鬼佬大哥大
  • / 10
  • 下載費用:30 金幣  

一類N不飽和脂肪酸酰化殼寡糖及其制備和應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201010604246.1

申請日:

2010.12.24

公開號:

CN102532207B

公開日:

2014.11.26

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效號牌文件類型代碼:1604號牌文件序號:101322509938IPC(主分類):C07H 5/06專利申請號:2010106042461申請日:20101224|||公開
IPC分類號: C07H5/06; A61K31/722; A61P9/12; A61P3/10; A61P35/00; A61P9/10; A01N43/16; A01P21/00; A01P1/00; A23L1/09 主分類號: C07H5/06
申請人: 大連中科格萊克生物科技有限公司
發明人: 杜昱光; 劉啟順; 喬瑩; 張紅艷; 白雪芳; 崔剛
地址: 116023 遼寧省大連市中山路595號星海大廈A座2301室
優先權:
專利代理機構: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002 代理人: 馬馳
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201010604246.1

授權公告號:

102532207B||||||

法律狀態公告日:

2014.11.26|||2012.09.05|||2012.07.04

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一類N-不飽和脂肪酸酰化殼寡糖及其制備和應用,其為混合組分,分子量為800-15000Da,混合組分的脫乙酰度為50%-100%;N-不飽和脂肪酸的取代度為30-100%,其組成成分的結構同時如下:其中R為碳鏈長度為12-22的不飽和脂肪酸酰基、H或CH3CO-,n=0-30。其具抗氧化、延緩衰老、抑制腫瘤、抗炎、降血壓、防止血栓形成、改善糖尿病、降血糖、抗動脈粥樣硬化以及促進植物生長和誘導植物抗病毒等活性;可作為醫藥、保健食品、化妝品和生物農藥的重要原料。

權利要求書

1: 一 類 N- 不 飽 和 脂 肪 酸 酰 化 殼 寡 糖, 其特征在于 : 其 為 混 合 組 分, 脫乙酰度為 50% -100% ; N- 不飽和脂肪酸的取代度為 30-100%, 其組成成分的結構同時如下 : 其中 R 為碳鏈長度為 12-22 的不飽和脂肪酸酰基、 H 或 CH3CO-, n = 0-30, 重均分子量 為 800-15000Da。
2: 一種權利要求 1 所述 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的制備方法, 其特征在于 : 1) 不飽和脂肪酸對硝基苯酯的制備 取碳鏈長度為 12-22 的不飽和脂肪酸溶于有機溶劑中, 加對硝基苯酚, 攪拌, 加入二甲 胺基吡啶, 滴加溶于有機溶劑的催化劑溶液, 濃度 1% -50%, 滴完后在 60-70℃下加熱條件 下反應 2-6h, 過濾, 濾液傾入冰水中, 析出白色固體, 過濾, 重結晶, 得到不飽和脂肪酸對硝 基苯酯 ; 其中催化劑、 硝基苯酚和不飽和脂肪酸的摩爾比為 1-1.5 ∶ 1-2 ∶ 1, 二甲胺基吡 啶的用量為不飽和脂肪酸摩爾數的 1% -20% ; 所述催化劑為 N, N′ - 二環己基碳二亞胺、 N, N′ - 二異丙基碳二亞胺或 1-(3- 二甲氨 基丙基 )-3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽 ; 2) 酯的氨解 不飽和 取殼寡糖溶于有機溶劑中, 濃度為 1% -40%, 加入不飽和脂肪酸對硝基苯酯, 脂肪酸對硝基苯酯與殼寡糖的氨基摩爾比為 1-2 ∶ 1, 在 60-70℃下反應 2-10 小時, 向反應 液加入反應液體積 1-8 倍的乙醚、 丙酮、 乙醇、 甲醇、 或 0.01-1.5 摩爾 / 升 NaOH 的乙醇或甲 醇溶液, 產生大量黃色沉淀, 抽濾, 濾餅用無水丙酮、 乙醚、 乙醇或甲醇洗 1-5 次, 得黃色粉 末, 真空干燥, 得到 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖粉末固體。
3: 按照權利要求 2 所述的制備方法, 其特征在于 : 步驟 1) 和 2) 中所述有機溶劑為 : N, N- 二甲基甲酰胺 (DMF)、 吡啶、 二甲亞砜、 二氯甲烷 中的一種或二種以上混合 ; 步驟 1) 重結晶過程可采用無水乙醇、 甲醇、 氯仿、 二氯甲烷或丙 酮進行。
4: 一種權利要求 1 所述 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的制備方法, 其特征在于 : 取殼寡糖溶于有機溶劑中, 濃度為 1% -40%, 有機溶劑為 N, N- 二甲基甲酰胺、 N, N- 二 甲基甲酰胺、 二甲亞砜中一種或二種以上混合 ; 再加入二甲胺基吡啶, 加入量為殼寡糖摩爾 數的 0.5% -10%; 加入殼寡糖摩爾數 1-8 倍的有機醇, 有機溶劑為甲醇、 乙醇、 正丁醇、 仲丁 醇、 乙二醇、 甘油中一種或二種以上混合 ; 在加入碳鏈長度為 12-22 的不飽和脂肪酸的有機溶劑的溶液, 1% -99%, 加入量為殼 寡糖中氨基摩爾數的 1-2 倍, 有機溶劑為 N, N- 二甲基甲酰胺、 N, N- 二甲基甲酰胺、 二甲亞 砜, 甲醇、 乙醇、 二氯甲烷和四氫呋喃中一種或二種以上混合 ; 將上述溶液在 40-80℃下反應 1-10 小時, 向反應液加入其體積 1-8 倍的乙醚、 丙酮、 乙 醇、 甲醇、 或 0.01-1.5 摩爾 / 升 NaOH 的乙醇或甲醇溶液, 產生大量黃色沉淀, 抽濾, 濾餅用 無水丙酮、 乙醚、 乙醇或甲醇洗 1-5 次, 得黃色粉末, 真空干燥, 得到 N- 不飽和脂肪酸酰化殼 2 寡糖粉末固體。
5: 按照權利要求 4 所述的制備方法, 其特征在于 : 于反應體系加入不飽和脂肪酸后再加入催化劑, 其加入量為不飽和脂肪酸摩爾數的 1-3 倍, 所述催化劑為 N, N′ - 二環己基碳二亞胺、 N, N′ - 二異丙基碳二亞胺或 1-(3- 二 甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
6: 一種權利要求 1 所述 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的應用, 其特征在于 : 所述 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖作為活性成份用于制備降血壓藥物、 延緩衰老保健 食品、 改善糖尿病保健藥物、 抑制腫瘤保健藥物、 抗炎癥藥物、 抗動脈粥樣硬化藥物或抗氧 化食品。
7: 一種權利要求 1 所述 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的應用, 其特征在于 : 所述 N- 不 飽和脂肪酸酰化殼寡糖作為活性成份用于制備促進植物生長劑、 或誘導植物抗病性制劑。

說明書


一類 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖及其制備和應用

    技術領域 本發明涉及 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖, 具體的說是 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡 糖及其制備方法和應用。
     背景技術 殼寡糖, 其結構為 β-(1, 4)-2- 脫氧 -2- 氨基葡萄寡糖。是一種難得又有著特殊 理化性質和優良生物活性的堿性寡糖。殼寡糖所具有的降血糖、 降血酯, 降膽固醇, 增強免 疫功能, 抑制腫瘤和抗疲勞、 延緩衰老, 抑菌, 抗病毒等作用, 已應用于醫藥、 保健食品、 化妝 品、 農業等方面。
     不飽和脂肪酸根據其雙鍵數目的多少分為單不飽和脂肪酸以及多不飽和脂肪 酸 . 單不飽和脂肪酸, 是指碳鏈中含有一個雙鍵的脂肪酸 . 多不飽和脂肪酸指碳鏈中含有 多個雙鍵的脂肪酸, 根據第一個雙鍵距離甲基端碳原子的位置, 可以分為 ω-3 系、 ω-6 系、 ω-7 系和 ω-9 系。
     單不飽和脂肪酸中的肉豆蔻油酸、 棕櫚油酸、 油酸 ; ω-3 系列的主要包括十八碳 三烯酸 ( 俗稱 α- 亞麻酸 )(ALA) ; 二十碳五烯酸 (EPA) ; 二十二碳六烯酸 (DHA)。
     ω-6 系列包括十八碳二烯酸 ( 俗稱亞油酸, LA) ; 十八碳三烯酸 ( 俗稱 Y 一亞麻酸, GLA) ; 二十碳四烯酸 ( 俗稱花生四烯酸, AA)。研究表明以上單不飽和脂肪酸和多不飽和脂 肪酸均有多種生物活性, 如抗氧化、 延緩衰老、 抑制腫瘤、 抗炎、 降血壓、 防止血栓形成、 改善 糖尿病、 降血糖和抗動脈粥樣硬化等活性。
     目前關于不飽和脂肪酸的食品、 保健品不少, 但也存在一些問題, 如活性不夠高 ; 另外, 不飽和脂肪酸一般都不夠穩定, 使用和存儲麻煩。
     本發明以具有多種生物活性的殼寡糖為原料, 將不飽和脂肪酸選擇性的連接到殼 寡糖的氨基上, 制備 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖。新化合物具有比兩種原料更好、 更廣的 活性 ; 此外, 新化合物使用方便, 具有很好的應用前景。
     發明內容 本發明的目的在于提供一種 N- 不飽和脂肪酰化殼寡糖及其制備和應用。
     為實現上述目的, 本發明采用的技術方案為 :
     一 類 N- 不 飽 和 脂 肪 酸 酰 化 殼 寡 糖, 其特征在于 : 混合組分的脫乙酰度為 50% -100% ; N- 不飽和脂肪酸的取代度為 30-100%, 其組成成分的結構同時如下 :
     其中 R 為碳鏈長度為 12-22 的不飽和脂肪酸酰基、 H 或 CH3CO-, n = 0-30, 重均分 子量為 800-15000Da。
     所述 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的制備方法, 其特征在于 :
     1) 不飽和脂肪酸對硝基苯酯的制備
     取碳鏈長度為 12-22 的不飽和脂肪酸溶于有機溶劑中, 加對硝基苯酚, 攪拌, 加入 二甲胺基吡啶, 滴加溶于有機溶劑的催化劑溶液, 濃度 1% -50%, 滴完后在 60-70℃下加熱 條件下反應 2-6h, 過濾, 濾液傾入冰水中, 析出白色固體, 過濾, 重結晶, 得到不飽和脂肪酸 對硝基苯酯 ; 其中催化劑、 硝基苯酚和不飽和脂肪酸的摩爾比為 1-1.5 ∶ 1-2 ∶ 1, 二甲胺 基吡啶的用量為不飽和脂肪酸摩爾數的 1% -20% ;
     所述催化劑為 N, N′ - 二環己基碳二亞胺、 N, N′ - 二異丙基碳二亞胺或 1-(3- 二 甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽 ;
     2) 酯的氨解
     取殼寡糖溶于有機溶劑中, 濃度為 1% -40%, 加入不飽和脂肪酸對硝基苯酯, 不 飽和脂肪酸對硝基苯酯與殼寡糖的氨基摩爾比為 1-2 ∶ 1, 在 60-70℃下反應 2-10 小時, 向 反應液加入反應液體積 1-8 倍的乙醚、 丙酮、 乙醇、 甲醇、 或 0.01-1.5 摩爾 / 升 NaOH 的乙醇 或甲醇溶液, 產生大量黃色沉淀, 抽濾, 濾餅用無水丙酮、 乙醚、 乙醇或甲醇洗 1-5 次, 得黃 色粉末, 真空干燥, 得到 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖粉末固體。 步驟 1) 和 2) 中所述有機溶劑為 : N, N- 二甲基甲酰胺 (DMF)、 吡啶、 二甲亞砜、 二氯 甲烷中的一種或二種以上混合 ; 步驟 1) 重結晶過程可采用無水乙醇、 甲醇、 氯仿、 二氯甲烷 或丙酮進行。
     所述 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的制備方法, 其特征在于 :
     取殼寡糖溶于有機溶劑中, 濃度為 1% -40%, 有機溶劑為 N, N- 二甲基甲酰胺、 N, N- 二甲基甲酰胺、 二甲亞砜中一種或二種以上混合 ; 再加入二甲胺基吡啶, 加入量為殼寡 糖摩爾數的 0.5% -10% ; 加入殼寡糖摩爾數 1-8 倍的有機醇, 有機溶劑為甲醇、 乙醇、 正丁 醇、 仲丁醇、 乙二醇、 甘油中一種或二種以上混合 ;
     在加入碳鏈長度為 12-22 的不飽和脂肪酸的有機溶劑的溶液, 1% -99%, 加入量 為殼寡糖中氨基摩爾數的 1-2 倍, 有機溶劑為 N, N- 二甲基甲酰胺、 N, N- 二甲基甲酰胺、 二 甲亞砜, 甲醇、 乙醇、 二氯甲烷和四氫呋喃中一種或二種以上混合 ;
     將上述溶液在 40-80℃下反應 1-10 小時, 向反應液加入其體積 1-8 倍的乙醚、 丙 酮、 乙醇、 甲醇、 或 0.01-1.5 摩爾 / 升 NaOH 的乙醇或甲醇溶液, 產生大量黃色沉淀, 抽濾, 濾 餅用無水丙酮、 乙醚、 乙醇或甲醇洗 1-5 次, 得黃色粉末, 真空干燥, 得到 N- 不飽和脂肪酸酰 化殼寡糖粉末固體。
     所述于反應體系加入不飽和脂肪酸后再加入催化劑, 其加入量為不飽和脂肪酸摩 爾數的 1-3 倍, 所述催化劑為 N, N′ - 二環己基碳二亞胺、 N, N′ - 二異丙基碳二亞胺或 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
     所述 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖作為活性成份用于制備降血壓藥物、 延緩衰老 保健食品、 改善糖尿病保健藥物、 抑制腫瘤保健藥物、 抗炎癥藥物、 或抗動脈粥樣硬化藥物、 抗氧化食品。
     所述 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的應用, 其特征在于 : 所述 N- 不飽和脂肪酸酰化
     殼寡糖作為活性成份用于制備促進植物生長劑、 或誘導植物抗病性制劑。
     本發明具有如下優點 :
     本發明涉及一類 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖, 本化合物結構上以殼寡糖為主體, 在每個結構單元的氨基上接上不飽和脂肪酸。本化合物集合兩種活性分子的活性, 在系列 活性方面超過殼寡糖和不飽和脂肪酸的活性, 既具有殼寡糖本身具有的一系列生物活性, 又具有較好的抗氧化活性、 降血壓活性、 延緩衰老活性、 抗血栓活性、 改善糖尿病活性、 抑制 腫瘤活性、 抗炎癥活性、 抗動脈粥樣硬化活性、 促進植物生長活性、 誘導植物抗病性活性, 可 作為某些醫藥、 保健食品、 化妝品和生物農藥的重要原料。
     本發明提供的兩種 N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的制備方法, 均不需要對羥基進 行保護, 具有氨基選擇性, 縮短了反應時間 ; 此外, 本發明所介紹反應過程條件溫和, 對不飽 和脂肪酸結構無破壞, 操作過程簡單, 具有很強的應用前景。 具體實施方式
     下面結合實施實例對本發明做進一步說明 :
     實施例 1 : N- 亞油酸酰化殼寡糖的制備 ( 氨解法 ) :
     取 2.8g 亞油酸溶于 N, N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中, 加 2.7g 對硝基苯酚, 攪拌, 加入 0.1g 二甲胺基吡啶, 滴加 2.06g 二環己基碳二亞胺溶于 5mLDMF 的溶液, 滴完后在 60-70℃ 下加熱條件下反應 2 ~ 6h, 過濾, 濾液傾入冰水中, 析出白色晶體, 過濾, 用無水乙醇重結 晶, 得到亞油酸對硝基苯酯 2.0g, 酯的氨解 :
     取亞油酸對硝基苯酯 1.28g(3.2mmol) 溶于 30mL 無水二甲亞砜中, 加聚合度為 2-8 的殼寡糖 0.6g(3.1mmol)( 酯與寡糖的摩爾比為 1 ~ 2 ∶ 1( 按殼寡糖中氨基葡萄糖殘基計 算 ), 在 60-70℃下反應 4 小時, 向反應液加入乙醚 / 丙酮溶液 50 ~ 100mL(1 ∶ 1, v/v), 產 生大量黃色沉淀, 抽濾, 濾餅用無水丙酮洗 3 次, 得黃色粉末, 真空干燥, 得到 N- 亞油酸酰化 殼寡糖 0.7g, 粉末固體。
     紅 外 光 譜 (KBr) 主 要 吸 收 峰 (IR u, cm-1) : 3580 ~ 3390(OH, NH) ; 3095(HC = CH)2939 ; 2860(CH+CH2) ; 1700(C = C) ; 1680(amide-I band) ; 1651(amide- Ⅱ band) ; 1116, 1054, 1033((C-O) ; 891(β, C-H)。
     通過用核磁共振法測定亞油酸的取代度為 67%。
     實施例 2 : N- 亞油酸酰化殼寡糖的制備 ( 一步法 )
     取聚合度為 2-15 的殼寡糖 1.62g 溶于 30mL 的 N, N- 二甲基甲酰胺, 再加入 0.1g 二甲胺基吡啶, 加入 4mL 的甲醇 ; 取亞油酸 3.0g 溶于 N, N- 二甲基甲酰胺中, 加入上上述溶 液中 ; 在 60℃下反應 4 小時后, 向反應液加入其 5 倍體積的乙醇, 產生大量黃色沉淀, 抽濾, 濾餅用無水丙酮洗 3 次, 得黃色粉末, 真空干燥, 得到 N- 亞油酸酰化殼寡糖粉末固體。紅外 數據與實例 1 完全相同或基本相同。用核磁共振法測定取代度為 71%。
     實施例 3 : N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖的制備 ( 一步法 )
     取 1.62g 殼寡糖溶于 30mL 的 N, N- 二甲基甲酰胺, 再加入 0.1g 二甲胺基吡啶, 加入 4mL 的甲醇 ; 取亞油酸 3.5g 溶于 N, N- 二甲基甲酰胺中, 加入上上述溶液中 ; 在 60℃下反應 4 小時后, 向反應液加入其 5 倍體積的乙醇, 產生大量淺黃色沉淀, 抽濾, 濾餅用無水丙酮洗 3 次, 得黃色粉末, 真空干燥, 得到 N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖粉末固體。紅外光譜 (KBr)主要吸收峰 (IRu, cm-1) : 3580 ~ 3390(OH, NH) ; 3095(HC = CH)2939 ; 2860(CH+CH2) ; 1705(C = C) ; 1685(amide-I band) ; 1650(amide- Ⅱ band) ; 1116, 1054, 1033(C-O) ; 891(β, C-H)。 同; 用核磁共振法測定取代度為 68%。實施例 4 : 肉豆蔻油酸、 棕櫚油酸、 油酸、 十八碳三烯 酸、 二十碳五烯酸、 二十二碳六烯酸、 十八碳二烯酸、 十八碳三烯酸、 二十碳四烯酸等 N- 酰 化殼寡糖的制備
     按照實施例 1 和 2 的方法, 不飽和脂肪酸原料選為肉豆蔻油酸、 棕櫚油酸、 油酸、 十八碳三烯酸、 二十碳五烯酸、 二十二碳六烯酸、 十八碳二烯酸、 十八碳三烯酸、 二十碳四烯 酸, 可制備得到 N- 肉豆蔻油酸酰化殼寡糖、 N- 棕櫚油酸酰化殼寡糖、 N- 油酸酰化殼寡糖、 N- 十八碳三烯酸酰化殼寡糖、 N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖、 N- 二十二碳六烯酸酰化殼寡 糖、 N- 十八碳二烯酸酰化殼寡糖、 N- 十八碳三烯酸酰化殼寡糖、 N- 二十碳四烯酸酰化殼寡 糖。
     實施例 5 : N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的抗炎活性
     抗炎實驗 : 對炎癥因子的抑制作用
     實驗材料 : 內皮細胞株, N- 亞麻酸酰化殼寡糖, TNF-α
     細胞培養條件 : 在完全培養基 RPMI1640 培養液中添加 10%小牛血清、 100U/mL 青 霉素、 100μug/mL 鏈霉素 ; 37℃, CO2 體積含量為 5%的細胞培養箱培養。 藥物處理如下 :
     收集對數生長期細胞, 調整細胞培養密度為 1-2×106 個 /mL 分到細胞培養六 孔板中, 加入 (100mg/mL 及 200mg/mL) 的 N- 亞麻酸酰化殼寡糖處理 24 小時后, 再加入 TNF-α(20ng/mL), 處理 6 小時。隨后棄去細胞培養上清, 提取細胞 RNA, 進行逆轉錄 PCR, 擴 增條件為 : 94℃, 45 秒, 54℃, 45 秒, 72℃, 45 秒, 擴增 28 個循環以檢測白細胞介素 -6(IL-6) 基因水平的變化。 實驗結果表明, 相比于未處理組, 100mg/mL 及 200mg/mL 的 N- 亞麻酸酰化 殼寡糖使 IL-6 的生成量降低了 22%及 35%。實驗結果說明 N- 亞麻酸酰化殼寡糖可以降 低炎癥因子 IL-6 的產生, 具有抗炎活性。
     實施例 6 : N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的抗腫瘤活性
     實驗材料 : 肝癌細胞株, N- 花生四烯酸酰化殼寡糖
     細胞培養條件 : 在完全培養基 DMEM 培養液中添加 10%小牛血清、 100U/mL 青霉素、 100μg/mL 鏈霉素 ; 37℃, CO2 體積含量為 5%的細胞培養箱培養。
     藥物處理 :
     收集對數生長期細胞, 調整細胞密度為 1-2×106 個 /mL, 分別加入 200mg/mL 及 400mg/mL 的 N- 花生四烯酸酰化殼寡糖處理 24 小時后, 采用碘化丙錠 (PI) 染色法檢測細胞 凋亡情況。具體操作為 : 收集各組處理后的細胞, 棄去培養液 ; 用 PBS 洗滌 2 次 ; 隨后離心 棄去上清, 加入冰預冷的 70%的乙醇固定 2 小時。隨后再次離心棄去固定液, PBS 洗滌 2 遍 再加入 PI 染液染色, 4℃避光染色 30 分鐘, 通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗結果表明, 相比于未處理組, 100mg/mL 及 200mg/mL 的 N- 花生四烯酸酰化殼寡糖的肝癌細胞凋亡增加 62%及 79%。實驗結果說明, N- 花生四烯酸酰化殼寡糖可促使肝癌細胞凋亡增加, 從而發 揮抗癌作用效果。
     實施例 7 : N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的清除自由基活性
     抗氧化實驗 : DPPH 自由基清除實驗。
     實驗材料 : 二苯代苦味酰自由基 (DPPH), N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖。
     試劑配制 : DPPH 應用液, 稱取 DPPH3.5mg, 溶于甲醇 10ml, 再加水定溶至 100mL, 充 分混勻后避光保存。
     取 4 支試管, 分別標記為空白對照組, 200mg/mL 和 400mg/mL 的 N- 二十碳五烯酸酰 化殼寡糖實驗組及維生素 C 陽性對照組。分別加入 0.1mL 甲醇, 200ng/mL N- 二十碳五烯 酸酰化殼寡糖的甲醇溶液及 400ng/ml N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖的甲醇溶液及 100μg/ ml 維生素 C 甲醇溶液。隨后, 分別加入 200μL 的 DPPH 溶液, 搖勻, 在黑暗中放置 30 分鐘, 以甲醇組為空白對照組在 515nm 分別測定各組吸光度。 實驗結果表明, 200mg/mL 的 N- 二十 碳五烯酸酰化殼寡糖清除自由基為 67%, 而 400mg/mL 的 N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖對自 由基的清除能力與 100μg/mL 維生素 C 效果相當, 清除率為 83%。 實驗結果說明, 400mg/mL 的 N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖具有良好的自由基清除效果。
     實施例 8 : N- 不飽和脂肪酸的改善糖尿病活性
     實驗材料 : SD 大鼠誘導糖尿病模型 ; N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖。
     雄性 SD 大鼠隨機分為正常對照組, 模型誘導組, 300mg/kg N- 二十碳五烯酸酰化 殼寡糖實驗組, 500mg/kg N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖實驗組灌胃喂養 4 周, 每組 6 只, 注射 鏈脲霉素 (streptozotocin, STZ) 誘導糖尿病并繼續飼喂高糖高脂飼料, 自由飲水。 8 周后, 在大鼠尾部剪尾取血樣, 室溫放置不超過 30 分鐘, 2000 轉 / 分鐘離心 10 分鐘, 分離血清, 隨 后立即測定血糖。實驗結果表明, 與模型誘導組相比, 300mg/kg N- 二十碳五烯酸酰化殼寡 糖實驗組可使大鼠血糖降低 25%, 500mg/kg 的 N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖實驗組可使大 鼠血糖降低 37%。結果說明, N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖可使糖尿病模型大鼠血糖降低, 具有潛在的治療糖尿病的潛力。
     實施例 9 : N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的抗衰老活性
     實驗材料 : 成纖維細胞, N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖
     實驗方法 : 成纖維細胞在完全培養基 DMEM 培養液中添加 10%小牛血清、 100U/mL 青霉素、 100μg/mL 鏈霉素 ; 37℃, CO2 體積含量為 5%的細胞培養箱培養。
     主要操作如下 : 收集對數生長期細胞, 調整細胞密度為 1-2×104 個 / 孔接種于 6 孔 板, 2mL 培養液, 分別加入空白組生理鹽水, 100μg/ml 的 N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖生理 鹽水溶液及 200μg/mL 的 N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖生理鹽水溶液處理 24 小時后, 紫外 2 光 UVB 為光源 290nm, 照射劑量為 10mJ/cm , 共計照射 5 次。隨后采用 SAβ-gal 染色試劑 盒檢測。室溫下用 1mL 固定液固定細胞 15min, 再以染色液 37℃孵育過夜。陽性細胞被染 成藍綠色, 顯微鏡下計數 SAβ-gal 染色陽性的細胞, 每皿計數 400 個, 計算陽性細胞的百分 比。實驗結果表明, 空白照射組陽性細胞數為 82%, 100μg/mL 的 N- 二十碳五烯酸酰化殼 寡糖處理組使陽性細胞數降低到 69%, 200μg/mL 的 N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖處理組使 陽性細胞數降低到 45%。 實驗結果說明, 不同濃度的 N- 二十碳五烯酸酰化殼寡糖可使紫外 線誘導的衰老細胞數降低, 從而具有抗衰老潛能。
     實施例 10 : N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的抗動脈粥樣硬化活性
     實驗材料 : 臍靜脈內皮細胞, TNF-α, N- 二十二碳六烯酸酰化殼寡糖。
     主要操作如下 : 用 0.125%胰蛋白酶消化單層培養細胞, 用 DMEM-F12 培養液 (10% 6 FBS) 稀釋成細胞懸液后, 按 1-2×10 個 / 孔接種到細胞培養瓶中。將培養瓶放入 CO2 孵箱, 在 37℃、 5% CO2 及飽和濕度條件下培養 24h。對照組及 TNF-α 模型組加入 3ml 新鮮的 空白培養基 ; 各 N- 二十二碳六烯酸酰化殼寡糖預保護組分別加入含有不同濃度 N- 二十二 碳六烯酸酰化殼寡糖的培養液, 繼續培養 24h。取出培養瓶, 吸棄瓶內上清液, 以 PBS 洗滌 2 次, 對照組加入 3mL 空白培養液 ; TNF-α 模型組及各 N- 二十二碳六烯酸酰化殼寡糖預保 護組分別加入 3mL 含 TNF-α(20ng/mL) 的培養液。加藥完畢將細胞置于培養箱中繼續培養 6h。取出培養瓶, 吸棄瓶內上清液, 以 PBS 洗滌 2 次, 進行 RNA 抽提并進行 VCAM-1 及 ICAM-1 的 PCR 檢測。實驗結果表明, N- 二十二碳六烯酸酰化殼寡糖在 100μg/mL 及 200μg/mL 的 濃度范圍, 可顯著抑制 TNF-α 對人臍靜脈內皮細胞內 VCAM-1 及 ICAM-1 的轉錄, 抑制率為 42%和 68%。其中 N- 二十二碳六烯酸酰化殼寡糖在 200μg/mL 時的抑制作用最為明顯。 實驗結果表明, N- 二十二碳六烯酸酰化殼寡糖可抑制臍靜脈內皮細胞中粘附分子 VCAM-1 及 ICAM-1 的表達, 具有潛在抗動脈粥樣硬化潛力。
     實施例 11 : N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的降血壓活性
     ACE 可把 HHL 降解成馬尿酸和組氨酰亮氨酸, 通過高效液相色譜在 228nm 的波長下 檢測馬脲酸生成量來計算樣品對 ACE 活性的影響。
     實驗方法 : 流動相的配制 : 300mL 甲醇加入 0.5mL 冰醋酸和 1mL 的三氟乙酸 (TFA), 用蒸餾水定容至 1000mL, 后用 NaOH 調節 pH 至 3.3。 ACE 抑制活性測定 : 在 5μL 的 50mg/mL 的 N- 油酸酰化殼寡糖樣品, 加入 15μL 的 ACE, 5min 后再加入 25μL 底物, 30min 后加 5μL 的 TFA 終止反應, 上述操作過程全部在 37℃ 恒溫條件下進行。高效液相檢測 ACE 酶抑制活性為 78%。
     實施例 12 : N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖的降血壓活性
     選擇自發性高血壓大鼠為實驗模型, 大鼠飼養一周后, 將其分組, 用 100-800mg/kg 劑量的 N- 十八碳三烯酸酰化殼寡糖口服, 結果表明, 4 周后對照組大鼠的血壓持續升高, 而 治療組自發性高血壓大鼠的血壓明顯下降, 說明珠蛋白酶解液具有很好的降血壓效果。
     實施例 13 : N- 不飽和脂肪酸酰化殼寡糖對黃瓜種子發芽的影響
     試驗材料和方法 : 選取籽粒飽滿的黃瓜種子, 漂洗干凈, 用 10 %次氯酸鈉溶液 消毒 10min, 用蒸餾水沖洗干凈后在室溫條件下浸種 8h, 然后分別用水 (CK), 0.01mg/L、 0.10mg/L、 1.00mg/L、 100.00mg/L 的 N- 十八碳三烯酸酰化殼寡糖溶液在 25℃恒溫箱中浸泡 24h。每個處理 100 粒, 3 次重復。然后用蒸餾水沖洗 3 次, 置于鋪有 3 層濾紙的培養皿中, 加 10ml 蒸餾水, 在 (25±1)℃恒溫箱內黑暗環境下萌發, 以芽長超過種子長度的一半為發 芽標準, 第 3 天統計測定發芽勢, 第 7 天統計發芽率、 發芽指數及活力指數。
     N- 十八碳三烯酸酰化殼寡糖施用濃度對黃瓜種子發芽的影響
     N- 十八碳三烯酸酰化殼寡糖可顯著促進黃瓜種子發芽率的提高。從發芽勢上看, N- 十八碳三烯酸酰化殼寡糖在低濃度 0.1mg/L 時能夠促進黃瓜種子發芽。
     實施例 14 : N- 油酸酰化殼寡糖對黃瓜幼苗生長的影響
     試驗材料和方法 : 將黃瓜幼苗盆栽, 長至 2-4 片葉時進行第 1 次葉面噴施處理, 7 天后部分處理進行第 2 次葉面噴施。試驗共設置 10 個處理, 即處理 CK1( 清水對照噴施 1 次 )、 處理 CK2( 清水對照噴施 2 次 ) ; 處理 A1(0.01mg/L N- 油酸酰化殼寡糖噴施 1 次 )、 處 理 A2(0.01mg/LN- 油酸酰化殼寡糖噴施 2 次 ) ; 處理 B1(0.1mg/LN- 油酸酰化殼寡糖噴施 1 次 )、 處理 B2(0.1mg/L N- 油酸酰化殼寡糖噴施 2 次 ) ; 處理 C1(1mg/L N- 油酸酰化殼寡糖 噴施 1 次 )、 處理 C2(1mg/L N- 油酸酰化殼寡糖噴施 2 次 ) ; 處理 D1(100mg/LN- 油酸酰化殼 寡糖噴施 1 次 )、 處理 D2(100mg/LN- 油酸酰化殼寡糖噴施 2 次 ) ; 每處理 2 次重復 ; 每小區 20 株。處理后第 21 天測定植株生長指標。
     N- 乙酰氨基葡萄糖施用次數及濃度對黃瓜生長發育的影響
     N- 油酸酰化殼寡糖能夠顯著影響黃瓜幼苗的株高, 各處理株高由高到低的順序依 次為 : B > A > C > CK > D, 其中處理 B(0.1mg/L) 和處理 A(0.01mg/L) 顯著高于處理 C(1mg/ L) 顯著高于對照, 處理 D(100mg/L) 的株高顯著低于對照, 說明 N- 油酸酰化殼寡糖在低濃 度時 (0.01 ~ 1mg/L) 促進黃瓜株高生長。從功能葉面積和根長來看, 0.1mg/L 和 0.01mg/L 的 N- 油酸酰化殼寡糖能顯著促進黃瓜幼苗的葉面積和根長生長。
     實施例 15 : N- 二十碳四烯酸酰化殼寡糖對煙草抗煙草花葉病毒核酸 (TMV RNA) 侵 染力的影響
     試驗材料和方法 : 采用摩擦法接種進行 TMV 核酸接種。在枯斑三生煙苗長勢一致 的葉片上均勻噴灑 100 目金剛砂, 將提取的對照 TMV 核酸以及與混合不同濃度 N- 二十碳四 烯酸酰化殼寡糖的核酸, 分別接種到煙草葉柄的兩側葉片, 盡力做到用力一致, 待發病時,
     檢測病斑數。
     N- 二十碳四烯酸酰化殼寡糖對 TMV RNA 侵染力的影響
     N- 二十碳四烯酸酰化殼寡糖對 TMV RNA 的侵染能力的抑制呈濃度依賴關系, 當濃 度比為 1 ∶ 8 的時候, 殼寡糖季銨鹽對 TMV RNA 的侵染抑制效果最好。10

關 鍵 詞:
一類 不飽和 脂肪酸 酰化殼 寡糖 及其 制備 應用
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:一類N不飽和脂肪酸酰化殼寡糖及其制備和應用.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6418669.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大