給藥。進而,此時也可以添加合適的藥學上允許的載體使
細胞穩定化。

另外,通過培養得到的細胞在從培養液中回收和給與細胞之間
存在時間差時,可以按照常規方法在液氮存在下或-80℃下保存。
優選在將單核細胞去分化培養開始后7天~14天的期間內回收細胞
直接用于目的治療。這是因為CXCR4基因的表達水平在該期間很可
能達到最大限。從該點上考慮,該基因標記的表達水平也可以決定
該干細胞的使用期間而不限于培養期間。

·治療劑/藥物組合物的適用領域

本發明通過將選自神經節苷脂及水溶性植物提取物中的至少1
種和根據需要的M-CSF給與人等哺乳動物,能夠治療外傷、炎癥
性疾病、骨·軟骨的損傷、循環系統疾病、神經障礙、肝病及腎病、
糖尿病、特應性皮炎、GVHD等疾病。這是通過選自神經節苷脂及
來自植物的Folch提取的水相級分中的至少1種和根據需要的
M-CSF的作用,將被給與的受檢體的單核細胞轉化為能夠修復上述
疾病的干細胞,該干細胞移動到疾病部位作為治療劑發揮作用。或
者,也不否定選自神經節苷脂及來自植物的Folch提取的水相級分中
的至少1種直接或間接地作用于單核細胞以外的細胞。

·作為試劑盒的應用

使用本去分化誘導劑制備的去分化干細胞在經過適當的保存處
理后可以用作試劑盒。

另外,去分化誘導劑也同樣地可以作為含有該誘導劑作為必要
構成成分的試劑盒。

[實施例]

以下,基于實施例更詳細地說明本發明,但不言而喻,本發明
并不限于這些實施例。

實施例1

根據本發明,在基礎培養基中添加以下的添加物1~5,對人單
核細胞(LONZA公司、PT038)進行培養(濃度以最終濃度(以下以
“FC”表示)表示)。結果示于圖1。圖1的縱軸相當于活細胞數,橫
軸為培養天數。由結果可知,與Fandrich和Huberman等報道的方法
相比,本發明的來自單核細胞的干細胞的增殖性非常高。

添加物1:M-CSF(FC:25ng/ml)+神經節苷脂(牛腦GD1a
SIGMA)(FC:100ug/ml)

添加物2:M-CSF(FC:5ng/ml)+IL-3(FC:0.5ng/ml)(非專利
文獻2)

添加物3:M-CSF(FC:25ng/ml)+IL-6(FC:20ng/ml)&LIF(FC:
1000unit/ml)(非專利文獻3)

添加物4:M-CSF(FC:25ng/ml)

添加物5:M-CSF(FC:25ng/ml)+糖脂(將植物(甘薯)的1g干燥重
量的Folch提取的水相級分溶解在500ml培養基中而獲得)

需要說明的是,添加物5中使用的Folch提取的水相級分如下制
備:將經冷凍干燥的細胞(甘薯植物組織)在適量的生理鹽水中充
分均化后,與等容量的氯仿·甲醇2∶1溶液劇烈地混合,通過離心分
離分離為有機溶劑相、變性蛋白質相、水相后,使用能夠被提取到
上層的水溶性級分中的成分。

將全部添加物添加到DMEM(20%胎牛血清中,在1.5×105/ml
(200ul/孔、96孔板)濃度下開始培養人單核細胞。使用Promega公
司的CellTiter-GloTM發光法細胞活力檢測試劑盒(Luminescent?Cell?
Viability?Assay)對活細胞數進行定量化。即,每個培養日用生理鹽
水對孔洗滌3次,除去不粘連的細胞,然后將粘連·增殖的細胞定
量化。

另一方面,利用RT-PCR對按照本發明及現有技術的培養方法
得到的干細胞的基因表達進行解析。人單核細胞是在上述條件下并
在1.5×105/ml(6ml/皿、直徑6cm)的濃度下開始培養,第14天回
收mRNA(Invitrogen公司:Micro?Fast?Track?2.0Kit),然后,利用
RT-PCR進行表達量解析。項目及引物的序列信息如下所示。

Nanog?F?5’-GCTTGCCTTGCTTTGAAGCA-3’(序列號1)

R?5’-TTCTTGACTGGGACCTTGTC-3’(序列號2)

Nestin?F?5’-CTCTGACCTGTCAGAAGAAT-3’(序列號3)

R?5’-GACGCTGACACTTACAGAAT-3’(序列號4)

Oct3/4F?5’-GAGCAAAACCCGGAGGAGT-3’(序列號5)

R?5’-TTCTCTTTCGGGCCTGCAC-3’(序列號6)

c-Kit?F?5’-CCAAGTCATTGTTGGATAAG-3’(序列號7)

R?5’-CTTAGATGAGTTTTCTTTCAC-3’(序列號8)

CXCR4

F?5’-ATCTTCCTGCCCACCATCTACTCCATCATC-3’(序列
號9)

R?5’-ATCCAGACGCCAACATAGACCACCTTTTCA-3’
(序列號10)

泳道構成(濃度以最終濃度(以下以“FC”表示)表示)

1:M-CSF(FC:25ng/ml)+神經節苷脂(牛腦GD1a?SIGMA)(FC:
100ug/ml)

2:M-CSF(FC:5ng/ml)+IL-3(FC:0.5ng/ml)(非專利文獻2)

3:M-CSF(FC:25ng/ml)+IL-6(FC:20ng/ml)+LIF(FC:1000unit/ml)
(非專利文獻3)

4:M-CSF(FC:25ng/ml)

5:M-CSF(FC:25ng/ml)+來自植物的Folch提取的水相級分

6:無培養基

7:無培養基

1-6:人單核細胞、7:人骨髓(Clontech公司Human?Bone?Marrow?
Marathon-Ready?cDNA)

結果示于圖2。圖2的結果表明利用本發明(泳道1或泳道5)
得到的干細胞的CXCR4的表達量極高。

接下來,對各種神經節苷脂的干細胞誘導活性進行比較。

即,將神經節苷脂添加到培養基中,使最終濃度為100ug/ml,
培養末梢血單核細胞。

添加rhM-CSF使最終濃度為25ng/ml。結果,利用cell-titer?Glo
(Promega公司)將培養第二周的活細胞數定量化,作為熒光素酶活
性。即,使用GM1、GD1a、GT1b及它們的混合物進行培養,均顯
示出相同程度的強干細胞誘導活性(圖3)。另外,也未觀察到細胞
形態上的差異(照片表示培養第二周)(圖4)。

圖3的泳道構成如下所述(濃度以最終濃度(以下以“FC”表示)
表示)。

1:GM1(FC:25ng/ml)、

2:GD1a(FC:25ng/ml)、

3:GT1b?FC:25ng/ml)、

4:GM1,GD1a,GT1b的等量混合物(Mix)、共計的FC:25ng/ml)、

5:只有M-CSF、

6:只有血清。

各種來自植物的提取物的干細胞誘導活性

從蓮藕、銳葉牽牛的莖的提取均采用與上述甘薯的莖相同的條
件進行。需要說明的是,活性的比較以提取中使用的干燥重量為基
準進行標準化。

比活度是以甘薯莖提取物的細胞增殖活性作為100的值。

如圖5所示,確認了從蓮藕、銳葉牽牛的莖提取的提取物具有
相同的干細胞誘導活性。

該有效成分的特征之一是通過Folch的提取方法主要被提取到
水相中。水溶性植物提取物可以通過若干種柱色譜法進行分餾、分
離或純化。即,水溶性植物提取物的有效成分的特征在于,在廣范
圍的pH范圍內結合到陰離子交換樹脂(Q-瓊脂糖凝膠、DEAE-
瓊脂糖凝膠等)、外源凝集素結合樹脂(Con?A等)上。

圖6表示將提取液涂到與有效成分具有結合能力的樹脂上,評
價流過級分(flow-through?fractions)的活性的結果。結果顯示,由
于有效成分結合到陰離子交換樹脂、Con?A瓊脂糖上,所以流過級
分活性消失。結果也表明通過陽離子交換樹脂消除阻礙因子,因此
活性上升。

以甘薯莖提取物的活性作為100進行計算。流過陽離子交換樹
脂的級分的活性上升表明阻礙物質被除去。流過陰離子交換樹脂、
外源凝集素的Con?A樹脂的級分的活性消失,表明活性因子被保持。

實施例2

干細胞給與動物模型中的治愈效果(使用肝硬化模型小鼠的治
療試驗例)

連續12周每周2次對實驗用小鼠給與四氯化碳(1ml/kg體重)
人為地誘發肝硬化。通過尾靜脈對該肝硬化模型小鼠給與2次(在
給與第1次后1周給與第二次,每1個體1×105細胞)本發明的
來自人單核細胞的去分化干細胞(hMDDSC),給與第2次后的1周后
(首次給與后的2周)取出肝臟,利用組織切片進行病理解析和生
化學分析。有報道指出由四氯化碳誘導的肝炎中,與病毒性肝炎相
同,在炎癥部位SDF1(質細胞衍化因子-1)高表達(Jung?et?al.,
2006),由于本發明的hMDDSC高表達作為SDF1的受體的CXCR4,
所以期待通過hMDDSC與CXCR4的結合,hMDDSC聚集在炎癥部
位,從而達到在組織周圍的治愈效果(Kollet?et?al.,2003;Nervi?et?al.,
2006)。

關于可以利用血中標記檢測的肝功能,GOT/GPT值在結束給與
四氯化碳后迅速降低返回到正常值,因此在2周的治療處置后已經
基本顯示正常值,未觀察到在試驗組間存在測量值的較大差異。但
是,如下所示上述的12周的藥物處理引起了肝組織中嚴重的纖維化,
成為肝硬化狀態。本發明的hMDDSC對在上述肝中生長的纖維狀組
織的降低和除去顯示出明顯的效果。

1.病理組織解析

由取出并被固定的小鼠肝臟制備石蠟切片,利用抗膠原I抗體檢
測作為纖維結構的主成分的膠原纖維(圖7、茶褐色)。同時將細胞
核染成藍色(蘇木精染色)。

上行表示肝硬化誘導后未給與hMDDSC而給與生理鹽水的對照
實驗,下行表示靜脈給與2次hMDDSC的3個例子。通過給與
hMDDSC,利用抗膠原抗體檢測的粗纖維束(上行箭頭)顯著消失。

另外,對相同的肝臟切片進行Azan/Mallory染色,利用圖像解
析顯微鏡(KeyenceBZ9000)計算被染成藍色的纖維組織部分的面積
(表1)。

[表1]

表1.利用Azan/Mallory染色的纖維部分圖像解析結果

??Saline
??hMDDSC
??Normal
??藍色像素
??40006.1
??30676.7
??5718
??SE
??16131.3
??1813.4
??1351.31

n=7,1400000像素/全幀

與未進行四氯化碳處理的正常對照組(Normal)相比,hMDDSC
給與組顯示出其5倍以上的數值,但hMDDSC給與組的纖維組織量
比生理鹽水給與組(Saline)少23%。

2.生化學解析

A)III型原膠原肽

使用相同的小鼠模型在肝硬化治療實驗中測定III型原膠原肽的
血中濃度。III型原膠原肽(Pro-collagen?type?III?peptide(PIIIP))為存
在于膠原前體中的末端肽,膠原產生時作為被消化的肽游離于血中、
組織中,所以可用作反映膠原生產量的標記(Giannini?et?al.,2001)。
從剛進行完2周的治療試驗后的小鼠尾部取血,利用ELISA法
(CUSABIO?CSB-E08095)測定血漿中的PIIIP(表2)。

[表2]

表2.血中III型原膠原肽的量

??Saline
??hMDDSC
??Normal
??ng/mL(血漿)
??283.5
??64.2
??57.45
??SE
??144
??24.15
??29.1

n=7

肝硬化誘導后給與生理鹽水的對照組(Saline)的值為正常對照組
(Normal)小鼠的約5倍,但通過給與hMDDSC,血中原膠原量顯著
減少,顯示出接近健康小鼠的數值。由于生理鹽水給與組顯示出高
值,所以推測停止利用四氯化碳刺激誘發肝硬化后,膠原分子的異
常的高生產仍然持續很長時間。已經發現,通過給與hMDDSC能夠
迅速地抑制上述異常的膠原高生產,使其下降到接近正常水平。

B)羥脯氨酸

為了直接從組織定量肝組織內部的總纖維量,測定作為膠原的
構成分子的羥脯氨酸在肝組織中的含量。將治療處置2周后取出的
肝臟破碎并均化,通過氫氧化鈉處理來分離含有的蛋白質,利用氯
胺T和二甲氨基苯甲醛的羥脯氨酸特異性呈色反應測定羥脯氨酸濃
度(表3、Reddy?et?al,1996)。

[表3]

表3.肝組織中羥脯氨酸的量

??Saline
??hMDDSC
??Normal
??ug/(g)肝
??884.4
??684
??222
??SE
??90.2
??67.0
??8.4

n=7

雖然hMDDSC給與組為正常對照組(Normal)的數值的3倍仍然
顯示出非常高的值,但與生理鹽水給與對象組(Saline)相比,hMDDSC
給與組減少了22.6%,即,在hMDDSC給與組中檢測出了肝纖維化
的改善。

對上述肝硬化模型小鼠從尾靜脈給與甘薯莖的Folch提取的水
相級分6.6mg/kg,結果本發明人確認到肝硬化得以減輕。

3.結論

如上所述,使用本發明的hMDDSC對小鼠肝硬化模型的治療的
特征為,僅以2周給與2次的治療處置,便能大幅度抑制纖維生產,
并且引起纖維組織的除去或減少。結果,對于從肝硬化狀態迅速地
脫離及修復為正常肝組織是有效的,因此,該治療是促進肝再生的
劃時代的治療系統。

4.引用文獻

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Moon?IH,Han?HS.Syngenic?bone?marrow?cells?restore?hepatic?function?
in?carbon?tetrachloride-induced?mouse?liver?injury.Stem?Cells?Dev.
2006,15,687-695.

Kollet?O,Shivtiel?S,Chen?YQ,Suriawinata?J,Thung?SN,Dabeva?
MD,Kahn?J,Spiegel?A,Dar?A,Samira?S,Goichberg?P,Kalinkovich?A,
Arenzana-Seisdedos?F,Nagler?A,Hardan?I,Revel?M,Shafritz?DA,
Lapidot?T.HGF,SDF-1,and?MMP-9?are?involved?in?stress-induced?
human?CD34+?stem?cell?recruitment?to?the?liver.J?Clin?Invest.2003,
112,160-169.

Nervi?B,Link?DC,DiPersio?JF.Cytokines?and?hematopoietic?stem?
cell?mobilization.J?Cell?Biochem.2006,99,690-705.

Giannini?E,Caglieris?S,Ceppa?P,Risso?D,Lantieri?PB,Testa?R.
Serum?pro-collagen?III?peptide?levels?are?related?to?lobular?necrosis?in?
untreated?patients?with?chronic?hepatitis?C.Eur?J?Gastroenterol?Hepatol.
2001,13,137-141.

Reddy?GK,Enwemeka?CS.A?simplified?method?for?the?analysis?of?
hydroxyproline?in?biological?tissues.Clin?Biochem.1996,29,225-229.




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