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用于增強調理吞噬作用的肺炎球菌P4肽在對病原體應答中的應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN200980137625.X

申請日:

2009.07.31

公開號:

CN102186495B

公開日:

2014.11.26

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 38/16申請日:20090731|||公開
IPC分類號: A61K38/16; A61K38/17; A61K31/00; A61K39/00; A61K39/395; A61P31/04; A61P31/00 主分類號: A61K38/16
申請人: 美國政府健康及人類服務部,疾病控制和預防中心
發明人: 埃德溫·W·阿德斯; 高瑞森卡·羅杰姆; 桑德拉·斯特內爾; 喬治·M·卡洛內; 尼可·梅爾尼克; 杰奎琳·S·桑普森; 約瑟夫·E·馬丁尼茲; 朱麗·M·斯金納
地址: 美國佐治亞州
優先權: 2008.07.31 US 61/085,208
專利代理機構: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219 代理人: 張穎;樊衛民
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200980137625.X

授權公告號:

102186495B||||||

法律狀態公告日:

2014.11.26|||2011.11.02|||2011.09.14

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了用于增強對目標病原體的調理吞噬作用的方法。所公開的方法包括向對象給藥分離的P4肽,所述P4肽包括SEQ?ID?NO:1所顯示的氨基酸序列,以及任選的特異性結合目標病原體表面上存在的抗原的分離的調理性抗體或其片段。在某些實例中,也給藥分離的補體蛋白或其片段(例如補體蛋白的C3a、C3b、iC3b、C3d、C4b或C5a片段)。還公開了含有分離的P4肽和特異性結合目標病原體表面上存在的抗原的一種或多種分離的調理性抗體或其片段的組合物。在某些實例中,組合物還包含分離的補體蛋白或其片段,例如C3a、C3b、iC3b、C3d、C4b或C5a中的一種或多種。

權利要求書

1: 一種增強對象對目標病原體的調理吞噬作用的方法, 所述方法包含 : 選擇患有目標病原體感染或具有發生目標病原體感染的風險的治療對象 ; 向對象給藥治療有效量的分離的 P4 肽, 所述 P4 肽包含與 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基 酸序列有至少 95%同一性的氨基酸序列 ; 向對象給藥治療有效量的、 特異性結合目標病原體表面上存在的抗原的一種或多種外 源的分離調理性抗體或其片段, 從而增強對目標病原體的調理吞噬作用。
2: 一種治療和 / 或抑制對象目標病原體感染的方法, 所述方法包含 : 向對象給藥分離的 P4 肽, 所述 P4 肽包含與 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基酸序列有至少 95%同一性的氨基酸序列 ; 向對象給藥特異性結合目標病原體表面上存在的抗原的一種或多種分離的調理性抗 體或其片段, 從而在對象中治療和 / 或抑制目標病原體感染。
3: 一種在對象中增強對不表達肺炎球菌表面黏附素 A(PsaA) 蛋白的目標病原體的調 理吞噬作用的方法, 所述方法包含 : 選擇患有不表達肺炎球菌表面黏附素 A(PsaA) 蛋白的目標病原體感染或有發生所述 目標病原體感染的風險的治療對象 ; 向對象給藥治療有效量的分離的 P4 肽, 所述 P4 肽包含與 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基 酸序列有至少 95%同一性的氨基酸序列, 從而增強對目標病原體的調理吞噬作用。
4: 權利要求 3 的方法, 還包含向對象給藥治療有效量的、 特異性結合目標病原體表面 上存在的抗原的一種或多種外源的分離的調理性抗體或其片段。
5: 權利要求 1-4 任一項的方法, 其中 P4 肽包含 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基酸序列。
6: 權利要求 1-4 任一項的方法, 其中 P4 肽由 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基酸序列構成。
7: 權利要求 1-6 任一項的方法, 還包含向對象給藥治療有效量的用于目標病原體的抗 生素。
8: 權利要求 7 的方法, 其中抗生素包括頭孢曲松。
9: 權利要求 1-8 任一項的方法, 還包含向對象給藥治療有效量的分離的補體蛋白或其 片段。
10: 權利要求 9 的方法, 其中補體蛋白片段補體是 C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a 中的 一種或多種。
11: 權利要求 1-10 任一項的方法, 其中分離的 P4 肽經鼻內途徑、 靜脈內途徑、 局部途 徑、 腸途徑、 腸胃外途徑或玻璃體內途徑中的一種或多種給藥。
12: 權利要求 1-11 任一項的方法, 其中目標病原體是目標細菌病原體。
13: 權 利 要 求 12 的 方 法, 其 中 目 標 細 菌 病 原 體 是 腦 膜 炎 奈 瑟 菌 (Neisseria meningitides)、化 膿 性 鏈 球 菌 (Streptococcus pyogenes) 或 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus)。
14: 權利要求 13 的方法, 其中金黃色葡萄球菌是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)。
15: 權 利 要 求 1-2 任 一 項 的 方 法, 其 中 目 標 病 原 體 是 肺 炎 鏈 球 菌 (Streptococcus pneumoniae)。
16: 權利要求 1-11 任一項的方法, 其中目標病原體是目標病毒病原體或病毒感染的目 標細胞。 2
17: 權利要求 1-11 任一項的方法, 其中目標病原體是目標真菌病原體。
18: 權利要求 1-17 任一項的方法, 其中方法是抑制和 / 或治療目標病原體的感染的方 法。
19: 權利要求 1-18 任一項的方法, 還包含給藥特異性結合一種或多種其他目標病原體 表面上存在的抗原的一種或多種其他外源的分離的調理性抗體, 從而增強對其他目標病原 體的調理吞噬作用。
20: 一種治療組合物, 其包含 : 治療有效量的分離的 P4 肽, 所述 P4 肽包含與 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基酸序列有至 少 95%同一性的氨基酸序列 ; 以及 治療有效量的、 特異性結合目標病原體表面上存在的抗原的一種或多種外源的分離的 調理性抗體或其片段。
21: 權利要求 20 的治療組合物, 其中 P4 肽包含 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基酸序列。
22: 權利要求 20 的治療組合物, 其中 P4 肽由 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基酸序列構成。
23: 權利要求 20-22 任一項的治療組合物, 所述治療組合物還包含治療有效量的用于 目標病原體的抗生素。
24: 權利要求 23 的方法, 其中抗生素包括頭孢曲松。
25: 權利要求 20-24 任一項的治療組合物, 還包含治療有效量的分離的補體蛋白或其 片段。
26: 權利要求 25 的治療組合物, 其中補體蛋白片段是 C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a 中的一種或多種。
27: 權利要求 20-26 任一項的治療組合物, 其中目標病原體是目標細菌病原體。
28: 權利要求 27 的治療組合物, 其中目標細菌病原體是肺炎鏈球菌、 化膿性鏈球菌、 腦 膜炎奈瑟菌或金黃色葡萄球菌。
29: 權利要求 28 的治療組合物, 其中金黃色葡萄球菌是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)。
30: 權利要求 20-26 任一項的治療組合物, 其中目標病原體是目標病毒病原體或病毒 病原體感染的目標細胞。
31: 權利要求 20-26 任一項的治療組合物, 其中目標病原體是目標真菌病原體。
32: 權利要求 20-31 任一項的治療組合物, 其用于制備治療目標病原體感染的藥物。
33: 權利要求 20-31 任一項的治療組合物, 其用作治療目標病原體感染的藥物。
34: 權利要求 20-33 任一項的組合物, 其中組合物被配制用于鼻內、 靜脈內、 局部、 腸、 腸胃外或玻璃體內給藥。

說明書


用于增強調理吞噬作用的肺炎球菌 P4 肽在對病原體應答 中的應用

    與相關申請的交叉參考
     本申請要求 2008 年 7 月 31 日提交的美國臨時專利申請 No.61/085,208 的優先權, 所述申請在此以其全文引為參考。
     技術領域
     本公開涉及用于治療和 / 或預防病原性感染、 具體來說用于增強調理性抗體在病 原體的調理吞噬中的有效性的組合物和方法。背景技術
     在過去的一個世紀中, 對抗感染例如病毒感染、 真菌感染、 細菌感染等的藥劑的開 發, 已在全世界大大增加了平均壽命。 但是, 病原體不斷發展出避開或繞過現有治療方法的 途徑。 例如, 傳統抗生素例如青霉素和相關化合物的廣泛使用, 已導致發展出對這些傳統抗 生素具有抗性的細菌, 例如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)(MRSA) 的出現。同樣地, 病毒病原體例如 HIV, 能夠在幾個復制周期內就獲得對抗病毒劑的抗性。 為了對抗病原體千變萬化的局面和不斷出現的對現有療法的抗性, 制藥公司的標 準做法是開發不斷增加的一系列小分子治療藥劑。作為供選方案, 已經開發了通過引發針 對靶病原體的抗體應答來刺激身體對抗感染的疫苗。
     抗體通過識別并結合病原體上的抗原以促進通過被稱為吞噬作用的過程移除或 “清除” 病原體, 來對抗病原體攻擊執行保護, 在所述吞噬作用中, 吞噬細胞 ( 例如中性粒細 胞和巨噬細胞 ) 識別、 吞食并隨后破壞病原體。但是, 一些病原體, 例如某些細菌, 能夠避開 吞噬作用。 細菌能夠產生抑制吞噬細胞附著的 “莢膜” 。調理性抗體通過在被稱為調理作 用的過程中與莢膜或細菌上的其他靶抗原結合, 來克服這些防御機制。 這觸發了補體級聯, 產生一組具有調理和裂解活性的血清蛋白質。調理性抗體與補體成分例如 C3a 和 C5a 一起 結合細菌, 使細菌極其吸引吞噬細胞, 并增加了細菌從血流的清除率。 最近的研究已經利用 到調理性抗體, 通過純化調理性抗體并向對象給藥這些抗體來治療感染。盡管調理性抗體 的使用在治療和 / 或預防病原體感染方面顯示出一些希望, 但對于增加這些抗體的功效以 例如減少獲得治療有效性結果所需的調理性抗體的量上, 存在著需求。本文公開的方法滿 足了這些需求。
     發明概述
     本文公開的方法涉及增強調理性抗體的調理性質以增加病原體的調理吞噬作用。 這種增強是基于一個意外的發現, 即包含 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基酸序列的 P4 肽增加了 效應細胞將調理性抗體結合的病原體內化的能力。因為 P4 肽以不加區別的方式增加效應 細胞調理吞噬被調理性抗體結合的病原體的能力, 因此通過使用特異性針對任何目標病原 體的調理性抗體, P4 肽能有潛力用于靶向任何目標病原體。在具體實例中, P4 肽與特異性 針對 ( 例如特異性結合 ) 所選目標病原體的調理性抗體共同給藥。因此, 本文公開的方法
     能夠用于抑制和 / 或治療來自任何目標病原體的感染。
     所公開的在對象中增強對目標病原體的調理吞噬作用的方法, 包括向對象給藥治 療有效量的含有 SEQ ID NO : 1 所顯示氨基酸序列的分離 P4 肽。也可以向對象給藥特異性 結合目標病原體表面上存在的抗原的治療有效量的分離的調理性抗體或其片段 ( 或甚至 多種調理性抗體 ), 用來例如靶向目標病原體。 通過給藥 P4 肽, 增加了調理性抗體的調理活 性 ( 不論調理性抗體是由對象產生還是給藥于對象 ), 從而增強了對目標病原體的調理吞 噬作用。在所公開的方法的某些實例中, 還向對象給藥分離的補體蛋白或其片段 ( 例如補 體蛋白的 C3a、 C3b、iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a 片段 )。在所公開的方法的某些實施方案中, 還 向對象給藥抗生素。
     通過使用與所選目標病原體結合的調理性抗體 ( 或與幾種目標病原體結合的抗 體 ), 所公開的方法可用于增強對任何目標病原體的調理吞噬作用, 其中所述目標病原體 是例如目標細菌病原體、 目標病毒病原體、 病毒感染的細胞或目標真菌病原體, 例如在術 語概述中闡釋的目標病原體。在具體實例中, 目標病原體是肺炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae)、 化 膿 性 鏈 球 菌 (Streptococcus pyogenes)、 腦 膜 炎 奈 瑟 菌 (Neisseria meningitides)、 或金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus), 例如耐甲氧西林金黃色葡 萄球菌 (MRSA)。 在某些實例中, 使用藥物增強對任何目標病原體的調理吞噬作用, 用于例如 治療目標病原體的感染, 所述目標病原體是例如目標細菌病原體、 目標病毒病原體、 病毒感 染的細胞或目標真菌病原體, 例如在術語概述中闡釋的目標病原體。
     還公開了用于治療和 / 或抑制目標病原體感染、 用于制造藥物和 / 或用作藥物的 組合物, 例如治療組合物。所公開的治療組合物包含治療有效量的含有 SEQ ID NO : 1 所顯 示氨基酸序列的分離的 P4 肽, 以及治療有效量的特異性結合目標病原體表面上存在的抗 原的一種或多種分離的調理性抗體或其片段。在某些實施方案中, 所公開的治療組合物包 括治療有效量的分離的補體蛋白或其片段, 例如 C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a 中的一種 或多種。在某些實施方案中, 所公開的治療組合物包括治療有效量的抗生素。
     從下面參考附圖進行的詳細描述中, 本發明的上述以及其他的目的、 特點和優點 將變得更加明了。
     附圖簡述
     圖 1A-1C 是一組條形圖, 證實了 P4 介導的體外調理吞噬作用的增 強。圖 1A 是 顯示抗體濃度對調理吞噬作用的影響的條形圖。在 1 ∶ 8 稀釋的 γ- 球蛋白下, 肺炎鏈球 菌 (Streptococcus pneumoniae) 血清型 3(WU2) 的調理吞噬性殺死 (OPK) 與對照相比增加 35%; 這種效應隨著稀釋而滴度下降, 在 1 ∶ 32 稀釋下與對照獲得的結果平行。圖 1B 是顯 示補體對調理吞噬作用的影響的條形圖。 不論是否存在 P4, 體外 OPK 都需要仔兔補體。 無補 體的分析組接受熱失活的補體 (56℃下 30 分鐘 )。圖 1C 是顯示 P4 濃度對調理吞噬作用的 影響的條形圖。 隨著 P4 濃度的增加, 可以觀察到肺炎鏈球菌 (S.pneumonia) 血清型 3(WU2) 與對照相比 OPK 的逐漸增加。使用 1 ∶ 8 稀釋的 γ- 球蛋白作為血清特異性 IgG 的來源。
     圖 2A-2C 是一組條形圖, 證實了通過流式細胞術測定到的 P4 介導的體外調理吞噬 作用的增強。圖 2A 是條形圖, 證實了 P4(100μg/mL) 在 HL-60 衍生的粒細胞中增加呼吸爆 發。使用自產 (in-house) 質量控制血清 (QC2) 測試了用 OXYBURST 標記的肺炎鏈球菌血 清型 23F 莢膜多糖 (Ps) 包被的珠子被粒細胞的調理吞噬性攝取 (OPU)。OXYBURST 信號的峰值位于 1 ∶ 3200 的血清稀釋度處。圖 2B 是條形圖, 證實了在 QC2 存在下, P4(100μg/ mL) 增加了用肺炎鏈球菌血清型 14 的 Ps 包被的珠子被從人類血液新鮮分離的粒細胞的 OPU。圖 2C 是條形圖, 證實了在自產質量控制血清 QC268 存在下, P4(100μg/mL) 增加了用 腦膜炎奈瑟菌 (N.meningitidis)A 的 Ps 包被的珠子被 HL-60 衍生的單核細胞的 OPU。
     圖 3 是證明了 P4 與血清型特異性 IgG 針對致命性鼻內肺炎鏈球菌血清型 3(WU2) 激惹提供保護作用的圖。在激惹后 72 和 96 小時時靜脈內 (iv) 注射 P4(100μg/ 小鼠 ) 和 γ- 球蛋白 (100μL/ 小鼠 ), 提供了針對致命性肺炎鏈球菌 WU2 感染的高度顯著的保護作 用 (80% ; P < .001), 有效性其次的是通過腹膜內 (ip) 途徑給藥 (60% ; P < .001)。
     圖 4 是證實了各種治療分支中的小鼠和對照小鼠在暴露于肺炎鏈球菌血清型 3(WU2) 后的存活率的圖。 P4 和 γ- 球蛋白 (IVIG) 混合物的單劑 iv 注射與頭孢曲松 (Ceft) 的 ip 注射, 與未處理的對照相比提供了非常顯著的保護作用 (100% ; P < 0.05)。
     圖 5 是顯示了對以前用 P4 組合療法援救、 在第 28 天時用肺炎鏈球菌 血清型 3(WU2) 重新感染的小鼠 ( ◆ ) 影響的圖。在 2 天后給藥單劑 P4、 γ- 球蛋白 (IVIG) 和頭 孢曲松。所有動物 (100% ) 都得到保護。
     圖 6 是一組條形圖, 顯示了使用從感染后 1 和 2 小時的小鼠或從未感染小鼠分離 的外周血 PMN 進行的體外調理吞噬性殺死分析 (OPKA) 的結果。γ- 球蛋白 (IVIG) 被用作 血清型特異性抗體的來源。與使用來自未接受 P4 的對照小鼠的 PMN 相比, 加入 P4 使肺炎 鏈球菌血清型 3(WU2) 的調理吞噬殺死增加了≥ 80% (P < 0.05)。
     序列 在隨附的序列名單中列出的氨基酸序列, 使用用于氨基酸的標準三字母編碼來顯示。 SEQ ID NO : 1 是示例性 P4 肽的氨基酸序列。
     詳細描述
     I. 術語概述
     除 非 另 外 指 明, 否 則 技 術 術 語 按 照 常 規 用 法 使 用。 分 子 生 物 學 中 的 常 見 術語的定義可見于: Benjamin Lewin, 《基 因 VII》 (Genes VII), 由牛津大學出版社 (Oxford University Press) 出版, 1999 ; Kendrew 等主編, 《分子生物學百科全書》 (The Encyclopedia of Molecular Biology),由 Blackwell Science Ltd. 出 版, 1994 ;和 Robert A.Meyers 主編, 《分子生物學和生物技術 : 全面桌面參考》 (Molecular Biology and Biotechnology : a Comprehensive Desk Reference), 由 VCH Publishers, Inc. 出版, 1995 ; 以及其他類似參考書。
     當在本文中使用時, 除非上下文明確另有指明, 否則不帶具體數量指示的名詞既 指單數、 也指復數。例如, 術語 “P4 肽” 包括單個或多個肽, 并可以被認為與詞組 “至少一個 P4 肽” 等價。
     本文中使用的術語 “包含” 意味著 “包括” 。因此, “包含 P4 肽” 意味 著 “包括 P4 肽” , 不排除其他要素。
     此外應該理解, 除非另有指明, 否則對于核酸或多肽所給出的所有堿基大小或氨 基酸大小以及所有的分子量或分子質量值, 都是近似值, 提供其是為了說明性目的。 盡管與 本文所述的相似或等價的方法和材料均可以使用, 但下面描述了特別適合的方法和材料。
     在有沖突的情況下, 以本說明書包括術語的解釋為準。此外, 材料、 方法和實例僅僅是說明 性的, 而不打算是限制性的。
     為了便于審閱本公開的各種實施方案, 提供了下列術語的解釋 :
     給藥 : 通過選定的途徑將組合物導入對象中。例如, 如果所選途徑是靜脈內, 那么 通過將組合物導入對象的靜脈中進行組合物給藥。 同樣地, 如果給藥途徑是鼻內, 組合物通 過鼻給藥。
     動物 : 活的多細胞有脊椎或無脊椎生物體, 類別包括例如哺乳動物和鳥類。 術語哺 乳動物包括人類和非人類哺乳動物二者。同樣地, 術語 “對象” 包括人類和獸醫對象, 例如 非人類靈長動物。因此, 向對象給藥可以包括向人類對象給藥。獸醫對象的具體實例包括 家養動物 ( 例如貓和狗 )、 家畜 ( 例如牛、 馬、 豬、 綿羊和山羊 )、 實驗室動物 ( 例如小鼠、 兔、 大鼠、 沙鼠、 豚鼠和非人類靈長動物 ) 以及鳥類、 爬行類和魚類等。
     抗生素 : 抑制細菌生長和 / 或殺死細菌的化合物、 組合物或物質。術語抗生素也 可用于指稱一種以上抗生素。可用于本公開的方法和組合物的抗生素的實例包括但不限 于氨基糖苷類 ( 例如阿米卡星、 慶大霉素、 卡那霉素、 新霉素、 奈替米星、 鏈霉素、 妥布霉素 和巴龍霉素 ) ; 安沙霉素類 ( 例如格爾德霉素和除莠霉素 ) ; 碳頭孢烯類 ( 例如氯碳頭孢、 厄他培南、 多尼培南、 亞胺培南 / 西司他汀和美羅培南 ) ; 頭孢菌素類 ( 例如頭孢羥氨芐、 頭 孢唑啉、 頭孢噻吩、 頭孢氨芐、 頭孢克 洛、 頭孢孟多、 頭孢西丁、 頭孢丙烯、 頭孢呋辛、 頭孢克 肟、 頭孢地尼、 頭孢妥侖、 頭孢哌酮、 頭孢噻肟、 頭孢泊肟、 頭孢他啶、 頭孢布烯、 頭孢唑肟、 頭 孢曲松、 頭孢吡肟和頭孢托羅 ) ; 糖肽類 ( 例如替考拉寧和萬古霉素 ) ; 大環內酯類 ( 例如阿 奇霉素、 克拉霉素、 地紅霉素、 紅霉素、 羅紅霉素、 醋竹桃霉素、 泰利霉素和壯觀霉素 ) ; 單酰 胺菌素類 ( 例如氨曲南 ) ; 青霉素類 ( 例如阿莫西林、 氨芐青霉素、 阿洛西林、 羧芐青霉素、 氯唑西林、 雙氯西林、 氟氯西林、 美洛西林、 甲氧西林、 萘夫西林、 苯唑西林、 青霉素、 哌拉西 林和替卡西林 ) ; 多肽類 ( 例如桿菌肽、 粘桿菌素和多粘菌素 b) ; 喹諾酮類 ( 例如環丙沙星、 依諾沙星、 加替沙星、 左氧氟沙星、 洛美沙星、 莫西沙星、 諾氟沙星、 氧氟沙星、 曲伐沙星、 格 帕沙星和司帕沙星 ) ; 磺胺類 ( 例如磺胺米隆、 百浪多息 ( 已廢止 )、 乙酰磺胺、 磺胺甲噻二 唑、 磺胺二甲異噁唑 ( 已廢止 )、 柳氮磺胺吡啶、 磺胺異噁唑、 甲氧芐啶和甲氧芐啶 - 磺胺甲 基異噁唑 ) ; 四環素類 ( 例如地美環素、 多西環素、 米諾環素、 土霉素和四環素 ) ; 以及其他 ( 例如胂凡納明、 氯霉素、 克林霉素、 林可霉素、 乙胺丁醇、 磷霉素、 夫西地酸、 呋喃唑酮、 異煙 肼、 利奈唑胺、 甲硝唑、 莫匹羅星、 呋喃妥因、 平板霉素、 吡嗪酰胺、 奎奴普汀 / 達福普汀、 利 福平、 甲砜霉素和替硝唑 )。
     抗原 : 能夠在哺乳動物中刺激抗體 ( 例如功能性抗體 ) 產生或 T 細胞應答的化合 物、 組合物或物質, 包括注射、 吸收或通過其他方法導入到哺乳動物中的組合物。實例包括 但不限于含有抗原決定簇、 例如被免疫細胞識別的抗原決定簇的肽類、 脂類、 多糖和核酸。 在某些實例中, 抗原包括源自于目標病原體的肽。示例性病原體包括細菌、 真菌、 病毒和寄 生蟲。 來自目標病原體的抗原可用于產生特異性結合目標病原體并參與對病原體的調理吞 噬作用的調理性抗體。
     抗體 : 免疫球蛋白及其免疫活性部分 (“片段” ), 例如包含與抗原特異性結合 ( 發 生免疫反應 ) 的抗原結合位點的分子。天然存在的抗體 ( 例如 IgG、 IgM 和 IgA) 包括 4 條 多肽鏈, 兩條重鏈 (H) 和兩 條輕鏈 (L) 通過二硫鍵互相連接。其免疫活性部分的實例包括但不限于 Fab、 Fab′、 F(ab′ )2、 Fabc 和 Fv 部分。功能性抗體是特異性結合抗原例如病原 體表面上存在的抗原、 能夠有效允許補體固著、 并且也與效應細胞相互作用的抗體, 其中抗 體與效應細胞的相互作用引起效應細胞將抗體內化以及對病原體的調理吞噬作用。
     細菌病原體 : 引 起 疾 病 的 細 菌 ( 病 原 性 細 菌 )。 可 以 按 照 本 公 開 的 方 法 增 強 針 對 其 調 理 吞 噬 作 用 的 病 原 性 細 菌, 包括但不限于下列細菌中的任一種或多 種(或其任何組合): 鮑 曼 不 動 桿 菌 (Acinetobacter baumanii)、 放線桿菌菌種 (Actinobacillus sp.)、 放 線 菌 綱 (Actinomycetes)、 放 線 菌 屬 (Actinomyces sp.)( 例 如 伊 氏 放 線 菌 (Actinomyces israelii) 和 內 氏 放 線 菌 (Actinomyces naeslundii))、 氣 單 胞 菌 屬 (Aeromonas sp.)( 例 如 嗜 水 氣 單 胞 菌 (Aeromonas hydrophila)、維 羅 納 氣 單 胞 菌 溫 和 生 物 變 種 (Aeromonas veronii biovar sobria)( 溫 和 氣 單 胞 菌 Aeromonas sobria) 和 豚 鼠 氣 單 胞 菌 (Aeromonas caviae))、 嗜吞噬細胞無形體 (Anaplasma phagocytophilum)、 邊 緣 無 漿 體 (Anaplasma marginale)、 木糖氧化產堿 菌 (Alcaligenes xylosoxidans)、 鮑曼不動桿菌 (Acinetobacter baumanii)、 伴放線放 線 桿 菌 (Actinobacillus actinomycetemcomitans)、 芽 孢 桿 菌 屬 (Bacillus sp.)( 例 如炭疽芽孢桿菌 (Bacillus anthracis)、 蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus cereus)、 枯草芽孢 桿 菌 (Bacillus subtilis)、 蘇 云 金 桿 菌 (Bacillus thuringiensis) 和 嗜 熱 脂 肪 芽 孢 桿 菌 (Bacillus stearothermophilus))、 擬 桿 菌 屬 (Bacteroides sp.)( 例 如 脆 弱 擬 桿 菌 (Bacteroides fragilis))、 巴爾通氏體屬 (Bartonella sp.)( 例如桿菌狀巴爾通氏 體 (Bartonella bacilliformis) 和 漢 氏 巴 爾 通 氏 體 (Bartonella henselae))、 雙歧 桿 菌 屬 (Bifidobacterium sp.)、 包 特 氏 菌 屬 (Bordetella sp.)( 例 如 百 日 咳 包 特 氏 菌 (Bordetella pertussis)、 副 百 日 咳 包 特 氏 菌 (Bordetella parapertussis) 和 支 氣 管 炎 包 特 氏 菌 (Bordetella bronchiseptica))、 疏 螺 旋 體 屬 (Borrelia sp.)( 例 如 回 歸 熱 螺 旋 體 (Borrelia recurrentis) 和 伯 氏 疏 螺 旋 體 (Borrelia burgdorferi))、 布 魯 氏 菌 屬 (Brucella sp.) ( 例 如 流 產 布 魯 氏 菌 (Brucella abortus)、 犬布魯氏 菌 (Brucella canis)、馬 爾 他 布 魯 氏 菌 (Brucella melintensis) 和 豬 布 魯 氏 菌 (Brucella suis))、 伯克霍爾德氏菌屬 (Burkholderia sp.)( 例如類鼻疽伯克霍爾德氏 菌 (Burkholderia pseudomallei) 和 洋 蔥 伯 克 霍 爾 德 氏 菌 (Burkholderia cepacia))、 彎曲桿菌屬 (Campylobacter sp.)( 例如空腸彎曲桿菌 (Campylobacter jejuni)、 大腸 彎曲桿菌 (Campylobacter coli)、 紅嘴鷗彎曲桿菌 (Campylobacter lari) 和胎兒彎曲 桿菌 (Campylobacter fetus))、 二氧化碳噬纖維菌屬 (Capnocytophaga sp.)、 人類心桿 菌 (Cardiobacterium hominis)、 沙 眼 衣 原 體 (Chlamydia trachomatis)、 肺炎嗜衣原 體 (Chlamydophila pneumoniae)、 鸚 鵡 熱 衣 原 體 (Chlamydophila psittaci)、 檸檬酸 桿 菌 屬 (Citrobacter sp.)、 伯 納 特 氏 柯 克 斯 氏 體 (Coxiella burnetii)、 棒狀桿菌屬 (Corynebacterium sp.)( 例如白喉棒狀桿菌 (Corynebacterium diphtheriae)、 杰氏棒 狀桿菌 (Corynebacterium jeikeum) 和棒狀桿菌 (Corynebacterium))、 梭狀芽胞桿菌屬 (Clostridium sp.)( 例如產氣莢膜梭狀芽胞桿菌 (Clostridium perfringens)、 艱難梭 狀芽胞桿菌 (Clostridium difficile)、 肉毒梭狀芽胞桿菌 (Clostridium botulinum) 和 破傷風梭狀芽胞桿菌 (Clostridium tetani))、 嚙蝕艾肯氏菌 (Eikenella corrodens)、 腸 桿 菌 屬 (Enterobacter sp.)( 例 如 產 氣 腸 桿 菌 (Enterobacter aerogenes)、集聚 腸 桿 菌 (Enterobacter agglomerans)、陰 溝 腸 桿 菌 (Enterobacter cloacae) 和 大 腸 埃 希 氏 菌 (Escherichia coli), 包括機會致病性大腸埃希氏菌例如腸毒性大 腸 埃 希 氏 菌 (enterotoxigenic E.coli)、 腸 侵 襲 性 大 腸 埃 希 氏 菌 (enteroinvasive E.coli)、 腸致病性大腸埃希氏菌 (enteropathogenic E.coli)、 腸出血性大腸埃希氏菌 (enterohemorrhagic E.coli)、 腸 聚 集 性 大 腸 埃 希 氏 菌 (enteroaggregative E.cColi) 和尿路致病性大腸埃希氏菌 (uropathogenic E.coli))、 腸球菌屬 (Enterococcus sp.) ( 例 如 糞 腸 球 菌 (Enterococcus faecalis) 和 屎 腸 球 菌 (Enterococcus faecium))、 埃 里 希 體 菌 屬 (Ehrlichia sp.)( 例 如 查 菲 埃 里 希 體 (Ehrlichia chafeensia) 和 犬 埃 里 希 體 (Ehrlichia canis))、 豬 紅 斑 丹 毒 絲 菌 (Erysipelothrix rhusiopathiae)、 真 桿 菌 屬 (Eubacterium sp.)、 土 拉 弗 朗 西 斯 菌 (Francisella tularensis)、 具核梭桿 菌 (Fusobacterium nucleatum)、 陰 道 加 德 納 氏 菌 (Gardnerella vaginalis)、 麻疹孿 生 球 菌 (Gemella morbillorum)、 嗜 血 桿 菌 屬 (Haemophilus sp.)( 例 如 流 感 嗜 血 桿 菌 (Haemophilus influenzae)、 杜 克 雷 嗜 血 桿 菌 (Haemophilus ducreyi)、 埃及嗜血桿菌 (Haemophilus aegyptius)、 副流感嗜血桿菌 (Haemophilus parainfluenzae)、 溶血嗜血桿 菌 (Haemophilus haemolyticus) 和副溶血嗜血桿菌 (Haemophilus parahaemolyticus))、 螺桿菌屬 (Helicobacter sp.)( 例如幽門螺桿菌 (Helicobacter pylori)、 同性戀螺桿 菌 (Helicobacter cinaedi) 和 芬 納 爾 螺 桿 菌 (Helicobacter fennelliae))、 金氏金 格 桿 菌 (Kingella kingii)、 克 雷 伯 氏 菌 屬 (Klebsiella sp.)( 例 如 肺 炎 克 雷 伯 氏 菌 (Klebsiella pneumoniae)、 肉芽腫克雷伯氏菌 (Klebsiella granulomatis) 和產酸克雷 伯氏菌 (Klebsiella oxytoca))、 乳酸桿菌屬 (Lactobacillus sp.)、 單核增生性李斯特 菌 (Listeria monocytogenes)、 問號鉤端螺旋體 (Leptospira interrogans)、 嗜肺軍團 菌 (Legionella pneumophila)、 問號鉤端螺旋體 (Leptospira interrogans)、 消化鏈球 菌 屬 (Peptostreptococcus sp.)、 溶 血 曼 海 姆 菌 (Mannheimia hemolytica)、 卡他莫拉 菌 (Moraxella catarrhalis)、 摩根氏菌屬 (Morganella sp.)、 動彎桿菌屬 (Mobiluncus sp.)、 微 球 菌 屬 (Micrococcus sp.)、 分 枝 桿 菌 屬 (Mycobacterium sp.)( 例 如 麻 風 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium leprae)、 結 核 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium tuberculosis)、 副 結 核 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium paratuberculosis)、 胞 內 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium intracellulare)、 鳥 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium avium)、 牛 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium bovis) 和 海 洋 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium marinum))、 支 原 體 菌 屬 (Mycoplasm sp.) ( 例 如 肺 炎 支 原 體 (Mycoplasma pneumoniae)、 人 型 支 原 體 (Mycoplasma hominis) 和 生 殖 道 支 原 體 (Mycoplasma genitalium))、 諾 卡 菌 屬 (Nocardia sp.)( 例 如 星 形 諾 卡 菌 (Nocardia asteroides)、 蓋 爾 森 基 興 諾 卡 菌 (Nocardia cyriacigeorgica) 和 巴 西 諾 卡 菌 (Nocardia brasiliensis))、 奈 瑟 菌 屬 (Neisseria sp.)( 例 如 淋 病 奈 瑟 菌 (Neisseria gonorrhoeae) 和腦膜炎奈瑟菌 (Neisseria meningitidis))、 多殺巴斯 德 桿 菌 (Pasteurella multocida)、 類 志 賀 鄰 單 胞 菌 (Plesiomonas shigelloides)、 普 氏 菌 屬 (Prevotella sp.)、 卟 啉 菌 屬 (Porphyromonas sp.)、 產 黑 普 氏 菌 (Prevotella melaninogenica)、 變形桿菌屬 (Proteus sp.)( 例如普通變形桿菌 (Proteus vulgaris) 和 奇異變形桿菌 (Proteus mirabilis))、 普羅威登斯菌屬 (Providencia sp.)( 例如產堿普羅 威登斯菌 (Providencia alcalifaciens)、 雷氏普羅威登斯菌 (Providencia rettgeri) 和斯氏普羅威登斯菌 (Providencia stuartii))、 銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、 痤瘡丙酸桿菌 (Propionibacterium acnes)、 馬紅球菌 (Rhodococcus equi)、 立克次氏體 菌屬 (Rickettsia sp.)( 例如立氏立克次氏體 (Rickettsia rickettsii)、 小株立克次 氏體 (Rickettsia akari) 和普氏立克次氏體 (Rickettsia prowazekii))、 恙蟲病東方 體 (Orientia tsutsugamushi)( 舊稱 : 恙蟲熱立克次氏體 (Rickettsia tsutsugamushi) 和斑疹傷寒立克次氏體 (Rickettsia typhi))、 紅球菌屬 (Rhodococcus sp.)、 粘質沙雷 氏 菌 (Serratia marcescens)、 嗜 麥 芽 寡 養 單 孢 菌 (Stenotrophomonas maltophilia)、 沙 門 氏 菌 屬 (Salmonella sp.)( 例 如 腸 道 沙 門 氏 菌 (Salmonella enterica)、 傷寒沙 門 氏 菌 (Salmonella typhi)、 副 傷 寒 沙 門 氏 菌 (Salmonella paratyphi)、 腸炎沙門氏 菌 (Salmonella enteritidis)、 豬 霍 亂 沙 門 氏 菌 (Salmonella cholerasuis) 和 鼠 傷 寒 沙門氏菌 (Salmonella typhimurium))、 沙雷氏菌屬 (Serratia sp.)( 例如粘質沙雷氏 菌 (Serratia marcesans) 和 液 化 沙 雷 氏 菌 (Serratia liquifaciens))、 志賀氏菌屬 (Shigella sp.)( 例如痢疾志賀氏菌 (Shigella dysenteriae)、 福氏志賀氏菌 (Shigella flexneri)、 鮑氏志賀氏菌 (Shigella boydii) 和索氏志賀菌 (Shigella sonnei))、 葡萄球 菌屬 (Staphylococcus sp.)( 例如金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 表皮葡萄 球菌 (Staphylococcus epidermidis)、 溶血性葡萄球菌 (Staphylococcus hemolyticus)、 腐 生 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus saprophyticus))、 鏈 球 菌 屬 (Streptococcus sp.) ( 例 如 肺 炎 鏈 球 菌 (Streptococcus pneumoniae)( 例 如 耐 氯 霉 素 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 4(chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae)、耐 壯 觀 霉 素 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 6B(spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、 耐 鏈 霉 素 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 9V(streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、 耐紅霉素肺炎鏈球菌血清型 14(erythromycin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、耐 奧 普 托 欣 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 14(optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、 耐 利 福 平 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 18C(rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、 耐四環素肺炎鏈球菌血清型 19F(tetracycline-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)、 耐 青 霉 素 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 19F(penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae) 和 耐 甲 氧 芐 啶 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 23F(trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae)、 耐 氯 霉 素 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 4(chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae)、 耐壯觀霉素肺炎鏈球菌血清型 6B(spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、 耐鏈霉素肺炎鏈球菌血清型 9V(streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、耐 奧 普 托 欣 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 14(optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、 耐利福平肺炎鏈 球 菌 血 清 型 18C(rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、 耐青霉素肺炎鏈球菌血清型 19F(penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae) 或耐甲氧芐啶肺炎鏈球菌血清型 23F(trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae))、 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae)、 變形鏈 球菌 (Streptococcus mutans)、 化膿性鏈球菌 (Streptococcus pyogenes)、 A 群鏈球菌(Group A streptococci)、 化膿性鏈球菌 (Streptococcus pyogenes)、 B 群鏈球菌 (Group B streptococci)、 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae)、 C 群 鏈 球 菌 (Group C streptococci)、 咽峽炎鏈球菌 (Streptococcus anginosus)、 類馬鏈球菌 (Streptococcus equismilis)、 D 群鏈球菌 (Group D streptococci)、 牛鏈球菌 (Streptococcus bovis)、 F 群 鏈 球 菌 (Group F streptococci) 和 咽 峽 炎 鏈 球 菌 (Streptococcus anginosus)、 G 群 鏈 球 菌 (Group G streptococci))、 鼠 咬 熱 螺 菌 (Soirillum minus)、 念珠 鏈桿 菌 (Streptobacillus moniliformi)、 密 螺 旋 體 屬 (Treponema sp.)( 例 如 斑 點 病 密 螺 旋 體 (Treponema carateum)、 極 細 密 螺 旋 體 (Treponema petenue)、 梅毒密螺旋體 (Treponema pallidum) 和 地 方 性 密 螺 旋 體 (Treponema endemicum))、 正惠普爾養障 體 (Tropheryma whippelii)、 解 脲 支 原 體 (Ureaplasma urealyticum)、 韋榮氏球菌屬 (Veillonella sp.)、 弧菌屬 (Vibrio sp.)( 例如霍亂弧菌 (Vibrio cholerae)、 副溶血性 弧菌 (Vibrio parahemolyticus)、 創傷弧菌 (Vibrio vulnificus)、 副溶血性弧菌 (Vibrio parahemolyticus)、 創傷弧菌 (Vibrio vulnificus)、 溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus)、 擬 態 弧 菌 (Vibrio mimicus)、霍 氏 弧 菌 (Vibrio hollisae)、河 流 弧 菌 (Vibrio fluvialis)、 麥奇尼科夫氏弧菌 (Vibrio metchnikovii)、 美人魚弧菌 (Vibrio damsela) 和 弗氏弧菌 (Vibrio furnisii))、 耶爾森氏菌屬 (Yersinia sp.)( 例如小腸結腸炎耶爾森氏 菌 (Yersinia enterocolitica)、 鼠疫耶爾森氏菌 (Yersinia pestis) 和假結核耶爾森氏 菌 (Yersinia pseudotuberculosis)), 以及嗜麥芽黃單孢菌 (Xanthomonas maltophilia) 等。 細胞 : 植物、 動物、 昆蟲、 細菌或真菌細胞。
     保守氨基酸取代在本技術領域中是公知的, 其提供功能上類似的氨基酸, 下面的 6 個組每個含有彼此保守取代的氨基酸 :
     1) 丙氨酸 (A)、 絲氨酸 (S)、 蘇氨酸 (T) ;
     2) 天冬氨酸 (D)、 谷氨酸 (E) ;
     3) 天冬酰胺 (N)、 谷氨酰胺 (Q) ;
     4) 精氨酸 (R)、 賴氨酸 (K) ;
     5) 異亮氨酸 (I)、 亮氨酸 (L)、 甲硫氨酸 (M)、 纈氨酸 (V) ; 以及
     6) 苯丙氨酸 (F)、 酪氨酸 (Y)、 色氨酸 (W)。
     蛋白中不是所有的殘基位置都耐受本來是 “保守的” 取代。例如, 如果氨基酸殘基 對于蛋白功能是必需的, 那么即使本來是保守的取代 也可能破壞該活性。
     補體 : 參與免疫防御的血漿蛋白系統。 在被抗原 - 抗體復合物活化后, 補體蛋白裂 解抗原性細胞, 吸引吞噬細胞, 并輔助通過調理吞噬作用破壞抗原性細胞。在哺乳動物中, 補體系統由一系列約 25 種蛋白構成, 所述蛋白通過促進調理吞噬作用或通過刺穿細菌細 胞膜, 在破壞細菌中起到 “補充” 抗體活性的作用。補體還通過例如清除被調理性抗體結合 的病原體, 來幫助身體擺脫抗原 - 調理性抗體復合物。
     補體蛋白以無活性形式在血液中循環。當第一種補體物質被引發時, 通常是由與 抗原互鎖的抗體引發。因為每種組分被相繼激活, 它在被稱為 “補體級聯” 的一系列順序精 確的細致調控的步驟中作用于下一種組分。
     補體片段 ( 例如 C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a, 其在補體活化過程中變得與抗原
     結合 ) 通過結合特異性細胞表面受體 ( 例如中性粒細胞和巨噬細胞上的 Fc 受體和 C3b 受 體, 以及巨噬細胞上的 C3d 受體 ) 觸發調理吞噬作用。在某些實例中, 效應細胞對抗體 / 抗 原復合物的調理吞噬作用的活性被 P4 肽的存在所增強。
     效應細胞 : 能夠結合抗體 / 抗原復合物并將這些復合物內化的細胞。在具體實例 中, 效應細胞表達與抗體 / 抗原復合物結合并促進內化的 Fc 受體, 例如 FcγRI、 FcγRII 和 FcγRIII。在某些實例中, 效應細胞源自于個體的血清 ( 例如外周血白細胞 PBL) 或源自于 體外培養。效應細胞的實例包括但不限于 : 巨噬細胞、 單核吞噬細胞、 自然殺傷細胞和粒細 胞例如中性粒細胞和嗜曙紅細胞。在具體實例中, 效應細胞是分化的人類早幼粒細胞性白 血病細胞, 例如分化的 HL-60 細胞。
     表位 : 抗原決定簇。 它們是具有抗原性、 以便能夠引發特異性免疫應答的分子上的 特定化學基團或肽序列。抗體結合特定抗原性表位,例如病原體表面上的表位。
     外源 : 從其所給藥的對象之外的來源獲得的物質, 例如分離的調理性抗體或其片 段的補體蛋白。例如, 當外源的分離的調理性抗體按照本文描述的方法和組合物給藥于對 象時, 不能獲得該分離的抗體, 例如從它所給藥的同一個對象中分離出。
     真菌病原體 : 引 起 疾 病 的 真 菌。 可 以 按 照 本 公 開 的 方 法 增 強 對 其 調 理 吞 噬 作用的真菌病原體的實例包括但不限于紅色毛癬菌 (Trichophyton rubrum)、 石膏樣 毛 癬 菌 (T.mentagrophytes)、 絮 狀 表 皮 癬 菌 (Epidermophyton floccosum)、 犬小孢子 菌 (Microsporum canis)、 糠 秕 孢 子 菌 (Pityrosporum orbiculare)( 秕 糠 馬 拉 色 癬 菌 Malassezia furfur)、 假 絲 酵 母 屬 (Candida sp.)( 例 如 白 色 假 絲 酵 母 (Candida albicans))、 曲霉屬 (Aspergillus sp.)( 例如煙曲霉 (Aspergillus fumigatus)、 黃曲霉 (Aspergillus fiavus) 和棒狀曲霉 (Aspergillus clavatus))、 隱球菌屬 (Cryptococcus sp.)( 例如新型隱球菌 (Cryptococcus neoformans)、 格特隱球菌 (Cryptococcus gattii)、 羅倫隱球菌 (Cryptococcus laurentii) 和淺白隱球菌 (Cryptococcus albidus))、 組織胞 漿菌屬 (Histoplasma sp.)( 例如莢膜組織胞漿菌 (Histoplasma capsulatum))、 肺孢子蟲 屬 (Pneumocystis sp.)( 例如耶氏肺孢子蟲 (Pneumocystis jirovecii)) 和葡萄穗霉屬 (Stachybotrys)( 例如紙葡萄穗霉 (Stachybotrys chartarum)) 等。
     抑制或治療疾病 : 在處于疾病例如病原體感染如細菌、 真菌或病毒病原體感染的 風險的對象中, 抑制疾病或病癥的全面發生。 “治療” 是指在疾病或病理狀況已經開始發生 后改善其體征或癥狀的治療性干預。術語 “改善” 在指稱疾病或病理狀況時, 是指治療的任 何可觀察到的有益效果。 有益效應可以表現為例如在易感對象中延遲疾病的臨床癥狀的發 生、 降低疾病的一些或所有臨床癥狀的嚴重性、 減慢疾病的發展、 改善對象的整體健康或身 體狀況、 或具體疾病特異性的本技術領 域公知的其他參數。 “預防性” 治療是向未表現出疾 病體征或僅表現出早期體征的對象提供的、 旨在降低發生病癥的風險的治療。
     分離的 : “分離的” 生物組分 ( 例如蛋白, 例如 P4 肽、 抗體或補體蛋白 ) 已經與組分 天然存在于其中的其他生物組分、 例如其他染色體和染色體外 DNA、 RNA 和蛋白質基本上分 離開或從中純化出來。已被 “分離” 的蛋白或肽包括通過標準純化方法純化的蛋白。術語 還包括通過在宿主細胞中重組表達而制備的蛋白或肽, 以及化學合成的蛋白或肽。分離不 要求絕對純度, 并且可以包括至少 50%分離, 例如至少 75%、 80%、 90%、 95%、 98%、 99% 或甚至 100%分離的蛋白或肽分子。調理素 : 變得附著于病原體例如細菌、 真菌或病毒病原體的表面、 被中性粒細胞和 巨噬細胞的表面受體所識別并且增加對微生物的吞噬作用效率的分子。 調理素包括被吞噬 細胞上的 Fcγ 受體所識別的 IgG 抗體, 以及被 CR1(CD35) 和白細胞整合蛋白 Mac-1 所識別 的補體蛋白片段。
     調理吞噬作用 : 在存在特異性血清調理素的情況下, 調理素附著于微生物表面以 靶定微生物用于被效應細胞 ( 例如巨噬細胞和單核細胞 ) 吞噬的過程。調理素包括結合特 定抗原并誘導它們被效應細胞吞噬的任何物質。示例性的調理素包括調理性抗體 ( 特異性 針對抗原的 IgM、 IgG1、 IgG2、 IgG3 和 IgA 免疫球蛋白 ) 和某些補體片段 (C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a, 其在補體活化過程中成為與抗原結合 ), 二者都通過結合特異性細胞表面 受體 ( 例如中性粒細胞和巨噬細胞上的 Fc 受體和 C3b 受體, 以及巨噬細胞上的 C3d 受體 ) 來引發吞噬作用。在某些實例中, 效應細胞對抗體 / 抗原復合物的調理吞噬作用的活性, 被 P4 肽的存在所增強。
     肽: 由化學連接在一起的氨基酸、 氨基酸類似物構成的任何化合物。 本文中使用的 肽包括氨基酸的低聚物、 氨基酸類似物或小和大的 肽, 包括多肽或蛋白。 任何氨基酸鏈, 不 論長度如何或是否翻譯后修飾 ( 例如糖基化或磷酸化 )。 “肽” 適用的氨基酸聚合物是天然 存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物, 以及其中一個或多個氨基酸殘基是非 天然氨基酸的氨基酸聚合物, 例如相應的天然存在的氨基酸的人造化學模擬物。在某些實 施方案中, 肽是 P4 肽, 其可以包括但不限于任何本文描述的修飾。 “殘基” 是指通過酰胺鍵 或酰胺鍵模擬物摻入到多肽中的氨基酸或氨基酸模擬物。肽具有氨基末端 (N- 末端 ) 和羧 基末端 (C- 末端 )。 “肽” 可以與多肽或蛋白互換使用, 并且在本文中可互換地用于指稱氨 基酸殘基的聚合物。
     氨 基 酸 一 般 通 過 酰 胺 連 鍵 (CONH) 化 學 連 接 在 一 起。 此 外, 氨基酸可以 通 過 其 他 化 學 鍵 連 接 在 一 起。 例 如, 用于氨基酸或氨基酸類似物的連鍵可以包括 CH2NH-、 -CH2S-、 -CH2-CH2-、 -CH = CH--( 順式和反式 )、 -COCH2--、 -CH(OH)CH2- 和 -CHH2SO-。 ( 這些和其他連鍵可見于 : Spatola, 《氨基酸、 肽和蛋白質的化學和生物化學》 (Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins), B.Weinstein 主編, Marcel Dekker, New York, p.267(1983) ; Spatola, A.F., Vega Data(1983 年 3 月 ), Vol.1, 第 3 期, “肽骨架修飾” (Peptide Backbone Modifications)( 一般性綜述 ) ; Morley, Trends Pharm Sci pp.463-468, 1980 ; Hudson 等, Int J Pept Prot Res 14 : 177-185, 1979 ; Spatola 等, Life Sci 38 : 1243-1249, 1986 ; Harm J.Chem.Soc Perkin Trans.1307-314, 1982 ; Almquist 等, J.Med.Chem.23 : 1392-1398, 1980 ; Jennings-White 等, Tetrahedron Lett 23 : 2533, 1982 ; Holladay 等, Tetrahedron.Lett 24 : 4401-4404, 1983 ; 以 及 Hruby Life Sci 31 : 189-199, 1982)。
     肽可以通過各種化學技術進行修飾, 以產生具有與未修飾蛋白基本上相同的活 性、 并任選具有其他所需性質的衍生物。 例如, 蛋白的羧酸基團, 不論是羧基末端還是側鏈, 都可以提供成可藥用的陽離子鹽的形式, 或酯化以形成 C1-C16 酯, 或轉變成式 NR1R2 的酰胺, 其中 R1 和 R2 各自獨立地是 H 或 C1-C16 烷基, 或組合形成雜環、 例如 5 或 6 員環。蛋白的氨 基, 不論是氨基末端還是側鏈, 都可以是可藥用的酸加成鹽的形式, 例如 HCl、 HBr、 乙酸、 苯 甲酸、 甲苯磺酸、 馬來酸、 酒石酸和其他有機酸鹽, 或者可以修飾成 C1-C16 烷基或二烷基氨基或進一步轉化成酰胺。
     蛋白側鏈的羥基可以使用公知的技術轉化成 C1-C16 烷氧基或 C1-C16 酯。蛋白側鏈 的苯環或酚環可以用一個或多個鹵素原子例如氟、 氯、 溴或碘取代, 或用 C1-C16 烷基、 C1-C16 烷氧基、 羧酸及其酯或這些羧酸的酰胺取代。 蛋白側鏈的亞甲基可以延長成同源的 C2-C4 亞 烷基。硫醇可以用眾多公知的保護基團中的任一種、 例如乙酰胺基團進行保護。本技術領 域的專業人員還將知道用于將環狀結構導入到肽中以選擇和提供對結構的構型限制、 產生 增加的穩定性的方法。
     可藥用載體 : 可用于本公開的方法的可藥用載體是常規載體。E.W.Martin 的 《Remington 藥物學》 (Remington’ s Pharmaceutical Sciences), Mack Publishing Co., Easton, PA, 第 15 版 (1975 年 ), 描述了適合于肽和蛋白例如 P4 肽、 調理性抗體和補體蛋白 或其片段的藥物遞送的組合物和制劑。
     一般來說, 載體的性質取決于所使用的具體給藥方式。 例如, 腸胃外制劑通常包含 可注射流體, 其包括可藥用和生理可接受的流體例如水、 生理鹽水、 平衡鹽溶液、 葡萄糖水、 甘油等作為介質。 對于固體組合物 ( 例如粉劑、 丸劑、 片劑或膠囊形式 ) 來說, 常規的無毒性 固體載體可以包括例如藥用級甘露糖醇、 乳糖、 淀粉或硬脂酸鎂。除了生物中性載體之外, 待給藥的藥物組合物可以包含少量無毒性輔助物質, 例如潤濕或乳化劑、 防腐劑和 pH 緩沖 劑等, 例如乙酸鈉或失水山梨糖醇單月桂酸酯。
     藥劑或藥物 : 當適當給藥于對象時能夠誘導所需治療或預防效應的化學化合物或 組合物。
     血清型 : 由針對表面上表達的抗原決定簇的抗血清所定義的單細胞生物體、 例如 細菌的基因型。也可以指抗原本身。
     特異性結合 : 當指稱調理素 ( 例如調理性抗體時 ), 是指在蛋白和其他生物物質的 異源群體存在下, 能夠確定靶蛋白、 肽或多糖的存在的結合反應。 因此, 在指定條件下, 抗體 優先結合特定靶蛋白、 肽或多糖 ( 例如病原體表面上存在的抗原, 例如細菌莢膜多糖 ), 而 不以顯著量結合樣品或對象中存在的其他蛋白或多糖。
     序列同一性 / 相似性 : 根據序列之間的同一性或相似性來表示的兩個或多個核酸 序列、 或兩個或多個氨基酸序列之間的同一性 / 相似性。序列同一性可以根據同一性百分 數來度量 ; 百分數越高, 序列越一致。當使用標準方法比對時, 核酸或氨基酸序列的同源物 或直向同源物具有相對高度的序列同一性 / 相似性。
     比對序列用于比較的方法在本技術領域中是公知的。各種程序和比對算法描述 在下列文獻中 : Smith & Waterman, Adv.Appl.Math.2 : 482, 1981 ; Needleman & Wunsch, J.Mol.Biol.48 : 443 , 1970 ; Pearson & Lipman , Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 : 2444 , 1988 ; Higgins & Sharp, Gene, 73 : 237-44, 1988 ; Higgins & Sharp, CABIOS 5 : 151-3, 1989 ; Corpet 等, Nuc.Acids Res.16 : 10881-90, 1988 ; Huang 等, Computer Appls.in the Biosciences 8, 155-65, 1992 ; 以及 Pearson 等, Meth.Mol.Bio.24 : 307-31, 1994。 Altschul 等, J.Mol.Biol.215 : 403-10, 1990, 提出了關于序列比對方法和同源性計算的詳細考慮。
     NCBI 的基本局部比對搜索工具 (Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST) (Altschul 等, J.Mol.Biol.215 : 403-10, 1990) 可以從幾個來源獲得, 包括國家生物技術 信息中心 (National Center for Biotechnology Information)(NCBI, 國立醫學圖書館(National Library of Medicine), Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894) 和 互聯網上, 用于與序列分析程序 blastp、 blastn、 blastx、 tblastn 和 tblastx 結合使用。 Blastn 用于比較核酸序列, 而 blastp 用于比較氨基酸序列。其他信息可以在 NCBI 網站上 找到。
     一旦比對后, 通過對兩個序列中存在的一致核苷酸或氨基酸殘基的位置數進行計 數, 來確定匹配數。通過用匹配數除以所鑒定序列中顯示的序列的長度, 或除以節段長度 ( 例如來自所鑒定序列中顯示的序列的 100 個連續的核苷酸或氨基酸殘基 ), 然后將得到的 值乘以 100, 來確定百分序列同一性。例如, 與具有 1554 個核苷酸的測試序列比對時具有 1166 個匹配的肽序列, 與測試序列的同一性是 75.0% (1166÷1554*100 = 75.0)。 將百分序 列同一性值取整到最接近的十分位數。例如, 75.11、 75.12、 75.13 和 75.14 向下取整 75.1, 而 75.15、 75.16、 75.17、 75.18 和 75.19 向上取整到 75.2。長度值總是整數。
     治療有效量 : 足以在被治療對象中實現所需效應的特定物質 ( 例如 P4 肽、 調理性 抗體、 抗生素和 / 或補體蛋白 ) 的量。例如, 這可以是抑制或治療病原體感染、 例如細菌病 原體感染所必需的量。當給藥于對象時, 一般將使用能夠獲得顯示出實現所需體外效應的 靶組織濃度的劑量。 治療有效量的物質例如 P4 肽、 調理性抗體和 / 或補體蛋白, 可以例如在治療過程 中每日以單劑或幾劑給藥。但是, 組合物的有效量取決于所應用的化合物或肽、 被治療的 對象、 疾病的嚴重性和類型、 以及組合物的給藥方式。例如, 組合物的治療有效量可以在約 0.01mg/kg 體重至約 1g/kg 體重之間變化。
     病毒 : 在活細胞內部增殖的微小感染性生物體。病毒基本上由蛋白外殼包圍核酸 核心構成, 并具有只在活細胞內部復制的能力。 “病毒復制” 是通過發生至少一個病毒生命 周期來產生更多的病毒。 病毒可以 破壞宿主細胞的正常功能, 致使細胞以病毒決定的方式 運轉。 例如, 病毒感染可能導致細胞產生細胞因子或對細胞因子做出響應, 而未感染的細胞 通常將不會如此。在某些實例中, 病毒是病原體。可以按照本公開的方法增強對其調理吞 噬作用的病毒病原體的具體實例包括但不限于沙粒病毒 ( 例如瓜納里托病毒、 拉沙病毒、 胡寧病毒、 馬丘波病毒和沙比亞病毒 )、 動脈炎病毒、 Roniviruses、 星狀病毒、 布尼亞病毒 ( 例如克里米亞 - 剛果出血熱病毒和漢坦病毒 )、 桿狀 RNA 病毒、 雙 RNA 病毒、 博納病毒 ( 例 如博納病病毒 )、 雀麥花葉病毒、 杯狀病毒、 青霉病毒、 冠狀病毒 ( 例如冠狀病毒和 SARS)、 囊 狀病毒、 線形病毒、 豇豆花葉病毒、 雙順反子病毒、 黃病毒 ( 例如黃熱病毒、 西尼羅病毒、 丙 型肝炎病毒和登革熱病毒 )、 線狀病毒 ( 例如埃博拉病毒和馬堡病毒 )、 Flexiviruses、 肝 炎病毒 ( 例如戊型肝炎病毒 )、 人腺病毒 ( 例如人類腺病毒 A-F)、 人星狀病毒、 人 BK 多瘤病 毒、 人博卡病毒、 人冠狀病毒 ( 例如人冠狀病毒 HKU1、 NL63 和 OC43)、 人腸道病毒 ( 例如人 腸道病毒 A-D)、 人紅細胞病毒 V9、 人泡沫病毒、 人皰疹病毒 ( 例如人皰疹病毒 1(1 型單純 性皰疹病毒 )、 人皰疹病毒 2(2 型單純性皰疹病毒 )、 人皰疹病毒 3( 水痘帶狀皰疹病毒 )、 1 型人皰疹病毒 4(1 型愛潑斯坦 - 巴爾 (Epstein-Barr) 病毒 )、 2 型人皰疹病毒 4(2 型愛潑 斯坦 - 巴爾病毒 )、 人皰疹病毒 5 株 AD169、 人皰疹病毒 5 株 Merlin 株、 人皰疹病毒 6A、 人 皰疹病毒 6B、 人皰疹病毒 7、 M 型人皰疹病毒 8、 P 型人皰疹病毒 8 和人巨細胞病毒 )、 人免 疫缺陷病毒 (HIV)( 例如 HIV 1 和 HIV 2)、 人偏肺病毒、 人乳頭瘤病毒組 ( 例如人乳頭瘤病 毒 -1、 人乳頭瘤病毒 -18、 人乳頭瘤病毒 -2、 人乳頭瘤病毒 -54、 人乳頭瘤病毒 -61、 人乳頭瘤
     病毒 -cand90、 人乳頭瘤病毒 RTRX7、 10 型人乳頭瘤病毒、 101 型人乳頭瘤病毒、 103 型人乳 頭瘤病毒、 107 型人乳頭瘤病毒、 16 型人乳頭瘤病毒、 24 型人乳頭瘤病毒、 26 型人乳頭瘤病 毒、 32 型人乳頭瘤病毒、 34 型人乳頭瘤病毒、 4 型人乳頭瘤病毒、 41 型人乳頭瘤病毒、 48 型人 乳頭瘤病毒、 49 型人乳頭瘤病毒、 5 型人乳頭瘤病毒、 50 型人乳頭瘤病毒、 53 型人乳頭瘤病 毒、 60 型人乳頭瘤病毒、 63 型人乳頭瘤病毒、 6b 型人乳頭瘤病毒、 7 型人乳頭瘤病毒、 71 型 人 乳頭瘤病毒、 9 型人乳頭瘤病毒、 92 型人乳頭瘤病毒和 96 型人乳頭瘤病毒 )、 人副流感病 毒 ( 例如人副流感病毒 1-3)、 人副腸孤病毒、 人細小病毒 ( 例如人細小病毒 4 和人細小病毒 B19)、 人呼吸道合胞病毒、 人鼻病毒 ( 例如人鼻病毒 A 和人鼻病毒 B)、 人泡沫反轉錄病毒、 人 嗜 T 淋巴細胞病毒 ( 例如人嗜 T 淋巴細胞病毒 1 和人嗜 T 淋巴細胞病毒 2)、 人多瘤病毒、 減毒病毒、 輕小病毒、 黃矮病毒、 淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒 (LCM)、 Marnaviruses、 裸露核 糖核酸病毒 (Narnaviruses)、 套式病毒目、 諾達病毒、 正粘病毒 ( 例如流感病毒 )、 分病毒、 副粘病毒 ( 例如麻疹病毒和腮腺炎病毒 )、 微小核糖核酸病毒 ( 例如脊髓灰質炎病毒、 感冒 病毒和甲肝病毒 )、 馬鈴薯 Y 病毒、 痘病毒 ( 例如天花和牛痘 )、 伴生病毒、 呼腸弧病毒 ( 例 如輪狀病毒 )、 彈狀病毒 ( 例如狂犬病病毒 )、 彈狀病毒 ( 例如水泡性口炎病毒 )、 四病毒、 披膜病毒 ( 例如風疹病毒和羅斯河病毒 )、 番茄叢矮病毒、 全病毒、 蕪菁黃花葉病毒、 諾如病 毒、 牛皰疹病毒包括牛皰疹病毒 (BHV) 和惡性卡他熱病毒 (MCFV), 等等。在某些實例中, 病 毒感染的細胞被調理吞噬。 II. 幾個實施方案的概述
     本公開涉及增強對病原體的調理性應答的方法, 以及用于靶向目標病原體進行調 理吞噬作用的組合物。調理吞噬作用是抗體和補體或補體組分與病原體結合 ( 或調理作 用 ), 隨后通過效應細胞與抗體 / 抗原復合物的結合由效應細胞攝入感染物。
     在保護性免疫應答過程中, 產生了與感染物結合并也為效應細胞的攝入和清除提 供手段的功能性抗體。特異性結合目標病原體表面上的抗原的功能性抗體 ( 調理性抗體 ) 可以被純化并給藥于對象, 以便通過靶向目標病原體以被對象自身的效應細胞進行調理來 治療和 / 或抑制對象中的感染。盡管這種療法顯示出希望, 但典型情況下必須給藥大劑量 調理性抗體才能達到所需的病原體清除效果。因此, 對于增強針對調理性抗體的調理性應 答的方法, 存在著需求。
     為了滿足這一需求, 本文公開了使用 P4 肽, 在與通過特異性結合靶病原體表面上 的抗原來靶向所述病原體的調理性抗體一起給藥時, 增強效應細胞對調理性抗體的調理性 應答的方法。P4 肽源自于肺炎鏈球菌 PsaA 蛋白的 7 號鏈、 12 號 α- 螺旋和 8 號鏈, 但是相 對于 PsaA 蛋白的天然序列來說含有點突變以提高等電點和增強結合。考慮到 P4 肽最初被 開發用于抑制肺炎鏈球菌被鼻咽細胞的內化 ( 參見國際專利公布 2006/127020), 本文所公 開的 P4 肽增強效應細胞對病原體的調理作用這一發現, 是特別令人吃驚和意外的。此外, 正如本文所公開的, 還發現 P4 肽與抗生素的共同給藥, 協同增加了抗生素的有效性。由于 這種協同行為, 在與 P4 肽組合時有可能使用較低劑量的抗生素, 同時仍維持抗生素的有效 性。
     A 治療方法
     公開了在對象中增強對目標病原體的調理吞噬作用的方法, 例如, 用以增強對目 標病原體的調理吞噬作用以在對象中抑制和 / 或治療目標病原體感染。目標病原體可以是
     在前面的術語概述中討論過的任何細菌、 病毒或真菌病原體。 在具體實例中, 該方法被用于 在感染有病原體 ( 例如病毒、 細菌或真菌病原體 )( 或具有病原體感染風險 ) 的對象中增 強調理吞噬作用。在具體實例中, 病原體是細菌病原體, 例如鏈球菌 ( 例如肺炎鏈球菌 )、 葡萄球菌 ( 例如金黃色葡萄球菌 ) 或腦膜炎球菌 ( 例如腦膜炎奈瑟菌 )。在某些實例中, 所選的治療對象具有病原體 ( 例如病毒、 細菌或真菌病原體 ) 感染或具有發生所述感染的 風險。在某些實例中, 所選的對象具有鏈球菌感染 ( 例如肺炎鏈球菌感染 ) 或具有所述感 染的風險。在某些實例中, 所選的對象具有葡萄球菌感染 ( 例如金黃色葡萄球菌感染 ) 或 具有所述感染的風險。在某些實例中, 所選的對象具有腦膜炎球菌感染 ( 例如腦膜炎奈瑟 菌感染 ) 或具有所述感染的風險。在某些實例中, 所選的治療對象未被表達肺炎球菌表面 黏附素 A(PsaA) 蛋白的病原體感染, 例如所選對象未被肺炎鏈球菌感染。所述方法包括向 對象給藥治療有效量的分離的 P4 肽, 所述 P4 肽包含與顯示為 LFVESSVKRRPMKTVSQDTNIPI YAQIF(SEQ ID NO : 1) 的氨基酸序列具有至少 95%同一性, 例如至少 96%、 至少 97%、 至少 99%、 至少 99%同一性或甚至 100%同一性的氨基酸序列, 以及任選治療有效量的特異性 結合目標病原體 ( 例如上面列出的細菌、 病毒或真菌目標病原體 ) 表面上存在的抗原的一 種或多種分離的調理性抗體或其片段。 在某些實例中, P4 肽的長度在約 27 至約 200 個氨基 酸之間, 例如長度不超過 28、 29、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190 或 200 個氨基酸, 或甚至更長, 例如長度為 27-50、 40-60、 50-70、 60-80、 70-90、 80-100、 90-110、 100-120、 110-130、 120-140、 130-140、 140-160、 150-170、 160-180、 170-190 或 180-200 個氨基酸。在某些實例中, P4 肽由 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基酸序列構成。在 某些實例中, 向對象給藥 P4 肽。在某些實例中, 向對象給藥 P4 肽和特異性結合目標病原體 表面上存在的抗原的一種或多種分離的調理性抗體或其片段。在某些實例中, 向具有被病 毒感染的細胞的對象給藥 P4 肽, 以例如增強對表達來自目標病毒病原體的細胞表面蛋白 的細胞的調理吞噬作用。在某些實例中, P4 肽包括與 SEQ ID NO : 1 顯示的氨基酸序列相 比具有不超過一個或兩個氨基酸改變、 例如保守取代的氨基酸序列。設想了可以利用將使 得到的肽仍然能夠增強對目標病原體的調理吞噬作用的氨基酸序列改變, 例如通過保守取 代。還設想到融合蛋白, 其包含與異源氨基酸序列融合的 P4 肽。在某些實例中, P4 肽被脂 質化, 例如用棕櫚酸等脂質化。示例性的藥物組合物描述在下面的 B 部分中。還設想了本 公開的藥物組合物的各種給藥方式 ( 參見下面的 B 部分 )。
     P4 肽的給藥增強了對象 ( 以及特別是對象的效應細胞 ) 調理吞噬目標病原體的能 力, 所述目標病原體被調理性抗體或其片段、 例如由對象 ( 例如被病原體感染的對象 ) 產生 的調理性抗體和 / 或給藥于對象的分離的調理性抗體特異性結合。在某些實例中, 向對象 給藥調理性抗體或其片段和 P4 肽。調理性抗體或其片段和 P4 肽的給藥可以任何次序或甚 至同時進行, 例如作為單一藥物制劑或作為多個藥物制劑共 同給藥, 所述多個藥物制劑例 如含有治療有效量的 P4 肽的藥物組合物和含有治療有效量的特異性結合目標病原體的調 理性抗體或其片段 ( 或甚至多種調理性抗體, 例如各自特異性結合單一目標病原體的多種 調理性抗體, 或其中每種調理性抗體特異性結合不同目標病原體或單一目標病原體的多種 血清型的多種調理性抗體, 或其任何組合 ) 的組合物, 或甚至同時含有治療有效量的 P4 肽 和治療有效量的調理性抗體或其片段 ( 或多種調理性抗體 ) 的組合物。
     正如本文所公開的, P4 肽與抗生素的聯合給藥增加了抗生素的有效性, 例如允許使用較低劑量和 / 或增加細菌的清除。總的來說, 任何抗生素都可用于本公開的方法。可 以使用的抗生素的實例包括但不限于氨基糖苷類 ( 例如阿米卡星、 慶大霉素、 卡那霉素、 新 霉素、 奈替米星、 鏈霉素、 妥布霉素和巴龍霉素 ) ; 安沙霉素類 ( 例如格爾德霉素和除莠霉 素); 碳頭孢烯類抗生素 ( 例如氯碳頭孢、 厄他培南、 多尼培南、 亞胺培南 / 西司他汀和美羅 培南 ) ; 頭孢菌素類 ( 例如頭孢羥氨芐、 頭孢唑啉、 頭孢噻吩、 頭孢氨芐、 頭孢克洛、 頭孢孟 多、 頭孢西丁、 頭孢丙烯、 頭孢呋辛、 頭孢克肟、 頭孢地尼、 頭孢妥侖、 頭孢哌酮、 頭孢噻肟、 頭 孢泊肟、 頭孢他啶、 頭孢布烯、 頭孢唑肟、 頭孢曲松、 頭孢吡肟和頭孢托羅 ) ; 糖肽類 ( 例如替 考拉寧和萬古霉素 ) ; 大環內酯類 ( 例如阿奇霉素、 克拉霉素、 地紅霉素、 紅霉素、 羅紅霉素、 醋竹桃霉素、 泰利霉素和壯觀霉素 ) ; 單酰胺菌素類 ( 例如氨曲南 ) ; 青霉素類 ( 例如阿莫西 林、 氨芐青霉素、 阿洛西林、 羧芐青霉素、 氯唑西林、 雙氯西林、 氟氯西林、 美洛西林、 甲氧西 林、 萘夫西林、 苯唑西林、 青霉素、 哌拉西林和替卡西林 ) ; 多肽類 ( 例如桿菌肽、 粘桿菌素和 多粘菌素 b) ; 喹諾酮類 ( 例如環丙沙星、 依諾沙星、 加替沙星、 左氧氟沙星、 洛美沙星、 莫西 沙星、 諾氟沙星、 氧氟沙星、 曲伐沙星、 格帕沙星和司帕沙星 ) ; 磺胺類 ( 例如磺胺米隆、 百浪 多息 ( 已廢止 )、 乙酰磺胺、 磺胺甲噻二唑、 磺胺二甲異噁唑 ( 已廢止 )、 柳氮磺胺吡啶、 磺胺 異噁唑、 甲氧芐啶和甲氧芐啶 - 磺胺甲基異噁唑 ) ; 四環素類 ( 例如地美環素、 多西環素、 米 諾環素、 土霉素和四環素 ) ; 以及其他 ( 例如胂凡納明、 氯霉素、 克林霉素、 林可霉素、 乙胺 丁醇、 磷霉素、 夫西地酸、 呋喃唑酮、 異煙肼、 利奈唑胺、 甲硝唑、 莫匹羅星、 呋喃妥因、 平板霉 素、 吡嗪酰胺、 奎奴普汀 / 達福普汀、 利福平、 甲砜霉素和替硝唑 )。 在某些實例中, 向對象給 藥抗生素 ( 或一種以上抗生素 ) 和 P4 肽。抗生素或其片段和 P4 肽的給藥可以任何次序或 甚至同時進行, 例如作為單一藥物制劑或作為多個制劑共同給藥, 所述多個制劑例如含有 治療有效量的 P4 肽的藥物組合物和含有治療有效量的特異性針對目標病原體的抗生素的 組合物。在某些實例中, 向患者給藥調理性抗體或其片段、 P4 肽和抗生素。調理性抗體或 其片段、 P4 肽和抗生素的給藥可以以任何次序或甚至同時進行, 例如作為單一藥物制劑或 作為多個制劑共同給藥, 所述多個制劑例如含有治療有效量的 P4 肽的藥物組合物、 含有治 療有效量的特異性針對目標病原體的抗生素的組合物, 以及含有治療有效量的特異性結合 目標病原體的調理性抗體或其片段 ( 或甚至多種調理性抗體, 例如各自特異性結合單一目 標病原體的多種調理性抗體, 或其中每種調理性抗體特異性結合不同目標病原體或單一目 標病原體的多種血清型的多種調理性抗體, 或其任何組合 ) 的組合物, 或甚至含有治療有 效量的 P4 肽和治療有效量的調理性抗體或其片段 ( 或多種調理性抗體 ) 和治療有效量的 特異性針對目標病原體的抗生素的組合物。
     補體蛋白及其片段通過結合調理性抗體并促進效應細胞的調理作用, 輔助對病原 體的調理吞噬作用。 因此, 在某些實例中, 也向對象給藥藥物有效量的分離的補體蛋白或其 片段, 例如 C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a 中的一種或多種。在某些實例中, 選擇具有補體 缺陷的對象給藥藥物有效量的分離的補體蛋白或其片段。在某些實例中, 通過鼻內途徑和 / 或靜脈內途徑給藥治療有效量的分離的 P4 肽。在某些實施方案中, 通過鼻內途徑和 / 或 靜脈內途徑給藥治療有效量的調理性抗體或其片段。在某些實例中, 通過鼻內途徑和 / 或 靜脈內途徑給藥藥物有效量的分離的補體蛋白或其片段, 例如 C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a 中的一種或多種。
     因為 P4 肽不特異性針對任何單一病原體, 因此可以配制本公開的 P4 肽和治療組合物, 以期通過提供靶向任何目標病原體的調理性抗體或其片段, 例如通過提供特異性結 合目標病原體表面上存在的抗原的調理性抗體或其片段 ( 例如治療有效量的調理性抗體 或其片段 )、 或向產生調理性抗體的對象例如被病原體感染或已被病原體感染的對象提供 P4 肽, 來增強對任何目標病原體的調理吞噬作用。產生調理性抗體的方法在下面的 C 部分 中給出。 在某些實例中, 目標病原體是細菌病原體, 并且提供了治療有效量的特異性結合細 菌病原體的調理性抗體。在某些實例中, 目標病原體是肺炎鏈球菌。在其他實例中, 目標病 原體是腦膜炎奈瑟菌。 在其他實例中, 目標病原體是金黃色葡萄球菌, 例如耐甲氧西林的金 黃色葡萄球菌 (MRSA)。 在某些實例中, 目標病原體是病毒病原體, 并且提供了治療有效量的 特異性結合病毒病原體或被病毒病原體感染的細胞的調理性抗體。在某些實例中, 目標病 原體是真菌病原體, 并且提供了治療有效量的特異性結合真菌病原體的調理性抗體。
     B. 治療組合物
     P4 肽可以體外、 離體 (ex vivo) 或體內給藥于細胞或對象。 希望將 P4 肽制備成適 合于目標應用、 例如抑制或治療病原體感染、 例如上面術語概述中討論過的病原體感染的 藥物組合物。因此, 本文包括了含有 P4 肽 ( 和在某些情況下的調理性抗體或其片段、 抗生 素和 / 或補體蛋白或其片段 ) 的藥物或藥物組合物的制備方法。P4 肽可以制備成用于單 獨或與其他活性成分、 例如抗生素 ( 例如上面 A 部分中描述的抗生素 ) 和 / 或其他蛋白一 起給藥, 例如與調理性抗體、 抗生素 ( 或甚至多種抗生素 ) 和 / 或補體蛋白 ( 或甚至特異性 針對不同病原體 ( 被病原體感染的細胞 ) 的多種調理性抗體, 和 / 或補體蛋白, 或其片段 ) 一起給藥。在某些實例中, 治療組合物包括 P4 肽。在某些實例中, 治療組合物包括調理性 抗體。在某些實例中, 治療組合物包括抗生素。在某些實例中, 治療組合物包括調理性抗體 和 P4 肽。在某些實例中, 治療 組合物包括調理性抗體、 P4 肽和抗生素。在某些實例中, 治 療組合物包括補體蛋白或其片段。在某些實例中, 治療組合物包括補體蛋白或其片段和 P4 肽。在某些實例中, 治療組合物包括補體蛋白或其片段、 抗生素和 P4 肽。在某些實例中, 治 療組合物包括補體蛋白或其片段、 調理性抗體、 抗生素和 P4 肽。在某些實例中, 治療組合物 包括補體蛋白或其片段和調理性抗體。當向對象給藥 P4 肽和調理性抗體和 / 或抗生素和 / 或補體蛋白時, 給藥可以同時或順序進行。P4 肽和調理性抗體和 / 或抗生素和 / 或補體 蛋白的順序給藥可以相隔任何時間量, 只要 P4 肽的給藥增強調理性抗體的調理活性即可。 也考慮到了本文描述的組合物的多次給藥。
     在某些實施方案中, 所公開的治療組合物包括治療有效量的分離的 P4 肽, 所述 P4 肽包含與 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基酸序列具有至少 95%同一性、 例如至少 96%、 至少 97%、 至少 98%、 至少 99%或甚至 100%同一性的氨基酸序列, 以及任選治療有效量的特異 性結合目標病原體表面上存在的抗原的一種或多種分離的調理性抗體或其片段。 在某些實 例中, 治療組合物還包含治療有效量的抗生素, 或甚至一種以上的抗生素。在某些實例中, 治療組合物還包含治療有效量的分離的補體蛋白或其片段, 例如 C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a 中的一種或多種。
     典型情況下, 藥物組合物 ( 用作藥物或用于制造藥物 ) 的制備需要制備基本上不 含熱原以及可能對人類或動物有害的任何其他雜質的藥物組合物。典型情況下, 藥物組合 物含有適合的鹽和緩沖劑, 以使組合物的組分穩定并允許 P4 肽與對象的細胞相互作用。
     治療組合物的給藥可以通過任何常用途徑, 只要可以通過該途徑到達靶組織即可。這包括口、 鼻 ( 例如鼻內 )、 眼、 頰、 腸、 玻璃體內或其他黏膜 ( 例如直腸或陰道 ) 或局 部給藥。 可供選擇地, 給藥可以通過常位、 皮內皮下、 肌肉內、 腸胃外腹膜內或靜脈內注射途 徑。 這樣的藥物組合物通常作為包含生理可接受的載體、 緩沖劑或其他賦形劑的可藥用組 合物給藥。
     治療組合物可以提供成腸胃外、 例如用于注射或輸注的組合物。這樣的組合物一 般通過將所需純度的 P4 肽與可藥用載體、 例如在所使用的劑量和濃度下對接受者無毒性 并且與制劑中的其他成分相容的載體混合成單位劑量的可注射形式 ( 溶液、 懸液或乳液 ) 來配制。 此外, 可以將 P4 肽 ( 和 / 或調理性抗體, 和 / 或抗生素, 和 / 或補體蛋白或其片段 ) 懸浮在水性載體中, 例如在 pH 為約 3.0 至約 8.0、 優選 pH 為約 3.5 至約 7.4、 3.5 至 6.0 或 3.5 至約 5.0 的等滲緩沖溶液中。可用的緩沖液包括檸檬酸鈉 - 檸檬酸和磷酸鈉 - 磷酸、 以 及乙酸鈉 / 乙酸緩沖液。P4 肽, 任選與賦形劑、 調理性抗體、 抗生素和 / 或補體蛋白或其片 段一起, 也可采取凍干物的形式, 并可以在腸胃外給藥前通過加入適合的溶劑來制成溶液。 溶液, 例如用于例如腸胃外給藥的溶液, 也可以用作輸注溶液。
     藥物組合物可以包括 ( 例如溶解或懸浮 ) 在可藥用載體或賦形劑中的有效量 ( 例如治療有效量 ) 的 P4 肽、 補體蛋白、 抗生素和 / 或調理性抗體。可藥用載體和 / 或可 藥用賦形劑在本技術領域中是已知的, 并描述在例如 E.W.Martin 的 《Remington 藥物學》 (Remington’ s Pharmaceutical Sciences), Mack Publishing Co., Easton, PA, 第 15 版 (1975) 中。
     載體的性質取決于所使用的具體給藥方式。例如, 腸胃外制劑通常包含可注射流 體, 所述可注射流體包括可藥用和生理可接受的流體例如水、 生理鹽水、 平衡鹽溶液、 葡萄 糖水、 甘油等作為介質。對于固體組合物 ( 例如粉劑、 丸劑、 片劑或膠囊形式 ) 來說, 常規的 無毒性固體載體可以包括例如藥用級甘露糖醇、 乳糖、 淀粉或硬脂酸鎂。此外, 待給藥的藥 物組合物可以包含少量無毒性輔助物質, 例如潤濕或乳化劑、 防腐劑和 pH 緩沖劑等, 例如 乙酸鈉或失水山梨糖醇單月桂 酸酯。
     本文中使用的 “可藥用載體” 包括任何和所有溶劑、 分散介質、 涂層、 抗細菌和抗真 菌劑、 等滲和吸收延遲劑等。這類介質和藥劑在藥物活性物質中的應用在本技術領域中是 公知的。 任何常規介質或藥劑, 除了與活性成分不相容的情況之外, 都可考慮用于藥物組合 物中。也可以在組合物中摻入增補的活性成分。例如, 某些藥物組合物可以在水中包含與 適合的表面活性劑例如羥丙基纖維素混合的 P4 肽。也可以在甘油、 液體聚乙二醇及其混合 物中和油中制備分散體。在平常的儲存和使用條件下, 這些制劑含有防腐劑以阻止微生物 的生長。
     其他制劑適合于口服給藥。 口服制劑可以包含賦形劑例如藥用級甘露糖醇、 乳糖、 淀粉、 硬脂酸鎂、 糖精鈉、 纖維素、 碳酸鎂等。組合物 ( 藥物 ) 典型地采取溶液、 懸液、 氣溶膠 或粉末的形式。示例性制劑可見于美國專利公布 No.20020031527。當途徑是局部途徑時, 形式可以是霜劑、 軟膏、 油膏或噴劑。
     打算使用本公開的藥物組合物和方法治療的典型對象包括人類以及非人類靈長 動物或其他動物。為了鑒定根據本公開的方法進行預防或治療的對象, 使用認可的篩選方 法在對象中確定與目標或懷疑的疾病或病癥 ( 例如與特定目標病原體相關的感染 ) 相關的 風險因素, 或確定已患的疾病或病癥的狀態。 這些篩選方法包括例如診斷方法, 例如在本技術領域中可用的或公知的用于檢測和 / 或表征疾病相關標志物的各種 ELISA 和其他免疫分 析方法。 這些以及其他常規方法允許臨床醫生選擇需要使用本公開的方法和藥物組合物治 療的患者。
     藥物組合物的有效量根據所計劃的目標、 例如抑制和 / 或治療人類或非人類對象 的病原性感染來確定。本公開的藥物組合物的給藥可用于預防性或治療性目的。當預防性 提供時, 藥物組合物在任何癥狀出現之前提供。化合物的預防性給藥用于阻止或改善任何 后續的疾病過 程。當治療性提供時, 化合物在疾病或感染的癥狀發作時 ( 或其后不久 ) 提 供。
     對于預防性和治療性目的來說, 藥物組合物可以單次推注 (bolus) 遞送、 通過在 一段較長時期內連續遞送 ( 例如連續的透皮、 黏膜或靜脈內遞送 )、 或以重復給藥方案 ( 例 如通過每小時、 每日或每周重復給藥方案 ) 向對象給藥。治療有效劑量的化合物可以在長 期預防或治療方案中作為重復藥劑提供, 以產生臨床顯著結果, 從而改善與本文提出的目 標疾病或病癥相關的一種或多種癥狀或可檢測到的狀況。就此而言, 有效劑量的確定典型 基于動物模型研究, 然后進行人類臨床試驗, 并通過在對象中明顯降低目標疾病癥狀或狀 況的發生或嚴重性的給藥方案來指導。 這方面的適合的模型包括例如鼠類、 大鼠、 豬、 貓、 非 人類靈長動物和本技術領域已知的其他認可的動物模型對象。可供選擇地, 有效劑量可以 使用體外模型 ( 例如免疫和組織病理分析 ) 來確定。使用這樣的模型, 只需要常規的計算 和調整就可確定給藥治療有效量 P4 肽的適合濃度和劑量 ( 例如有效改善目標感染的一種 或多種癥狀的量 )。
     適合的劑量將根據下列因素而異 : 對象的特征例如對象是人類還是非人類、 年齡、 體重和與對象的條件或狀態有關的其他健康考慮, 給藥方式、 途徑, 和劑量次數以及藥物組 合物包含單獨的 P4 肽還是還包含調理性抗體和 / 或抗生素和 / 或補體蛋白, 給藥的時間和 途徑, 同時給藥的其他藥物或治療, 以及治療組合物在對象中引發所需活性或生物響應的 特定藥理學。可以調整劑量方案, 以提供最優的預防或治療響應。治療有效量也是其中化 合物和 / 或其他生物活性劑的任何有毒或有害副作用被以臨床術語而言的治療有益效應 勝過的量。在本公開的方法和制劑中, P4 肽和 / 或其他生物活性劑的治療有效量的非限制 性范圍是約 0.01mg/kg 體重至約 10mg/kg 體重, 例如約 0.05mg/kg 至約 5mg/kg 體重, 或約 0.2mg/kg 至約 2mg/kg 體重。
     包含本公開的治療藥劑的治療組合物可以通過泵遞送 ( 參見 Langer, 同上 ; Sefton, CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14 : 201, 1987 ; Buchwald 等, Surgery 88 : 507, 1980 ; Saudek 等, N.Engl.J.Med.321 : 574, 1989), 或通過連續皮下輸注例如使用微型泵來遞 送。也可以使用靜脈內溶液袋 (intravenous bag solution)。選擇適合劑量的一個因素 是通過本文公開的方法測量得到的、 被執業醫師視為適合的結果。其他受控釋放系統在 Langer(Science 249 : 1527-33, 1990) 中討論。
     在一個實例中, 泵是植入式的 ( 參見例如美國專利 No.6,436,091、 5,939,380 和 5,993,414)。使用可植入的藥物輸注裝置為患者提供治療藥劑的恒定和長期的劑量或輸 注。這樣的裝置可以分類成主動或被動式的。
     主動式藥物或可編程輸注裝置的特點在于用于將藥劑遞送到患者系統中的泵或 計量系統。目前可用的這種主動式輸注裝置的實例是 Medtronic SYNCHROMEDTM 可編程泵。相反, 被動式輸注裝置的特點不是泵, 而是依賴于加壓的藥物儲池遞送目標藥劑。 這種裝置 TM 的實例包括 Medtronic ISOMED 。
     在具體實例中, 包含本公開的治療藥劑的治療組合物通過持續釋放系統給藥。持 續釋放系統的適合的實例包括適合的聚合材料 ( 例如采用成形物件例如薄膜或微囊形式 的半透性聚合物基質 )、 適合的疏水性材料 ( 例如作為在可接受的油中的乳液 ) 或離子交換 樹脂, 以及微溶衍生物 ( 例如微溶的鹽 )。持續釋放組合物可以口服、 腸胃外、 腦池內、 腹膜 內、 局部 ( 例如通過粉劑、 軟膏、 凝膠、 滴劑或透皮貼片 ) 或作為口或鼻噴劑來給藥。持續釋 放基質包括聚丙交酯 ( 美國專利 No.3,773,919、 EP 58,481)、 L- 谷氨酸和 γ- 乙基 -L- 谷 氨酸酯的共聚物 (Sidman 等, Biopolymers 22 : 547-556, 1983)、 聚 ( 甲基丙烯酸 2- 羥乙基 酯 )(Langer 等, J.Biomed.Mater.Res.15 : 167-277, 1981 ; Langer, Chem.Tech.12 : 98-105, 1982)、 乙烯 - 乙酸乙烯酯 (Langer 等, 同上 ) 或聚 -D-(-)-3- 羥基丁酸 (EP 133,988)。
     聚合物可用于離子控制的釋放。用于受控藥物遞送的各種可降解和不可降解 的聚合基質在本技術領域中是已知的 (Langer, Accounts Chem.Res.26 : 537, 1993)。例 如, 嵌段共聚物泊洛沙姆 407 在低溫下作為粘稠但仍可流動的液體存在, 而在體溫下 形成半固體凝膠。它已被顯示是用于重組白介素 -2 和脲酶的配制和持續遞送的有效 介 質 (Johnston 等, Pharm.Res.9 : 425, 1992 ; 和 Pec, J.Parent.Sci.Tech.44(2) : 58, 1990)。可供選擇地, 羥基磷灰石已被用作微載體, 用于蛋白的受控釋放 (Ijntema 等, Int.J.Pharm.112 : 215, 1994)。另一方面, 脂質體被用于脂類包囊的藥物的受控釋放以 及藥物定向 (Betageri 等 《脂質體藥物遞送系統》 (Liposome Drug Delivery Systems), Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, 1993)。大量用于治療性蛋白的受控遞 送的其他系統是已知的 ( 例如美國專利 No.5,055,303、 美國專利 No.5,188,837、 美國專利 No.4,235,871、 美國專利 No.4,501,728、 美國專利 No.4,837,028、 美國專利 No.4,957,735 和美國專利 No.5,019,369、 美國專利 No.5,055,303、 美國專利 No.5,514,670、 美國專利 No.5,413,797、 美國專利 No.5,268,164、 美國專利 No.5,004,697、 美國專利 No.4,902,505、 美 國 專 利 No.5,506,206、 美 國 專 利 No.5,271,961、 美 國 專 利 No.5,254,342 和 美 國 專 利 No.5,534,496)。
     可以制備藥物組合物 ( 藥物 ) 用于預防性方案中并給藥于人類或非人類對象, 以 針對病原體 ( 或多種病原體 ) 的感染進行保護。因此, 藥物組合物典型地包含藥物有效量 的 P4 肽和任選的藥物有效量的調理性抗體或其片段、 和 / 或抗生素和 / 或補體蛋白或其片 段。在某些情況下, 組合物在感染后給藥, 以例如治療感染、 增加病原體清除, 在這種應用 中, 藥物組合物以治療有效量給藥。治療有效量是用于在對象中獲得所需效應的組合物的 量。 例如, 這可以是抑制病原體感染、 增加病原體從對象的清除或者阻止或可測量地改變對 象的病原體感染的外在癥狀所需的組合物的量。當給藥于對象時, 一般使用將達到已顯示 出 實現體外或體內效應的靶組織濃度的劑量。
     C. 調理性抗體
     免疫原、 例如免疫原性多糖或免疫原性多肽 ( 例如源自于病原體例如病毒、 細菌 或真菌病原體如上面列出的病毒、 細菌或真菌病原體的免疫原性多糖或免疫原性肽 ) 或其 片段或保守變體, 可用于產生與病原體表面上的表位發生免疫反應或結合、 例如結合特定 抗原并誘導效應細胞對靶病原體的調理吞噬作用的調理性抗體。包括多克隆調理性抗體、基本上由具有不同表位特異性的合并的調理性單隆抗體構成的抗體, 以及不同的單克隆調 理性抗體制劑。
     多克隆抗體的制備對于本技術領域的專業人員來說是公知的。參見例如 Green 等, “多克隆抗血清的生產” (Production of polyclonal Antisera), Manson 主編的 《免 疫化學方法》 (Immunochemical Protocols) 第 1-5 頁, Humana Press 1992 ; Coligan 等, “在兔、 大鼠、 小鼠和倉鼠中生產多克隆抗血清” (Production of polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters), 《免 疫 學 現 代 方 法》 (Current Protocols in Immunology) 第 2.4.1 節, 1992。
     單克隆抗體的制備同樣是常規的。參見例如 Kohler & Milstein, Nature 256 : 495, 1975 ; Coligan 等, 2.5.1-2.6.7 節 ; 以 及 Harlow 等, 《抗 體 實 驗 指 南》 (Antibodies : a Laboratory Manual) 第 726 頁, Cold Spring Harbor Pub., 1988。簡單來說, 可以如下 獲得單克隆抗體 : 用包含抗原 ( 例如源自于病原體的抗原 ) 的組合物注射小鼠, 通過取出 血清樣品驗證抗體生產的存在, 取出脾臟獲得 B 淋巴細胞, 將 B 淋巴細胞與骨髓瘤細胞融 合以產生雜交瘤, 克隆雜交瘤, 篩選產生針對抗原的抗體的陽性克隆以及從雜交瘤培養物 分離抗體。單克隆抗體可以通過各種已確立的技術從雜交瘤培養物分離和純化。這樣的 分離技術包括使用蛋白 A 瓊脂糖凝膠的親和層析、 尺寸排阻層析和離子交換層析。參見例 如 Coligan 等, 第 2.7.1-2.7.12 節和第 2.9.1-2.9.3 節 ; Barnes 等, “免 疫球蛋白 G(IgG) 的純化” (Purification of Immunoglobulin G(IgG)), 《分子生物學方法》 (Methods in Molecular Biology) 第 10 卷 79-104 頁, Humana Press, 1992。
     單克隆抗體的體外和體內倍增方法對于本技術領域的專業人員來說是公知的。 體 外倍增可以在適合的培養基中進行, 例如 Dulbecco 修改的 Eagle 培養基或 RPMI 1640 培養 基, 任選增補有哺乳動物血清例如胎牛血清或微量元素和生長維持增補劑例如正常小鼠的 腹腔滲出細胞、 脾細胞、 胸腺細胞或骨髓巨噬細胞。體外生產提供相對純的抗體制備物, 并 允許規模放大以生產大量目標抗體。大規模雜交瘤培養可以通過在氣升式反應器、 連續攪 拌反應器中的均相懸浮培養或在固定或截留細胞培養中來進行。 體內倍增可以通過將細胞 克隆注射到與親代細胞組織相容的哺乳動物例如同系基因小鼠中, 以引起產生抗體的腫瘤 的生長來進行。任選地, 在注射前將動物用烴、 特別是油類例如降植烷 ( 四甲基十五烷 ) 致 敏。在 1 到 3 周后, 從動物的體液回收目標單克隆抗體。
     抗體也可以源自于類人靈長動物抗體。 用于在狒狒中產生治療有用抗體的通用技 術, 可見于例如 WO 91/11465, 1991 和 Losman 等, Int.J.Cancer 46 : 310, 1990。
     可供選擇地, 特異性結合源自于病原體的多肽的抗體, 可以源自于人源化單克隆 抗體。人源化單克隆抗體通過將來自于小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區的互補性決 定區轉移到人類可變結構域中, 然后將框架區中的人類殘基用鼠類對應物代替。使用源自 于人源化單克隆抗體的抗體組分免除了與鼠類恒定區的免疫原性相關的潛在問題。用于 克隆鼠類免疫球蛋白可變結構域的通用技術描述在例如 Orlandi 等, Proc.Nat′ l Acad. Sci.U.S.A.86 : 3833, 1989 中。用于生產人源化單克隆抗體的技術描述在例如 Jones 等, Nature 321 : 522, 1986 ; Riechmann 等, Nature 332 : 323, 1988 ; Verhoeyen 等, Science 239 : 1534, 1988 ; Carter 等, Proc.Nat′ l Acad.Sci.U.S.A.89 : 4285, 1992 ; Sandhu, Crit. Rev.Biotech.12 : 437, 1992 ; 和 Singer 等, J.Immunol.150 : 2844, 1993 中。抗體可以源自于從組合免疫球蛋白文庫分離的人類抗體片段。參見例如 Barbas 等, 《方法 : 酶學方法指南》 (Methods : a Companion to Methods in Enzymology)Vol.2, 119 頁, 1991 ; Winter 等, Ann.Rev.Immunol.12 : 433, 1994。可用于生產人類免疫球蛋白噬菌體 文庫的克隆和表達載體, 可以從例如 STRATAGENE Cloning Systems 公司 (La Jolla, CA) 獲得。
     此外, 抗體可以源自于人類單克隆抗體。這樣的抗體從已被 “工程化改造” 以對 抗原激惹做出應答而產生特異性人類抗體的轉基因小鼠獲得。在該技術中, 將人類重鏈和 輕鏈基因座的元件引入源自于胚胎干細胞系的小鼠種系中, 所述胚胎干細胞系含有定向破 壞的內源重鏈和輕鏈基因座。轉基因小鼠能夠合成對人類抗原特異的人類抗體, 并且小鼠 可用于產生分泌人類抗體的雜交瘤。用于從轉基因小鼠獲得人類抗體的方法描述在 Green 等, Nature Genet.7 : 13, 1994 ; Lonberg 等, Nature 368 : 856, 1994 ;和 Taylor 等, Int. Immunol.6 : 579, 1994 中。
     抗體包括完整分子及其能夠結合表位決定簇的片段, 例如 Fab、 F(ab ′ )2 和 Fv。制造這些片段的方法是本領域已知的。( 參見例如 Harlow 和 Lane, 《抗體實驗指南》 (Antibodies : A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988)。 表位是抗原上與抗體的互補位結合的任何抗原決定簇。 表位決定簇通常由分子例如氨基酸 或糖側鏈的化學活性表面基團組構成, 并通常具有特定的三維結構特征以及特定的電荷特 征。
     抗體片段可以通過抗體的蛋白水解作用或通過在大腸桿菌 (E.coli) 中表達編 碼所述片段的 DNA 來制備。抗體片段可以通過常規方法, 用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化 完整抗體來獲得。例如, 可以通過 用胃蛋白酶對抗體進行酶切割以提供被稱為 F(ab′ )2 的 5S 片段, 來產生抗體片段。該片段可以使用硫醇還原劑以及任選的用于切開二硫鍵 所產生的巰基的阻斷基團來進一步切割, 以產生 3.5S 的 Fab ′單價片段。可供選擇地, 使用胃蛋白酶的酶切割直接產生兩個單價 Fab ′片段和一個 Fc 片段 ( 參見美國專利 No.4,036,945 和美國專利 No.4,331,647 以及其中包含的參考文獻 ; Nisonhoff 等, Arch. Biochem.Biophys.89 : 230, 1960 ; Porter, Biochem.J.73 : 119, 1959 ; Edelman 等, 《酶 學 方 法》 (Methods in Enzymology), 第 1 卷, 422 頁, Academic Press, 1967 ; 和 Coligan 等, 第 2.8.1-2.8.10 和 2.10.1-2.10.4 節 )。
     也可以使用其他切割抗體的方法, 例如分離重鏈以形成單價輕鏈 - 重鏈片段、 片 段的進一步切割、 或其他酶、 化學或遺傳技術, 只一要片段與完整抗體所識別的抗原結合即 可。
     例如, Fv 片段包含聯合的 VH 和 VL 鏈。該聯合可以是非共價的 (Inbar 等, Proc. Nat′ l Acad.Sci.U.S.A.69 : 2659, 1972)。 可供選擇地, 可變鏈可以通過分子間二硫鍵相連 或通過化學物質例如戊二醛交聯。參見例如 Sandhu, 同上。優選, Fv 片段包含通過肽接頭 相連的 VH 和 VL 鏈。這些單鏈抗原結合蛋白 (sFv) 通過構建包含由寡核苷酸相連的、 編碼 VH 和 VL 結構域的 DNA 序列的結構基因來制備。將結構基因插入到表達載體中, 隨后將表達載 體導入宿主細胞例如大腸桿菌中。重組的宿主細胞合成具有橋連兩個 V 結構域的接頭肽的 單一多肽鏈。用于生產 sFv 的方法在本技術領域中是已知的 ( 參見 Whitlow 等, 《方法 : 酶 學方法指南》 (Methods : a Companion to Methods in Enzymology)Vol.2, 97 頁, 1991 ; Bird等, Science 242 : 423, 1988 ; 美國專利 No.4,946,778 ; Pack 等, Bio/Technology 11 : 1271, 1993 ; 和 Sandhu, 同上 )。
     另一種形式的抗體片段是編碼單個互補性決定區 (CDR) 的肽。CDR 肽 (“最小識 別單位” ) 可以通過構建編碼目標抗體的 CDR 的基因來獲得。這種基因通過例如使用聚合 酶鏈反應從抗體產生細胞的 RNA 合成可變區來制備 (Larrick 等, 《方法 : 酶學方法指南》 (Methods : a Companion to Methods in Enzymology)Vol.2, 106 頁, 1991)。
     抗體可以使用完整多肽、 含有目標小肽或多糖的片段作為免疫抗原來制備。用于 免疫動物的多肽或肽可以源自于在宿主細胞中產生的基本上純化的多肽、 體外翻譯的 cDNA 或化學合成, 如果需要, 其可以與載體蛋白接合。 這種常用的與肽化學偶聯的載體包括匙孔 血藍蛋白 (KLH)、 甲狀腺球蛋白、 牛血清白蛋白 (BSA) 和破傷風類毒素。然后將偶聯的肽用 于免疫動物 ( 例如小鼠、 大鼠或兔 )。
     多克隆或單克隆抗體可以通過例如結合到基質上并從基質洗脫來進一步純化, 所 述基質結合有將針對它們產生抗體的多肽或肽。本技術領域的專業人員將了解在免疫學 技術領域中用于純化和 / 或濃縮多克隆抗體以及單克隆抗體的各種常用技術 ( 參見例如 Coligan 等, 《免疫學現代方法》 (Current Protocols in Immunology) 的第 9 單元, Wiley Interscience, 1991)。
     也可以使用模擬表位的抗獨特型抗體技術來生產單克隆抗體。例如, 針對第一種 單克隆抗體制造的抗獨特型單克隆抗體, 將在高變區中具有結合結構域作為被第一個單克 隆抗體結合的表位的 “圖像” 。
     抗體可以通過克隆技術制備。適合的克隆和測序技術的實例, 以及足以指導專 業技術人員許多克隆實踐的說明, 可見于下列文獻 : Sambrook 等, 《分子克隆實驗指南》 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual) 第 2 版, Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory(1989) ; Berger 和 Kimmel 主編, 《分子克隆技術指導》 (Guide to Molecular Cloning Techniques), Academic Press, Inc., San Diego CA(1987) ; 或 Ausubel 等 主 編, 《分 子 生 物 學 現 代 方 法》 (Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY(1987)。來自生物試劑和實驗設備制造商的產 品信息也提供有用的信息。這些制造 商包括 SIGMA 化學品公司 ((Saint Louis, MO)、 R&D systems(Minneapolis, MN)、 Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway, NJ)、 CLONTECH oratories, Inc.(Palo Alto, CA)、 Chem Genes Corp.、 Aldrich 化學品公司 (Milwaukee, WI)、 Glen Research, Inc.、 GIBCO BRL Life Technologies, Inc.(Gaithersburg, MD)、 TM Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG, Buchs, 瑞士 )、 INVITROGEN (San Diego, CA) 和 Applied Biosystems(Foster City, CA), 以及專業技術人員所知的許多其他 商業來源。
     源自于病原體的、 適合用作免疫原以產生調理性抗體的基本上純的靶抗原, 通過 純化或重組表達來分離 ( 參見 D 部分 )。通過例如在 Amicon 過濾裝置上濃縮到每毫升幾微 克的水平, 來調整最終制備物中的蛋白濃度。然后可以按照 Harlow 和 Lane(《抗體實驗指 南》 (Antibodies, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Press.1988) 所述, 制備針 對蛋白的單克隆或多克隆抗體。
     可供選擇地, 可以針對合成的肽產生抗體, 所述合成肽在可商購的肽合成儀上根據靶或內化受體多肽的預測氨基酸或已知序列來合成 (Harlow 和 Lane, 《抗體實驗指南》 (Antibodies, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Press.1988)。
     單克隆抗體可以通過各種已確立的技術從雜交瘤培養物分離和純化。這樣的 分離技術包括使用蛋白 A 瓊脂糖凝膠的親和層析、 尺寸排阻層析和離子交換層析。參見 例 如 Coligan 等, 第 2.7.1-2.7.12 和 2.9.1-2.9.3 節 ; Barnes 等, “免 疫 球 蛋 白 G(IgG) 的純化” (Purification of Immunoglobulin G(IgG)), 《分子生物學方法》 (Methods in Molecular Biology) 第 10 卷第 79-104 頁中, Humana Press, 1992。
     多克隆或單克隆抗體可以通過例如結合到基質上并從基質洗脫來進一步純化, 所 述基質結合有要針對它們產生抗體的多肽或肽。本技 術領域的專業人員將了解在免疫學 技術領域中用于純化和 / 或濃縮多克隆抗體以及單克隆抗體的各種常用技術 ( 參見例如 Coligan 等, 《免疫學現代方法》 (Current Protocols in Immunology) 的第 9 單元, Wiley Interscience, 1991)。
     為了通過 Western 印跡法確定給定抗體制備物 ( 例如在小鼠中生產的 ) 特異性 結合目標的靶或內化受體多肽, 從鼠類骨髓瘤細胞提取含有靶或內化受體多肽的全細胞蛋 白, 并將其在 SDS- 聚丙烯酰胺凝膠上電泳。然后將蛋白轉移到膜 ( 例如硝酸纖維素 ) 上, 并將待測抗體制備物與膜溫育。在清洗膜以除去非特異性結合的抗體后, 使用與酶例如堿 性磷酸酶接合的抗小鼠抗體檢測特異性結合的抗體的存在 ; 施加底物 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 基磷酸鹽 / 硝基四氮唑藍, 通過免疫集中的堿性磷酸酶導致產生了致密的藍色化合物。通 過這種技術, 與靶或內化受體多肽特異性結合的抗體將顯示出結合于靶或內化受體多肽條 帶上 ( 所述條帶將集中在凝膠上由其分子量所決定的既定位置處 )。可能發生抗體與其他 蛋白 ( 例如血清靶蛋白 ) 的非特異性結合, 并可以作為弱的信號在 Western 印跡上檢測到。 本技術領域的專業人員通過在 Western 印跡上獲得的相對于由抗體 - 靶或內化受體多肽的 特異性結合產生的強的主要信號來說弱的信號和 / 或不相關部分, 認識到這種結合的非特 異性本質。
     D. 肽的生產
     P4 肽、 補體肽和源自于病原體的肽, 可以通過克隆技術來制備。適合的克隆和測 序技術的實例, 以及足以指導專業技術人員許多克隆實踐的說明, 可見于 : Sambrook 等, 《分 子克隆實驗指南》 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual) 第 2 版, Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory(1989) ; Berger 和 Kimmel 主編, 《分子克隆技術指導》 (Guide to Molecular Cloning Techniques), Academic Press, Inc., San Diego CA(1987) ; 或 Ausubel 等主編, 《分子生物學現代方法》 (Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY(1987)。來自生物試劑和實驗設備制 造商的產品信息也提供有用的信息。這些制造商包括 SIGMA 化學品公司 ((Saint Louis, MO)、 R&D systems(Minneapolis, MN)、 Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway, NJ)、 CLONTECH oratories, Inc.(Palo Alto, CA)、 Chem Genes Corp.、 Aldrich 化學 品 公 司 (Milwaukee, WI)、 Glen Research, Inc.、 GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD)、 Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG, Buchs, 瑞 TM 士 )、 INVITROGEN (San Diego, CA) 和 Applied Biosystems(Foster City, CA), 以及專業技 術人員所知的許多其他商業來源。在某些實例中。肽、 例如補體肽, 從對象、 例如從對象的血液級份、 例如從對象獲得的血清來純化。
     在某些實施方案中, 肽從例如用編碼肽或其部分的多核苷酸轉化或轉染的細胞 通過重組產生。用于操作編碼本公開的肽或其部分的核酸并將其插入到用于表達多肽的 載體中的方法, 在本技術領域中是公知的 ( 參見例如 Sambrook 等, 《分子克隆實驗指南》 (Molecular Cloning, a Laboratory Manual), 第 2 版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, 和 Ausubel 等, 《分子生物學現代方法》 (Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1994)。
     編碼本公開的肽或其部分的核酸構建物可以插入到質粒中。但是, 其他載體 ( 例 如病毒載體、 噬菌體、 粘粒等 ), 也可用于復制核酸。在本公開的情況下, 核酸構建物典型是 表達載體, 其含有促進宿主被插入的遺傳序列有效轉錄的啟動子序列。表達載體典型含有 復制原點、 啟動子以及允許轉化細胞的表型篩選的特定核酸序列。
     更通常情況下, 編碼本公開的肽或其部分的多核苷酸序列, 可以與能夠在導入宿 主細胞后驅動核酸表達的任何啟動子和 / 或增強子可操作連接。啟動子是指導核酸轉錄 的一系列核酸控制序列。包括組成型 和誘導型啟動子 ( 參見例如 Bitter 等, Methods in Enzymology 153 : 516-544, 1987)。 通過將 DNA 轉移到適合的宿主中, 可以在體外表達編碼肽或其部分的 DNA 序列。 細胞可以是原核或真核細胞。宿主可以包括微生物、 酵母、 昆蟲和哺乳動物生物體。術語還 包括對象宿主細胞的任何后代。穩定轉移——意味著外來 DNA 在宿主中連續維持——的方 法, 在本技術領域中是已知的。
     用重組 DNA 轉化宿主細胞, 可以通過本技術領域的普通專業人員所公知的常規技 術來進行。 當宿主是原核生物例如大腸桿菌時, 可以通過在指數生長期后收獲細胞, 然后使 用本技術領域公知的程序通過 CaCl2 方法進行處理, 來制備能夠攝取 DNA 的感受態細胞。 可 供選擇地, 也可以使用 MgCl2 或 RbCl。如果需要, 轉化也可以在形成宿主細胞的原生質體后 進行, 或通過電穿孔來進行。
     當宿主是真核生物時, 可以使用 DNA 轉染方法例如磷酸鈣共沉淀、 常規機械程序 例如包裹在脂質體中的質粒、 或病毒載體的微注射、 電穿孔、 插入。真核細胞也可以用編碼 肽或其部分的多核苷酸和編碼選擇性表型的第二種外源 DNA 分子例如單純性皰疹病毒胸 腺嘧啶激酶基因進行共轉染。另一種方法是使用真核的病毒載體例如猿猴病毒 40(SV40) 《真核病毒載體》 或牛乳頭狀瘤病毒來瞬時感染或轉化真核細胞并表達蛋白 ( 參見例如 (Eukaryotic Viral Vectors), Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman 主編, 1982)。 然 后可以使用本技術領域已知的方法從宿主細胞純化肽。
     源自于病原體和 / 或 P4 肽的免疫原性肽, 也可以例如通過化學合成, 利用本技術 領域中已知的多種手動或自動合成方法中的任一種來生產。 例如, 在 0.25 毫摩爾 (mmol) 規 模上進行的固相肽合成 (SPPS), 使用 Applied Biosystems 公司的 431A 型肽合成儀, 并使用 9- 芴甲氧羰 基 (Fmoc) 氨基末端保護, 與二環己基碳二亞胺 / 羥基苯并三唑或 2-(1H- 苯并 三唑 -1- 基 )-1, 1, 3, 3- 四甲基脲六氟磷酸鹽 / 羥基苯并三唑 (HBTU/HOBT) 偶聯, 并對于羧 基末端酸使用對羥甲基苯氧基甲基聚苯乙烯 (HMP) 或 Sasrin 樹脂, 或對于羧基末端酰胺使 用 Rink 酰胺樹脂。
     Fmoc 衍生的氨基酸, 從適合的前體氨基酸通過在三氟乙酸中的三苯基甲醇進行三 苯甲基化, 然后按照 Atherton 等, 《固相肽合成》 (Solid Phase Peptide Synthesis), IRL Press : Oxford, 1989 中的描述通過 Fmoc 衍生作用來制備。
     使用 1% TFA 在二氯甲烷中的溶液切割 Sasrin 樹脂結合的肽, 以產生被保護的肽。 當適宜時, 通過在其中氨基酸側鏈被保護的新生肽中使用疊氮磷酸二苯酯將氨基末端的游 離胺與羧基末端的游離酸進行反應, 將被保護的肽前體在氨基和羧基末端之間環化。
     通常使用含有三氟乙酸 (TFA)、 任選還包含比例為 100 ∶ 5 ∶ 5 ∶ 2.5 的水、 苯甲 硫醚和乙二硫醇的溶液在室溫下處理 0.5-3 小時, 將 HMP 或 Rink 酰胺樹脂結合的產物切 下, 并使含有被保護側鏈的環化肽去保護。
     粗品肽通過制備型高壓液相色譜 (HPLC) 純化, 例如使用 Waters Delta-Pak C18 柱, 并使用含有 0.1% TFA 的水通過改變乙腈進行梯度洗脫。在柱洗脫后, 從洗脫級份中蒸 發掉乙腈, 然后將其冷凍干燥。 如此生產和純化的每種產物的身份, 可以通過快原子轟擊質 譜術 (FABMS) 或電噴霧質譜術 (ESMS) 來證實。
     通過這種方法生產的肽可用于為衍生出免疫原性肽的病原體產生調理性抗體。 抗 體的調理能力的測定方法, 可以通過本技術領域的專業人員已知的方法來確定, 例如在國 際專利申請 No. PCT/US2006/015499 和美國專利申請 No.11/910,517 中描述的方法, 所述 專利申請在此以其全文引為參考。
     提供了下面的實施例以說明某些實施方案的具體特點。但是, 下面描述的具體特 點不應被解釋為對本公開范圍的限制, 而是作為實例, 本技術領域的普通專業人員將能夠 識別出其等價物。 實施例 實施例 1
     本實施例描述了證明 P4 肽增強調理吞噬作用的試驗。
     材料與方法
     肽的合成。被命名為 P4、 P6 和 P7 的肽的氨基酸序列以前已被描述 ( 參見例 如 Rajam 等, Microb Pathog 2008 ; 44 : 186-96 ; Romero-Steiner 等, Vaccine 2006 ; 24 : 3224-31)。具有游離 N- 和 C- 末端的純肽在疾病控制和預防中心 (Centers for Disease Control and Prevention(CDC)) 和 Emory 大 學 微 量 化 學 機 構 (Emory University Microchemical Facility) 合成并冷凍干燥。 在本實施例中使用的肽在 Advanced ChemTech 396 多路肽合成儀上利用標準和修改的 9- 芴甲氧羰基方案合成。 將冷凍干燥的肽重懸浮在 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 水中, 超聲處理 3 分鐘進行溶解, 并儲存在 -70℃下。從 P4 序列產生 了兩種肽 P6 和 / 或 P7。這些肽對所測試的真核細胞沒有活化效應 ( 參見 Rajam 等, Microb Pathog 44 : 186-96, 2008)。這些肽在本實施例中描述的所有體外試驗中用作陰性對照。
     在本實施例中使用的種特異性抗體。球蛋白 (Gamunex ) 已用作肺炎球菌血清 型特異性多糖 (Ps) 抗體的來源 ( 參見例如 Rajam 等, Clin Vaccine Immunol, 14 : 1223-7, 2007 ; Romero-Steiner 等, Clin Diagn Lab Immunol 10 : 1019-24, 2003)。 QC2、 QC5 和 QC268 是 CDC 自產的質控人類血清, 對于靶生物體具有指定的滴度 ( 參見例如 Martinez 等, Clin Diagn Lab Immunol 9 : 485-8, 2002 ; Martinez 等, Clin Vaccine Immunol 13 : 459-66,
     2006)。 如 Srivastava 等 (Hybridoma 2000 ; 19 : 23-31) 描述的特異性針對肺炎球菌表面黏 附素 A 的單克隆抗體 8G12G11B10(8G12), 也用作抗鏈球菌蛋白抗體的來源。對這些血清進 行篩選以確保存在特異性抗體, 并證實 P4 介導的免疫增強的特異性。體外試驗設計包括對 存在或不存在 P4 的情況下調理吞噬殺死 (OPK) 或攝取的變化進行直接比較。
     OPK 分析。在本實施例中, 如 Romero-Steiner 等, Clin Diagn Lab Immunol, 4: 415-22, 1997 中所述, 參比 OPK 分析與分化成粒細胞的人類早幼粒白血病細胞 (HL-60) 一 起使用。用作肺炎鏈球菌血清型 3(WU2) 的血清型特異性抗體來源的 γ- 球蛋白在本分析 中的增殖、 儲存和使用, 如 Romero-Steiner 等, Clin Vaccine Immunol, 13 : 165-9, 2006 和 Rajam 等, Clin Vaccine Immunol, 14 : 1223-7, 2007 所述。在預調理階段, 向 OPK 分析混合 物加入 P4 肽溶液 (100μg/mL), 對照孔代之以接受 10μL DEPC 水。也使用 γ- 球蛋白或 8G12, 利用肺炎鏈球菌血清型 6B、 15B、 15C 和 19A 評估了 P4 介導的 OPK 的增強。
     流式細胞調理吞噬攝取分析。流式細胞調理吞噬分析 (fOPA) 使用分化成粒細胞 或單核細胞的 HL-60 細胞, 按照 Martinez 等, Clin Diagn Lab Immunol 9 : 485-8, 2002 ; Martinez 等, Clin Vaccine Immunol 13 : 459-66, 2006 ; 和 Mezzatesta 等, Infect Immun 42 : 99-105, 1983 的描述進行。 使用自產的質控血清 (QC5 和 QC268) 分別作為抗肺炎鏈球菌 血清型 14 和腦膜炎奈瑟菌 A 的莢膜 Ps 的血清型特異性抗體的來源。如 Martinez 等, Clin Diagn Lab Immunol 9 : 485-8, 2002 和 Martinez 等, Clin Vaccine Immunol 13 : 459-66, 2006 所述, 將聚苯乙烯珠子與肺炎鏈球菌和非肺炎鏈球菌抗原共價連接, 并用于 fOPA 中。 在預調理階段, 向 fOPA 混合物加入 P4 肽溶液 (100μg/mL), 對照孔代之以接受 10μL DEPC 水。
     肺炎鏈球菌分離株的 OXYBURST 標記。為了證實在效應細胞中對 P4 介導的 活化做出響應, 細胞內呼吸爆發的增加, 使用了 OXYBURST 示記的肺炎鏈球菌分離株。 將一滿環肺炎鏈球菌血清型 23F 的冷凍儲用物, 在增補有 0.5 %酵母提取物 (THYE) 的 Todd-Hewitt 肉湯 (Difco) 中生長過夜 ( 在 37℃和 5% CO2 下 )。將一滿環過夜培養物轉移 到 1mL 新鮮的 THYE 肉湯中, 并溫育 3 小時。從該培養物中取 200μL 轉移到 5mL THYE 肉湯 中并溫育 3 小時, 然后取 1mL 轉移到 5mLTHYE 肉湯中并另外溫育 3 小時 ( 所有溫育在 37℃ 和 5% CO2 下進行 )。在第三次傳代后, 將細菌懸液以 6000g 離心 10 分鐘, 并重懸浮在 1mL 0.01mol/L 磷酸鹽緩沖的鹽水 (PBS) 中。將 OXYBURST 染色劑 (INVITROGEN ) 用 1mL 去 離子水復溶, 并取 50μL 加入到 1-mL 細菌懸液中。使其在旋轉搖床中在 4℃下充分混合過 夜。然后, 將 OXYBURST 標記的細菌懸液在 PBS 中洗滌兩次, 并代替聚苯乙烯珠作為抗原 來源用于 fOPA 中。在本分析中使用了自產的質控血清 (QC2)。
     從人類血液分離多形核白細胞。肝素化的靜脈血從 Emory 獻血服務部 (Emory Blood Donor Services) 獲得。使用白細胞分離試劑盒 HISTOPAQUE -1119(Sigma), 按照 制造商推薦的方法從血液分離粒細胞。
     小鼠種系。 Swiss Webster(ND4-SW) 種系的小鼠 (Mus musculus) 從 Charles River Laboratories 獲得。在本研究中使用的小鼠為 6-10 周齡。所有實驗得到機構委員會的批 準, 并按照用于動物實驗的機構論理準則和安全準則進行。 。
     細菌菌株。肺炎鏈球菌 WU2( 血清型 3) 用于小鼠感染。該肺炎鏈球菌分離株從 CDC 的鏈球菌參比實驗室 (Streptococcal Reference Laboratory) 篩選。簡單來說, 將肺炎鏈球菌分離株 ( 冷凍儲用物 ) 在血瓊脂板 ( 添加 5%綿羊血的血瓊脂基質 ) 上劃線, 并溫 育 ( 在 37℃和 5% CO2 中 )18-24 小時。使用接種環刮取血瓊脂上的肺炎鏈球菌菌落, 并在 5mL THYE 肉湯中生長~ 4 小時 ( 在 37℃和 5% CO2 中 ), 直到對數中期 (492nm 處光密度讀 數為 0.5-0.6)。將該培養物 (1.5mL) 在 2-mL 聚丙烯螺旋蓋管中以 10,000g 離心 5 分鐘, 并將濕沉淀團重懸浮在 1mL 的 0.1mol/L PBS(pH 7.2) 中。將 1-mL 細菌懸液置于冰上并用 于感染。也將其用 PBS 稀釋 10-6, 并在血瓊脂板上對活細菌載量進行計數。平均活細菌載 7 量為 4X10 個細胞 /mL。
     鼻內感染。利用 Briles 等, J Infect Dis 188 : 339-48, 2003 描述的方法使用肺 炎鏈球菌對小鼠進行鼻內感染。簡單來說, 對小鼠腹膜內注射 20μL KETASET (100mg/ mL 鹽酸開他敏 ; Wyeth)。當小鼠昏睡后, 將 40μL 前面制備的細菌懸液逐滴靠近鼻施加, 使 小鼠吸入感染。
     腹膜內 (ip) 和靜脈內 (iv) 療法。每只小鼠用 4X107 個肺炎鏈球菌 WU2 細胞感染, 在 48 小時時在 50% -60%的動物中產生瀕死特征。在 72 小時時, 所有被感染的小鼠瀕死 (n = 60 ; 瀕死分值 2-3[ 參見下文 ])。在感染后 72 和 96 小時時, 將 40 只動物用 γ- 球 蛋白被動免疫 (100μL/ 小鼠 ; iv, n = 20, ip, n = 20)。在允許發生可能的體內預調理的 20 分鐘時間后, 通過 iv 或 ip 途徑使 20 只被動免疫的小鼠 ( 靜脈內 (iv), n = 10 ; 腹膜內 (ip), n = 10) 接受 P4(100μg ; 100μL/ 小鼠 )。對照小鼠只給予 DEPC 水 (100μL) 或 P4。 開始時, 測試 1、 10、 100 和 1000μg 的 P4 肽在小鼠中的毒性。將 P4 以 100μL 的恒定體積 ip 注射到 10 周齡 ND4-SW 小鼠中。即使在 1000μg/ 小鼠的劑量下, P4 也對小鼠沒有明顯 的毒性效應。
     瀕死特征的計分。每天兩次對小鼠進行監測, 并對瀕死特征進行目測計分。以 5 到 0 的等級為小鼠進行排序, 其中 5 表示健康, 皮毛、 皮膚、 眼睛、 呼吸和活動 / 移動正常 ; 4 表示健康, 但是開始看起來有病, 毛皮起皺 ; 3 表示有病、 皮毛起皺、 活動減少 ; 2 表示病情嚴 重、 皮毛起皺、 活動減少、 有眼分泌物 ; 1 表示接近死亡、 皮毛起皺、 很少或不活動、 有眼分泌 物、 呼吸減少 ( 因此將這些動物安樂死 ) ; 以及 0 表示死亡。
     細胞因子分析。將 P4 處理的和對照的小鼠殺死并去頭。從頸根部將血液快速收 集在冷凍管中, 并將其在 4℃放置 30 分鐘。然后將管以 1000g 離心 10 分鐘。收集血清樣 品并立即用于細胞因子分析。利用基于 LUMINEX 的 LINCOPLEXTM 小鼠 22 種細胞因子試劑 盒 (MCYTO-70K-PMX22 ; LINCO Research), 使用制造商推薦的方案分析小鼠血清中的細胞因 子。
     統計學。除非另外指明, 否則所有體外實驗在 3 個獨立的分析日進行三份平行試 驗。 體內激惹實驗重復> 5 次。 處理后瀕死動物的數量記錄到 166 小時, 并使用用于平均值 的成對樣品的 t 檢驗 (Microsoft Excel 2003) 分析數據在各個組之間的顯著性差異。
     結果
     OPK 分析。測試了 P4 肽在體外增強調理吞噬作用的潛力, 數據在圖 1 中給出。圖 1A 中呈現的數據顯示出 P4 介導的肺炎鏈球菌血清型 3(WU2) 的 OPK 的增加依賴于抗體濃 度。盡管在 γ- 球蛋白 1 ∶ 8 稀釋下觀察到 OPK 增加了 35%, 但隨著抗血清的稀釋, 效果 逐漸降低 ( 圖 1A)。P4 介導的 OPK 的增加是補體依賴性的, 因為在不存在補體源的情況下, 沒有觀察到使用 P4 相對于對照的 OPK 的增加 ( 圖 1B)。P4 介導的 OPK 的增加依賴于反應混合物中 P4 的濃度。盡管在增補 5μg/mL P4 時沒有觀察到 OPK 的變化, 但隨著 P4 濃度 的增加觀察到了逐漸增加 ( 對于 10μg/mL 來說為 8%, 對于 50μg/mL 來說為 30% ; 對于 100μg/mL 來說為 35% )。在 100μg/mL 濃度下, P4 介導的 OPK 的增加達到平臺 ( 圖 1C)。 使用 γ- 球蛋白或 8G12 作為特異性抗體來源, 用肺炎鏈球菌血清型 6B、 15B、 15C 和 19A 時 也記錄到相似的 P4 介導的 OPK 的增加。
     調 理 吞 噬 性 攝 取 (OPU) 分 析。 利 用 OXYBURST 標記的肺炎鏈球菌血清型 23F(DS3848-03), 通過吞噬細胞內呼吸爆發的改變測試了 P4 介導的調理吞噬作用的增強。 P4 介導的 OPU 增加的特征為吞噬細胞內呼吸爆發隨著抗體稀釋而逐漸降低 ( 圖 2A)。圖 2B 和 2C 中呈現的 數據顯示, 在存在抗原特異性抗體和補體的情況下, P4 在活化不同效應細 胞和增強 OPU 方面具有多能性。從新鮮人類血液分離的粒細胞使肺炎鏈球菌血清型 14 的 Ps 珠的 OPU 增加≥ 50%, 其隨著抗體的稀釋而逐漸降低 ( 對于 1 ∶ 64 來說為 52% ; 對于 1 ∶ 128 來說為 48% ; 對于 1 ∶ 256 來說為 25% ; 對于 1 ∶ 512 來說為 5% )( 圖 2B)。圖 2C 顯示出在存在特異性抗體和效應細胞的情況下, P4 能夠增強對非肺炎鏈球菌抗原的體 外調理吞噬作用。使用分化成單核細胞的 HL-60 細胞, 記錄到包被了腦膜炎奈瑟菌 AP 的珠 子的 OPU 存在 P4 介導的增加 ( 圖 2C)。
     體內研究。將肺炎鏈球菌 WU2 感染的小鼠在感染后 72 和 96 小時時用 γ- 球蛋白 和 / 或 P4 進行被動免疫。盡管未治療的小鼠具有 10%的存活率 (10 只中的 1 只 ), 但單用 γ- 球蛋白治療 (iv 和 ip 兩者 ) 的小鼠具有 30%的存活率。另一方面, 使用 γ- 球蛋白和 P4 通過 iv 治療的 10 只小鼠中的 8 只 (80% )(P < .001) 和通過 ip 治療的 10 只小鼠中的 6 只 (60% )(P < .001), 表現出從菌血癥和瀕臨死亡的完全恢復 ( 圖 3)。小鼠血清樣品的 細胞因子分析顯示, 在獲救動物中細胞因子水平沒有一致的模式或變化。
     實施例 2
     本實施例描述了 P4 肽和抗生素的共同給藥作為新的治療方法來治療嚴重肺炎球 菌感染的評估。
     材料與方法
     在本實施例中使用的細菌、 肽、 抗體和抗生素。按照以前的描述使用肺炎鏈球菌 血清型 3(WU2) 感染小鼠 (Rajam 等, J.Infect.Dis.199 : 1233-1238, 1999)。按照以前的描 述合成、 純化和制備了 P4——一種 28 個氨基酸的肽, 用于組合療法 (Carlone 等, Microb. Pathog.44 : 186-196, 2008)。 使 用 γ- 球 蛋 白 ( 靜 脈 內 免 疫 球 蛋 白 [IVIG] ; Gamunex, Telecris, NC) 作為 Pnc 血清型特異性多糖抗體的來源 (Frasch 和 Scott Clin.Diagn.Lab. Immunol.11 : 1158-1164, 2004 ; Rajam 等, Clin.Vaccine Immunol.14 : 1223-1227, 2007 ; Romero-Steiner 等, Clin.Diagn.Lab.Immunol.10 : 1019-1024, 2003)。將一種廣譜頭孢菌 素——頭孢曲松 ( 目錄號 C5793 ; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) 溶解在磷酸鹽緩沖的鹽水 (0.01M) 中, 并在磷酸鹽緩沖的鹽水中制備用于小鼠接種的工作溶液。
     在本實施例中使用的小鼠。 在本研究中使用了 6 到 10 周齡的雌性 Swiss Webster 小鼠 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA)。所有實驗得到機構實驗動物管理 和使用委員會 (Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC) 批準, 并按照用 于動物實驗的機構論理準則和安全準則執行。
     鼻內感染。采用 Briles 等, 2003 描述的方法, 使用 Pnc 分離株對小鼠進行鼻內感染。簡單來說, 對小鼠腹膜內 (ip) 注射 20μl 100mg/ml 鹽酸開他敏 (KETASET Wyeth)。 當小鼠昏睡后, 將 40μl 細菌懸液 ( ~ 2.1X107 個細胞 / 小鼠 ) 逐滴靠近鼻施加, 使小鼠吸 入細菌。小鼠骯臟結合隆背體態或嗜睡標明瀕死。大多數小鼠 (80% ) 在暴露后 48 小時瀕 死。將瀕死小鼠分成表 1 中顯示的各種對照和治療組 (n = 10/ 組 )。對照組包括未治療的 動物或只接受 P4、 只接受 IVIG、 或只接受頭孢曲松 (0.3、 3.0、 300 或 3,000μg/ 小鼠 ) 的動 物。治療組包括接受單一接種物的小鼠, 所述接種物含有 P4 和 IVIG, 并含有或不含有三種 不同劑量 (0.3、 3.0 或 300μg/ 小鼠 ) 之一的頭孢曲松。
     組 合 療 法。 使 用 Tailveiner 固 定 器 ( 型 號 TV-150 ; Braintree Scientific, Braintree, MA) 將小鼠固定。使用 25 號針頭和 1-ml 注射器靜脈內 (iv) 給藥 IVIG 和 / 或 P4。首先給藥 IVIG(100-μl 體積 / 小鼠 ), 在 20 分鐘后接著給藥 P4( 每只小鼠 50μg, 在 100-μl 體積中 )。在 P4 給藥后 30 分鐘給藥頭孢曲松 (ip, 100-μl 體積 / 小鼠 )。在治療 后 7 天或 ( 在重復感染研究中 )36 天中, 每天監測動物疾病發展的臨床體征。對于重復治 療來說, 將使用 P4 組合療法挽救的小鼠在治療后第 28 天重新感染, 并再次用 P4 組合療法 治療。 盡管對照組中 25 到 30%的小鼠在第一次激惹后存 活, 但它們后來或者死于感染, 或 病入膏肓并因此被人道地安樂死。因此, 沒有來自第一次激惹的對照小鼠用于重復治療。 菌 血 癥 測 試。 收 集 來 自 P4 治 療 和 未 治 療 小 鼠 的 血 樣 (Rajam 等, J.Infect. Dis.199 : 1233-1238, 2009), 將 100-μl 等份的肝素化血樣鋪在血瓊脂板 ( 添加 5%綿羊血 加慶大霉素 [2.5mg/ 升 ] 的血瓊脂基質 ) 上。將板在 37℃和 5% CO2 中溫育 18 到 24 小時, 并對細菌進行計數。
     P4 增 強 的 調 理 吞 噬 作 用。 我 們 使 用 了 以 前 由 Romero-Steiner 等 所 描 述 的 (Romero-Steiner 等, Clin.Diagn.Lab.Immunol.4 : 415-422, 1997)、 使用從小鼠分離的多 形核白細胞 (PMN)(Devi 等, Indian J.Physiol.Pharmacol.39 : 354-360, 1995) 的體外調理 吞噬性殺死分析 (OPKA)。從感染 ( 用 Pnc WU2) 后 1 和 2 小時的小鼠或從未感染對照中, 按照以前的描述 (Frasch 和 Scott, 2004) 收集外周血樣品, 并分離白細胞衣級份 (Devi 等, 1995) 用作效應細胞來源。使用 γ- 球蛋白 (Gamunex, Telecris, NC) 作為血清型特異性 抗體來源。肺炎鏈球菌血清型 3(WU2) 按照以前的描述 (Rajam 等, 2007 ; Romero-Steiner, 2006) 繁殖、 儲存和用于本分析中。在預調理階段向 OPKA 混合物加入 100-μg/ml P4 肽溶 液, 而對照孔接受焦炭酸二乙酯水。
     用于抗 P4 IgG 的 ELISA。在感染后 14 天從用 P4 療法治療的小鼠收集血液樣品, 并采用以前描述的方法 (Rajam, 2009) 分離血清級份。酶聯免疫吸附分析 (ELISA) 按照以 前的描述并做少量修改后進行 (Scott 等, Clin.Diagn.Lab.Immunol.12 : 1195-1201, 2005 ; Scott 等, J.Infect.Dis.186 : 220-226, 2002), 以檢測和定量抗蛋白的免疫球蛋白 G(IgG)。 簡單來說, 將 ELISA 板用濃度為 5-μg/ml 的 P4 肽包被。將板在 4℃溫育過夜, 并用于檢測 和定量小鼠血清中的抗 P4 IgG。使用辣根過氧化物酶標記的抗小鼠 IgG(Sigma, St.Louis, 3, 3’ , 5, 5’ - 四甲基聯苯胺 (KPL, Gaithersburg, MD) MO) 作為報告抗體。使用 SUREBLUE 作為底物, 并使用 1N HCl 作為終止溶液。樣品測定三份平行樣, 并包含適合 的陽性和陰性 對照。
     統計學。體內組合療法實驗重復 3 到 5 次, 重復療法執行一次。分別記錄組合和 重復療法后直到 7 天和 36 天的瀕死動物的數量, 并在 MICROSOFT Excel 2003 中使用用
     于平均值的成對雙樣品 t 檢驗來分析數據在各個組之間的顯著性差異。
     結果
     組合療法。未治療的對照小鼠 (n = 10) 在 168 小時時具有 30 %的存活率。用 3,000μg 頭孢曲松單獨治療的小鼠具有 90%的存活率 ( 圖 4)。 另一方面, 單獨的較低劑量 (300、 3.0 和 0.3μg) 的頭孢曲松或 P4 提供的保護作用差, 存活率與未治療對照組的相當。 用濃度為 50μg 的 P4 與 IVIG 一起單劑治療瀕死小鼠, 產生 70%的存活率 ( 圖 4)。低劑量 (300μg) 頭孢曲松與這種 IVIG-P4 治療混合物的組合, 將小鼠存活率增加到 100%, 明顯好 于未治療對照 (P < 0.05)( 圖 4)。
     重復療法。將用組合 (P4、 IVIG 和頭孢曲松 ) 療法從致命的肺炎鏈球菌 WU2 感染 挽救的小鼠 (n = 10), 在 28 天后用肺炎鏈球菌 WU2 重新感染, 并在它們表現出瀕死時用組 合療法重新治療。P4 介導的組合療法挽救了所有被感染的動物 ( 圖 5)。
     菌血癥測試。 從 P4 治療和未治療的小鼠抽取血液樣品并進行菌血癥測試。 來自未 治療對照小鼠的血樣含有的細菌載量太高而無法計數。 來自治療動物的樣品沒有菌血癥。
     P4 增強的調理吞噬作用。 使用來自感染或未感染小鼠的 PMN 進行了 OPKA。 在存在 血清型特異性 IgG 的情況下, 與對照水平相比, 添加 P4 顯著增加 ( 達到> 80% ; P < 0.05) 了 Pnc(WU2) 的體外調理吞噬性殺死 ( 圖 6)。 用于抗 P4 IgG 的 ELISA。使用小鼠 IgG 特異性 ELISA 測試了來自 P4 治療小鼠的 血清樣品的抗 P4 抗體。所有樣品的抗 P4IgG 均為陰性。
     表1: 研究設計
     n = 10/ 組。 所 有 組 以 ~ 2.1X107 個 細 胞 /40μl/ 小 鼠 鼻 內 接 受 肺 炎 鏈 球 菌 (S.pneumoniae) 血清型 3(WU2)。33a102186495 A CN 102186499
     b說明書31/34 頁iv 給藥在 100-μl 體積中的 50μg P4 和 100μl γ- 球蛋白 ; 頭孢曲松以表明的 劑量在 100-μl 體積中 ip 給藥。+, 包含在治療混合物中 ; -, 未包含在治療混合物中。
     實施例 3
     使用 P4 肽治療對象
     本實施例描述了可用于治療患有目標病原體 ( 例如術語概述中列出的病原體 ) 感 染或具有其感染風險的對象的方法, 所述感染可以通過給藥一種或多種 P4 肽以及任選的 調理性抗體和 / 或補體蛋白, 通過對目標病原體的調理吞噬作用進行治療。在某些實例中, 所述一種或多種 P4 肽不與調理性抗體和 / 或補體蛋白一同給藥。在具體實例中, 方法 包 括篩選患有、 據認為患有病原體感染或具有病原體感染的風險 ( 例如由于免疫力受損、 生 理狀態或暴露于病原體 ) 的對象。可以對感染狀態未知的對象進行檢查, 以確定他們是否 具有感染, 例如使用血清學測試、 身體檢查、 酶聯免疫吸附分析 (ELISA)、 放射學篩查或本技 術領域的專業人員已知的其他診斷技術。在某些實例中, 篩選具有病原體感染或具有獲得 病原體感染的風險的對象, 所述病原體不表達肺炎球菌表面黏附素 A(PsaA), 例如對象不具 有肺炎鏈球菌感染。選擇被發現 ( 或已知 ) 具有病原體感染并因此可以通過給藥 P4 肽治 療的對象來接受 P4 肽。也可以選擇具有發生病原體感染的風險的對象, 例如年老、 免疫受 損和非常年輕的對象, 例如嬰兒。
     向所選的治療對象給藥治療量的 P4 肽。P4 肽可以用每劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體 重 的 劑 量 給 藥, 例 如 每 劑 1μg/kg 體 重 -100μg/kg 體 重、 每 劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重或甚至更高的劑量。但是, 具體的劑量可以由訓練有素的臨床醫生決定。藥劑可以給藥幾劑, 例如連續地、 每日、 每周 或每月給藥。
     給藥方式可以是本技術領域中使用的任何方式。 給藥于對象的藥劑量可以由臨床 醫生確定, 并可能取決于待治療的具體對象。本文中提供了示例性的具體量 ( 但本公開不 限于這些劑量 )。
     實施例 4
     使用 P4 肽和調理性抗體治療對象
     本實施例描述了可用于治療患有目標病原體 ( 例如術語概述中列出的病原體 ) 感 染或具有其感染風險的對象的方法, 所述感染可以通過給藥一種或多種 P4 肽和特異性結 合目標病原體表面上存在的抗原的調理性抗體, 通過對目標病原體的調理吞噬作用進行治 療。 在具體實例中, 方法包括篩選患有、 據認為患有病原體感染或具有病原體感染的風險的 對象。可以對感染狀態未知的對象進行檢查, 以確定他們是 否具有感染, 例如使用血清學 測試、 身體檢查、 酶聯免疫吸附分析 (ELISA)、 放射學篩查或本技術領域的專業人員已知的 其他診斷技術。 在某些實例中, 使用血清學測試、 或使用特異性針對目標病原體的核酸探針 或甚至可以同時鑒定幾種病原體的一組核酸探針例如陣列, 來篩查對象以鑒定具體的目標 病原體。選擇的對象被發現 ( 或已知 ) 具有來自目標病原體例如肺炎鏈球菌、 化膿性鏈球 菌、 腦膜炎奈瑟菌或金黃色葡萄球菌例如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌 (MRSA) 的病原性 感染, 并因此可以通過給藥 P4 肽聯合特異性針對所檢測目標病原體的調理性抗體治療, 使 其接受 P4 肽和特異性針對目標病原體的調理性抗體。也可以選擇具有發生病原體感染的 風險的對象, 例如暴露于已知目標病原體、 年老、 免疫受損和非常年輕的對象, 例如嬰兒。向所選的治療對象給藥治療量的 P4 肽。P4 肽可以用每劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體 重 的 劑 量 給 藥, 例 如 每 劑 1μg/kg 體 重 -100μg/kg 體 重、 每 劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。向對象給藥治療量 的特異性針對所鑒定的目標病原體的調理性抗體。調理性抗體可以用每劑 1μg/kg 體重至 約 1mg/kg 體重的劑量給藥, 例如每劑 1μg/kg 體重 -100μg/kg 體重、 每劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。但是, 具體的劑量 可以由有訓練有素的臨床醫生決定。P4 肽可以與調理性抗體同時或順序給藥。P4 肽和 / 或調理性抗體可以一劑或幾劑給藥, 例如連續地、 每日、 每周或每月給藥。 當順序給藥時, P4 肽和調理性抗體給藥的時間間隔可以是數秒、 數分鐘、 數小時、 數日或甚至數周。
     給藥方式可以是本技術領域中使用的任何方式。 給藥于對象的藥劑量可以由臨床 醫生確定, 并可能取決于所治療的具體對象。本文中提供了示例性的具體量 ( 但本公開不 限于這些劑量 )。
     實施例 5
     使用抗生素、 P4 肽和調理性抗體的組合治療對象
     本實施例描述了可用于治療患有目標病原體 ( 例如術語概述中列出的病原體 ) 感 染或具有其感染風險的對象的方法, 所述感染可以通過給藥一種或多種 P4 肽和特異性結 合目標病原體表面上存在的抗原的調理性抗體, 通過對目標病原體的調理吞噬作用進行治 療。 在具體實例中, 方法包括篩選患有、 據認為患有病原體感染或具有病原體感染的風險的 對象。可以對感染狀態未知的對象進行檢查, 以確定他們是否具有感染, 例如使用血清學 測試、 身體檢查、 酶聯免疫吸附分析 (ELISA)、 放射學篩查或本技術領域的專業人員已知的 其他診斷技術。 在某些實例中, 使用血清學測試、 或使用特異性針對目標病原體的核酸探針 或甚至可以同時鑒定幾種病原體的一組核酸探針例如陣列, 來篩查對象以鑒定具體的目標 病原體。選擇的對象被發現 ( 或已知 ) 具有來自目標病原體例如肺炎鏈球菌、 化膿性鏈球 菌、 腦膜炎奈瑟菌或金黃色葡萄球菌例如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌 (MRSA) 的病原性 感染, 并因此可以通過給藥 P4 肽聯合抗生素和特異性針對所檢測的目標病原體的調理性 抗體來治療, 將其給藥 P4 肽和抗生素以及特異性針對目標病原體的調理性抗體。也可以選 擇具有發生病原體感染的風險的對象, 例如暴露于已知目標病原體、 年老、 免疫受損和非常 年輕的對象, 例如嬰兒。
     向所選的治療對象給藥治療量的 P4 肽。P4 肽可以用每劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體 重 的 劑 量 給 藥, 例 如 每 劑 1μg/kg 體 重 -100μg/kg 體 重、 每 劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。向對象給藥治療量 的特異性針對所鑒定的目標病原體的調理性抗體。調理性抗體可以用每劑 1μg/kg 體重至 約 1mg/kg 體重的劑量給藥, 例如每劑 1μg/kg 體重 -100μg/kg 體重、 每劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。但是, 具體的劑量 可以由有訓練有素的臨床醫生決定。向所選的治療對象給藥治療量的 P4 肽。抗生素可以 用每劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體重 ( 取決于諸如抗生素的效力和 / 或類型等因素 ) 的 劑量給藥, 例如 每劑 1μg/kg 體重 -100μg/kg 體重、 每劑 100μg/kg 體重 -500μg/kg 體 重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。P4 肽可以與抗生素和調理性抗體同 時或順序給藥。給藥方式可以是本技術領域中使用的任何方式。 給藥于對象的藥劑量可以由臨床 醫生確定, 并可能取決于所治療的具體對象。本文中提供了示例性的具體量 ( 但本公開不 限于這些劑量 )。
     實施例 6
     使用 P4 肽和抗生素治療對象
     本實施例描述了可用于治療患有目標病原體 ( 例如術語概述中列出的病原體 ) 感 染或具有其感染風險的對象的方法, 所述感染可以通過給藥一種或多種 P4 肽和特異性結 合目標病原體表面上存在的抗原的調理性抗體, 通過對目標病原體的調理吞噬作用進行治 療。 在具體實例中, 方法包括篩選患有、 據認為患有病原體感染或具有病原體感染的風險的 對象。可以對感染狀態未知的對象進行檢查, 以確定他們是否具有感染, 例如使用血清學 測試、 身體檢查、 酶聯免疫吸附分析 (ELISA)、 放射學篩查或本技術領域的專業人員已知的 其他診斷技術。 在某些實例中, 使用血清學測試、 或使用特異性針對目標病原體的核酸探針 或甚至可以同時鑒定幾種病原體的一組核酸探針例如陣列, 來篩查對象以鑒定具體的目標 病原體。選擇的對象被發現 ( 或已知 ) 具有來自目標病原體例如肺炎鏈球菌、 化膿性鏈球 菌、 腦膜炎奈瑟菌或金黃色葡萄球菌例如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌 (MRSA) 的病原性 感染, 并因此可以通過給藥 P4 肽聯合特異性針對所檢測的目標病原體的抗生素治療, 對其 給藥 P4 肽和特異性針對目標病原體的抗生素。也可以選擇具有發生病原體感染的風險的 對象, 例如暴露于已知目標病原體、 年老、 免疫受損和非常年輕的對象, 例如嬰兒。
     向所選的治療對象給藥治療量的 P4 肽。P4 肽可以用每劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體重的劑量給藥, 例如每劑 1μg/kg 體重 -100μg/kg 體重、 每劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。向對象給藥治療 量的特異性針對所鑒定的目標病原體的調理性抗體。抗生素可以用每劑 1μg/kg 體重至 約 1mg/kg 體重的劑量給藥, 例如每劑 1μg/kg 體重 -100μg/kg 體重、 每劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。但是, 具體的劑量 可以由有訓練有素的臨床醫生決定。P4 肽可以與抗生素同時或順序給藥。P4 肽和 / 或抗 生素可以用一劑或幾劑給藥, 例如連續地、 每日、 每周或每月給藥。當順序給藥時, P4 肽和 抗生素給藥的時間間隔可以是數秒、 數分鐘、 數小時、 數日或甚至數周。
     給藥方式可以是本技術領域中使用的任何方式。 給藥于對象的藥劑量可以由臨床 醫生確定, 并可能取決于所治療的具體對象。本文中提供了示例性的具體量 ( 但本公開不 限于這些劑量 )。
     實施例 7
     使用 P4 肽治療具有肺炎風險的對象
     本實施例描述了可用于治療患有肺炎或具有肺炎風險的對象的方法, 所述肺炎來 自例如已知引起肺炎的病原體, 例如肺炎鏈球菌。在具體實例中, 方法包括篩選患有、 據認 為患有引起肺炎例如肺炎球菌疾病的病原體感染如肺炎鏈球菌感染或具有所述感染風險 的對象。可以選擇具有發生病原體感染的風險的對象, 例如暴露于已知目標病原體、 年老、 免疫受損的 ( 例如處在免疫抑制療法中或 HIV 感染的 ) 和非常年輕的對象, 例如嬰兒。可 以將肺炎球菌感染例如肺炎鏈球菌感染的風險增加, 與對抗肺炎鏈球菌的定植、 吸入或侵 襲的非特異性和特異性防御機制的缺陷相關聯。這種缺陷的實例包括咳嗽反射降低、 纖毛功能不良和免疫缺陷例如低 γ 球蛋白血癥、 補體缺陷、 白細胞減少癥或無脾。其他風險因 子包括癡呆、 癲癇病、 當前吸食煙草例如吸煙、 飲酒、 充血性心力衰竭、 腦血管疾病、 收容和 慢性阻塞性肺病 (COPD)。在例如無脾對象中, 侵入性肺炎球菌疾病的風險為每年約十萬分 之五百。
     向所選的治療對象給藥治療量的 P4 肽。P4 肽可以用每劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體 重 的 劑 量 給 藥, 例 如 每 劑 1μg/kg 體 重 -100μg/kg 體 重、 每 劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。在某些實例中, 還 向對象給藥治療量的特異性針對所鑒定的目標病原體的調理性抗體。 調理性抗體可以用每 劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體重的劑量給藥, 例如每劑 1μg/kg 體重 -100μg/kg 體重、 每 劑 100μg/kg 體重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。但 是, 具體的劑量可以由有訓練有素的臨床醫生決定。P4 肽可以與調理性抗體同時或順序給 藥。P4 肽和 / 或調理素抗體可以給藥一劑或幾劑, 例如連續地、 每日、 每周或每月給藥。當 順序給藥時, P4 肽和調理性抗體給藥的時間間隔可以是數秒、 數分鐘、 數小時、 數日或甚至 數周。
     給藥方式可以是本技術領域中使用的任何方式。 給藥于對象的藥劑量可以由臨床 醫生確定, 并可取決于所治療的具體對象。本文中提供了示例性的具體量 ( 但本公開不限 于這些劑量 )。
     技術領域
    本公開涉及用于治療和 / 或預防病原性感染、 具體來說用于增強調理性抗體在病 原體的調理吞噬中的有效性的組合物和方法。背景技術
     在過去的一個世紀中, 對抗感染例如病毒感染、 真菌感染、 細菌感染等的藥劑的開 發, 已在全世界大大增加了平均壽命。 但是, 病原體不斷發展出避開或繞過現有治療方法的 途徑。 例如, 傳統抗生素例如青霉素和相關化合物的廣泛使用, 已導致發展出對這些傳統抗 生素具有抗性的細菌, 例如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)(MRSA) 的出現。同樣地, 病毒病原體例如 HIV, 能夠在幾個復制周期內就獲得對抗病毒劑的抗性。 為了對抗病原體千變萬化的局面和不斷出現的對現有療法的抗性, 制藥公司的標 準做法是開發不斷增加的一系列小分子治療藥劑。作為供選方案, 已經開發了通過引發針 對靶病原體的抗體應答來刺激身體對抗感染的疫苗。
     抗體通過識別并結合病原體上的抗原以促進通過被稱為吞噬作用的過程移除或 “清除” 病原體, 來對抗病原體攻擊執行保護, 在所述吞噬作用中, 吞噬細胞 ( 例如中性粒細 胞和巨噬細胞 ) 識別、 吞食并隨后破壞病原體。但是, 一些病原體, 例如某些細菌, 能夠避開 吞噬作用。 細菌能夠產生抑制吞噬細胞附著的 “莢膜” 。調理性抗體通過在被稱為調理作 用的過程中與莢膜或細菌上的其他靶抗原結合, 來克服這些防御機制。 這觸發了補體級聯, 產生一組具有調理和裂解活性的血清蛋白質。調理性抗體與補體成分例如 C3a 和 C5a 一起 結合細菌, 使細菌極其吸引吞噬細胞, 并增加了細菌從血流的清除率。 最近的研究已經利用 到調理性抗體, 通過純化調理性抗體并向對象給藥這些抗體來治療感染。盡管調理性抗體 的使用在治療和 / 或預防病原體感染方面顯示出一些希望, 但對于增加這些抗體的功效以 例如減少獲得治療有效性結果所需的調理性抗體的量上, 存在著需求。本文公開的方法滿 足了這些需求。
     發明概述
     本文公開的方法涉及增強調理性抗體的調理性質以增加病原體的調理吞噬作用。 這種增強是基于一個意外的發現, 即包含 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基酸序列的 P4 肽增加了 效應細胞將調理性抗體結合的病原體內化的能力。因為 P4 肽以不加區別的方式增加效應 細胞調理吞噬被調理性抗體結合的病原體的能力, 因此通過使用特異性針對任何目標病原 體的調理性抗體, P4 肽能有潛力用于靶向任何目標病原體。在具體實例中, P4 肽與特異性 針對 ( 例如特異性結合 ) 所選目標病原體的調理性抗體共同給藥。因此, 本文公開的方法
     能夠用于抑制和 / 或治療來自任何目標病原體的感染。
     所公開的在對象中增強對目標病原體的調理吞噬作用的方法, 包括向對象給藥治 療有效量的含有 SEQ ID NO : 1 所顯示氨基酸序列的分離 P4 肽。也可以向對象給藥特異性 結合目標病原體表面上存在的抗原的治療有效量的分離的調理性抗體或其片段 ( 或甚至 多種調理性抗體 ), 用來例如靶向目標病原體。 通過給藥 P4 肽, 增加了調理性抗體的調理活 性 ( 不論調理性抗體是由對象產生還是給藥于對象 ), 從而增強了對目標病原體的調理吞 噬作用。在所公開的方法的某些實例中, 還向對象給藥分離的補體蛋白或其片段 ( 例如補 體蛋白的 C3a、 C3b、iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a 片段 )。在所公開的方法的某些實施方案中, 還 向對象給藥抗生素。
     通過使用與所選目標病原體結合的調理性抗體 ( 或與幾種目標病原體結合的抗 體 ), 所公開的方法可用于增強對任何目標病原體的調理吞噬作用, 其中所述目標病原體 是例如目標細菌病原體、 目標病毒病原體、 病毒感染的細胞或目標真菌病原體, 例如在術 語概述中闡釋的目標病原體。在具體實例中, 目標病原體是肺炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae)、 化 膿 性 鏈 球 菌 (Streptococcus pyogenes)、 腦 膜 炎 奈 瑟 菌 (Neisseria meningitides)、 或金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus), 例如耐甲氧西林金黃色葡 萄球菌 (MRSA)。 在某些實例中, 使用藥物增強對任何目標病原體的調理吞噬作用, 用于例如 治療目標病原體的感染, 所述目標病原體是例如目標細菌病原體、 目標病毒病原體、 病毒感 染的細胞或目標真菌病原體, 例如在術語概述中闡釋的目標病原體。
     還公開了用于治療和 / 或抑制目標病原體感染、 用于制造藥物和 / 或用作藥物的 組合物, 例如治療組合物。所公開的治療組合物包含治療有效量的含有 SEQ ID NO : 1 所顯 示氨基酸序列的分離的 P4 肽, 以及治療有效量的特異性結合目標病原體表面上存在的抗 原的一種或多種分離的調理性抗體或其片段。在某些實施方案中, 所公開的治療組合物包 括治療有效量的分離的補體蛋白或其片段, 例如 C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a 中的一種 或多種。在某些實施方案中, 所公開的治療組合物包括治療有效量的抗生素。
     從下面參考附圖進行的詳細描述中, 本發明的上述以及其他的目的、 特點和優點 將變得更加明了。
     附圖簡述
     圖 1A-1C 是一組條形圖, 證實了 P4 介導的體外調理吞噬作用的增 強。圖 1A 是 顯示抗體濃度對調理吞噬作用的影響的條形圖。在 1 ∶ 8 稀釋的 γ- 球蛋白下, 肺炎鏈球 菌 (Streptococcus pneumoniae) 血清型 3(WU2) 的調理吞噬性殺死 (OPK) 與對照相比增加 35%; 這種效應隨著稀釋而滴度下降, 在 1 ∶ 32 稀釋下與對照獲得的結果平行。圖 1B 是顯 示補體對調理吞噬作用的影響的條形圖。 不論是否存在 P4, 體外 OPK 都需要仔兔補體。 無補 體的分析組接受熱失活的補體 (56℃下 30 分鐘 )。圖 1C 是顯示 P4 濃度對調理吞噬作用的 影響的條形圖。 隨著 P4 濃度的增加, 可以觀察到肺炎鏈球菌 (S.pneumonia) 血清型 3(WU2) 與對照相比 OPK 的逐漸增加。使用 1 ∶ 8 稀釋的 γ- 球蛋白作為血清特異性 IgG 的來源。
     圖 2A-2C 是一組條形圖, 證實了通過流式細胞術測定到的 P4 介導的體外調理吞噬 作用的增強。圖 2A 是條形圖, 證實了 P4(100μg/mL) 在 HL-60 衍生的粒細胞中增加呼吸爆 發。使用自產 (in-house) 質量控制血清 (QC2) 測試了用 OXYBURST 標記的肺炎鏈球菌血 清型 23F 莢膜多糖 (Ps) 包被的珠子被粒細胞的調理吞噬性攝取 (OPU)。OXYBURST 信號的峰值位于 1 ∶ 3200 的血清稀釋度處。圖 2B 是條形圖, 證實了在 QC2 存在下, P4(100μg/ mL) 增加了用肺炎鏈球菌血清型 14 的 Ps 包被的珠子被從人類血液新鮮分離的粒細胞的 OPU。圖 2C 是條形圖, 證實了在自產質量控制血清 QC268 存在下, P4(100μg/mL) 增加了用 腦膜炎奈瑟菌 (N.meningitidis)A 的 Ps 包被的珠子被 HL-60 衍生的單核細胞的 OPU。
     圖 3 是證明了 P4 與血清型特異性 IgG 針對致命性鼻內肺炎鏈球菌血清型 3(WU2) 激惹提供保護作用的圖。在激惹后 72 和 96 小時時靜脈內 (iv) 注射 P4(100μg/ 小鼠 ) 和 γ- 球蛋白 (100μL/ 小鼠 ), 提供了針對致命性肺炎鏈球菌 WU2 感染的高度顯著的保護作 用 (80% ; P < .001), 有效性其次的是通過腹膜內 (ip) 途徑給藥 (60% ; P < .001)。
     圖 4 是證實了各種治療分支中的小鼠和對照小鼠在暴露于肺炎鏈球菌血清型 3(WU2) 后的存活率的圖。 P4 和 γ- 球蛋白 (IVIG) 混合物的單劑 iv 注射與頭孢曲松 (Ceft) 的 ip 注射, 與未處理的對照相比提供了非常顯著的保護作用 (100% ; P < 0.05)。
     圖 5 是顯示了對以前用 P4 組合療法援救、 在第 28 天時用肺炎鏈球菌 血清型 3(WU2) 重新感染的小鼠 ( ◆ ) 影響的圖。在 2 天后給藥單劑 P4、 γ- 球蛋白 (IVIG) 和頭 孢曲松。所有動物 (100% ) 都得到保護。
     圖 6 是一組條形圖, 顯示了使用從感染后 1 和 2 小時的小鼠或從未感染小鼠分離 的外周血 PMN 進行的體外調理吞噬性殺死分析 (OPKA) 的結果。γ- 球蛋白 (IVIG) 被用作 血清型特異性抗體的來源。與使用來自未接受 P4 的對照小鼠的 PMN 相比, 加入 P4 使肺炎 鏈球菌血清型 3(WU2) 的調理吞噬殺死增加了≥ 80% (P < 0.05)。
    
    序列 在隨附的序列名單中列出的氨基酸序列, 使用用于氨基酸的標準三字母編碼來顯示。 SEQ ID NO : 1 是示例性 P4 肽的氨基酸序列。
     詳細描述
     I. 術語概述
     除 非 另 外 指 明, 否 則 技 術 術 語 按 照 常 規 用 法 使 用。 分 子 生 物 學 中 的 常 見 術語的定義可見于: Benjamin Lewin, 《基 因 VII》 (Genes VII), 由牛津大學出版社 (Oxford University Press) 出版, 1999 ; Kendrew 等主編, 《分子生物學百科全書》 (The Encyclopedia of Molecular Biology),由 Blackwell Science Ltd. 出 版, 1994 ;和 Robert A.Meyers 主編, 《分子生物學和生物技術 : 全面桌面參考》 (Molecular Biology and Biotechnology : a Comprehensive Desk Reference), 由 VCH Publishers, Inc. 出版, 1995 ; 以及其他類似參考書。
     當在本文中使用時, 除非上下文明確另有指明, 否則不帶具體數量指示的名詞既 指單數、 也指復數。例如, 術語 “P4 肽” 包括單個或多個肽, 并可以被認為與詞組 “至少一個 P4 肽” 等價。
     本文中使用的術語 “包含” 意味著 “包括” 。因此, “包含 P4 肽” 意味 著 “包括 P4 肽” , 不排除其他要素。
     此外應該理解, 除非另有指明, 否則對于核酸或多肽所給出的所有堿基大小或氨 基酸大小以及所有的分子量或分子質量值, 都是近似值, 提供其是為了說明性目的。 盡管與 本文所述的相似或等價的方法和材料均可以使用, 但下面描述了特別適合的方法和材料。
     在有沖突的情況下, 以本說明書包括術語的解釋為準。此外, 材料、 方法和實例僅僅是說明 性的, 而不打算是限制性的。
     為了便于審閱本公開的各種實施方案, 提供了下列術語的解釋 :
     給藥 : 通過選定的途徑將組合物導入對象中。例如, 如果所選途徑是靜脈內, 那么 通過將組合物導入對象的靜脈中進行組合物給藥。 同樣地, 如果給藥途徑是鼻內, 組合物通 過鼻給藥。
     動物 : 活的多細胞有脊椎或無脊椎生物體, 類別包括例如哺乳動物和鳥類。 術語哺 乳動物包括人類和非人類哺乳動物二者。同樣地, 術語 “對象” 包括人類和獸醫對象, 例如 非人類靈長動物。因此, 向對象給藥可以包括向人類對象給藥。獸醫對象的具體實例包括 家養動物 ( 例如貓和狗 )、 家畜 ( 例如牛、 馬、 豬、 綿羊和山羊 )、 實驗室動物 ( 例如小鼠、 兔、 大鼠、 沙鼠、 豚鼠和非人類靈長動物 ) 以及鳥類、 爬行類和魚類等。
     抗生素 : 抑制細菌生長和 / 或殺死細菌的化合物、 組合物或物質。術語抗生素也 可用于指稱一種以上抗生素。可用于本公開的方法和組合物的抗生素的實例包括但不限 于氨基糖苷類 ( 例如阿米卡星、 慶大霉素、 卡那霉素、 新霉素、 奈替米星、 鏈霉素、 妥布霉素 和巴龍霉素 ) ; 安沙霉素類 ( 例如格爾德霉素和除莠霉素 ) ; 碳頭孢烯類 ( 例如氯碳頭孢、 厄他培南、 多尼培南、 亞胺培南 / 西司他汀和美羅培南 ) ; 頭孢菌素類 ( 例如頭孢羥氨芐、 頭 孢唑啉、 頭孢噻吩、 頭孢氨芐、 頭孢克 洛、 頭孢孟多、 頭孢西丁、 頭孢丙烯、 頭孢呋辛、 頭孢克 肟、 頭孢地尼、 頭孢妥侖、 頭孢哌酮、 頭孢噻肟、 頭孢泊肟、 頭孢他啶、 頭孢布烯、 頭孢唑肟、 頭 孢曲松、 頭孢吡肟和頭孢托羅 ) ; 糖肽類 ( 例如替考拉寧和萬古霉素 ) ; 大環內酯類 ( 例如阿 奇霉素、 克拉霉素、 地紅霉素、 紅霉素、 羅紅霉素、 醋竹桃霉素、 泰利霉素和壯觀霉素 ) ; 單酰 胺菌素類 ( 例如氨曲南 ) ; 青霉素類 ( 例如阿莫西林、 氨芐青霉素、 阿洛西林、 羧芐青霉素、 氯唑西林、 雙氯西林、 氟氯西林、 美洛西林、 甲氧西林、 萘夫西林、 苯唑西林、 青霉素、 哌拉西 林和替卡西林 ) ; 多肽類 ( 例如桿菌肽、 粘桿菌素和多粘菌素 b) ; 喹諾酮類 ( 例如環丙沙星、 依諾沙星、 加替沙星、 左氧氟沙星、 洛美沙星、 莫西沙星、 諾氟沙星、 氧氟沙星、 曲伐沙星、 格 帕沙星和司帕沙星 ) ; 磺胺類 ( 例如磺胺米隆、 百浪多息 ( 已廢止 )、 乙酰磺胺、 磺胺甲噻二 唑、 磺胺二甲異噁唑 ( 已廢止 )、 柳氮磺胺吡啶、 磺胺異噁唑、 甲氧芐啶和甲氧芐啶 - 磺胺甲 基異噁唑 ) ; 四環素類 ( 例如地美環素、 多西環素、 米諾環素、 土霉素和四環素 ) ; 以及其他 ( 例如胂凡納明、 氯霉素、 克林霉素、 林可霉素、 乙胺丁醇、 磷霉素、 夫西地酸、 呋喃唑酮、 異煙 肼、 利奈唑胺、 甲硝唑、 莫匹羅星、 呋喃妥因、 平板霉素、 吡嗪酰胺、 奎奴普汀 / 達福普汀、 利 福平、 甲砜霉素和替硝唑 )。
     抗原 : 能夠在哺乳動物中刺激抗體 ( 例如功能性抗體 ) 產生或 T 細胞應答的化合 物、 組合物或物質, 包括注射、 吸收或通過其他方法導入到哺乳動物中的組合物。實例包括 但不限于含有抗原決定簇、 例如被免疫細胞識別的抗原決定簇的肽類、 脂類、 多糖和核酸。 在某些實例中, 抗原包括源自于目標病原體的肽。示例性病原體包括細菌、 真菌、 病毒和寄 生蟲。 來自目標病原體的抗原可用于產生特異性結合目標病原體并參與對病原體的調理吞 噬作用的調理性抗體。
     抗體 : 免疫球蛋白及其免疫活性部分 (“片段” ), 例如包含與抗原特異性結合 ( 發 生免疫反應 ) 的抗原結合位點的分子。天然存在的抗體 ( 例如 IgG、 IgM 和 IgA) 包括 4 條 多肽鏈, 兩條重鏈 (H) 和兩 條輕鏈 (L) 通過二硫鍵互相連接。其免疫活性部分的實例包括但不限于 Fab、 Fab′、 F(ab′ )2、 Fabc 和 Fv 部分。功能性抗體是特異性結合抗原例如病原 體表面上存在的抗原、 能夠有效允許補體固著、 并且也與效應細胞相互作用的抗體, 其中抗 體與效應細胞的相互作用引起效應細胞將抗體內化以及對病原體的調理吞噬作用。
     細菌病原體 : 引 起 疾 病 的 細 菌 ( 病 原 性 細 菌 )。 可 以 按 照 本 公 開 的 方 法 增 強 針 對 其 調 理 吞 噬 作 用 的 病 原 性 細 菌, 包括但不限于下列細菌中的任一種或多 種(或其任何組合): 鮑 曼 不 動 桿 菌 (Acinetobacter baumanii)、 放線桿菌菌種 (Actinobacillus sp.)、 放 線 菌 綱 (Actinomycetes)、 放 線 菌 屬 (Actinomyces sp.)( 例 如 伊 氏 放 線 菌 (Actinomyces israelii) 和 內 氏 放 線 菌 (Actinomyces naeslundii))、 氣 單 胞 菌 屬 (Aeromonas sp.)( 例 如 嗜 水 氣 單 胞 菌 (Aeromonas hydrophila)、維 羅 納 氣 單 胞 菌 溫 和 生 物 變 種 (Aeromonas veronii biovar sobria)( 溫 和 氣 單 胞 菌 Aeromonas sobria) 和 豚 鼠 氣 單 胞 菌 (Aeromonas caviae))、 嗜吞噬細胞無形體 (Anaplasma phagocytophilum)、 邊 緣 無 漿 體 (Anaplasma marginale)、 木糖氧化產堿 菌 (Alcaligenes xylosoxidans)、 鮑曼不動桿菌 (Acinetobacter baumanii)、 伴放線放 線 桿 菌 (Actinobacillus actinomycetemcomitans)、 芽 孢 桿 菌 屬 (Bacillus sp.)( 例 如炭疽芽孢桿菌 (Bacillus anthracis)、 蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus cereus)、 枯草芽孢 桿 菌 (Bacillus subtilis)、 蘇 云 金 桿 菌 (Bacillus thuringiensis) 和 嗜 熱 脂 肪 芽 孢 桿 菌 (Bacillus stearothermophilus))、 擬 桿 菌 屬 (Bacteroides sp.)( 例 如 脆 弱 擬 桿 菌 (Bacteroides fragilis))、 巴爾通氏體屬 (Bartonella sp.)( 例如桿菌狀巴爾通氏 體 (Bartonella bacilliformis) 和 漢 氏 巴 爾 通 氏 體 (Bartonella henselae))、 雙歧 桿 菌 屬 (Bifidobacterium sp.)、 包 特 氏 菌 屬 (Bordetella sp.)( 例 如 百 日 咳 包 特 氏 菌 (Bordetella pertussis)、 副 百 日 咳 包 特 氏 菌 (Bordetella parapertussis) 和 支 氣 管 炎 包 特 氏 菌 (Bordetella bronchiseptica))、 疏 螺 旋 體 屬 (Borrelia sp.)( 例 如 回 歸 熱 螺 旋 體 (Borrelia recurrentis) 和 伯 氏 疏 螺 旋 體 (Borrelia burgdorferi))、 布 魯 氏 菌 屬 (Brucella sp.) ( 例 如 流 產 布 魯 氏 菌 (Brucella abortus)、 犬布魯氏 菌 (Brucella canis)、馬 爾 他 布 魯 氏 菌 (Brucella melintensis) 和 豬 布 魯 氏 菌 (Brucella suis))、 伯克霍爾德氏菌屬 (Burkholderia sp.)( 例如類鼻疽伯克霍爾德氏 菌 (Burkholderia pseudomallei) 和 洋 蔥 伯 克 霍 爾 德 氏 菌 (Burkholderia cepacia))、 彎曲桿菌屬 (Campylobacter sp.)( 例如空腸彎曲桿菌 (Campylobacter jejuni)、 大腸 彎曲桿菌 (Campylobacter coli)、 紅嘴鷗彎曲桿菌 (Campylobacter lari) 和胎兒彎曲 桿菌 (Campylobacter fetus))、 二氧化碳噬纖維菌屬 (Capnocytophaga sp.)、 人類心桿 菌 (Cardiobacterium hominis)、 沙 眼 衣 原 體 (Chlamydia trachomatis)、 肺炎嗜衣原 體 (Chlamydophila pneumoniae)、 鸚 鵡 熱 衣 原 體 (Chlamydophila psittaci)、 檸檬酸 桿 菌 屬 (Citrobacter sp.)、 伯 納 特 氏 柯 克 斯 氏 體 (Coxiella burnetii)、 棒狀桿菌屬 (Corynebacterium sp.)( 例如白喉棒狀桿菌 (Corynebacterium diphtheriae)、 杰氏棒 狀桿菌 (Corynebacterium jeikeum) 和棒狀桿菌 (Corynebacterium))、 梭狀芽胞桿菌屬 (Clostridium sp.)( 例如產氣莢膜梭狀芽胞桿菌 (Clostridium perfringens)、 艱難梭 狀芽胞桿菌 (Clostridium difficile)、 肉毒梭狀芽胞桿菌 (Clostridium botulinum) 和 破傷風梭狀芽胞桿菌 (Clostridium tetani))、 嚙蝕艾肯氏菌 (Eikenella corrodens)、 腸 桿 菌 屬 (Enterobacter sp.)( 例 如 產 氣 腸 桿 菌 (Enterobacter aerogenes)、集聚 腸 桿 菌 (Enterobacter agglomerans)、陰 溝 腸 桿 菌 (Enterobacter cloacae) 和 大 腸 埃 希 氏 菌 (Escherichia coli), 包括機會致病性大腸埃希氏菌例如腸毒性大 腸 埃 希 氏 菌 (enterotoxigenic E.coli)、 腸 侵 襲 性 大 腸 埃 希 氏 菌 (enteroinvasive E.coli)、 腸致病性大腸埃希氏菌 (enteropathogenic E.coli)、 腸出血性大腸埃希氏菌 (enterohemorrhagic E.coli)、 腸 聚 集 性 大 腸 埃 希 氏 菌 (enteroaggregative E.cColi) 和尿路致病性大腸埃希氏菌 (uropathogenic E.coli))、 腸球菌屬 (Enterococcus sp.) ( 例 如 糞 腸 球 菌 (Enterococcus faecalis) 和 屎 腸 球 菌 (Enterococcus faecium))、 埃 里 希 體 菌 屬 (Ehrlichia sp.)( 例 如 查 菲 埃 里 希 體 (Ehrlichia chafeensia) 和 犬 埃 里 希 體 (Ehrlichia canis))、 豬 紅 斑 丹 毒 絲 菌 (Erysipelothrix rhusiopathiae)、 真 桿 菌 屬 (Eubacterium sp.)、 土 拉 弗 朗 西 斯 菌 (Francisella tularensis)、 具核梭桿 菌 (Fusobacterium nucleatum)、 陰 道 加 德 納 氏 菌 (Gardnerella vaginalis)、 麻疹孿 生 球 菌 (Gemella morbillorum)、 嗜 血 桿 菌 屬 (Haemophilus sp.)( 例 如 流 感 嗜 血 桿 菌 (Haemophilus influenzae)、 杜 克 雷 嗜 血 桿 菌 (Haemophilus ducreyi)、 埃及嗜血桿菌 (Haemophilus aegyptius)、 副流感嗜血桿菌 (Haemophilus parainfluenzae)、 溶血嗜血桿 菌 (Haemophilus haemolyticus) 和副溶血嗜血桿菌 (Haemophilus parahaemolyticus))、 螺桿菌屬 (Helicobacter sp.)( 例如幽門螺桿菌 (Helicobacter pylori)、 同性戀螺桿 菌 (Helicobacter cinaedi) 和 芬 納 爾 螺 桿 菌 (Helicobacter fennelliae))、 金氏金 格 桿 菌 (Kingella kingii)、 克 雷 伯 氏 菌 屬 (Klebsiella sp.)( 例 如 肺 炎 克 雷 伯 氏 菌 (Klebsiella pneumoniae)、 肉芽腫克雷伯氏菌 (Klebsiella granulomatis) 和產酸克雷 伯氏菌 (Klebsiella oxytoca))、 乳酸桿菌屬 (Lactobacillus sp.)、 單核增生性李斯特 菌 (Listeria monocytogenes)、 問號鉤端螺旋體 (Leptospira interrogans)、 嗜肺軍團 菌 (Legionella pneumophila)、 問號鉤端螺旋體 (Leptospira interrogans)、 消化鏈球 菌 屬 (Peptostreptococcus sp.)、 溶 血 曼 海 姆 菌 (Mannheimia hemolytica)、 卡他莫拉 菌 (Moraxella catarrhalis)、 摩根氏菌屬 (Morganella sp.)、 動彎桿菌屬 (Mobiluncus sp.)、 微 球 菌 屬 (Micrococcus sp.)、 分 枝 桿 菌 屬 (Mycobacterium sp.)( 例 如 麻 風 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium leprae)、 結 核 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium tuberculosis)、 副 結 核 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium paratuberculosis)、 胞 內 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium intracellulare)、 鳥 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium avium)、 牛 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium bovis) 和 海 洋 分 枝 桿 菌 (Mycobacterium marinum))、 支 原 體 菌 屬 (Mycoplasm sp.) ( 例 如 肺 炎 支 原 體 (Mycoplasma pneumoniae)、 人 型 支 原 體 (Mycoplasma hominis) 和 生 殖 道 支 原 體 (Mycoplasma genitalium))、 諾 卡 菌 屬 (Nocardia sp.)( 例 如 星 形 諾 卡 菌 (Nocardia asteroides)、 蓋 爾 森 基 興 諾 卡 菌 (Nocardia cyriacigeorgica) 和 巴 西 諾 卡 菌 (Nocardia brasiliensis))、 奈 瑟 菌 屬 (Neisseria sp.)( 例 如 淋 病 奈 瑟 菌 (Neisseria gonorrhoeae) 和腦膜炎奈瑟菌 (Neisseria meningitidis))、 多殺巴斯 德 桿 菌 (Pasteurella multocida)、 類 志 賀 鄰 單 胞 菌 (Plesiomonas shigelloides)、 普 氏 菌 屬 (Prevotella sp.)、 卟 啉 菌 屬 (Porphyromonas sp.)、 產 黑 普 氏 菌 (Prevotella melaninogenica)、 變形桿菌屬 (Proteus sp.)( 例如普通變形桿菌 (Proteus vulgaris) 和 奇異變形桿菌 (Proteus mirabilis))、 普羅威登斯菌屬 (Providencia sp.)( 例如產堿普羅 威登斯菌 (Providencia alcalifaciens)、 雷氏普羅威登斯菌 (Providencia rettgeri) 和斯氏普羅威登斯菌 (Providencia stuartii))、 銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、 痤瘡丙酸桿菌 (Propionibacterium acnes)、 馬紅球菌 (Rhodococcus equi)、 立克次氏體 菌屬 (Rickettsia sp.)( 例如立氏立克次氏體 (Rickettsia rickettsii)、 小株立克次 氏體 (Rickettsia akari) 和普氏立克次氏體 (Rickettsia prowazekii))、 恙蟲病東方 體 (Orientia tsutsugamushi)( 舊稱 : 恙蟲熱立克次氏體 (Rickettsia tsutsugamushi) 和斑疹傷寒立克次氏體 (Rickettsia typhi))、 紅球菌屬 (Rhodococcus sp.)、 粘質沙雷 氏 菌 (Serratia marcescens)、 嗜 麥 芽 寡 養 單 孢 菌 (Stenotrophomonas maltophilia)、 沙 門 氏 菌 屬 (Salmonella sp.)( 例 如 腸 道 沙 門 氏 菌 (Salmonella enterica)、 傷寒沙 門 氏 菌 (Salmonella typhi)、 副 傷 寒 沙 門 氏 菌 (Salmonella paratyphi)、 腸炎沙門氏 菌 (Salmonella enteritidis)、 豬 霍 亂 沙 門 氏 菌 (Salmonella cholerasuis) 和 鼠 傷 寒 沙門氏菌 (Salmonella typhimurium))、 沙雷氏菌屬 (Serratia sp.)( 例如粘質沙雷氏 菌 (Serratia marcesans) 和 液 化 沙 雷 氏 菌 (Serratia liquifaciens))、 志賀氏菌屬 (Shigella sp.)( 例如痢疾志賀氏菌 (Shigella dysenteriae)、 福氏志賀氏菌 (Shigella flexneri)、 鮑氏志賀氏菌 (Shigella boydii) 和索氏志賀菌 (Shigella sonnei))、 葡萄球 菌屬 (Staphylococcus sp.)( 例如金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 表皮葡萄 球菌 (Staphylococcus epidermidis)、 溶血性葡萄球菌 (Staphylococcus hemolyticus)、 腐 生 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus saprophyticus))、 鏈 球 菌 屬 (Streptococcus sp.) ( 例 如 肺 炎 鏈 球 菌 (Streptococcus pneumoniae)( 例 如 耐 氯 霉 素 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 4(chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae)、耐 壯 觀 霉 素 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 6B(spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、 耐 鏈 霉 素 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 9V(streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、 耐紅霉素肺炎鏈球菌血清型 14(erythromycin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、耐 奧 普 托 欣 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 14(optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、 耐 利 福 平 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 18C(rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、 耐四環素肺炎鏈球菌血清型 19F(tetracycline-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)、 耐 青 霉 素 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 19F(penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae) 和 耐 甲 氧 芐 啶 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 23F(trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae)、 耐 氯 霉 素 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 4(chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae)、 耐壯觀霉素肺炎鏈球菌血清型 6B(spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、 耐鏈霉素肺炎鏈球菌血清型 9V(streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、耐 奧 普 托 欣 肺 炎 鏈 球 菌 血 清 型 14(optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、 耐利福平肺炎鏈 球 菌 血 清 型 18C(rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、 耐青霉素肺炎鏈球菌血清型 19F(penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae) 或耐甲氧芐啶肺炎鏈球菌血清型 23F(trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae))、 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae)、 變形鏈 球菌 (Streptococcus mutans)、 化膿性鏈球菌 (Streptococcus pyogenes)、 A 群鏈球菌(Group A streptococci)、 化膿性鏈球菌 (Streptococcus pyogenes)、 B 群鏈球菌 (Group B streptococci)、 無 乳 鏈 球 菌 (Streptococcus agalactiae)、 C 群 鏈 球 菌 (Group C streptococci)、 咽峽炎鏈球菌 (Streptococcus anginosus)、 類馬鏈球菌 (Streptococcus equismilis)、 D 群鏈球菌 (Group D streptococci)、 牛鏈球菌 (Streptococcus bovis)、 F 群 鏈 球 菌 (Group F streptococci) 和 咽 峽 炎 鏈 球 菌 (Streptococcus anginosus)、 G 群 鏈 球 菌 (Group G streptococci))、 鼠 咬 熱 螺 菌 (Soirillum minus)、 念珠 鏈桿 菌 (Streptobacillus moniliformi)、 密 螺 旋 體 屬 (Treponema sp.)( 例 如 斑 點 病 密 螺 旋 體 (Treponema carateum)、 極 細 密 螺 旋 體 (Treponema petenue)、 梅毒密螺旋體 (Treponema pallidum) 和 地 方 性 密 螺 旋 體 (Treponema endemicum))、 正惠普爾養障 體 (Tropheryma whippelii)、 解 脲 支 原 體 (Ureaplasma urealyticum)、 韋榮氏球菌屬 (Veillonella sp.)、 弧菌屬 (Vibrio sp.)( 例如霍亂弧菌 (Vibrio cholerae)、 副溶血性 弧菌 (Vibrio parahemolyticus)、 創傷弧菌 (Vibrio vulnificus)、 副溶血性弧菌 (Vibrio parahemolyticus)、 創傷弧菌 (Vibrio vulnificus)、 溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus)、 擬 態 弧 菌 (Vibrio mimicus)、霍 氏 弧 菌 (Vibrio hollisae)、河 流 弧 菌 (Vibrio fluvialis)、 麥奇尼科夫氏弧菌 (Vibrio metchnikovii)、 美人魚弧菌 (Vibrio damsela) 和 弗氏弧菌 (Vibrio furnisii))、 耶爾森氏菌屬 (Yersinia sp.)( 例如小腸結腸炎耶爾森氏 菌 (Yersinia enterocolitica)、 鼠疫耶爾森氏菌 (Yersinia pestis) 和假結核耶爾森氏 菌 (Yersinia pseudotuberculosis)), 以及嗜麥芽黃單孢菌 (Xanthomonas maltophilia) 等。 細胞 : 植物、 動物、 昆蟲、 細菌或真菌細胞。
     保守氨基酸取代在本技術領域中是公知的, 其提供功能上類似的氨基酸, 下面的 6 個組每個含有彼此保守取代的氨基酸 :
     1) 丙氨酸 (A)、 絲氨酸 (S)、 蘇氨酸 (T) ;
     2) 天冬氨酸 (D)、 谷氨酸 (E) ;
     3) 天冬酰胺 (N)、 谷氨酰胺 (Q) ;
     4) 精氨酸 (R)、 賴氨酸 (K) ;
     5) 異亮氨酸 (I)、 亮氨酸 (L)、 甲硫氨酸 (M)、 纈氨酸 (V) ; 以及
     6) 苯丙氨酸 (F)、 酪氨酸 (Y)、 色氨酸 (W)。
     蛋白中不是所有的殘基位置都耐受本來是 “保守的” 取代。例如, 如果氨基酸殘基 對于蛋白功能是必需的, 那么即使本來是保守的取代 也可能破壞該活性。
     補體 : 參與免疫防御的血漿蛋白系統。 在被抗原 - 抗體復合物活化后, 補體蛋白裂 解抗原性細胞, 吸引吞噬細胞, 并輔助通過調理吞噬作用破壞抗原性細胞。在哺乳動物中, 補體系統由一系列約 25 種蛋白構成, 所述蛋白通過促進調理吞噬作用或通過刺穿細菌細 胞膜, 在破壞細菌中起到 “補充” 抗體活性的作用。補體還通過例如清除被調理性抗體結合 的病原體, 來幫助身體擺脫抗原 - 調理性抗體復合物。
     補體蛋白以無活性形式在血液中循環。當第一種補體物質被引發時, 通常是由與 抗原互鎖的抗體引發。因為每種組分被相繼激活, 它在被稱為 “補體級聯” 的一系列順序精 確的細致調控的步驟中作用于下一種組分。
     補體片段 ( 例如 C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a, 其在補體活化過程中變得與抗原
     結合 ) 通過結合特異性細胞表面受體 ( 例如中性粒細胞和巨噬細胞上的 Fc 受體和 C3b 受 體, 以及巨噬細胞上的 C3d 受體 ) 觸發調理吞噬作用。在某些實例中, 效應細胞對抗體 / 抗 原復合物的調理吞噬作用的活性被 P4 肽的存在所增強。
     效應細胞 : 能夠結合抗體 / 抗原復合物并將這些復合物內化的細胞。在具體實例 中, 效應細胞表達與抗體 / 抗原復合物結合并促進內化的 Fc 受體, 例如 FcγRI、 FcγRII 和 FcγRIII。在某些實例中, 效應細胞源自于個體的血清 ( 例如外周血白細胞 PBL) 或源自于 體外培養。效應細胞的實例包括但不限于 : 巨噬細胞、 單核吞噬細胞、 自然殺傷細胞和粒細 胞例如中性粒細胞和嗜曙紅細胞。在具體實例中, 效應細胞是分化的人類早幼粒細胞性白 血病細胞, 例如分化的 HL-60 細胞。
     表位 : 抗原決定簇。 它們是具有抗原性、 以便能夠引發特異性免疫應答的分子上的 特定化學基團或肽序列。抗體結合特定抗原性表位,例如病原體表面上的表位。
     外源 : 從其所給藥的對象之外的來源獲得的物質, 例如分離的調理性抗體或其片 段的補體蛋白。例如, 當外源的分離的調理性抗體按照本文描述的方法和組合物給藥于對 象時, 不能獲得該分離的抗體, 例如從它所給藥的同一個對象中分離出。
     真菌病原體 : 引 起 疾 病 的 真 菌。 可 以 按 照 本 公 開 的 方 法 增 強 對 其 調 理 吞 噬 作用的真菌病原體的實例包括但不限于紅色毛癬菌 (Trichophyton rubrum)、 石膏樣 毛 癬 菌 (T.mentagrophytes)、 絮 狀 表 皮 癬 菌 (Epidermophyton floccosum)、 犬小孢子 菌 (Microsporum canis)、 糠 秕 孢 子 菌 (Pityrosporum orbiculare)( 秕 糠 馬 拉 色 癬 菌 Malassezia furfur)、 假 絲 酵 母 屬 (Candida sp.)( 例 如 白 色 假 絲 酵 母 (Candida albicans))、 曲霉屬 (Aspergillus sp.)( 例如煙曲霉 (Aspergillus fumigatus)、 黃曲霉 (Aspergillus fiavus) 和棒狀曲霉 (Aspergillus clavatus))、 隱球菌屬 (Cryptococcus sp.)( 例如新型隱球菌 (Cryptococcus neoformans)、 格特隱球菌 (Cryptococcus gattii)、 羅倫隱球菌 (Cryptococcus laurentii) 和淺白隱球菌 (Cryptococcus albidus))、 組織胞 漿菌屬 (Histoplasma sp.)( 例如莢膜組織胞漿菌 (Histoplasma capsulatum))、 肺孢子蟲 屬 (Pneumocystis sp.)( 例如耶氏肺孢子蟲 (Pneumocystis jirovecii)) 和葡萄穗霉屬 (Stachybotrys)( 例如紙葡萄穗霉 (Stachybotrys chartarum)) 等。
     抑制或治療疾病 : 在處于疾病例如病原體感染如細菌、 真菌或病毒病原體感染的 風險的對象中, 抑制疾病或病癥的全面發生。 “治療” 是指在疾病或病理狀況已經開始發生 后改善其體征或癥狀的治療性干預。術語 “改善” 在指稱疾病或病理狀況時, 是指治療的任 何可觀察到的有益效果。 有益效應可以表現為例如在易感對象中延遲疾病的臨床癥狀的發 生、 降低疾病的一些或所有臨床癥狀的嚴重性、 減慢疾病的發展、 改善對象的整體健康或身 體狀況、 或具體疾病特異性的本技術領 域公知的其他參數。 “預防性” 治療是向未表現出疾 病體征或僅表現出早期體征的對象提供的、 旨在降低發生病癥的風險的治療。
     分離的 : “分離的” 生物組分 ( 例如蛋白, 例如 P4 肽、 抗體或補體蛋白 ) 已經與組分 天然存在于其中的其他生物組分、 例如其他染色體和染色體外 DNA、 RNA 和蛋白質基本上分 離開或從中純化出來。已被 “分離” 的蛋白或肽包括通過標準純化方法純化的蛋白。術語 還包括通過在宿主細胞中重組表達而制備的蛋白或肽, 以及化學合成的蛋白或肽。分離不 要求絕對純度, 并且可以包括至少 50%分離, 例如至少 75%、 80%、 90%、 95%、 98%、 99% 或甚至 100%分離的蛋白或肽分子。調理素 : 變得附著于病原體例如細菌、 真菌或病毒病原體的表面、 被中性粒細胞和 巨噬細胞的表面受體所識別并且增加對微生物的吞噬作用效率的分子。 調理素包括被吞噬 細胞上的 Fcγ 受體所識別的 IgG 抗體, 以及被 CR1(CD35) 和白細胞整合蛋白 Mac-1 所識別 的補體蛋白片段。
     調理吞噬作用 : 在存在特異性血清調理素的情況下, 調理素附著于微生物表面以 靶定微生物用于被效應細胞 ( 例如巨噬細胞和單核細胞 ) 吞噬的過程。調理素包括結合特 定抗原并誘導它們被效應細胞吞噬的任何物質。示例性的調理素包括調理性抗體 ( 特異性 針對抗原的 IgM、 IgG1、 IgG2、 IgG3 和 IgA 免疫球蛋白 ) 和某些補體片段 (C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a, 其在補體活化過程中成為與抗原結合 ), 二者都通過結合特異性細胞表面 受體 ( 例如中性粒細胞和巨噬細胞上的 Fc 受體和 C3b 受體, 以及巨噬細胞上的 C3d 受體 ) 來引發吞噬作用。在某些實例中, 效應細胞對抗體 / 抗原復合物的調理吞噬作用的活性, 被 P4 肽的存在所增強。
     肽: 由化學連接在一起的氨基酸、 氨基酸類似物構成的任何化合物。 本文中使用的 肽包括氨基酸的低聚物、 氨基酸類似物或小和大的 肽, 包括多肽或蛋白。 任何氨基酸鏈, 不 論長度如何或是否翻譯后修飾 ( 例如糖基化或磷酸化 )。 “肽” 適用的氨基酸聚合物是天然 存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物, 以及其中一個或多個氨基酸殘基是非 天然氨基酸的氨基酸聚合物, 例如相應的天然存在的氨基酸的人造化學模擬物。在某些實 施方案中, 肽是 P4 肽, 其可以包括但不限于任何本文描述的修飾。 “殘基” 是指通過酰胺鍵 或酰胺鍵模擬物摻入到多肽中的氨基酸或氨基酸模擬物。肽具有氨基末端 (N- 末端 ) 和羧 基末端 (C- 末端 )。 “肽” 可以與多肽或蛋白互換使用, 并且在本文中可互換地用于指稱氨 基酸殘基的聚合物。
     氨 基 酸 一 般 通 過 酰 胺 連 鍵 (CONH) 化 學 連 接 在 一 起。 此 外, 氨基酸可以 通 過 其 他 化 學 鍵 連 接 在 一 起。 例 如, 用于氨基酸或氨基酸類似物的連鍵可以包括 CH2NH-、 -CH2S-、 -CH2-CH2-、 -CH = CH--( 順式和反式 )、 -COCH2--、 -CH(OH)CH2- 和 -CHH2SO-。 ( 這些和其他連鍵可見于 : Spatola, 《氨基酸、 肽和蛋白質的化學和生物化學》 (Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins), B.Weinstein 主編, Marcel Dekker, New York, p.267(1983) ; Spatola, A.F., Vega Data(1983 年 3 月 ), Vol.1, 第 3 期, “肽骨架修飾” (Peptide Backbone Modifications)( 一般性綜述 ) ; Morley, Trends Pharm Sci pp.463-468, 1980 ; Hudson 等, Int J Pept Prot Res 14 : 177-185, 1979 ; Spatola 等, Life Sci 38 : 1243-1249, 1986 ; Harm J.Chem.Soc Perkin Trans.1307-314, 1982 ; Almquist 等, J.Med.Chem.23 : 1392-1398, 1980 ; Jennings-White 等, Tetrahedron Lett 23 : 2533, 1982 ; Holladay 等, Tetrahedron.Lett 24 : 4401-4404, 1983 ; 以 及 Hruby Life Sci 31 : 189-199, 1982)。
     肽可以通過各種化學技術進行修飾, 以產生具有與未修飾蛋白基本上相同的活 性、 并任選具有其他所需性質的衍生物。 例如, 蛋白的羧酸基團, 不論是羧基末端還是側鏈, 都可以提供成可藥用的陽離子鹽的形式, 或酯化以形成 C1-C16 酯, 或轉變成式 NR1R2 的酰胺, 其中 R1 和 R2 各自獨立地是 H 或 C1-C16 烷基, 或組合形成雜環、 例如 5 或 6 員環。蛋白的氨 基, 不論是氨基末端還是側鏈, 都可以是可藥用的酸加成鹽的形式, 例如 HCl、 HBr、 乙酸、 苯 甲酸、 甲苯磺酸、 馬來酸、 酒石酸和其他有機酸鹽, 或者可以修飾成 C1-C16 烷基或二烷基氨基或進一步轉化成酰胺。
     蛋白側鏈的羥基可以使用公知的技術轉化成 C1-C16 烷氧基或 C1-C16 酯。蛋白側鏈 的苯環或酚環可以用一個或多個鹵素原子例如氟、 氯、 溴或碘取代, 或用 C1-C16 烷基、 C1-C16 烷氧基、 羧酸及其酯或這些羧酸的酰胺取代。 蛋白側鏈的亞甲基可以延長成同源的 C2-C4 亞 烷基。硫醇可以用眾多公知的保護基團中的任一種、 例如乙酰胺基團進行保護。本技術領 域的專業人員還將知道用于將環狀結構導入到肽中以選擇和提供對結構的構型限制、 產生 增加的穩定性的方法。
     可藥用載體 : 可用于本公開的方法的可藥用載體是常規載體。E.W.Martin 的 《Remington 藥物學》 (Remington’ s Pharmaceutical Sciences), Mack Publishing Co., Easton, PA, 第 15 版 (1975 年 ), 描述了適合于肽和蛋白例如 P4 肽、 調理性抗體和補體蛋白 或其片段的藥物遞送的組合物和制劑。
     一般來說, 載體的性質取決于所使用的具體給藥方式。 例如, 腸胃外制劑通常包含 可注射流體, 其包括可藥用和生理可接受的流體例如水、 生理鹽水、 平衡鹽溶液、 葡萄糖水、 甘油等作為介質。 對于固體組合物 ( 例如粉劑、 丸劑、 片劑或膠囊形式 ) 來說, 常規的無毒性 固體載體可以包括例如藥用級甘露糖醇、 乳糖、 淀粉或硬脂酸鎂。除了生物中性載體之外, 待給藥的藥物組合物可以包含少量無毒性輔助物質, 例如潤濕或乳化劑、 防腐劑和 pH 緩沖 劑等, 例如乙酸鈉或失水山梨糖醇單月桂酸酯。
     藥劑或藥物 : 當適當給藥于對象時能夠誘導所需治療或預防效應的化學化合物或 組合物。
     血清型 : 由針對表面上表達的抗原決定簇的抗血清所定義的單細胞生物體、 例如 細菌的基因型。也可以指抗原本身。
     特異性結合 : 當指稱調理素 ( 例如調理性抗體時 ), 是指在蛋白和其他生物物質的 異源群體存在下, 能夠確定靶蛋白、 肽或多糖的存在的結合反應。 因此, 在指定條件下, 抗體 優先結合特定靶蛋白、 肽或多糖 ( 例如病原體表面上存在的抗原, 例如細菌莢膜多糖 ), 而 不以顯著量結合樣品或對象中存在的其他蛋白或多糖。
     序列同一性 / 相似性 : 根據序列之間的同一性或相似性來表示的兩個或多個核酸 序列、 或兩個或多個氨基酸序列之間的同一性 / 相似性。序列同一性可以根據同一性百分 數來度量 ; 百分數越高, 序列越一致。當使用標準方法比對時, 核酸或氨基酸序列的同源物 或直向同源物具有相對高度的序列同一性 / 相似性。
     比對序列用于比較的方法在本技術領域中是公知的。各種程序和比對算法描述 在下列文獻中 : Smith & Waterman, Adv.Appl.Math.2 : 482, 1981 ; Needleman & Wunsch, J.Mol.Biol.48 : 443 , 1970 ; Pearson & Lipman , Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 : 2444 , 1988 ; Higgins & Sharp, Gene, 73 : 237-44, 1988 ; Higgins & Sharp, CABIOS 5 : 151-3, 1989 ; Corpet 等, Nuc.Acids Res.16 : 10881-90, 1988 ; Huang 等, Computer Appls.in the Biosciences 8, 155-65, 1992 ; 以及 Pearson 等, Meth.Mol.Bio.24 : 307-31, 1994。 Altschul 等, J.Mol.Biol.215 : 403-10, 1990, 提出了關于序列比對方法和同源性計算的詳細考慮。
     NCBI 的基本局部比對搜索工具 (Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST) (Altschul 等, J.Mol.Biol.215 : 403-10, 1990) 可以從幾個來源獲得, 包括國家生物技術 信息中心 (National Center for Biotechnology Information)(NCBI, 國立醫學圖書館(National Library of Medicine), Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894) 和 互聯網上, 用于與序列分析程序 blastp、 blastn、 blastx、 tblastn 和 tblastx 結合使用。 Blastn 用于比較核酸序列, 而 blastp 用于比較氨基酸序列。其他信息可以在 NCBI 網站上 找到。
     一旦比對后, 通過對兩個序列中存在的一致核苷酸或氨基酸殘基的位置數進行計 數, 來確定匹配數。通過用匹配數除以所鑒定序列中顯示的序列的長度, 或除以節段長度 ( 例如來自所鑒定序列中顯示的序列的 100 個連續的核苷酸或氨基酸殘基 ), 然后將得到的 值乘以 100, 來確定百分序列同一性。例如, 與具有 1554 個核苷酸的測試序列比對時具有 1166 個匹配的肽序列, 與測試序列的同一性是 75.0% (1166÷1554*100 = 75.0)。 將百分序 列同一性值取整到最接近的十分位數。例如, 75.11、 75.12、 75.13 和 75.14 向下取整 75.1, 而 75.15、 75.16、 75.17、 75.18 和 75.19 向上取整到 75.2。長度值總是整數。
     治療有效量 : 足以在被治療對象中實現所需效應的特定物質 ( 例如 P4 肽、 調理性 抗體、 抗生素和 / 或補體蛋白 ) 的量。例如, 這可以是抑制或治療病原體感染、 例如細菌病 原體感染所必需的量。當給藥于對象時, 一般將使用能夠獲得顯示出實現所需體外效應的 靶組織濃度的劑量。 治療有效量的物質例如 P4 肽、 調理性抗體和 / 或補體蛋白, 可以例如在治療過程 中每日以單劑或幾劑給藥。但是, 組合物的有效量取決于所應用的化合物或肽、 被治療的 對象、 疾病的嚴重性和類型、 以及組合物的給藥方式。例如, 組合物的治療有效量可以在約 0.01mg/kg 體重至約 1g/kg 體重之間變化。
     病毒 : 在活細胞內部增殖的微小感染性生物體。病毒基本上由蛋白外殼包圍核酸 核心構成, 并具有只在活細胞內部復制的能力。 “病毒復制” 是通過發生至少一個病毒生命 周期來產生更多的病毒。 病毒可以 破壞宿主細胞的正常功能, 致使細胞以病毒決定的方式 運轉。 例如, 病毒感染可能導致細胞產生細胞因子或對細胞因子做出響應, 而未感染的細胞 通常將不會如此。在某些實例中, 病毒是病原體。可以按照本公開的方法增強對其調理吞 噬作用的病毒病原體的具體實例包括但不限于沙粒病毒 ( 例如瓜納里托病毒、 拉沙病毒、 胡寧病毒、 馬丘波病毒和沙比亞病毒 )、 動脈炎病毒、 Roniviruses、 星狀病毒、 布尼亞病毒 ( 例如克里米亞 - 剛果出血熱病毒和漢坦病毒 )、 桿狀 RNA 病毒、 雙 RNA 病毒、 博納病毒 ( 例 如博納病病毒 )、 雀麥花葉病毒、 杯狀病毒、 青霉病毒、 冠狀病毒 ( 例如冠狀病毒和 SARS)、 囊 狀病毒、 線形病毒、 豇豆花葉病毒、 雙順反子病毒、 黃病毒 ( 例如黃熱病毒、 西尼羅病毒、 丙 型肝炎病毒和登革熱病毒 )、 線狀病毒 ( 例如埃博拉病毒和馬堡病毒 )、 Flexiviruses、 肝 炎病毒 ( 例如戊型肝炎病毒 )、 人腺病毒 ( 例如人類腺病毒 A-F)、 人星狀病毒、 人 BK 多瘤病 毒、 人博卡病毒、 人冠狀病毒 ( 例如人冠狀病毒 HKU1、 NL63 和 OC43)、 人腸道病毒 ( 例如人 腸道病毒 A-D)、 人紅細胞病毒 V9、 人泡沫病毒、 人皰疹病毒 ( 例如人皰疹病毒 1(1 型單純 性皰疹病毒 )、 人皰疹病毒 2(2 型單純性皰疹病毒 )、 人皰疹病毒 3( 水痘帶狀皰疹病毒 )、 1 型人皰疹病毒 4(1 型愛潑斯坦 - 巴爾 (Epstein-Barr) 病毒 )、 2 型人皰疹病毒 4(2 型愛潑 斯坦 - 巴爾病毒 )、 人皰疹病毒 5 株 AD169、 人皰疹病毒 5 株 Merlin 株、 人皰疹病毒 6A、 人 皰疹病毒 6B、 人皰疹病毒 7、 M 型人皰疹病毒 8、 P 型人皰疹病毒 8 和人巨細胞病毒 )、 人免 疫缺陷病毒 (HIV)( 例如 HIV 1 和 HIV 2)、 人偏肺病毒、 人乳頭瘤病毒組 ( 例如人乳頭瘤病 毒 -1、 人乳頭瘤病毒 -18、 人乳頭瘤病毒 -2、 人乳頭瘤病毒 -54、 人乳頭瘤病毒 -61、 人乳頭瘤
     病毒 -cand90、 人乳頭瘤病毒 RTRX7、 10 型人乳頭瘤病毒、 101 型人乳頭瘤病毒、 103 型人乳 頭瘤病毒、 107 型人乳頭瘤病毒、 16 型人乳頭瘤病毒、 24 型人乳頭瘤病毒、 26 型人乳頭瘤病 毒、 32 型人乳頭瘤病毒、 34 型人乳頭瘤病毒、 4 型人乳頭瘤病毒、 41 型人乳頭瘤病毒、 48 型人 乳頭瘤病毒、 49 型人乳頭瘤病毒、 5 型人乳頭瘤病毒、 50 型人乳頭瘤病毒、 53 型人乳頭瘤病 毒、 60 型人乳頭瘤病毒、 63 型人乳頭瘤病毒、 6b 型人乳頭瘤病毒、 7 型人乳頭瘤病毒、 71 型 人 乳頭瘤病毒、 9 型人乳頭瘤病毒、 92 型人乳頭瘤病毒和 96 型人乳頭瘤病毒 )、 人副流感病 毒 ( 例如人副流感病毒 1-3)、 人副腸孤病毒、 人細小病毒 ( 例如人細小病毒 4 和人細小病毒 B19)、 人呼吸道合胞病毒、 人鼻病毒 ( 例如人鼻病毒 A 和人鼻病毒 B)、 人泡沫反轉錄病毒、 人 嗜 T 淋巴細胞病毒 ( 例如人嗜 T 淋巴細胞病毒 1 和人嗜 T 淋巴細胞病毒 2)、 人多瘤病毒、 減毒病毒、 輕小病毒、 黃矮病毒、 淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒 (LCM)、 Marnaviruses、 裸露核 糖核酸病毒 (Narnaviruses)、 套式病毒目、 諾達病毒、 正粘病毒 ( 例如流感病毒 )、 分病毒、 副粘病毒 ( 例如麻疹病毒和腮腺炎病毒 )、 微小核糖核酸病毒 ( 例如脊髓灰質炎病毒、 感冒 病毒和甲肝病毒 )、 馬鈴薯 Y 病毒、 痘病毒 ( 例如天花和牛痘 )、 伴生病毒、 呼腸弧病毒 ( 例 如輪狀病毒 )、 彈狀病毒 ( 例如狂犬病病毒 )、 彈狀病毒 ( 例如水泡性口炎病毒 )、 四病毒、 披膜病毒 ( 例如風疹病毒和羅斯河病毒 )、 番茄叢矮病毒、 全病毒、 蕪菁黃花葉病毒、 諾如病 毒、 牛皰疹病毒包括牛皰疹病毒 (BHV) 和惡性卡他熱病毒 (MCFV), 等等。在某些實例中, 病 毒感染的細胞被調理吞噬。 II. 幾個實施方案的概述
     本公開涉及增強對病原體的調理性應答的方法, 以及用于靶向目標病原體進行調 理吞噬作用的組合物。調理吞噬作用是抗體和補體或補體組分與病原體結合 ( 或調理作 用 ), 隨后通過效應細胞與抗體 / 抗原復合物的結合由效應細胞攝入感染物。
     在保護性免疫應答過程中, 產生了與感染物結合并也為效應細胞的攝入和清除提 供手段的功能性抗體。特異性結合目標病原體表面上的抗原的功能性抗體 ( 調理性抗體 ) 可以被純化并給藥于對象, 以便通過靶向目標病原體以被對象自身的效應細胞進行調理來 治療和 / 或抑制對象中的感染。盡管這種療法顯示出希望, 但典型情況下必須給藥大劑量 調理性抗體才能達到所需的病原體清除效果。因此, 對于增強針對調理性抗體的調理性應 答的方法, 存在著需求。
     為了滿足這一需求, 本文公開了使用 P4 肽, 在與通過特異性結合靶病原體表面上 的抗原來靶向所述病原體的調理性抗體一起給藥時, 增強效應細胞對調理性抗體的調理性 應答的方法。P4 肽源自于肺炎鏈球菌 PsaA 蛋白的 7 號鏈、 12 號 α- 螺旋和 8 號鏈, 但是相 對于 PsaA 蛋白的天然序列來說含有點突變以提高等電點和增強結合。考慮到 P4 肽最初被 開發用于抑制肺炎鏈球菌被鼻咽細胞的內化 ( 參見國際專利公布 2006/127020), 本文所公 開的 P4 肽增強效應細胞對病原體的調理作用這一發現, 是特別令人吃驚和意外的。此外, 正如本文所公開的, 還發現 P4 肽與抗生素的共同給藥, 協同增加了抗生素的有效性。由于 這種協同行為, 在與 P4 肽組合時有可能使用較低劑量的抗生素, 同時仍維持抗生素的有效 性。
     A 治療方法
     公開了在對象中增強對目標病原體的調理吞噬作用的方法, 例如, 用以增強對目 標病原體的調理吞噬作用以在對象中抑制和 / 或治療目標病原體感染。目標病原體可以是
     在前面的術語概述中討論過的任何細菌、 病毒或真菌病原體。 在具體實例中, 該方法被用于 在感染有病原體 ( 例如病毒、 細菌或真菌病原體 )( 或具有病原體感染風險 ) 的對象中增 強調理吞噬作用。在具體實例中, 病原體是細菌病原體, 例如鏈球菌 ( 例如肺炎鏈球菌 )、 葡萄球菌 ( 例如金黃色葡萄球菌 ) 或腦膜炎球菌 ( 例如腦膜炎奈瑟菌 )。在某些實例中, 所選的治療對象具有病原體 ( 例如病毒、 細菌或真菌病原體 ) 感染或具有發生所述感染的 風險。在某些實例中, 所選的對象具有鏈球菌感染 ( 例如肺炎鏈球菌感染 ) 或具有所述感 染的風險。在某些實例中, 所選的對象具有葡萄球菌感染 ( 例如金黃色葡萄球菌感染 ) 或 具有所述感染的風險。在某些實例中, 所選的對象具有腦膜炎球菌感染 ( 例如腦膜炎奈瑟 菌感染 ) 或具有所述感染的風險。在某些實例中, 所選的治療對象未被表達肺炎球菌表面 黏附素 A(PsaA) 蛋白的病原體感染, 例如所選對象未被肺炎鏈球菌感染。所述方法包括向 對象給藥治療有效量的分離的 P4 肽, 所述 P4 肽包含與顯示為 LFVESSVKRRPMKTVSQDTNIPI YAQIF(SEQ ID NO : 1) 的氨基酸序列具有至少 95%同一性, 例如至少 96%、 至少 97%、 至少 99%、 至少 99%同一性或甚至 100%同一性的氨基酸序列, 以及任選治療有效量的特異性 結合目標病原體 ( 例如上面列出的細菌、 病毒或真菌目標病原體 ) 表面上存在的抗原的一 種或多種分離的調理性抗體或其片段。 在某些實例中, P4 肽的長度在約 27 至約 200 個氨基 酸之間, 例如長度不超過 28、 29、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190 或 200 個氨基酸, 或甚至更長, 例如長度為 27-50、 40-60、 50-70、 60-80、 70-90、 80-100、 90-110、 100-120、 110-130、 120-140、 130-140、 140-160、 150-170、 160-180、 170-190 或 180-200 個氨基酸。在某些實例中, P4 肽由 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基酸序列構成。在 某些實例中, 向對象給藥 P4 肽。在某些實例中, 向對象給藥 P4 肽和特異性結合目標病原體 表面上存在的抗原的一種或多種分離的調理性抗體或其片段。在某些實例中, 向具有被病 毒感染的細胞的對象給藥 P4 肽, 以例如增強對表達來自目標病毒病原體的細胞表面蛋白 的細胞的調理吞噬作用。在某些實例中, P4 肽包括與 SEQ ID NO : 1 顯示的氨基酸序列相 比具有不超過一個或兩個氨基酸改變、 例如保守取代的氨基酸序列。設想了可以利用將使 得到的肽仍然能夠增強對目標病原體的調理吞噬作用的氨基酸序列改變, 例如通過保守取 代。還設想到融合蛋白, 其包含與異源氨基酸序列融合的 P4 肽。在某些實例中, P4 肽被脂 質化, 例如用棕櫚酸等脂質化。示例性的藥物組合物描述在下面的 B 部分中。還設想了本 公開的藥物組合物的各種給藥方式 ( 參見下面的 B 部分 )。
     P4 肽的給藥增強了對象 ( 以及特別是對象的效應細胞 ) 調理吞噬目標病原體的能 力, 所述目標病原體被調理性抗體或其片段、 例如由對象 ( 例如被病原體感染的對象 ) 產生 的調理性抗體和 / 或給藥于對象的分離的調理性抗體特異性結合。在某些實例中, 向對象 給藥調理性抗體或其片段和 P4 肽。調理性抗體或其片段和 P4 肽的給藥可以任何次序或甚 至同時進行, 例如作為單一藥物制劑或作為多個藥物制劑共 同給藥, 所述多個藥物制劑例 如含有治療有效量的 P4 肽的藥物組合物和含有治療有效量的特異性結合目標病原體的調 理性抗體或其片段 ( 或甚至多種調理性抗體, 例如各自特異性結合單一目標病原體的多種 調理性抗體, 或其中每種調理性抗體特異性結合不同目標病原體或單一目標病原體的多種 血清型的多種調理性抗體, 或其任何組合 ) 的組合物, 或甚至同時含有治療有效量的 P4 肽 和治療有效量的調理性抗體或其片段 ( 或多種調理性抗體 ) 的組合物。
     正如本文所公開的, P4 肽與抗生素的聯合給藥增加了抗生素的有效性, 例如允許使用較低劑量和 / 或增加細菌的清除。總的來說, 任何抗生素都可用于本公開的方法。可 以使用的抗生素的實例包括但不限于氨基糖苷類 ( 例如阿米卡星、 慶大霉素、 卡那霉素、 新 霉素、 奈替米星、 鏈霉素、 妥布霉素和巴龍霉素 ) ; 安沙霉素類 ( 例如格爾德霉素和除莠霉 素); 碳頭孢烯類抗生素 ( 例如氯碳頭孢、 厄他培南、 多尼培南、 亞胺培南 / 西司他汀和美羅 培南 ) ; 頭孢菌素類 ( 例如頭孢羥氨芐、 頭孢唑啉、 頭孢噻吩、 頭孢氨芐、 頭孢克洛、 頭孢孟 多、 頭孢西丁、 頭孢丙烯、 頭孢呋辛、 頭孢克肟、 頭孢地尼、 頭孢妥侖、 頭孢哌酮、 頭孢噻肟、 頭 孢泊肟、 頭孢他啶、 頭孢布烯、 頭孢唑肟、 頭孢曲松、 頭孢吡肟和頭孢托羅 ) ; 糖肽類 ( 例如替 考拉寧和萬古霉素 ) ; 大環內酯類 ( 例如阿奇霉素、 克拉霉素、 地紅霉素、 紅霉素、 羅紅霉素、 醋竹桃霉素、 泰利霉素和壯觀霉素 ) ; 單酰胺菌素類 ( 例如氨曲南 ) ; 青霉素類 ( 例如阿莫西 林、 氨芐青霉素、 阿洛西林、 羧芐青霉素、 氯唑西林、 雙氯西林、 氟氯西林、 美洛西林、 甲氧西 林、 萘夫西林、 苯唑西林、 青霉素、 哌拉西林和替卡西林 ) ; 多肽類 ( 例如桿菌肽、 粘桿菌素和 多粘菌素 b) ; 喹諾酮類 ( 例如環丙沙星、 依諾沙星、 加替沙星、 左氧氟沙星、 洛美沙星、 莫西 沙星、 諾氟沙星、 氧氟沙星、 曲伐沙星、 格帕沙星和司帕沙星 ) ; 磺胺類 ( 例如磺胺米隆、 百浪 多息 ( 已廢止 )、 乙酰磺胺、 磺胺甲噻二唑、 磺胺二甲異噁唑 ( 已廢止 )、 柳氮磺胺吡啶、 磺胺 異噁唑、 甲氧芐啶和甲氧芐啶 - 磺胺甲基異噁唑 ) ; 四環素類 ( 例如地美環素、 多西環素、 米 諾環素、 土霉素和四環素 ) ; 以及其他 ( 例如胂凡納明、 氯霉素、 克林霉素、 林可霉素、 乙胺 丁醇、 磷霉素、 夫西地酸、 呋喃唑酮、 異煙肼、 利奈唑胺、 甲硝唑、 莫匹羅星、 呋喃妥因、 平板霉 素、 吡嗪酰胺、 奎奴普汀 / 達福普汀、 利福平、 甲砜霉素和替硝唑 )。 在某些實例中, 向對象給 藥抗生素 ( 或一種以上抗生素 ) 和 P4 肽。抗生素或其片段和 P4 肽的給藥可以任何次序或 甚至同時進行, 例如作為單一藥物制劑或作為多個制劑共同給藥, 所述多個制劑例如含有 治療有效量的 P4 肽的藥物組合物和含有治療有效量的特異性針對目標病原體的抗生素的 組合物。在某些實例中, 向患者給藥調理性抗體或其片段、 P4 肽和抗生素。調理性抗體或 其片段、 P4 肽和抗生素的給藥可以以任何次序或甚至同時進行, 例如作為單一藥物制劑或 作為多個制劑共同給藥, 所述多個制劑例如含有治療有效量的 P4 肽的藥物組合物、 含有治 療有效量的特異性針對目標病原體的抗生素的組合物, 以及含有治療有效量的特異性結合 目標病原體的調理性抗體或其片段 ( 或甚至多種調理性抗體, 例如各自特異性結合單一目 標病原體的多種調理性抗體, 或其中每種調理性抗體特異性結合不同目標病原體或單一目 標病原體的多種血清型的多種調理性抗體, 或其任何組合 ) 的組合物, 或甚至含有治療有 效量的 P4 肽和治療有效量的調理性抗體或其片段 ( 或多種調理性抗體 ) 和治療有效量的 特異性針對目標病原體的抗生素的組合物。
     補體蛋白及其片段通過結合調理性抗體并促進效應細胞的調理作用, 輔助對病原 體的調理吞噬作用。 因此, 在某些實例中, 也向對象給藥藥物有效量的分離的補體蛋白或其 片段, 例如 C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a 中的一種或多種。在某些實例中, 選擇具有補體 缺陷的對象給藥藥物有效量的分離的補體蛋白或其片段。在某些實例中, 通過鼻內途徑和 / 或靜脈內途徑給藥治療有效量的分離的 P4 肽。在某些實施方案中, 通過鼻內途徑和 / 或 靜脈內途徑給藥治療有效量的調理性抗體或其片段。在某些實例中, 通過鼻內途徑和 / 或 靜脈內途徑給藥藥物有效量的分離的補體蛋白或其片段, 例如 C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a 中的一種或多種。
     因為 P4 肽不特異性針對任何單一病原體, 因此可以配制本公開的 P4 肽和治療組合物, 以期通過提供靶向任何目標病原體的調理性抗體或其片段, 例如通過提供特異性結 合目標病原體表面上存在的抗原的調理性抗體或其片段 ( 例如治療有效量的調理性抗體 或其片段 )、 或向產生調理性抗體的對象例如被病原體感染或已被病原體感染的對象提供 P4 肽, 來增強對任何目標病原體的調理吞噬作用。產生調理性抗體的方法在下面的 C 部分 中給出。 在某些實例中, 目標病原體是細菌病原體, 并且提供了治療有效量的特異性結合細 菌病原體的調理性抗體。在某些實例中, 目標病原體是肺炎鏈球菌。在其他實例中, 目標病 原體是腦膜炎奈瑟菌。 在其他實例中, 目標病原體是金黃色葡萄球菌, 例如耐甲氧西林的金 黃色葡萄球菌 (MRSA)。 在某些實例中, 目標病原體是病毒病原體, 并且提供了治療有效量的 特異性結合病毒病原體或被病毒病原體感染的細胞的調理性抗體。在某些實例中, 目標病 原體是真菌病原體, 并且提供了治療有效量的特異性結合真菌病原體的調理性抗體。
     B. 治療組合物
     P4 肽可以體外、 離體 (ex vivo) 或體內給藥于細胞或對象。 希望將 P4 肽制備成適 合于目標應用、 例如抑制或治療病原體感染、 例如上面術語概述中討論過的病原體感染的 藥物組合物。因此, 本文包括了含有 P4 肽 ( 和在某些情況下的調理性抗體或其片段、 抗生 素和 / 或補體蛋白或其片段 ) 的藥物或藥物組合物的制備方法。P4 肽可以制備成用于單 獨或與其他活性成分、 例如抗生素 ( 例如上面 A 部分中描述的抗生素 ) 和 / 或其他蛋白一 起給藥, 例如與調理性抗體、 抗生素 ( 或甚至多種抗生素 ) 和 / 或補體蛋白 ( 或甚至特異性 針對不同病原體 ( 被病原體感染的細胞 ) 的多種調理性抗體, 和 / 或補體蛋白, 或其片段 ) 一起給藥。在某些實例中, 治療組合物包括 P4 肽。在某些實例中, 治療組合物包括調理性 抗體。在某些實例中, 治療組合物包括抗生素。在某些實例中, 治療組合物包括調理性抗體 和 P4 肽。在某些實例中, 治療 組合物包括調理性抗體、 P4 肽和抗生素。在某些實例中, 治 療組合物包括補體蛋白或其片段。在某些實例中, 治療組合物包括補體蛋白或其片段和 P4 肽。在某些實例中, 治療組合物包括補體蛋白或其片段、 抗生素和 P4 肽。在某些實例中, 治 療組合物包括補體蛋白或其片段、 調理性抗體、 抗生素和 P4 肽。在某些實例中, 治療組合物 包括補體蛋白或其片段和調理性抗體。當向對象給藥 P4 肽和調理性抗體和 / 或抗生素和 / 或補體蛋白時, 給藥可以同時或順序進行。P4 肽和調理性抗體和 / 或抗生素和 / 或補體 蛋白的順序給藥可以相隔任何時間量, 只要 P4 肽的給藥增強調理性抗體的調理活性即可。 也考慮到了本文描述的組合物的多次給藥。
     在某些實施方案中, 所公開的治療組合物包括治療有效量的分離的 P4 肽, 所述 P4 肽包含與 SEQ ID NO : 1 所顯示的氨基酸序列具有至少 95%同一性、 例如至少 96%、 至少 97%、 至少 98%、 至少 99%或甚至 100%同一性的氨基酸序列, 以及任選治療有效量的特異 性結合目標病原體表面上存在的抗原的一種或多種分離的調理性抗體或其片段。 在某些實 例中, 治療組合物還包含治療有效量的抗生素, 或甚至一種以上的抗生素。在某些實例中, 治療組合物還包含治療有效量的分離的補體蛋白或其片段, 例如 C3a、 C3b、 iC3b、 C3d、 C4b 或 C5a 中的一種或多種。
     典型情況下, 藥物組合物 ( 用作藥物或用于制造藥物 ) 的制備需要制備基本上不 含熱原以及可能對人類或動物有害的任何其他雜質的藥物組合物。典型情況下, 藥物組合 物含有適合的鹽和緩沖劑, 以使組合物的組分穩定并允許 P4 肽與對象的細胞相互作用。
     治療組合物的給藥可以通過任何常用途徑, 只要可以通過該途徑到達靶組織即可。這包括口、 鼻 ( 例如鼻內 )、 眼、 頰、 腸、 玻璃體內或其他黏膜 ( 例如直腸或陰道 ) 或局 部給藥。 可供選擇地, 給藥可以通過常位、 皮內皮下、 肌肉內、 腸胃外腹膜內或靜脈內注射途 徑。 這樣的藥物組合物通常作為包含生理可接受的載體、 緩沖劑或其他賦形劑的可藥用組 合物給藥。
     治療組合物可以提供成腸胃外、 例如用于注射或輸注的組合物。這樣的組合物一 般通過將所需純度的 P4 肽與可藥用載體、 例如在所使用的劑量和濃度下對接受者無毒性 并且與制劑中的其他成分相容的載體混合成單位劑量的可注射形式 ( 溶液、 懸液或乳液 ) 來配制。 此外, 可以將 P4 肽 ( 和 / 或調理性抗體, 和 / 或抗生素, 和 / 或補體蛋白或其片段 ) 懸浮在水性載體中, 例如在 pH 為約 3.0 至約 8.0、 優選 pH 為約 3.5 至約 7.4、 3.5 至 6.0 或 3.5 至約 5.0 的等滲緩沖溶液中。可用的緩沖液包括檸檬酸鈉 - 檸檬酸和磷酸鈉 - 磷酸、 以 及乙酸鈉 / 乙酸緩沖液。P4 肽, 任選與賦形劑、 調理性抗體、 抗生素和 / 或補體蛋白或其片 段一起, 也可采取凍干物的形式, 并可以在腸胃外給藥前通過加入適合的溶劑來制成溶液。 溶液, 例如用于例如腸胃外給藥的溶液, 也可以用作輸注溶液。
     藥物組合物可以包括 ( 例如溶解或懸浮 ) 在可藥用載體或賦形劑中的有效量 ( 例如治療有效量 ) 的 P4 肽、 補體蛋白、 抗生素和 / 或調理性抗體。可藥用載體和 / 或可 藥用賦形劑在本技術領域中是已知的, 并描述在例如 E.W.Martin 的 《Remington 藥物學》 (Remington’ s Pharmaceutical Sciences), Mack Publishing Co., Easton, PA, 第 15 版 (1975) 中。
     載體的性質取決于所使用的具體給藥方式。例如, 腸胃外制劑通常包含可注射流 體, 所述可注射流體包括可藥用和生理可接受的流體例如水、 生理鹽水、 平衡鹽溶液、 葡萄 糖水、 甘油等作為介質。對于固體組合物 ( 例如粉劑、 丸劑、 片劑或膠囊形式 ) 來說, 常規的 無毒性固體載體可以包括例如藥用級甘露糖醇、 乳糖、 淀粉或硬脂酸鎂。此外, 待給藥的藥 物組合物可以包含少量無毒性輔助物質, 例如潤濕或乳化劑、 防腐劑和 pH 緩沖劑等, 例如 乙酸鈉或失水山梨糖醇單月桂 酸酯。
     本文中使用的 “可藥用載體” 包括任何和所有溶劑、 分散介質、 涂層、 抗細菌和抗真 菌劑、 等滲和吸收延遲劑等。這類介質和藥劑在藥物活性物質中的應用在本技術領域中是 公知的。 任何常規介質或藥劑, 除了與活性成分不相容的情況之外, 都可考慮用于藥物組合 物中。也可以在組合物中摻入增補的活性成分。例如, 某些藥物組合物可以在水中包含與 適合的表面活性劑例如羥丙基纖維素混合的 P4 肽。也可以在甘油、 液體聚乙二醇及其混合 物中和油中制備分散體。在平常的儲存和使用條件下, 這些制劑含有防腐劑以阻止微生物 的生長。
     其他制劑適合于口服給藥。 口服制劑可以包含賦形劑例如藥用級甘露糖醇、 乳糖、 淀粉、 硬脂酸鎂、 糖精鈉、 纖維素、 碳酸鎂等。組合物 ( 藥物 ) 典型地采取溶液、 懸液、 氣溶膠 或粉末的形式。示例性制劑可見于美國專利公布 No.20020031527。當途徑是局部途徑時, 形式可以是霜劑、 軟膏、 油膏或噴劑。
     打算使用本公開的藥物組合物和方法治療的典型對象包括人類以及非人類靈長 動物或其他動物。為了鑒定根據本公開的方法進行預防或治療的對象, 使用認可的篩選方 法在對象中確定與目標或懷疑的疾病或病癥 ( 例如與特定目標病原體相關的感染 ) 相關的 風險因素, 或確定已患的疾病或病癥的狀態。 這些篩選方法包括例如診斷方法, 例如在本技術領域中可用的或公知的用于檢測和 / 或表征疾病相關標志物的各種 ELISA 和其他免疫分 析方法。 這些以及其他常規方法允許臨床醫生選擇需要使用本公開的方法和藥物組合物治 療的患者。
     藥物組合物的有效量根據所計劃的目標、 例如抑制和 / 或治療人類或非人類對象 的病原性感染來確定。本公開的藥物組合物的給藥可用于預防性或治療性目的。當預防性 提供時, 藥物組合物在任何癥狀出現之前提供。化合物的預防性給藥用于阻止或改善任何 后續的疾病過 程。當治療性提供時, 化合物在疾病或感染的癥狀發作時 ( 或其后不久 ) 提 供。
     對于預防性和治療性目的來說, 藥物組合物可以單次推注 (bolus) 遞送、 通過在 一段較長時期內連續遞送 ( 例如連續的透皮、 黏膜或靜脈內遞送 )、 或以重復給藥方案 ( 例 如通過每小時、 每日或每周重復給藥方案 ) 向對象給藥。治療有效劑量的化合物可以在長 期預防或治療方案中作為重復藥劑提供, 以產生臨床顯著結果, 從而改善與本文提出的目 標疾病或病癥相關的一種或多種癥狀或可檢測到的狀況。就此而言, 有效劑量的確定典型 基于動物模型研究, 然后進行人類臨床試驗, 并通過在對象中明顯降低目標疾病癥狀或狀 況的發生或嚴重性的給藥方案來指導。 這方面的適合的模型包括例如鼠類、 大鼠、 豬、 貓、 非 人類靈長動物和本技術領域已知的其他認可的動物模型對象。可供選擇地, 有效劑量可以 使用體外模型 ( 例如免疫和組織病理分析 ) 來確定。使用這樣的模型, 只需要常規的計算 和調整就可確定給藥治療有效量 P4 肽的適合濃度和劑量 ( 例如有效改善目標感染的一種 或多種癥狀的量 )。
     適合的劑量將根據下列因素而異 : 對象的特征例如對象是人類還是非人類、 年齡、 體重和與對象的條件或狀態有關的其他健康考慮, 給藥方式、 途徑, 和劑量次數以及藥物組 合物包含單獨的 P4 肽還是還包含調理性抗體和 / 或抗生素和 / 或補體蛋白, 給藥的時間和 途徑, 同時給藥的其他藥物或治療, 以及治療組合物在對象中引發所需活性或生物響應的 特定藥理學。可以調整劑量方案, 以提供最優的預防或治療響應。治療有效量也是其中化 合物和 / 或其他生物活性劑的任何有毒或有害副作用被以臨床術語而言的治療有益效應 勝過的量。在本公開的方法和制劑中, P4 肽和 / 或其他生物活性劑的治療有效量的非限制 性范圍是約 0.01mg/kg 體重至約 10mg/kg 體重, 例如約 0.05mg/kg 至約 5mg/kg 體重, 或約 0.2mg/kg 至約 2mg/kg 體重。
     包含本公開的治療藥劑的治療組合物可以通過泵遞送 ( 參見 Langer, 同上 ; Sefton, CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14 : 201, 1987 ; Buchwald 等, Surgery 88 : 507, 1980 ; Saudek 等, N.Engl.J.Med.321 : 574, 1989), 或通過連續皮下輸注例如使用微型泵來遞 送。也可以使用靜脈內溶液袋 (intravenous bag solution)。選擇適合劑量的一個因素 是通過本文公開的方法測量得到的、 被執業醫師視為適合的結果。其他受控釋放系統在 Langer(Science 249 : 1527-33, 1990) 中討論。
     在一個實例中, 泵是植入式的 ( 參見例如美國專利 No.6,436,091、 5,939,380 和 5,993,414)。使用可植入的藥物輸注裝置為患者提供治療藥劑的恒定和長期的劑量或輸 注。這樣的裝置可以分類成主動或被動式的。
     主動式藥物或可編程輸注裝置的特點在于用于將藥劑遞送到患者系統中的泵或 計量系統。目前可用的這種主動式輸注裝置的實例是 Medtronic SYNCHROMEDTM 可編程泵。相反, 被動式輸注裝置的特點不是泵, 而是依賴于加壓的藥物儲池遞送目標藥劑。 這種裝置 TM 的實例包括 Medtronic ISOMED 。
     在具體實例中, 包含本公開的治療藥劑的治療組合物通過持續釋放系統給藥。持 續釋放系統的適合的實例包括適合的聚合材料 ( 例如采用成形物件例如薄膜或微囊形式 的半透性聚合物基質 )、 適合的疏水性材料 ( 例如作為在可接受的油中的乳液 ) 或離子交換 樹脂, 以及微溶衍生物 ( 例如微溶的鹽 )。持續釋放組合物可以口服、 腸胃外、 腦池內、 腹膜 內、 局部 ( 例如通過粉劑、 軟膏、 凝膠、 滴劑或透皮貼片 ) 或作為口或鼻噴劑來給藥。持續釋 放基質包括聚丙交酯 ( 美國專利 No.3,773,919、 EP 58,481)、 L- 谷氨酸和 γ- 乙基 -L- 谷 氨酸酯的共聚物 (Sidman 等, Biopolymers 22 : 547-556, 1983)、 聚 ( 甲基丙烯酸 2- 羥乙基 酯 )(Langer 等, J.Biomed.Mater.Res.15 : 167-277, 1981 ; Langer, Chem.Tech.12 : 98-105, 1982)、 乙烯 - 乙酸乙烯酯 (Langer 等, 同上 ) 或聚 -D-(-)-3- 羥基丁酸 (EP 133,988)。
     聚合物可用于離子控制的釋放。用于受控藥物遞送的各種可降解和不可降解 的聚合基質在本技術領域中是已知的 (Langer, Accounts Chem.Res.26 : 537, 1993)。例 如, 嵌段共聚物泊洛沙姆 407 在低溫下作為粘稠但仍可流動的液體存在, 而在體溫下 形成半固體凝膠。它已被顯示是用于重組白介素 -2 和脲酶的配制和持續遞送的有效 介 質 (Johnston 等, Pharm.Res.9 : 425, 1992 ; 和 Pec, J.Parent.Sci.Tech.44(2) : 58, 1990)。可供選擇地, 羥基磷灰石已被用作微載體, 用于蛋白的受控釋放 (Ijntema 等, Int.J.Pharm.112 : 215, 1994)。另一方面, 脂質體被用于脂類包囊的藥物的受控釋放以 及藥物定向 (Betageri 等 《脂質體藥物遞送系統》 (Liposome Drug Delivery Systems), Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, 1993)。大量用于治療性蛋白的受控遞 送的其他系統是已知的 ( 例如美國專利 No.5,055,303、 美國專利 No.5,188,837、 美國專利 No.4,235,871、 美國專利 No.4,501,728、 美國專利 No.4,837,028、 美國專利 No.4,957,735 和美國專利 No.5,019,369、 美國專利 No.5,055,303、 美國專利 No.5,514,670、 美國專利 No.5,413,797、 美國專利 No.5,268,164、 美國專利 No.5,004,697、 美國專利 No.4,902,505、 美 國 專 利 No.5,506,206、 美 國 專 利 No.5,271,961、 美 國 專 利 No.5,254,342 和 美 國 專 利 No.5,534,496)。
     可以制備藥物組合物 ( 藥物 ) 用于預防性方案中并給藥于人類或非人類對象, 以 針對病原體 ( 或多種病原體 ) 的感染進行保護。因此, 藥物組合物典型地包含藥物有效量 的 P4 肽和任選的藥物有效量的調理性抗體或其片段、 和 / 或抗生素和 / 或補體蛋白或其片 段。在某些情況下, 組合物在感染后給藥, 以例如治療感染、 增加病原體清除, 在這種應用 中, 藥物組合物以治療有效量給藥。治療有效量是用于在對象中獲得所需效應的組合物的 量。 例如, 這可以是抑制病原體感染、 增加病原體從對象的清除或者阻止或可測量地改變對 象的病原體感染的外在癥狀所需的組合物的量。當給藥于對象時, 一般使用將達到已顯示 出 實現體外或體內效應的靶組織濃度的劑量。
     C. 調理性抗體
     免疫原、 例如免疫原性多糖或免疫原性多肽 ( 例如源自于病原體例如病毒、 細菌 或真菌病原體如上面列出的病毒、 細菌或真菌病原體的免疫原性多糖或免疫原性肽 ) 或其 片段或保守變體, 可用于產生與病原體表面上的表位發生免疫反應或結合、 例如結合特定 抗原并誘導效應細胞對靶病原體的調理吞噬作用的調理性抗體。包括多克隆調理性抗體、基本上由具有不同表位特異性的合并的調理性單隆抗體構成的抗體, 以及不同的單克隆調 理性抗體制劑。
     多克隆抗體的制備對于本技術領域的專業人員來說是公知的。參見例如 Green 等, “多克隆抗血清的生產” (Production of polyclonal Antisera), Manson 主編的 《免 疫化學方法》 (Immunochemical Protocols) 第 1-5 頁, Humana Press 1992 ; Coligan 等, “在兔、 大鼠、 小鼠和倉鼠中生產多克隆抗血清” (Production of polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters), 《免 疫 學 現 代 方 法》 (Current Protocols in Immunology) 第 2.4.1 節, 1992。
     單克隆抗體的制備同樣是常規的。參見例如 Kohler & Milstein, Nature 256 : 495, 1975 ; Coligan 等, 2.5.1-2.6.7 節 ; 以 及 Harlow 等, 《抗 體 實 驗 指 南》 (Antibodies : a Laboratory Manual) 第 726 頁, Cold Spring Harbor Pub., 1988。簡單來說, 可以如下 獲得單克隆抗體 : 用包含抗原 ( 例如源自于病原體的抗原 ) 的組合物注射小鼠, 通過取出 血清樣品驗證抗體生產的存在, 取出脾臟獲得 B 淋巴細胞, 將 B 淋巴細胞與骨髓瘤細胞融 合以產生雜交瘤, 克隆雜交瘤, 篩選產生針對抗原的抗體的陽性克隆以及從雜交瘤培養物 分離抗體。單克隆抗體可以通過各種已確立的技術從雜交瘤培養物分離和純化。這樣的 分離技術包括使用蛋白 A 瓊脂糖凝膠的親和層析、 尺寸排阻層析和離子交換層析。參見例 如 Coligan 等, 第 2.7.1-2.7.12 節和第 2.9.1-2.9.3 節 ; Barnes 等, “免 疫球蛋白 G(IgG) 的純化” (Purification of Immunoglobulin G(IgG)), 《分子生物學方法》 (Methods in Molecular Biology) 第 10 卷 79-104 頁, Humana Press, 1992。
     單克隆抗體的體外和體內倍增方法對于本技術領域的專業人員來說是公知的。 體 外倍增可以在適合的培養基中進行, 例如 Dulbecco 修改的 Eagle 培養基或 RPMI 1640 培養 基, 任選增補有哺乳動物血清例如胎牛血清或微量元素和生長維持增補劑例如正常小鼠的 腹腔滲出細胞、 脾細胞、 胸腺細胞或骨髓巨噬細胞。體外生產提供相對純的抗體制備物, 并 允許規模放大以生產大量目標抗體。大規模雜交瘤培養可以通過在氣升式反應器、 連續攪 拌反應器中的均相懸浮培養或在固定或截留細胞培養中來進行。 體內倍增可以通過將細胞 克隆注射到與親代細胞組織相容的哺乳動物例如同系基因小鼠中, 以引起產生抗體的腫瘤 的生長來進行。任選地, 在注射前將動物用烴、 特別是油類例如降植烷 ( 四甲基十五烷 ) 致 敏。在 1 到 3 周后, 從動物的體液回收目標單克隆抗體。
     抗體也可以源自于類人靈長動物抗體。 用于在狒狒中產生治療有用抗體的通用技 術, 可見于例如 WO 91/11465, 1991 和 Losman 等, Int.J.Cancer 46 : 310, 1990。
     可供選擇地, 特異性結合源自于病原體的多肽的抗體, 可以源自于人源化單克隆 抗體。人源化單克隆抗體通過將來自于小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區的互補性決 定區轉移到人類可變結構域中, 然后將框架區中的人類殘基用鼠類對應物代替。使用源自 于人源化單克隆抗體的抗體組分免除了與鼠類恒定區的免疫原性相關的潛在問題。用于 克隆鼠類免疫球蛋白可變結構域的通用技術描述在例如 Orlandi 等, Proc.Nat′ l Acad. Sci.U.S.A.86 : 3833, 1989 中。用于生產人源化單克隆抗體的技術描述在例如 Jones 等, Nature 321 : 522, 1986 ; Riechmann 等, Nature 332 : 323, 1988 ; Verhoeyen 等, Science 239 : 1534, 1988 ; Carter 等, Proc.Nat′ l Acad.Sci.U.S.A.89 : 4285, 1992 ; Sandhu, Crit. Rev.Biotech.12 : 437, 1992 ; 和 Singer 等, J.Immunol.150 : 2844, 1993 中。抗體可以源自于從組合免疫球蛋白文庫分離的人類抗體片段。參見例如 Barbas 等, 《方法 : 酶學方法指南》 (Methods : a Companion to Methods in Enzymology)Vol.2, 119 頁, 1991 ; Winter 等, Ann.Rev.Immunol.12 : 433, 1994。可用于生產人類免疫球蛋白噬菌體 文庫的克隆和表達載體, 可以從例如 STRATAGENE Cloning Systems 公司 (La Jolla, CA) 獲得。
     此外, 抗體可以源自于人類單克隆抗體。這樣的抗體從已被 “工程化改造” 以對 抗原激惹做出應答而產生特異性人類抗體的轉基因小鼠獲得。在該技術中, 將人類重鏈和 輕鏈基因座的元件引入源自于胚胎干細胞系的小鼠種系中, 所述胚胎干細胞系含有定向破 壞的內源重鏈和輕鏈基因座。轉基因小鼠能夠合成對人類抗原特異的人類抗體, 并且小鼠 可用于產生分泌人類抗體的雜交瘤。用于從轉基因小鼠獲得人類抗體的方法描述在 Green 等, Nature Genet.7 : 13, 1994 ; Lonberg 等, Nature 368 : 856, 1994 ;和 Taylor 等, Int. Immunol.6 : 579, 1994 中。
     抗體包括完整分子及其能夠結合表位決定簇的片段, 例如 Fab、 F(ab ′ )2 和 Fv。制造這些片段的方法是本領域已知的。( 參見例如 Harlow 和 Lane, 《抗體實驗指南》 (Antibodies : A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988)。 表位是抗原上與抗體的互補位結合的任何抗原決定簇。 表位決定簇通常由分子例如氨基酸 或糖側鏈的化學活性表面基團組構成, 并通常具有特定的三維結構特征以及特定的電荷特 征。
     抗體片段可以通過抗體的蛋白水解作用或通過在大腸桿菌 (E.coli) 中表達編 碼所述片段的 DNA 來制備。抗體片段可以通過常規方法, 用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化 完整抗體來獲得。例如, 可以通過 用胃蛋白酶對抗體進行酶切割以提供被稱為 F(ab′ )2 的 5S 片段, 來產生抗體片段。該片段可以使用硫醇還原劑以及任選的用于切開二硫鍵 所產生的巰基的阻斷基團來進一步切割, 以產生 3.5S 的 Fab ′單價片段。可供選擇地, 使用胃蛋白酶的酶切割直接產生兩個單價 Fab ′片段和一個 Fc 片段 ( 參見美國專利 No.4,036,945 和美國專利 No.4,331,647 以及其中包含的參考文獻 ; Nisonhoff 等, Arch. Biochem.Biophys.89 : 230, 1960 ; Porter, Biochem.J.73 : 119, 1959 ; Edelman 等, 《酶 學 方 法》 (Methods in Enzymology), 第 1 卷, 422 頁, Academic Press, 1967 ; 和 Coligan 等, 第 2.8.1-2.8.10 和 2.10.1-2.10.4 節 )。
     也可以使用其他切割抗體的方法, 例如分離重鏈以形成單價輕鏈 - 重鏈片段、 片 段的進一步切割、 或其他酶、 化學或遺傳技術, 只一要片段與完整抗體所識別的抗原結合即 可。
     例如, Fv 片段包含聯合的 VH 和 VL 鏈。該聯合可以是非共價的 (Inbar 等, Proc. Nat′ l Acad.Sci.U.S.A.69 : 2659, 1972)。 可供選擇地, 可變鏈可以通過分子間二硫鍵相連 或通過化學物質例如戊二醛交聯。參見例如 Sandhu, 同上。優選, Fv 片段包含通過肽接頭 相連的 VH 和 VL 鏈。這些單鏈抗原結合蛋白 (sFv) 通過構建包含由寡核苷酸相連的、 編碼 VH 和 VL 結構域的 DNA 序列的結構基因來制備。將結構基因插入到表達載體中, 隨后將表達載 體導入宿主細胞例如大腸桿菌中。重組的宿主細胞合成具有橋連兩個 V 結構域的接頭肽的 單一多肽鏈。用于生產 sFv 的方法在本技術領域中是已知的 ( 參見 Whitlow 等, 《方法 : 酶 學方法指南》 (Methods : a Companion to Methods in Enzymology)Vol.2, 97 頁, 1991 ; Bird等, Science 242 : 423, 1988 ; 美國專利 No.4,946,778 ; Pack 等, Bio/Technology 11 : 1271, 1993 ; 和 Sandhu, 同上 )。
     另一種形式的抗體片段是編碼單個互補性決定區 (CDR) 的肽。CDR 肽 (“最小識 別單位” ) 可以通過構建編碼目標抗體的 CDR 的基因來獲得。這種基因通過例如使用聚合 酶鏈反應從抗體產生細胞的 RNA 合成可變區來制備 (Larrick 等, 《方法 : 酶學方法指南》 (Methods : a Companion to Methods in Enzymology)Vol.2, 106 頁, 1991)。
     抗體可以使用完整多肽、 含有目標小肽或多糖的片段作為免疫抗原來制備。用于 免疫動物的多肽或肽可以源自于在宿主細胞中產生的基本上純化的多肽、 體外翻譯的 cDNA 或化學合成, 如果需要, 其可以與載體蛋白接合。 這種常用的與肽化學偶聯的載體包括匙孔 血藍蛋白 (KLH)、 甲狀腺球蛋白、 牛血清白蛋白 (BSA) 和破傷風類毒素。然后將偶聯的肽用 于免疫動物 ( 例如小鼠、 大鼠或兔 )。
     多克隆或單克隆抗體可以通過例如結合到基質上并從基質洗脫來進一步純化, 所 述基質結合有將針對它們產生抗體的多肽或肽。本技術領域的專業人員將了解在免疫學 技術領域中用于純化和 / 或濃縮多克隆抗體以及單克隆抗體的各種常用技術 ( 參見例如 Coligan 等, 《免疫學現代方法》 (Current Protocols in Immunology) 的第 9 單元, Wiley Interscience, 1991)。
     也可以使用模擬表位的抗獨特型抗體技術來生產單克隆抗體。例如, 針對第一種 單克隆抗體制造的抗獨特型單克隆抗體, 將在高變區中具有結合結構域作為被第一個單克 隆抗體結合的表位的 “圖像” 。
     抗體可以通過克隆技術制備。適合的克隆和測序技術的實例, 以及足以指導專 業技術人員許多克隆實踐的說明, 可見于下列文獻 : Sambrook 等, 《分子克隆實驗指南》 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual) 第 2 版, Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory(1989) ; Berger 和 Kimmel 主編, 《分子克隆技術指導》 (Guide to Molecular Cloning Techniques), Academic Press, Inc., San Diego CA(1987) ; 或 Ausubel 等 主 編, 《分 子 生 物 學 現 代 方 法》 (Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY(1987)。來自生物試劑和實驗設備制造商的產 品信息也提供有用的信息。這些制造 商包括 SIGMA 化學品公司 ((Saint Louis, MO)、 R&D systems(Minneapolis, MN)、 Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway, NJ)、 CLONTECH oratories, Inc.(Palo Alto, CA)、 Chem Genes Corp.、 Aldrich 化學品公司 (Milwaukee, WI)、 Glen Research, Inc.、 GIBCO BRL Life Technologies, Inc.(Gaithersburg, MD)、 TM Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG, Buchs, 瑞士 )、 INVITROGEN (San Diego, CA) 和 Applied Biosystems(Foster City, CA), 以及專業技術人員所知的許多其他 商業來源。
     源自于病原體的、 適合用作免疫原以產生調理性抗體的基本上純的靶抗原, 通過 純化或重組表達來分離 ( 參見 D 部分 )。通過例如在 Amicon 過濾裝置上濃縮到每毫升幾微 克的水平, 來調整最終制備物中的蛋白濃度。然后可以按照 Harlow 和 Lane(《抗體實驗指 南》 (Antibodies, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Press.1988) 所述, 制備針 對蛋白的單克隆或多克隆抗體。
     可供選擇地, 可以針對合成的肽產生抗體, 所述合成肽在可商購的肽合成儀上根據靶或內化受體多肽的預測氨基酸或已知序列來合成 (Harlow 和 Lane, 《抗體實驗指南》 (Antibodies, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Press.1988)。
     單克隆抗體可以通過各種已確立的技術從雜交瘤培養物分離和純化。這樣的 分離技術包括使用蛋白 A 瓊脂糖凝膠的親和層析、 尺寸排阻層析和離子交換層析。參見 例 如 Coligan 等, 第 2.7.1-2.7.12 和 2.9.1-2.9.3 節 ; Barnes 等, “免 疫 球 蛋 白 G(IgG) 的純化” (Purification of Immunoglobulin G(IgG)), 《分子生物學方法》 (Methods in Molecular Biology) 第 10 卷第 79-104 頁中, Humana Press, 1992。
     多克隆或單克隆抗體可以通過例如結合到基質上并從基質洗脫來進一步純化, 所 述基質結合有要針對它們產生抗體的多肽或肽。本技 術領域的專業人員將了解在免疫學 技術領域中用于純化和 / 或濃縮多克隆抗體以及單克隆抗體的各種常用技術 ( 參見例如 Coligan 等, 《免疫學現代方法》 (Current Protocols in Immunology) 的第 9 單元, Wiley Interscience, 1991)。
     為了通過 Western 印跡法確定給定抗體制備物 ( 例如在小鼠中生產的 ) 特異性 結合目標的靶或內化受體多肽, 從鼠類骨髓瘤細胞提取含有靶或內化受體多肽的全細胞蛋 白, 并將其在 SDS- 聚丙烯酰胺凝膠上電泳。然后將蛋白轉移到膜 ( 例如硝酸纖維素 ) 上, 并將待測抗體制備物與膜溫育。在清洗膜以除去非特異性結合的抗體后, 使用與酶例如堿 性磷酸酶接合的抗小鼠抗體檢測特異性結合的抗體的存在 ; 施加底物 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 基磷酸鹽 / 硝基四氮唑藍, 通過免疫集中的堿性磷酸酶導致產生了致密的藍色化合物。通 過這種技術, 與靶或內化受體多肽特異性結合的抗體將顯示出結合于靶或內化受體多肽條 帶上 ( 所述條帶將集中在凝膠上由其分子量所決定的既定位置處 )。可能發生抗體與其他 蛋白 ( 例如血清靶蛋白 ) 的非特異性結合, 并可以作為弱的信號在 Western 印跡上檢測到。 本技術領域的專業人員通過在 Western 印跡上獲得的相對于由抗體 - 靶或內化受體多肽的 特異性結合產生的強的主要信號來說弱的信號和 / 或不相關部分, 認識到這種結合的非特 異性本質。
     D. 肽的生產
     P4 肽、 補體肽和源自于病原體的肽, 可以通過克隆技術來制備。適合的克隆和測 序技術的實例, 以及足以指導專業技術人員許多克隆實踐的說明, 可見于 : Sambrook 等, 《分 子克隆實驗指南》 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual) 第 2 版, Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory(1989) ; Berger 和 Kimmel 主編, 《分子克隆技術指導》 (Guide to Molecular Cloning Techniques), Academic Press, Inc., San Diego CA(1987) ; 或 Ausubel 等主編, 《分子生物學現代方法》 (Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY(1987)。來自生物試劑和實驗設備制 造商的產品信息也提供有用的信息。這些制造商包括 SIGMA 化學品公司 ((Saint Louis, MO)、 R&D systems(Minneapolis, MN)、 Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway, NJ)、 CLONTECH oratories, Inc.(Palo Alto, CA)、 Chem Genes Corp.、 Aldrich 化學 品 公 司 (Milwaukee, WI)、 Glen Research, Inc.、 GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD)、 Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG, Buchs, 瑞 TM 士 )、 INVITROGEN (San Diego, CA) 和 Applied Biosystems(Foster City, CA), 以及專業技 術人員所知的許多其他商業來源。在某些實例中。肽、 例如補體肽, 從對象、 例如從對象的血液級份、 例如從對象獲得的血清來純化。
     在某些實施方案中, 肽從例如用編碼肽或其部分的多核苷酸轉化或轉染的細胞 通過重組產生。用于操作編碼本公開的肽或其部分的核酸并將其插入到用于表達多肽的 載體中的方法, 在本技術領域中是公知的 ( 參見例如 Sambrook 等, 《分子克隆實驗指南》 (Molecular Cloning, a Laboratory Manual), 第 2 版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, 和 Ausubel 等, 《分子生物學現代方法》 (Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1994)。
     編碼本公開的肽或其部分的核酸構建物可以插入到質粒中。但是, 其他載體 ( 例 如病毒載體、 噬菌體、 粘粒等 ), 也可用于復制核酸。在本公開的情況下, 核酸構建物典型是 表達載體, 其含有促進宿主被插入的遺傳序列有效轉錄的啟動子序列。表達載體典型含有 復制原點、 啟動子以及允許轉化細胞的表型篩選的特定核酸序列。
     更通常情況下, 編碼本公開的肽或其部分的多核苷酸序列, 可以與能夠在導入宿 主細胞后驅動核酸表達的任何啟動子和 / 或增強子可操作連接。啟動子是指導核酸轉錄 的一系列核酸控制序列。包括組成型 和誘導型啟動子 ( 參見例如 Bitter 等, Methods in Enzymology 153 : 516-544, 1987)。 通過將 DNA 轉移到適合的宿主中, 可以在體外表達編碼肽或其部分的 DNA 序列。 細胞可以是原核或真核細胞。宿主可以包括微生物、 酵母、 昆蟲和哺乳動物生物體。術語還 包括對象宿主細胞的任何后代。穩定轉移——意味著外來 DNA 在宿主中連續維持——的方 法, 在本技術領域中是已知的。
     用重組 DNA 轉化宿主細胞, 可以通過本技術領域的普通專業人員所公知的常規技 術來進行。 當宿主是原核生物例如大腸桿菌時, 可以通過在指數生長期后收獲細胞, 然后使 用本技術領域公知的程序通過 CaCl2 方法進行處理, 來制備能夠攝取 DNA 的感受態細胞。 可 供選擇地, 也可以使用 MgCl2 或 RbCl。如果需要, 轉化也可以在形成宿主細胞的原生質體后 進行, 或通過電穿孔來進行。
     當宿主是真核生物時, 可以使用 DNA 轉染方法例如磷酸鈣共沉淀、 常規機械程序 例如包裹在脂質體中的質粒、 或病毒載體的微注射、 電穿孔、 插入。真核細胞也可以用編碼 肽或其部分的多核苷酸和編碼選擇性表型的第二種外源 DNA 分子例如單純性皰疹病毒胸 腺嘧啶激酶基因進行共轉染。另一種方法是使用真核的病毒載體例如猿猴病毒 40(SV40) 《真核病毒載體》 或牛乳頭狀瘤病毒來瞬時感染或轉化真核細胞并表達蛋白 ( 參見例如 (Eukaryotic Viral Vectors), Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman 主編, 1982)。 然 后可以使用本技術領域已知的方法從宿主細胞純化肽。
     源自于病原體和 / 或 P4 肽的免疫原性肽, 也可以例如通過化學合成, 利用本技術 領域中已知的多種手動或自動合成方法中的任一種來生產。 例如, 在 0.25 毫摩爾 (mmol) 規 模上進行的固相肽合成 (SPPS), 使用 Applied Biosystems 公司的 431A 型肽合成儀, 并使用 9- 芴甲氧羰 基 (Fmoc) 氨基末端保護, 與二環己基碳二亞胺 / 羥基苯并三唑或 2-(1H- 苯并 三唑 -1- 基 )-1, 1, 3, 3- 四甲基脲六氟磷酸鹽 / 羥基苯并三唑 (HBTU/HOBT) 偶聯, 并對于羧 基末端酸使用對羥甲基苯氧基甲基聚苯乙烯 (HMP) 或 Sasrin 樹脂, 或對于羧基末端酰胺使 用 Rink 酰胺樹脂。
     Fmoc 衍生的氨基酸, 從適合的前體氨基酸通過在三氟乙酸中的三苯基甲醇進行三 苯甲基化, 然后按照 Atherton 等, 《固相肽合成》 (Solid Phase Peptide Synthesis), IRL Press : Oxford, 1989 中的描述通過 Fmoc 衍生作用來制備。
     使用 1% TFA 在二氯甲烷中的溶液切割 Sasrin 樹脂結合的肽, 以產生被保護的肽。 當適宜時, 通過在其中氨基酸側鏈被保護的新生肽中使用疊氮磷酸二苯酯將氨基末端的游 離胺與羧基末端的游離酸進行反應, 將被保護的肽前體在氨基和羧基末端之間環化。
     通常使用含有三氟乙酸 (TFA)、 任選還包含比例為 100 ∶ 5 ∶ 5 ∶ 2.5 的水、 苯甲 硫醚和乙二硫醇的溶液在室溫下處理 0.5-3 小時, 將 HMP 或 Rink 酰胺樹脂結合的產物切 下, 并使含有被保護側鏈的環化肽去保護。
     粗品肽通過制備型高壓液相色譜 (HPLC) 純化, 例如使用 Waters Delta-Pak C18 柱, 并使用含有 0.1% TFA 的水通過改變乙腈進行梯度洗脫。在柱洗脫后, 從洗脫級份中蒸 發掉乙腈, 然后將其冷凍干燥。 如此生產和純化的每種產物的身份, 可以通過快原子轟擊質 譜術 (FABMS) 或電噴霧質譜術 (ESMS) 來證實。
     通過這種方法生產的肽可用于為衍生出免疫原性肽的病原體產生調理性抗體。 抗 體的調理能力的測定方法, 可以通過本技術領域的專業人員已知的方法來確定, 例如在國 際專利申請 No. PCT/US2006/015499 和美國專利申請 No.11/910,517 中描述的方法, 所述 專利申請在此以其全文引為參考。
     提供了下面的實施例以說明某些實施方案的具體特點。但是, 下面描述的具體特 點不應被解釋為對本公開范圍的限制, 而是作為實例, 本技術領域的普通專業人員將能夠 識別出其等價物。 實施例 實施例 1
     本實施例描述了證明 P4 肽增強調理吞噬作用的試驗。
     材料與方法
     肽的合成。被命名為 P4、 P6 和 P7 的肽的氨基酸序列以前已被描述 ( 參見例 如 Rajam 等, Microb Pathog 2008 ; 44 : 186-96 ; Romero-Steiner 等, Vaccine 2006 ; 24 : 3224-31)。具有游離 N- 和 C- 末端的純肽在疾病控制和預防中心 (Centers for Disease Control and Prevention(CDC)) 和 Emory 大 學 微 量 化 學 機 構 (Emory University Microchemical Facility) 合成并冷凍干燥。 在本實施例中使用的肽在 Advanced ChemTech 396 多路肽合成儀上利用標準和修改的 9- 芴甲氧羰基方案合成。 將冷凍干燥的肽重懸浮在 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 水中, 超聲處理 3 分鐘進行溶解, 并儲存在 -70℃下。從 P4 序列產生 了兩種肽 P6 和 / 或 P7。這些肽對所測試的真核細胞沒有活化效應 ( 參見 Rajam 等, Microb Pathog 44 : 186-96, 2008)。這些肽在本實施例中描述的所有體外試驗中用作陰性對照。
     在本實施例中使用的種特異性抗體。球蛋白 (Gamunex ) 已用作肺炎球菌血清 型特異性多糖 (Ps) 抗體的來源 ( 參見例如 Rajam 等, Clin Vaccine Immunol, 14 : 1223-7, 2007 ; Romero-Steiner 等, Clin Diagn Lab Immunol 10 : 1019-24, 2003)。 QC2、 QC5 和 QC268 是 CDC 自產的質控人類血清, 對于靶生物體具有指定的滴度 ( 參見例如 Martinez 等, Clin Diagn Lab Immunol 9 : 485-8, 2002 ; Martinez 等, Clin Vaccine Immunol 13 : 459-66,
     2006)。 如 Srivastava 等 (Hybridoma 2000 ; 19 : 23-31) 描述的特異性針對肺炎球菌表面黏 附素 A 的單克隆抗體 8G12G11B10(8G12), 也用作抗鏈球菌蛋白抗體的來源。對這些血清進 行篩選以確保存在特異性抗體, 并證實 P4 介導的免疫增強的特異性。體外試驗設計包括對 存在或不存在 P4 的情況下調理吞噬殺死 (OPK) 或攝取的變化進行直接比較。
     OPK 分析。在本實施例中, 如 Romero-Steiner 等, Clin Diagn Lab Immunol, 4: 415-22, 1997 中所述, 參比 OPK 分析與分化成粒細胞的人類早幼粒白血病細胞 (HL-60) 一 起使用。用作肺炎鏈球菌血清型 3(WU2) 的血清型特異性抗體來源的 γ- 球蛋白在本分析 中的增殖、 儲存和使用, 如 Romero-Steiner 等, Clin Vaccine Immunol, 13 : 165-9, 2006 和 Rajam 等, Clin Vaccine Immunol, 14 : 1223-7, 2007 所述。在預調理階段, 向 OPK 分析混合 物加入 P4 肽溶液 (100μg/mL), 對照孔代之以接受 10μL DEPC 水。也使用 γ- 球蛋白或 8G12, 利用肺炎鏈球菌血清型 6B、 15B、 15C 和 19A 評估了 P4 介導的 OPK 的增強。
     流式細胞調理吞噬攝取分析。流式細胞調理吞噬分析 (fOPA) 使用分化成粒細胞 或單核細胞的 HL-60 細胞, 按照 Martinez 等, Clin Diagn Lab Immunol 9 : 485-8, 2002 ; Martinez 等, Clin Vaccine Immunol 13 : 459-66, 2006 ; 和 Mezzatesta 等, Infect Immun 42 : 99-105, 1983 的描述進行。 使用自產的質控血清 (QC5 和 QC268) 分別作為抗肺炎鏈球菌 血清型 14 和腦膜炎奈瑟菌 A 的莢膜 Ps 的血清型特異性抗體的來源。如 Martinez 等, Clin Diagn Lab Immunol 9 : 485-8, 2002 和 Martinez 等, Clin Vaccine Immunol 13 : 459-66, 2006 所述, 將聚苯乙烯珠子與肺炎鏈球菌和非肺炎鏈球菌抗原共價連接, 并用于 fOPA 中。 在預調理階段, 向 fOPA 混合物加入 P4 肽溶液 (100μg/mL), 對照孔代之以接受 10μL DEPC 水。
     肺炎鏈球菌分離株的 OXYBURST 標記。為了證實在效應細胞中對 P4 介導的 活化做出響應, 細胞內呼吸爆發的增加, 使用了 OXYBURST 示記的肺炎鏈球菌分離株。 將一滿環肺炎鏈球菌血清型 23F 的冷凍儲用物, 在增補有 0.5 %酵母提取物 (THYE) 的 Todd-Hewitt 肉湯 (Difco) 中生長過夜 ( 在 37℃和 5% CO2 下 )。將一滿環過夜培養物轉移 到 1mL 新鮮的 THYE 肉湯中, 并溫育 3 小時。從該培養物中取 200μL 轉移到 5mL THYE 肉湯 中并溫育 3 小時, 然后取 1mL 轉移到 5mLTHYE 肉湯中并另外溫育 3 小時 ( 所有溫育在 37℃ 和 5% CO2 下進行 )。在第三次傳代后, 將細菌懸液以 6000g 離心 10 分鐘, 并重懸浮在 1mL 0.01mol/L 磷酸鹽緩沖的鹽水 (PBS) 中。將 OXYBURST 染色劑 (INVITROGEN ) 用 1mL 去 離子水復溶, 并取 50μL 加入到 1-mL 細菌懸液中。使其在旋轉搖床中在 4℃下充分混合過 夜。然后, 將 OXYBURST 標記的細菌懸液在 PBS 中洗滌兩次, 并代替聚苯乙烯珠作為抗原 來源用于 fOPA 中。在本分析中使用了自產的質控血清 (QC2)。
     從人類血液分離多形核白細胞。肝素化的靜脈血從 Emory 獻血服務部 (Emory Blood Donor Services) 獲得。使用白細胞分離試劑盒 HISTOPAQUE -1119(Sigma), 按照 制造商推薦的方法從血液分離粒細胞。
     小鼠種系。 Swiss Webster(ND4-SW) 種系的小鼠 (Mus musculus) 從 Charles River Laboratories 獲得。在本研究中使用的小鼠為 6-10 周齡。所有實驗得到機構委員會的批 準, 并按照用于動物實驗的機構論理準則和安全準則進行。 。
     細菌菌株。肺炎鏈球菌 WU2( 血清型 3) 用于小鼠感染。該肺炎鏈球菌分離株從 CDC 的鏈球菌參比實驗室 (Streptococcal Reference Laboratory) 篩選。簡單來說, 將肺炎鏈球菌分離株 ( 冷凍儲用物 ) 在血瓊脂板 ( 添加 5%綿羊血的血瓊脂基質 ) 上劃線, 并溫 育 ( 在 37℃和 5% CO2 中 )18-24 小時。使用接種環刮取血瓊脂上的肺炎鏈球菌菌落, 并在 5mL THYE 肉湯中生長~ 4 小時 ( 在 37℃和 5% CO2 中 ), 直到對數中期 (492nm 處光密度讀 數為 0.5-0.6)。將該培養物 (1.5mL) 在 2-mL 聚丙烯螺旋蓋管中以 10,000g 離心 5 分鐘, 并將濕沉淀團重懸浮在 1mL 的 0.1mol/L PBS(pH 7.2) 中。將 1-mL 細菌懸液置于冰上并用 于感染。也將其用 PBS 稀釋 10-6, 并在血瓊脂板上對活細菌載量進行計數。平均活細菌載 7 量為 4X10 個細胞 /mL。
     鼻內感染。利用 Briles 等, J Infect Dis 188 : 339-48, 2003 描述的方法使用肺 炎鏈球菌對小鼠進行鼻內感染。簡單來說, 對小鼠腹膜內注射 20μL KETASET (100mg/ mL 鹽酸開他敏 ; Wyeth)。當小鼠昏睡后, 將 40μL 前面制備的細菌懸液逐滴靠近鼻施加, 使 小鼠吸入感染。
     腹膜內 (ip) 和靜脈內 (iv) 療法。每只小鼠用 4X107 個肺炎鏈球菌 WU2 細胞感染, 在 48 小時時在 50% -60%的動物中產生瀕死特征。在 72 小時時, 所有被感染的小鼠瀕死 (n = 60 ; 瀕死分值 2-3[ 參見下文 ])。在感染后 72 和 96 小時時, 將 40 只動物用 γ- 球 蛋白被動免疫 (100μL/ 小鼠 ; iv, n = 20, ip, n = 20)。在允許發生可能的體內預調理的 20 分鐘時間后, 通過 iv 或 ip 途徑使 20 只被動免疫的小鼠 ( 靜脈內 (iv), n = 10 ; 腹膜內 (ip), n = 10) 接受 P4(100μg ; 100μL/ 小鼠 )。對照小鼠只給予 DEPC 水 (100μL) 或 P4。 開始時, 測試 1、 10、 100 和 1000μg 的 P4 肽在小鼠中的毒性。將 P4 以 100μL 的恒定體積 ip 注射到 10 周齡 ND4-SW 小鼠中。即使在 1000μg/ 小鼠的劑量下, P4 也對小鼠沒有明顯 的毒性效應。
     瀕死特征的計分。每天兩次對小鼠進行監測, 并對瀕死特征進行目測計分。以 5 到 0 的等級為小鼠進行排序, 其中 5 表示健康, 皮毛、 皮膚、 眼睛、 呼吸和活動 / 移動正常 ; 4 表示健康, 但是開始看起來有病, 毛皮起皺 ; 3 表示有病、 皮毛起皺、 活動減少 ; 2 表示病情嚴 重、 皮毛起皺、 活動減少、 有眼分泌物 ; 1 表示接近死亡、 皮毛起皺、 很少或不活動、 有眼分泌 物、 呼吸減少 ( 因此將這些動物安樂死 ) ; 以及 0 表示死亡。
     細胞因子分析。將 P4 處理的和對照的小鼠殺死并去頭。從頸根部將血液快速收 集在冷凍管中, 并將其在 4℃放置 30 分鐘。然后將管以 1000g 離心 10 分鐘。收集血清樣 品并立即用于細胞因子分析。利用基于 LUMINEX 的 LINCOPLEXTM 小鼠 22 種細胞因子試劑 盒 (MCYTO-70K-PMX22 ; LINCO Research), 使用制造商推薦的方案分析小鼠血清中的細胞因 子。
     統計學。除非另外指明, 否則所有體外實驗在 3 個獨立的分析日進行三份平行試 驗。 體內激惹實驗重復> 5 次。 處理后瀕死動物的數量記錄到 166 小時, 并使用用于平均值 的成對樣品的 t 檢驗 (Microsoft Excel 2003) 分析數據在各個組之間的顯著性差異。
     結果
     OPK 分析。測試了 P4 肽在體外增強調理吞噬作用的潛力, 數據在圖 1 中給出。圖 1A 中呈現的數據顯示出 P4 介導的肺炎鏈球菌血清型 3(WU2) 的 OPK 的增加依賴于抗體濃 度。盡管在 γ- 球蛋白 1 ∶ 8 稀釋下觀察到 OPK 增加了 35%, 但隨著抗血清的稀釋, 效果 逐漸降低 ( 圖 1A)。P4 介導的 OPK 的增加是補體依賴性的, 因為在不存在補體源的情況下, 沒有觀察到使用 P4 相對于對照的 OPK 的增加 ( 圖 1B)。P4 介導的 OPK 的增加依賴于反應混合物中 P4 的濃度。盡管在增補 5μg/mL P4 時沒有觀察到 OPK 的變化, 但隨著 P4 濃度 的增加觀察到了逐漸增加 ( 對于 10μg/mL 來說為 8%, 對于 50μg/mL 來說為 30% ; 對于 100μg/mL 來說為 35% )。在 100μg/mL 濃度下, P4 介導的 OPK 的增加達到平臺 ( 圖 1C)。 使用 γ- 球蛋白或 8G12 作為特異性抗體來源, 用肺炎鏈球菌血清型 6B、 15B、 15C 和 19A 時 也記錄到相似的 P4 介導的 OPK 的增加。
     調 理 吞 噬 性 攝 取 (OPU) 分 析。 利 用 OXYBURST 標記的肺炎鏈球菌血清型 23F(DS3848-03), 通過吞噬細胞內呼吸爆發的改變測試了 P4 介導的調理吞噬作用的增強。 P4 介導的 OPU 增加的特征為吞噬細胞內呼吸爆發隨著抗體稀釋而逐漸降低 ( 圖 2A)。圖 2B 和 2C 中呈現的 數據顯示, 在存在抗原特異性抗體和補體的情況下, P4 在活化不同效應細 胞和增強 OPU 方面具有多能性。從新鮮人類血液分離的粒細胞使肺炎鏈球菌血清型 14 的 Ps 珠的 OPU 增加≥ 50%, 其隨著抗體的稀釋而逐漸降低 ( 對于 1 ∶ 64 來說為 52% ; 對于 1 ∶ 128 來說為 48% ; 對于 1 ∶ 256 來說為 25% ; 對于 1 ∶ 512 來說為 5% )( 圖 2B)。圖 2C 顯示出在存在特異性抗體和效應細胞的情況下, P4 能夠增強對非肺炎鏈球菌抗原的體 外調理吞噬作用。使用分化成單核細胞的 HL-60 細胞, 記錄到包被了腦膜炎奈瑟菌 AP 的珠 子的 OPU 存在 P4 介導的增加 ( 圖 2C)。
     體內研究。將肺炎鏈球菌 WU2 感染的小鼠在感染后 72 和 96 小時時用 γ- 球蛋白 和 / 或 P4 進行被動免疫。盡管未治療的小鼠具有 10%的存活率 (10 只中的 1 只 ), 但單用 γ- 球蛋白治療 (iv 和 ip 兩者 ) 的小鼠具有 30%的存活率。另一方面, 使用 γ- 球蛋白和 P4 通過 iv 治療的 10 只小鼠中的 8 只 (80% )(P < .001) 和通過 ip 治療的 10 只小鼠中的 6 只 (60% )(P < .001), 表現出從菌血癥和瀕臨死亡的完全恢復 ( 圖 3)。小鼠血清樣品的 細胞因子分析顯示, 在獲救動物中細胞因子水平沒有一致的模式或變化。
     實施例 2
     本實施例描述了 P4 肽和抗生素的共同給藥作為新的治療方法來治療嚴重肺炎球 菌感染的評估。
     材料與方法
     在本實施例中使用的細菌、 肽、 抗體和抗生素。按照以前的描述使用肺炎鏈球菌 血清型 3(WU2) 感染小鼠 (Rajam 等, J.Infect.Dis.199 : 1233-1238, 1999)。按照以前的描 述合成、 純化和制備了 P4——一種 28 個氨基酸的肽, 用于組合療法 (Carlone 等, Microb. Pathog.44 : 186-196, 2008)。 使 用 γ- 球 蛋 白 ( 靜 脈 內 免 疫 球 蛋 白 [IVIG] ; Gamunex, Telecris, NC) 作為 Pnc 血清型特異性多糖抗體的來源 (Frasch 和 Scott Clin.Diagn.Lab. Immunol.11 : 1158-1164, 2004 ; Rajam 等, Clin.Vaccine Immunol.14 : 1223-1227, 2007 ; Romero-Steiner 等, Clin.Diagn.Lab.Immunol.10 : 1019-1024, 2003)。將一種廣譜頭孢菌 素——頭孢曲松 ( 目錄號 C5793 ; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) 溶解在磷酸鹽緩沖的鹽水 (0.01M) 中, 并在磷酸鹽緩沖的鹽水中制備用于小鼠接種的工作溶液。
     在本實施例中使用的小鼠。 在本研究中使用了 6 到 10 周齡的雌性 Swiss Webster 小鼠 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA)。所有實驗得到機構實驗動物管理 和使用委員會 (Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC) 批準, 并按照用 于動物實驗的機構論理準則和安全準則執行。
     鼻內感染。采用 Briles 等, 2003 描述的方法, 使用 Pnc 分離株對小鼠進行鼻內感染。簡單來說, 對小鼠腹膜內 (ip) 注射 20μl 100mg/ml 鹽酸開他敏 (KETASET Wyeth)。 當小鼠昏睡后, 將 40μl 細菌懸液 ( ~ 2.1X107 個細胞 / 小鼠 ) 逐滴靠近鼻施加, 使小鼠吸 入細菌。小鼠骯臟結合隆背體態或嗜睡標明瀕死。大多數小鼠 (80% ) 在暴露后 48 小時瀕 死。將瀕死小鼠分成表 1 中顯示的各種對照和治療組 (n = 10/ 組 )。對照組包括未治療的 動物或只接受 P4、 只接受 IVIG、 或只接受頭孢曲松 (0.3、 3.0、 300 或 3,000μg/ 小鼠 ) 的動 物。治療組包括接受單一接種物的小鼠, 所述接種物含有 P4 和 IVIG, 并含有或不含有三種 不同劑量 (0.3、 3.0 或 300μg/ 小鼠 ) 之一的頭孢曲松。
     組 合 療 法。 使 用 Tailveiner 固 定 器 ( 型 號 TV-150 ; Braintree Scientific, Braintree, MA) 將小鼠固定。使用 25 號針頭和 1-ml 注射器靜脈內 (iv) 給藥 IVIG 和 / 或 P4。首先給藥 IVIG(100-μl 體積 / 小鼠 ), 在 20 分鐘后接著給藥 P4( 每只小鼠 50μg, 在 100-μl 體積中 )。在 P4 給藥后 30 分鐘給藥頭孢曲松 (ip, 100-μl 體積 / 小鼠 )。在治療 后 7 天或 ( 在重復感染研究中 )36 天中, 每天監測動物疾病發展的臨床體征。對于重復治 療來說, 將使用 P4 組合療法挽救的小鼠在治療后第 28 天重新感染, 并再次用 P4 組合療法 治療。 盡管對照組中 25 到 30%的小鼠在第一次激惹后存 活, 但它們后來或者死于感染, 或 病入膏肓并因此被人道地安樂死。因此, 沒有來自第一次激惹的對照小鼠用于重復治療。 菌 血 癥 測 試。 收 集 來 自 P4 治 療 和 未 治 療 小 鼠 的 血 樣 (Rajam 等, J.Infect. Dis.199 : 1233-1238, 2009), 將 100-μl 等份的肝素化血樣鋪在血瓊脂板 ( 添加 5%綿羊血 加慶大霉素 [2.5mg/ 升 ] 的血瓊脂基質 ) 上。將板在 37℃和 5% CO2 中溫育 18 到 24 小時, 并對細菌進行計數。
     P4 增 強 的 調 理 吞 噬 作 用。 我 們 使 用 了 以 前 由 Romero-Steiner 等 所 描 述 的 (Romero-Steiner 等, Clin.Diagn.Lab.Immunol.4 : 415-422, 1997)、 使用從小鼠分離的多 形核白細胞 (PMN)(Devi 等, Indian J.Physiol.Pharmacol.39 : 354-360, 1995) 的體外調理 吞噬性殺死分析 (OPKA)。從感染 ( 用 Pnc WU2) 后 1 和 2 小時的小鼠或從未感染對照中, 按照以前的描述 (Frasch 和 Scott, 2004) 收集外周血樣品, 并分離白細胞衣級份 (Devi 等, 1995) 用作效應細胞來源。使用 γ- 球蛋白 (Gamunex, Telecris, NC) 作為血清型特異性 抗體來源。肺炎鏈球菌血清型 3(WU2) 按照以前的描述 (Rajam 等, 2007 ; Romero-Steiner, 2006) 繁殖、 儲存和用于本分析中。在預調理階段向 OPKA 混合物加入 100-μg/ml P4 肽溶 液, 而對照孔接受焦炭酸二乙酯水。
     用于抗 P4 IgG 的 ELISA。在感染后 14 天從用 P4 療法治療的小鼠收集血液樣品, 并采用以前描述的方法 (Rajam, 2009) 分離血清級份。酶聯免疫吸附分析 (ELISA) 按照以 前的描述并做少量修改后進行 (Scott 等, Clin.Diagn.Lab.Immunol.12 : 1195-1201, 2005 ; Scott 等, J.Infect.Dis.186 : 220-226, 2002), 以檢測和定量抗蛋白的免疫球蛋白 G(IgG)。 簡單來說, 將 ELISA 板用濃度為 5-μg/ml 的 P4 肽包被。將板在 4℃溫育過夜, 并用于檢測 和定量小鼠血清中的抗 P4 IgG。使用辣根過氧化物酶標記的抗小鼠 IgG(Sigma, St.Louis, 3, 3’ , 5, 5’ - 四甲基聯苯胺 (KPL, Gaithersburg, MD) MO) 作為報告抗體。使用 SUREBLUE 作為底物, 并使用 1N HCl 作為終止溶液。樣品測定三份平行樣, 并包含適合 的陽性和陰性 對照。
     統計學。體內組合療法實驗重復 3 到 5 次, 重復療法執行一次。分別記錄組合和 重復療法后直到 7 天和 36 天的瀕死動物的數量, 并在 MICROSOFT Excel 2003 中使用用
     于平均值的成對雙樣品 t 檢驗來分析數據在各個組之間的顯著性差異。
     結果
     組合療法。未治療的對照小鼠 (n = 10) 在 168 小時時具有 30 %的存活率。用 3,000μg 頭孢曲松單獨治療的小鼠具有 90%的存活率 ( 圖 4)。 另一方面, 單獨的較低劑量 (300、 3.0 和 0.3μg) 的頭孢曲松或 P4 提供的保護作用差, 存活率與未治療對照組的相當。 用濃度為 50μg 的 P4 與 IVIG 一起單劑治療瀕死小鼠, 產生 70%的存活率 ( 圖 4)。低劑量 (300μg) 頭孢曲松與這種 IVIG-P4 治療混合物的組合, 將小鼠存活率增加到 100%, 明顯好 于未治療對照 (P < 0.05)( 圖 4)。
     重復療法。將用組合 (P4、 IVIG 和頭孢曲松 ) 療法從致命的肺炎鏈球菌 WU2 感染 挽救的小鼠 (n = 10), 在 28 天后用肺炎鏈球菌 WU2 重新感染, 并在它們表現出瀕死時用組 合療法重新治療。P4 介導的組合療法挽救了所有被感染的動物 ( 圖 5)。
     菌血癥測試。 從 P4 治療和未治療的小鼠抽取血液樣品并進行菌血癥測試。 來自未 治療對照小鼠的血樣含有的細菌載量太高而無法計數。 來自治療動物的樣品沒有菌血癥。
     P4 增強的調理吞噬作用。 使用來自感染或未感染小鼠的 PMN 進行了 OPKA。 在存在 血清型特異性 IgG 的情況下, 與對照水平相比, 添加 P4 顯著增加 ( 達到> 80% ; P < 0.05) 了 Pnc(WU2) 的體外調理吞噬性殺死 ( 圖 6)。 用于抗 P4 IgG 的 ELISA。使用小鼠 IgG 特異性 ELISA 測試了來自 P4 治療小鼠的 血清樣品的抗 P4 抗體。所有樣品的抗 P4IgG 均為陰性。
     表1: 研究設計
    
    n = 10/ 組。 所 有 組 以 ~ 2.1X107 個 細 胞 /40μl/ 小 鼠 鼻 內 接 受 肺 炎 鏈 球 菌 (S.pneumoniae) 血清型 3(WU2)。33a102186495 A CN 102186499
    b說明書31/34 頁iv 給藥在 100-μl 體積中的 50μg P4 和 100μl γ- 球蛋白 ; 頭孢曲松以表明的 劑量在 100-μl 體積中 ip 給藥。+, 包含在治療混合物中 ; -, 未包含在治療混合物中。
     實施例 3
     使用 P4 肽治療對象
     本實施例描述了可用于治療患有目標病原體 ( 例如術語概述中列出的病原體 ) 感 染或具有其感染風險的對象的方法, 所述感染可以通過給藥一種或多種 P4 肽以及任選的 調理性抗體和 / 或補體蛋白, 通過對目標病原體的調理吞噬作用進行治療。在某些實例中, 所述一種或多種 P4 肽不與調理性抗體和 / 或補體蛋白一同給藥。在具體實例中, 方法 包 括篩選患有、 據認為患有病原體感染或具有病原體感染的風險 ( 例如由于免疫力受損、 生 理狀態或暴露于病原體 ) 的對象。可以對感染狀態未知的對象進行檢查, 以確定他們是否 具有感染, 例如使用血清學測試、 身體檢查、 酶聯免疫吸附分析 (ELISA)、 放射學篩查或本技 術領域的專業人員已知的其他診斷技術。在某些實例中, 篩選具有病原體感染或具有獲得 病原體感染的風險的對象, 所述病原體不表達肺炎球菌表面黏附素 A(PsaA), 例如對象不具 有肺炎鏈球菌感染。選擇被發現 ( 或已知 ) 具有病原體感染并因此可以通過給藥 P4 肽治 療的對象來接受 P4 肽。也可以選擇具有發生病原體感染的風險的對象, 例如年老、 免疫受 損和非常年輕的對象, 例如嬰兒。
     向所選的治療對象給藥治療量的 P4 肽。P4 肽可以用每劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體 重 的 劑 量 給 藥, 例 如 每 劑 1μg/kg 體 重 -100μg/kg 體 重、 每 劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重或甚至更高的劑量。但是, 具體的劑量可以由訓練有素的臨床醫生決定。藥劑可以給藥幾劑, 例如連續地、 每日、 每周 或每月給藥。
     給藥方式可以是本技術領域中使用的任何方式。 給藥于對象的藥劑量可以由臨床 醫生確定, 并可能取決于待治療的具體對象。本文中提供了示例性的具體量 ( 但本公開不 限于這些劑量 )。
     實施例 4
     使用 P4 肽和調理性抗體治療對象
     本實施例描述了可用于治療患有目標病原體 ( 例如術語概述中列出的病原體 ) 感 染或具有其感染風險的對象的方法, 所述感染可以通過給藥一種或多種 P4 肽和特異性結 合目標病原體表面上存在的抗原的調理性抗體, 通過對目標病原體的調理吞噬作用進行治 療。 在具體實例中, 方法包括篩選患有、 據認為患有病原體感染或具有病原體感染的風險的 對象。可以對感染狀態未知的對象進行檢查, 以確定他們是 否具有感染, 例如使用血清學 測試、 身體檢查、 酶聯免疫吸附分析 (ELISA)、 放射學篩查或本技術領域的專業人員已知的 其他診斷技術。 在某些實例中, 使用血清學測試、 或使用特異性針對目標病原體的核酸探針 或甚至可以同時鑒定幾種病原體的一組核酸探針例如陣列, 來篩查對象以鑒定具體的目標 病原體。選擇的對象被發現 ( 或已知 ) 具有來自目標病原體例如肺炎鏈球菌、 化膿性鏈球 菌、 腦膜炎奈瑟菌或金黃色葡萄球菌例如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌 (MRSA) 的病原性 感染, 并因此可以通過給藥 P4 肽聯合特異性針對所檢測目標病原體的調理性抗體治療, 使 其接受 P4 肽和特異性針對目標病原體的調理性抗體。也可以選擇具有發生病原體感染的 風險的對象, 例如暴露于已知目標病原體、 年老、 免疫受損和非常年輕的對象, 例如嬰兒。向所選的治療對象給藥治療量的 P4 肽。P4 肽可以用每劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體 重 的 劑 量 給 藥, 例 如 每 劑 1μg/kg 體 重 -100μg/kg 體 重、 每 劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。向對象給藥治療量 的特異性針對所鑒定的目標病原體的調理性抗體。調理性抗體可以用每劑 1μg/kg 體重至 約 1mg/kg 體重的劑量給藥, 例如每劑 1μg/kg 體重 -100μg/kg 體重、 每劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。但是, 具體的劑量 可以由有訓練有素的臨床醫生決定。P4 肽可以與調理性抗體同時或順序給藥。P4 肽和 / 或調理性抗體可以一劑或幾劑給藥, 例如連續地、 每日、 每周或每月給藥。 當順序給藥時, P4 肽和調理性抗體給藥的時間間隔可以是數秒、 數分鐘、 數小時、 數日或甚至數周。
     給藥方式可以是本技術領域中使用的任何方式。 給藥于對象的藥劑量可以由臨床 醫生確定, 并可能取決于所治療的具體對象。本文中提供了示例性的具體量 ( 但本公開不 限于這些劑量 )。
     實施例 5
     使用抗生素、 P4 肽和調理性抗體的組合治療對象
     本實施例描述了可用于治療患有目標病原體 ( 例如術語概述中列出的病原體 ) 感 染或具有其感染風險的對象的方法, 所述感染可以通過給藥一種或多種 P4 肽和特異性結 合目標病原體表面上存在的抗原的調理性抗體, 通過對目標病原體的調理吞噬作用進行治 療。 在具體實例中, 方法包括篩選患有、 據認為患有病原體感染或具有病原體感染的風險的 對象。可以對感染狀態未知的對象進行檢查, 以確定他們是否具有感染, 例如使用血清學 測試、 身體檢查、 酶聯免疫吸附分析 (ELISA)、 放射學篩查或本技術領域的專業人員已知的 其他診斷技術。 在某些實例中, 使用血清學測試、 或使用特異性針對目標病原體的核酸探針 或甚至可以同時鑒定幾種病原體的一組核酸探針例如陣列, 來篩查對象以鑒定具體的目標 病原體。選擇的對象被發現 ( 或已知 ) 具有來自目標病原體例如肺炎鏈球菌、 化膿性鏈球 菌、 腦膜炎奈瑟菌或金黃色葡萄球菌例如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌 (MRSA) 的病原性 感染, 并因此可以通過給藥 P4 肽聯合抗生素和特異性針對所檢測的目標病原體的調理性 抗體來治療, 將其給藥 P4 肽和抗生素以及特異性針對目標病原體的調理性抗體。也可以選 擇具有發生病原體感染的風險的對象, 例如暴露于已知目標病原體、 年老、 免疫受損和非常 年輕的對象, 例如嬰兒。
     向所選的治療對象給藥治療量的 P4 肽。P4 肽可以用每劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體 重 的 劑 量 給 藥, 例 如 每 劑 1μg/kg 體 重 -100μg/kg 體 重、 每 劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。向對象給藥治療量 的特異性針對所鑒定的目標病原體的調理性抗體。調理性抗體可以用每劑 1μg/kg 體重至 約 1mg/kg 體重的劑量給藥, 例如每劑 1μg/kg 體重 -100μg/kg 體重、 每劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。但是, 具體的劑量 可以由有訓練有素的臨床醫生決定。向所選的治療對象給藥治療量的 P4 肽。抗生素可以 用每劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體重 ( 取決于諸如抗生素的效力和 / 或類型等因素 ) 的 劑量給藥, 例如 每劑 1μg/kg 體重 -100μg/kg 體重、 每劑 100μg/kg 體重 -500μg/kg 體 重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。P4 肽可以與抗生素和調理性抗體同 時或順序給藥。給藥方式可以是本技術領域中使用的任何方式。 給藥于對象的藥劑量可以由臨床 醫生確定, 并可能取決于所治療的具體對象。本文中提供了示例性的具體量 ( 但本公開不 限于這些劑量 )。
     實施例 6
     使用 P4 肽和抗生素治療對象
     本實施例描述了可用于治療患有目標病原體 ( 例如術語概述中列出的病原體 ) 感 染或具有其感染風險的對象的方法, 所述感染可以通過給藥一種或多種 P4 肽和特異性結 合目標病原體表面上存在的抗原的調理性抗體, 通過對目標病原體的調理吞噬作用進行治 療。 在具體實例中, 方法包括篩選患有、 據認為患有病原體感染或具有病原體感染的風險的 對象。可以對感染狀態未知的對象進行檢查, 以確定他們是否具有感染, 例如使用血清學 測試、 身體檢查、 酶聯免疫吸附分析 (ELISA)、 放射學篩查或本技術領域的專業人員已知的 其他診斷技術。 在某些實例中, 使用血清學測試、 或使用特異性針對目標病原體的核酸探針 或甚至可以同時鑒定幾種病原體的一組核酸探針例如陣列, 來篩查對象以鑒定具體的目標 病原體。選擇的對象被發現 ( 或已知 ) 具有來自目標病原體例如肺炎鏈球菌、 化膿性鏈球 菌、 腦膜炎奈瑟菌或金黃色葡萄球菌例如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌 (MRSA) 的病原性 感染, 并因此可以通過給藥 P4 肽聯合特異性針對所檢測的目標病原體的抗生素治療, 對其 給藥 P4 肽和特異性針對目標病原體的抗生素。也可以選擇具有發生病原體感染的風險的 對象, 例如暴露于已知目標病原體、 年老、 免疫受損和非常年輕的對象, 例如嬰兒。
     向所選的治療對象給藥治療量的 P4 肽。P4 肽可以用每劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體重的劑量給藥, 例如每劑 1μg/kg 體重 -100μg/kg 體重、 每劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。向對象給藥治療 量的特異性針對所鑒定的目標病原體的調理性抗體。抗生素可以用每劑 1μg/kg 體重至 約 1mg/kg 體重的劑量給藥, 例如每劑 1μg/kg 體重 -100μg/kg 體重、 每劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。但是, 具體的劑量 可以由有訓練有素的臨床醫生決定。P4 肽可以與抗生素同時或順序給藥。P4 肽和 / 或抗 生素可以用一劑或幾劑給藥, 例如連續地、 每日、 每周或每月給藥。當順序給藥時, P4 肽和 抗生素給藥的時間間隔可以是數秒、 數分鐘、 數小時、 數日或甚至數周。
     給藥方式可以是本技術領域中使用的任何方式。 給藥于對象的藥劑量可以由臨床 醫生確定, 并可能取決于所治療的具體對象。本文中提供了示例性的具體量 ( 但本公開不 限于這些劑量 )。
     實施例 7
     使用 P4 肽治療具有肺炎風險的對象
     本實施例描述了可用于治療患有肺炎或具有肺炎風險的對象的方法, 所述肺炎來 自例如已知引起肺炎的病原體, 例如肺炎鏈球菌。在具體實例中, 方法包括篩選患有、 據認 為患有引起肺炎例如肺炎球菌疾病的病原體感染如肺炎鏈球菌感染或具有所述感染風險 的對象。可以選擇具有發生病原體感染的風險的對象, 例如暴露于已知目標病原體、 年老、 免疫受損的 ( 例如處在免疫抑制療法中或 HIV 感染的 ) 和非常年輕的對象, 例如嬰兒。可 以將肺炎球菌感染例如肺炎鏈球菌感染的風險增加, 與對抗肺炎鏈球菌的定植、 吸入或侵 襲的非特異性和特異性防御機制的缺陷相關聯。這種缺陷的實例包括咳嗽反射降低、 纖毛功能不良和免疫缺陷例如低 γ 球蛋白血癥、 補體缺陷、 白細胞減少癥或無脾。其他風險因 子包括癡呆、 癲癇病、 當前吸食煙草例如吸煙、 飲酒、 充血性心力衰竭、 腦血管疾病、 收容和 慢性阻塞性肺病 (COPD)。在例如無脾對象中, 侵入性肺炎球菌疾病的風險為每年約十萬分 之五百。
     向所選的治療對象給藥治療量的 P4 肽。P4 肽可以用每劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體 重 的 劑 量 給 藥, 例 如 每 劑 1μg/kg 體 重 -100μg/kg 體 重、 每 劑 100μg/kg 體 重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。在某些實例中, 還 向對象給藥治療量的特異性針對所鑒定的目標病原體的調理性抗體。 調理性抗體可以用每 劑 1μg/kg 體重至約 1mg/kg 體重的劑量給藥, 例如每劑 1μg/kg 體重 -100μg/kg 體重、 每 劑 100μg/kg 體重 -500μg/kg 體重、 或每劑 500μg/kg 體重 -1000μg/kg 體重的劑量。但 是, 具體的劑量可以由有訓練有素的臨床醫生決定。P4 肽可以與調理性抗體同時或順序給 藥。P4 肽和 / 或調理素抗體可以給藥一劑或幾劑, 例如連續地、 每日、 每周或每月給藥。當 順序給藥時, P4 肽和調理性抗體給藥的時間間隔可以是數秒、 數分鐘、 數小時、 數日或甚至 數周。
     給藥方式可以是本技術領域中使用的任何方式。 給藥于對象的藥劑量可以由臨床 醫生確定, 并可取決于所治療的具體對象。本文中提供了示例性的具體量 ( 但本公開不限 于這些劑量 )。
     盡管在描述本公開時強調了具體的實施方案, 但對于本技術領域的專業人員來 說, 顯然可以使用這些具體實施方案的變化形式, 并且打算可以不按本文的具體描述來實 踐本公開。 結合本發明的具體情況、 實施方案或實施例描述的特點、 特征、 化合物、 化學部分 或實例, 應該被理解為可適用于本發明的任何其他情況、 實施方案或實施例。因此, 本公開 包括由下面的權利要求書所定義的本公開的精神和范圍內所涵蓋的所有修改。37102186495 A CN 102186499
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用于 增強 調理 吞噬作用 肺炎 球菌 P4 病原體 應答 中的 應用
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