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抗單純皰疹病毒多肽及其應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201110248318.8

申請日:

2011.08.24

公開號:

CN102295683B

公開日:

2014.12.31

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 7/06申請日:20110824|||公開
IPC分類號: C07K7/06; C07K7/08; C07K9/00; C12N15/12; A61K38/08; A61K38/10; A61K38/14; A61P31/22 主分類號: C07K7/06
申請人: 武漢摩爾生物科技有限公司
發明人: 李文鑫; 曹志賤; 吳英亮; 韓松
地址: 430079 湖北省武漢市東湖高新區國際企業中心棲鳳樓B棟2樓
優先權:
專利代理機構: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227 代理人: 逯長明
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110248318.8

授權公告號:

102295683B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.31|||2012.02.15|||2011.12.28

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及生物技術領域,公開了抗單純皰疹病毒活性多肽及其用途。試驗表明本發明所述抗單純皰疹病毒多肽對單純皰疹病毒增殖具有高效抑制作用,可用于制備治療或預防單純皰疹相關疾病藥物。本發明提供的以抗單純皰疹病毒多肽為有效成分的治療單純皰疹病毒引起皰疹的藥物制劑,用于治療皰疹見效明顯,治療效果顯著,對治療單純皰疹、口唇皰疹、生殖皰疹等有效率達到100%,且無毒副作用,治愈后不復發。

權利要求書

1.一種多肽,其特征在于,其氨基酸序列為PheIleX1X2IleAlaX3LeuLeuX4
X5IlePhe、PheIleX6IleX7LeuLeuX8IlePhe或PheIleX9IleX10LeuX11Ile?Phe,其中
X1、X3和X5~11獨立選自Arg、Lys或His;X2和X4為任意氨基酸;且該多肽不為
Phe?Ile?Lys?Arg?Ile?Ala?Arg?Leu?Leu?Arg?Lys?Ile?Phe。
2.具有通過在權利要求1所述多肽的氨基酸序列中取代、缺失或添加一
個或多個氨基酸殘基所得到的氨基酸序列且具有抗單純皰疹病毒活性的多
肽。
3.根據權利要求1所述多肽,其特征在于,具有SEQ?ID?NO:1~25之一
所示的氨基酸序列。
4.具有權利要求3所述多肽的一個或多個氨基酸殘基被甲基化、糖基化、
磷酸化、乙酰化修飾所得到的氨基酸序列的且具有抗單純皰疹病毒活性的多
肽。
5.編碼權利要求1~4任意一項所述多肽的DNA分子。
6.編碼SEQ?ID?NO:1所示氨基酸序列的DNA分子,其特征在于,具有
如SEQ?ID?NO:26所示的核苷酸序列。
7.權利要求1~4任意一項所述多肽在制備治療或預防單純皰疹相關疾病
藥物中的應用。
8.根據權利要求7所述應用,其特征在于,所述單純皰疹相關疾病為單
純皰疹、口唇皰疹或生殖器皰疹。
9.一種治療皰疹的藥物制劑,其特征在于,包括治療有效量的權利要求
1~4任意一項所述多肽中的一種或幾種和藥學上可接受的輔料。
10.根據權利要求9所述藥物制劑,其特征在于,所述藥物制劑為凝膠
劑。
11.根據權利要求10所述藥物制劑,其特征在于,所述凝膠劑包括0.5wt%
的權利要求1~4任意一項所述多肽中的一種或幾種。
12.根據權利要求11所述藥物制劑,其特征在于,還包括10wt%的丙
二醇、20wt%的乙醇、15wt%的羥甲基纖維素、1wt%的三乙醇胺、0.1wt%
的羥苯乙酯和53.4wt%的無菌水。

說明書

抗單純皰疹病毒多肽及其應用

技術領域

本發明屬于生物技術領域,具體的說是涉及抗單純皰疹病毒多肽及其應
用。

背景技術

單純皰疹病毒(HSV)是一種常見的人類傳染病病毒,在全球廣泛分布,
可造成齦口炎(gingivostomatitis)、角膜結膜炎(keratoconjunctivitis)、腦炎
(encephalitis)以及生殖系統感染和新生兒的感染,引發單純皰疹、口唇皰疹、
生殖皰疹,嚴重影響人體健康。單純皰疹病毒在感染宿主后,常在神經細胞
中建立潛伏感染,激活后又會出現無癥狀的排毒,在人群中通過皮膚、粘膜
的直接接觸或性接觸途徑進入機體,周而復始的循環。

皰疹病毒的治療方法包括一般療法、中醫中藥治療和抗病毒藥治療,其
中抗病毒藥物治療是現階段最主要的治療方法。目前,抗病毒藥物有很多,
如阿糖腺苷或無環鳥苷,阿昔洛韋(ACV),它們是口服高效抗病毒藥,均
為開鏈嘌呤核苷,能抑制病毒脫氧核糖核酸合成,但對宿主細胞DNA的合成
作用較少,被認為是當前最有效的抗HSV藥物。近年來還新開發出無環鳥苷
的類似物,如萬乃洛韋(valaciclovir)、法昔洛韋(famicidovir)、潘昔洛韋
(pencidovir)等,具有療效確切、生物利用度高等優點。但這些抗病毒藥物的
使用產生病毒的耐藥性,導致許多皰疹治療藥物療效不佳。

中國傳統醫藥常用“以毒攻毒”的策略治療人類的疑難雜癥,其中以蝎、蛇、
蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等有毒動物為首選藥材。現代研究表明這些有毒動物的毒
液中富含動物活性多肽,稱為多肽的生物活性物質,因其具有純生物物質、
穩定性強、殺病毒強、廣譜、無抗藥耐藥性、無毒副作用和“三致”作用特點,
已成為全球競爭研發的重要藥物資源[Nat.Rev.Drug.Discov.20032:63]。

有毒動物陽離子防御肽是一類由宿主生成在天然免疫中特異性發揮防御
性作用的一類小分子多肽,通常由10-50個氨基酸構成,靜電荷從+2到+9不
等。根據結構的差別,陽離子防御肽可以分為如下幾類:含有2-4個β片層的
兩親性分子、兩親性α螺旋、卷曲結構、以及含有高級結構的分子,它們都在
生物體抵御微生物的入侵中發揮重要的作用。而其中的α螺旋類陽離子防御肽
特異性作用于有包膜的RNA病毒及DNA病毒,其作用方式通常是作用于病毒
進入的過程,或者是直接作用于病毒的包膜。例如,蜂毒溶血肽Melitiin和天
蠶素Cecropins在亞毒性濃度下通過阻遏基因表達來抑制HIV-1病毒的增殖,爪
蟾抗病毒多肽Magainin-2對皰疹病毒HSV和HSV-2有一定的抑制效果,
Dermaseptin就是通過作用于HIV的包膜而引起HIV的失活,從而達到抗病毒的
作用。蝎子中陽離子防御肽的研究也已經有多年的歷史。其中除了從淋巴系
統中發現的防御肽外,更多的是從蝎毒腺中分離到的防御肽,例如Hadrurin、
Scorpine、Opistoporin、Parabutoporin、ISCT和Pandinin,這些多肽都屬α螺旋
類陽離子防御肽,且陽離子防御肽不再是傳統的疫苗防治,而是通過直接抑
制病毒達到抗病毒的目的。

發明內容

本發明目的是提供穩定的抗單純皰疹病毒多肽。

為實現本發明的目的,本發明采用如下技術方案:

一種多肽,其氨基酸序列為PheIleX1X2IleAlaX3LeuLeuX4X5IlePhe、PheIle
X6IleX7LeuLeuX8IlePhe或PheIleX9IleX10LeuX11IlePhe,其中X1、X3和X5~11獨立
選自Arg、Lys或His;X2和X4為任意氨基酸;且該多肽不為Phe?Ile?Lys?Arg?Ile?Ala?
Arg?Leu?Leu?Arg?Lys?Ile?Phe。

本發明通過構建和篩選我國西藏琵蝎毒腺組織cDNA文庫,得到了具有抗
單純皰疹病毒活性的多肽基因,通過基因工程技術,獲得了西藏琵蝎抗單純
皰疹病毒活性多肽AHSVP1,其序列為Phe?Ile?Arg?Lys?Ile?Ala?Arg?Leu?Leu?Lys?
Arg?Ile?Phe。根據AHSVP1的成熟肽序列,使用在線NPSserver[DSC法
(Discrimination?of?protein?Secondary?structure?Class)]對其進行二級結構預測,
并利用軟件AHTHEPROT?2000繪制其二級結構圖像。二級結構圖顯示
AHSVP1含有100%的α-Helix結構,具有典型的兩親性(amphiphilic)α-Helix
結構,含有大量帶凈正電荷的堿性殘基(Arg和Lys)。然后對AHSVP1多肽
序列進行大量點突變,發現氨基酸序列為PheIleX1X2IleAlaX3LeuLeuX4X5Ile
Phe、PheIleX6IleX7LeuLeuX8IlePhe或PheIleX9IleX10LeuX11IlePhe的AHSVP1同
源結構多肽,并不影響其雙親性的特征,其中X1、X3和X5~11獨立選自Arg、Lys
或His,X2和X4為任意氨基酸。因此,本發明提供了抗單純皰疹病毒多肽,其
氨基酸序列為PheIleX1X2IleAlaX3LeuLeuX4X5IlePhe、PheIleX6IleX7Leu
LeuX8IlePhe或PheIleX9IleX10LeuX11IlePhe,其中X1、X3和X5~11獨立選自Arg、
Lys或His;X2和X4為任意氨基酸;且該多肽不為Phe?Ile?Lys?Arg?Ile?Ala?Arg?Leu?
Leu?Arg?Lys?Ile?Phe。

本發明還提供了具有通過在本發明所述多肽的氨基酸序列中取代、缺失
或添加一個或多個氨基酸殘基所得到的氨基酸序列的且具有抗單純皰疹病毒
活性的多肽。所述的氨基酸取代、缺失或添加,可以在氨基酸序列的任意位
點進行,只要具有改造后的氨基酸序列的多肽具有抗單純庖疹病毒活性即可。
類似的,所取代、缺失或添加的氨基酸的數目也是任意的,只要具有改造后
的氨基酸序列的多肽具有抗單純庖疹病毒活性。

在具體實施實施方案中,本發明提供了具有SEQ?ID?NO:1~25之一所示的
氨基酸序列的多肽。其中具有SEQ?ID?NO:1所示氨基酸序列的多肽為
AHSVP1。AHSVP1的前體組織形式編碼70個氨基酸殘基,由三個部分組成,
即信號肽(23個殘基)、成熟肽(13個殘基)和前體肽(34個殘基),如圖1
所示,其中,cDNA序列下方為推斷的對應氨基酸序列;信號肽氨基酸以斜體
標記;成熟肽氨基酸為陰影部分氨基酸;下劃線部分氨基酸為C端前體肽。

本發明還提供了本發明所述具有SEQ?ID?NO:1~25之一所示的氨基酸序
列的多肽一個或多個氨基酸殘基被甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化修飾所
得到的氨基酸序列的且具有抗單純皰疹病毒活性的多肽。所述的氨基酸被甲
基化、糖基化、磷酸化、乙酰化修飾,可以在氨基酸序列任意位點進行,只
要具有改造后的氨基酸序列的多肽具有抗單純庖疹病毒活性即可。類似的,
所述被甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化修飾的氨基酸的數目也是任意的,
只要具有改造后的氨基酸序列的多肽具有抗單純庖疹病毒活性。

本發明也提供了編碼本發明所述多肽的DNA分子。由于密碼子的簡并
性,可以存在很多種能夠編碼本發明所述的特定多肽的核苷酸序列。對于編
碼本發明所述多肽的DNA分子,本領域技術人員可以很容易的利用現有公知
的方法制造合成。諸如,通過選擇對應于構成所設計的氨基酸序列的氨基酸
殘基的密碼子,可很容易地確定和提供相應于抗菌性多肽的氨基酸序列的
DNA分子。

在一個實施方案中,本發明提供了可以編碼具有SEQ?ID?NO:1所示氨基
酸序列的多肽AHSVP1的DNA分子,其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:26所示。

在其它實施方案中,本發明還提供了可以編碼具有SEQ?ID?NO:2~25所示
氨基酸序列的多肽的DNA分子。

實驗表明,本發明所述多肽對單純皰疹病毒增殖具有高效抑制作用,對
單純皰疹病毒的IC50小于2μg/mL。因此本發明提供了所述多肽在制備治療或預
防單純皰疹相關疾病藥物中的應用,所述單純皰疹相關疾病具體為單純皰疹、
口唇皰疹或生殖器皰疹。

本發明還提供了一種治療皰疹的藥物制劑,包括治療有效量的本發明所
述多肽中的一種或幾種和藥學上可接受的輔料。本領域技術人員可將所述抗
單純皰疹病毒多肽直接或間接加入制備不同劑型時所需的藥學上可接受的各
種常用輔料,如崩解劑、潤滑劑、乳化劑、粘合劑等,以常規藥物制劑方法,
制成抗病毒常用制劑如口服液、注射液、顆粒劑、片劑、丸劑、散劑、膠囊
劑、滴丸劑、軟膏劑和凝膠劑等。

在實施方案中,本發明所述治療皰疹的藥物制劑為凝膠劑,由于可直接
作用于病灶,利于藥物釋放,且使用方便,涂布性好,不妨礙皮膚正常功能,
該劑型深受臨床患者的青睞。

本發明提供的凝膠劑中本發明所述多肽含量可在廣泛的限度內變化,具
體含量取決于有待治療的疾病的嚴重性、施用的模式和時間等。優選的,本
發明所述凝膠劑中包括0.5wt%本發明所述抗單純皰疹病毒多肽中的一種或幾
種。

在具體實施方案中,本發明提供的所述凝膠劑還包括10wt%的丙二醇、
20wt%的乙醇、15wt%的羥甲基纖維素、1wt%的三乙醇胺、0.1wt%的羥
苯乙酯和53.4wt%的無菌水。

本發明經臨床療效觀察,在100例單純皰疹患者中,用本發明所述凝膠劑
涂抹2天后有效率可達42%,用藥第4、6和10天時有效率達到86%、98%和100%。
本發明還分別針對口唇皰疹和生殖皰疹進行了臨床療效觀察,結果顯示本發
明所述含有AHSVP1或其同源結構多肽的治療皰疹的凝膠制劑對治療口唇皰
疹和生殖皰疹有效率達到100%。

本發明提供了抗單純皰疹病毒多肽。試驗表明本發明所述多肽對單純皰
疹病毒增殖具有高效抑制作用,可用于制備治療或預防單純皰疹相關疾病藥
物。本發明提供的以抗單純皰疹病毒多肽為有效成分的治療單純皰疹病毒引
起皰疹的藥物制劑,用于治療皰疹見效明顯,治療效果顯著,對治療單純皰
疹、口唇皰疹、生殖皰疹等有效率達到100%,且無毒副作用,治愈后不復發。

附圖說明

圖1示抗單純皰疹病毒活性多肽AHSVP1?cDNA序列及其氨基酸序列,其
中,cDNA序列下方為推斷的對應氨基酸序列;信號肽氨基酸以斜體標記;成
熟肽氨基酸為陰影部分氨基酸;下劃線部分氨基酸為C端前體肽;

圖2示抗單純皰疹病毒活性多肽AHSVP1及其部分結構同源多肽的雙親
性結構圖;

圖3示抗單純皰疹病毒活性多肽AHSVP1色譜圖;

圖4示抗單純皰疹病毒活性多肽AHSVP1質譜圖;

圖5示抗單純皰疹病毒活性多肽AHSVP1抗HSV-1濃度依賴效應,其中
橫坐標為AHSVP1多肽濃度(μg/mL),縱坐標為相應濃度的多肽處理后病
毒的噬斑形成百分比。

具體實施方式

本發明實施例公開了抗單純皰疹病毒活性多肽及其用途。本領域技術人
員可以借鑒本文內容,適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是,所有類
似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的,它們都被視為包括在
本發明。本發明的產品和應用已經通過較佳實施例進行了描述,相關人員明
顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的產品和應用進行改動
或適當變更與組合,來實現和應用本發明技術。

為了進一步理解本發明,下面結合實施例對本發明進行詳細說明。

實施例1:抗單純皰疹病毒多肽基因的制備

取40只西藏琵蝎(Scorpops?tibetanus)蝎尾腺,用Trizol試劑(Invitrogen)
提取總RNA,提取方法參照Trizol試劑盒說明書。用Poly?A?Tract?mRNA分離
系統(Promega,USA)和純化mRNA,并采用Superscript?Plasmid?System?cDNA?
library?construction?kit(Gibco/BRL)試劑盒構建西藏琵蝎毒腺組織cDNA文庫。
將cDNA克隆到pSPORT1載體中,并轉化大腸桿菌DH5α。隨機從構建好的西
藏琵蝎毒腺cDNA文庫中挑選2000克隆子,對測序的結果進行序列分析,采
用CLUSTAL?X?1.8(Thompson?et?al.,1997)和PC/GENE(Intelligenetics?Inc.,
Switzerland)軟件進行同源性比較和信號肽切割位點預測,獲得具有編碼抗單
純皰疹病毒活性多肽AHSVP1的cDNA基因,所編碼的成熟肽為具有如SEQ?ID?
NO:1氨基酸序列的抗單純皰疹病毒多肽AHSVP1。AHSVP1的前體組織形式
編碼70個氨基酸殘基,由三個部分組成,即信號肽(23個殘基)、成熟肽(13
個殘基)和前體肽(34個殘基)。

實施例2:AHSVP1多肽的結構分析及其同源結構雙親性多肽

根據SEQ?ID?NO:1所示的AHSVP1的成熟肽序列FIRKIARLLKRIF,即
Phe?Ile?Arg?Lys?Ile?Ala?Arg?Leu?Leu?Lys?Arg?Ile?Phe,使用在線NPSserver
[DSC法(Discrimination?of?protein?Secondary?structure?Class)]對其進行二
級結構預測,并利用軟件AHTHEPROT?2000繪制其二級結構圖像,結果見圖
2。二級結構圖顯示AHSVP1含有100%的α-Helix結構,具有典型的兩親性
(amphiphilic)α-Helix結構,含有大量帶凈正電荷的堿性殘基(Arg和Lys)。
然后根據AHSVP1螺旋圖對AHSVP1多肽序列進行大量點突變和缺失,各序
列見表1。

表1:抗單純皰疹病毒多肽AHSVP1及其結構同源多肽

??SEQ?IDNO.
??多肽名稱
??氨基酸序列
??突變性質
?a螺旋值
??1
??AHSVP1
??FIRKIARLLKRIF
??野生型
?100%
??2
??AHSVP1-R3K
??FIKKIARLLKRIF
??堿性
?100%
??3
??AHSVP1-R3H
??FIHKIARLLKRIF
??堿性
?100%
??4
??AHSVP1-K4A
??FIRAIARLLKRIF
??非極性
?100%
??5
??AHSVP1-K4D
??FIRDIARLLKRIF
??酸性
?100%
??6
??AHSVP1-K4R
??FIRRIARLLKRIF
??堿性
??100%
??7
??AHSVP1-K4S
??FIRSIARLLKRIF
??極性中性
??100%
??8
??AHSVP1-R7K
??FIRKIAKLLKRIF
??堿性
??100%
??9
??AHSVP1-R7H
??FIRKIAHLLKRIF
??堿性
??100%
??10
??AHSVP1-K10A
??FIRKIARLLARIF
??非極性
??100%
??11
??AHSVP1-K10D
??FIRKIARLLDRIF
??酸性
??100%
??12
??AHSVP1-K10R
??FIRKIARLLRRIF
??堿性
??100%
??13
??AHSVP1-K10S
??FIRKIARLLSRIF
??極性中性
??100%
??14
??AHSVP1-R11K
??FIRRIARLLKKIF
??堿性
??100%
??15
??AHSVP1-R11H
??FIRRIARLLKHIF
??堿性
??100%
??16
??AHSVP1-16
??FIIRLLRIF
??缺失、堿性
??100%
??17
??AHSVP1-17
??FIKIRLLRIF
??缺失、堿性
??100%
??18
??AHSVP1-18
??FIRIKLLRIF
??缺失、堿性
??100%
??19
??AHSVP1-19
??FIRIRLLKIF
??缺失、堿性
??100%
??20
??AHSVP1-20
??FIRIHLLRIF
??缺失、堿性
??100%
??21
??AHSVP1-21
??FIRIRLRIF
??缺失、堿性
??100%
??22
??AHSVP1-22
??FIKIRLRIF
??缺失、堿性
??100%
??23
??AHSVP1-23
??FIRIKLRIF
??缺失、堿性
??100%
??24
??AHSVP1-24
??FIRIRLKIF
??缺失、堿性
??100%
??25
??AHSVP1-25
??FIRIHLRIF
??缺失、堿性
??100%

由表1結果可見氨基酸序列為PheIleX1X2IleAlaX3LeuLeuX4X5IlePhe、
PheIleX6IleX7LeuLeuX8IlePhe或PheIleX9IleX10LeuX11IlePhe的AHSVP1同源結
構多肽,并不影響其雙親性的特征,其中X1、X3和X5~11獨立選自Arg、Lys或His;
X2和X4為任意氨基酸。

實施例3?化學合成AHSVP1多肽及其同源結構雙親性多肽

根據AHSVP1(Phe?Ile?Arg?Lys?Ile?Ala?Arg?Leu?Leu?Lys?Arg?Ile?Phe)及其
同源結構雙親性多肽的氨基酸序列進行人工合成。固相化學合成方法獲得了
高純度的AHSVP1多肽及其同源結構雙親性多肽。對制得AHSVP1多肽進行
純度檢測,結果見圖3和圖4。AHSVP1同源結構多肽的檢測結果未顯示。

實施例4:AHSVP1多肽及其同源結構雙親性多肽的細胞毒性檢測

按照3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法(MTT法)檢測
AHSVP1及其同源結構雙親性多肽的細胞毒性。Vero細胞消化計數,按
7000~10000/孔接種至96孔板,37℃,5%CO2培養24h。將AHSVP1多肽或其
同源結構雙親性多肽進行梯度稀釋,加入到細胞培養基中,使之終濃度分別
為25、50、75、100、150、200、250μg/mL,每個濃度設3~5個重復孔,37℃,
5%CO2培養48h。取出培養板,每孔加入5mg/mL(PBS配制,即0.5%MTT)
的MTT溶液20μL,輕搖混勻,37℃,5%CO2孵育4h。吸去培養基,每孔加入
100μL二甲基亞砜(DMSO),室溫震搖20min,使結晶紫沉淀完全溶解,用
酶標儀在570nm波長下檢測各孔吸光值,計算細胞存活率。同時設置調零孔
(含培養基、MTT和DMSO),對照孔(含有Vero細胞、相同濃度的藥物溶
解介質、培養基、MTT和DMSO)。

結果顯示,AHSVP1及其同源結構雙親性多肽的細胞毒性的CC50均大于
100μg/mL。

實施例5:AHSVP1多肽及其同源結構雙親性多肽的溶血性檢測

取健康人抗凝血(由武漢大學校醫院提供),離心收集血細胞,用1×Hepes
(pH7.2)洗2~3次,1200g離心10min,血細胞用生理鹽水重懸計數,以107~108/
孔加至96孔板。然后將AHSVP1多肽或其同源結構雙親性多肽進行梯度稀釋,
加入到細胞培養基中,使之終濃度分別為25、50、75、100、150、200、250μg/mL,
以生理鹽水和Triton?X-100作為陰性和陽性對照,每個濃度設3~5個重復孔,
37℃孵育30~60min,1000g離心5min,取上清100μL,用酶標儀在570nm波
長下檢測吸光值,計算溶血率。。

結果顯示,AHSVP1及其同源結構雙親性多肽的溶血性HC50均大于
250μg/mL。

實施例6:AHSVP1多肽及其同源結構雙親性多肽對單純皰疹病毒抑制效應

試驗材料:Vero細胞,購自武漢大學典型培養物保藏中心;培養基為MEM
培養基,含有10%(傳代培養基)或2%(維持培養基)胎牛血清(FBS,GIBCO)、
2mM/mL左旋谷氨酸鹽、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素,培養條件為
37℃,5%CO2培養箱培養;病毒株為單純皰疹病毒HSV(F株)和I單純皰疹
病毒HSV-2,購自中國科學院武漢病毒所保藏中心。

單純皰疹病毒HSV的擴增:取Vero細胞培養至匯合度70~80%,吸出培養
基,加入HSV病毒稀釋液,37℃吸附約2h,補充2%FBS-MEM培養基至正常
培養體積,置37℃,5%CO2培養。約48~72h后,待細胞單層出現80~90%病
變,反復凍融3~5次,收集細胞及上清至離心管中,4℃3000~4000rpm離心
10min,除去細胞碎片,上清分裝,-80℃保存備用。病毒儲存液的滴度以蝕斑
法測定。

AHSVP1多肽及其同源結構雙親性多肽對HSV感染抑制的劑量關系檢測:
將Vero細胞接種96孔板,37℃,5%CO2培養24h,至細胞匯合度達到70~80%。
將AHSVP1多肽或其同源結構雙親性多肽進行連續兩倍稀釋,濃度梯度為0、
0.625、1.25、2.5、5、10μg/mL,然后將HSV病毒儲存液進行連續稀釋,按相
同PFU的感染劑量分別與不同濃度AHSVP1多肽或其同源結構雙親性多肽混
合孵育2h,無血清培養基洗細胞三次后,加入病毒與多肽混合液,37℃感染
吸附約2h,移除病毒液,用無血清培養基清洗三次,除去游離病毒,分別添
加含對應濃度多肽的細胞覆蓋層(2×MEM,含4%FBS,使用前與等體積1.5%
低熔點瓊脂糖混勻,成為含2%FBS的細胞維持液),置37℃,5%CO2培養約
72h后,棄去細胞培養液,然后每孔加入2mL?1%結晶紫染液(含10%甲醛)
染色2min。觀察并計錄蝕斑的形態、大小、數目,計算AHSVP1多肽和其同
源結構雙親性多肽對HSV的抗病毒效應。

計算方法:空斑形成單位(PFU/mL)=每孔平均空斑數×病毒稀釋度/每孔
接種病毒量。不同濃度AHSVP1多肽抑制HSV噬斑形成效應如圖5,AHSVP1
同源結構雙親性多肽抑制HSV噬斑形成效應如表2所示。

表2?AHSVP1多肽及其同源結構雙親性多肽對單純皰疹病毒的抑制效應

??SEQ?IDNO.
??多肽名稱
??氨基酸序列
?HSV-1(μg/mL)
?HSV-2(μg/mL)
??1
??AHSVP1
??FIRKIARLLKRIF
?0.8
?0.9
??2
??AHSVP1-R3K
??FIKKIARLLKRIF
?1.4
?1.5
??3
??AHSVP1-R3H
??FIHKIARLLKRIF
?1.9
?1.5
??4
??AHSVP1-K4A
??FIRAIARLLKRIF
?1.8
?1.3
??5
??AHSVP1-K4D
??FIRDIARLLKRIF
?1.0
?1.6
??6
??AHSVP1-K4R
??FIRRIARLLKRIF
?1.1
?1.8
??7
??AHSVP1-K4S
??FIRSIARLLKRIF
?1.1
?0.9
??8
??AHSVP1-R7K
??FIRKIAKLLKRIF
?0.8
?1.0
??9
??AHSVP1-R7H
??FIRKIAHLLKRIF
?0.9
?0.9
??10
??AHSVP1-K10A
??FIRKIARLLARIF
?0.9
?0.9
??11
??AHSVP1-K10D
??FIRKIARLLDRIF
?1.0
?1.0
??12
??AHSVP1-K10R
??FIRKIARLLRRIF
?0.9
?0.9
??13
??AHSVP1-K10S
??FIRKIARLLSRIF
?1.4
?1.9
??14
??AHSVP1-R11K
??FIRRIARLLKKIF
?1.4
?1.9
??15
??AHSVP1-R11H
??FIRRIARLLKHIF
?1.7
?1.9
??16
??AHSVP1-16
??FIRIRLLRIF
?1.1
?1.5
??17
??AHSVP1-17
??FIKIRLLRIF
?1.2
?0.9
??18
??AHSVP1-18
??FIRIKLLRIF
?0.8
?1.0
??19
??AHSVP1-19
??FIRIRLLKIF
?0.9
?0.9
??20
??AHSVP1-20
??FIRIHLLRIF
?0.9
?0.9
??21
??AHSVP1-21
??FIRIRLRIF
?1.0
?1.0
??22
??AHSVP1-22
??FIKIRLRIF
?0.9
?0.9
??23
??AHSVP1-23
??FIRIKLRIF
?1.4
?1.9
??24
??AHSVP1-24
??FIRIRLKIF
?1.4
?1.9
??25
??AHSVP1-25
??FIRIHLRIF
?1.7
?1.9

由圖5和表2結果可見AHSVP1多肽及其同源結構雙親性多肽對單純皰
疹病毒具有抑制效應,對HSV噬斑形成效應的半數抑制濃度均小于2μg/mL。

實施例7:本發明所述治療皰疹的凝膠劑

處方:AHSVP1多肽或其同源結構雙親性多肽0.5g、丙二醇10g、乙醇
20g、羥甲基纖維素1.5g、三乙醇胺1g、羥苯乙酯0.1g,無菌水加至100g。

制備:將羥甲基纖維素灑于無菌水液面(60mL左右),隔夜后成為凝膠
劑基質,靜置后真空脫泡,將AHSVP1多肽或其同源結構雙親性多肽、丙二
醇、乙醇、三乙醇胺和羥苯乙酯混勻,緩慢加入到漿料中混勻,緩慢攪拌,
以避免劇烈攪拌混入過多氣泡,分裝,即得本發明所述治療皰疹凝膠劑。

空白對照凝膠劑:制劑中除了不含有AHSVP1多肽或其同源結構雙親性
多肽外,其余處方和制備同本發明所述治療皰疹凝膠劑。

實施例8:本發明所述治療皰疹的凝膠劑對單純皰疹病毒的抑制作用

將實施例7制備的凝膠劑按照1∶49的比例溶解在滅菌的生理鹽水中,并
進行等比稀釋10個濃度,置于4℃冰箱備用。按照實施例6所述方法對本發
明所述治療皰疹的對HSV感染的抑制作用進行檢測,觀察并計錄蝕斑的形態、
大小、數目,計算含有AHSVP1或其同源結構多肽的凝膠制劑對HSV的抗病
毒效應,所述凝膠劑按照制劑中有效成分抗單純皰疹病毒多肽AHSVP1或其
結構同源多肽計算,結果見表3。

表3?本發明所述治療皰疹的凝膠制劑對單純皰疹病毒的抑制效應

??SEQ?IDNO.
??多肽名稱
??HSV-1(μg/mL)
??HSV-2(μg/mL)
??1
??AHSVP1
??0.8
??0.9
??2
??AHSVP1-R3K
??1.4
??1.5
??3
??AHSVP1-R3H
??1.9
??1.5
??4
??AHSVP1-K4A
??1.8
??1.3
??5
??AHSVP1-K4D
??1.0
??1.6
??6
??AHSVP1-K4R
??1.1
??1.8
??7
??AHSVP1-K4S
??1.1
??0.9
??8
??AHSVP1-R7K
??0.8
??1.0
??9
??AHSVP1-R7H
??0.9
??0.9
??10
??AHSVP1-K10A
??0.9
??0.9
??11
??AHSVP1-K10D
??1.0
??1.0
??12
??AHSVP1-K10R
??0.9
??0.9
??13
??AHSVP1-K10S
??1.4
??1.9
??14
??AHSVP1-R11K
??1.4
??1.9
??15
??AHSVP1-R11H
??1.7
??1.9
??16
??AHSVP1-16
??1.1
??1.5
??17
??AHSVP1-17
??1.2
??0.9
??18
??AHSVP1-18
??0.8
??1.0
??19
??AHSVP1-19
??0.9
??0.9
??20
??AHSVP1-20
??0.9
??0.9
??21
??AHSVP1-21
??1.0
??1.0
??22
??AHSVP1-22
??0.9
??0.9
??23
??AHSVP1-23
??1.4
??1.9
??24
??AHSVP1-24
??1.4
??1.9
??25
??AHSVP1-25
??1.7
??1.9

由表3結果可見本發明所述含有AHSVP1或其同源結構多肽的治療皰疹
的凝膠制劑對HSV噬斑形成效應的半數抑制濃度均小于2μg/mL。

實施例9:本發明所述治療皰疹的凝膠劑對皰疹患者的臨床治療試驗

病例選擇:病人均來自武漢大學人民醫院皮膚科門診經臨床確診的單純
皰疹患者。排除使用過其他抗病毒藥物者、嚴重的肝腎功能不全者以及孕婦
哺乳期婦女。

實驗分組:將200例病人采用多中心開放平行對照觀察方法,分為實驗
組、對照組。實驗組:100人,男性52人,女性48人,年齡18歲到42歲;
對照組:100人,男性53人,女性47人,年齡19歲到41歲。2組間年齡性
別、病期以及皮損程度等各項指標值相比,差異均無明顯意義,具有可比性。

實驗方法:實驗組給予本發明所述治療皰疹的凝膠劑;對照組給予3%阿
昔洛韋ACV軟膏。用藥方法為用溫熱水和皂液或硫磺藥皂洗臉,將面部油灰
充分洗凈,再用棉簽蘸藥,反復輕輕涂抹于患處,每日早晚各涂抹一次,連
續2周為一療程。

療效觀察:用藥2天時,實驗組有效率為42%,高于對照組(7%)。在
用藥的第4、6和10天時,實驗組有效率分別為86%,98%和100%,而對照
組的有效率僅為32%、43%和53%。兩組間有效率差異明顯,而且實驗組比
對照組起效快,實驗組丘疹停止出現時間和疼痛緩解時間較對照組短
(P<0.01),實驗組水皰停止出現時間及瘙癢緩解時間也早于對照組(P<0.01)。
實驗組完全結痂時間比對照組短(P<0.01)。

不良反應:實驗組100例患者中無1例不良反應。對照組100例患者中
有5例涂藥后局部灼熱感,潮紅停藥后,自行緩解,未作處理。此外,實驗
組治療前后共觀察了12例血尿常規、14例肝功,8例腎功能檢查,均無異常
改變。

結果表明,本發明所述治療皰疹的凝膠劑治療單純皰疹較阿昔洛韋軟膏
起效快、程療短,且無毒副作用。

以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當
指出,對于本技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明原理的前提下,
還可以對本發明進行若干改進和修飾,這些改進和修飾也落入本發明權利要
求的保護范圍內。









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