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一種免疫增強劑、滅活疫苗及其制備方法.pdf

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一種 免疫 增強 疫苗 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310042983.0

申請日:

2013.02.04

公開號:

CN103083663B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 專利權的轉移IPC(主分類):A61K 39/39登記生效日:20180724變更事項:專利權人變更前權利人:江蘇省農業科學院變更后權利人:江蘇省農業科學院變更事項:地址變更前權利人:210014 江蘇省南京市孝陵衛鐘靈街50號變更后權利人:210014 江蘇省南京市孝陵衛鐘靈街50號變更事項:共同專利權人變更后權利人:南京吉升和化工科技有限公司|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 39/39申請日:20130204|||公開
IPC分類號: A61K39/39; A61K9/107; A61K39/135; A61K39/12; A61K39/215; A61P31/20; A61P31/14 主分類號: A61K39/39
申請人: 江蘇省農業科學院
發明人: 陳瑾; 鄭其升; 侯立婷; 李鵬成; 于曉明; 徐海; 侯繼波
地址: 210014 江蘇省南京市孝陵衛鐘靈街50號
優先權:
專利代理機構: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙) 32238 代理人: 張立榮
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310042983.0

授權公告號:

|||103083663B||||||

法律狀態公告日:

2018.08.10|||2014.12.10|||2013.06.12|||2013.05.08

法律狀態類型:

專利申請權、專利權的轉移|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供一種免疫增強劑、滅活疫苗及其制備方法,涉及生物制藥領域。免疫增強劑含有0.1-21mg/mL的單磷酰脂質A、1.5-125mg/mL的胞壁酰二肽和0.7-4.5mg/mL的β-葡聚糖。一種含有所述免疫增強劑的滅活疫苗。一種所述滅活疫苗的制備方法,將免疫增強劑與滅活的抗原溶液混合,得到水相溶液;將水相溶液與油相溶液混合,得到滅活疫苗。本發明免疫增強劑由于其組分之間的協同效應,提高機體的免疫水平、對抗原的免疫應答,從而提高免疫后的抗體水平、縮短免疫窗口期,增強疫苗的免疫效果。本發明含有免疫增強劑的滅活疫苗,免疫后產生的抗體水平高,保護期長,免疫窗口期短。

權利要求書

權利要求書一種免疫增強劑,其特征在于:所述免疫增強劑含有0.1?21mg/mL的單磷酰脂質A、1.5?125mg/mL的胞壁酰二肽和0.7?4.5mg /mL的β?葡聚糖。
根據權利要求1所述免疫增強劑,其特征在于所述免疫增強劑為油乳劑。
根據權利要求2所述免疫增強劑,其特征在于所述油乳劑的制備方法如下:
(1)配制水相溶液:將含有單磷酰脂質A、胞壁酰二肽和β?葡聚糖的母液與吐溫?80混合,得到成水相溶液;
(2)配制油相溶液:將白油和司盤?80混合,得到油相溶液; 
(3) 將所述水相溶液與油相溶液混合乳化后,得所述免疫增強劑。
一種含有權利要求1所述免疫增強劑的滅活疫苗。
根據權利要求4所述滅活疫苗,其特征在于:所述滅活疫苗還包括滅活的抗原溶液。
根據權利要求5所述滅活疫苗,其特征在于:所述滅活疫苗還包括油相溶液。
根據權利要求6所述滅活疫苗,其特征在于:所述免疫增強劑與滅活的抗原溶液組成了水相溶液,所述水相溶液與油相溶液的體積比為46:40?60;所述水相溶液中免疫增強劑與滅活的抗原溶液的體積比為1:1?3。
根據權利要求7所述滅活疫苗,其特征在于:所述油相溶液為ISA206。
根據權利要求8所述滅活疫苗,其特征在于:所述滅活的抗原溶液為滅活的豬O型口蹄疫病毒液、豬圓環病毒2型病毒液和豬流行性腹瀉病毒液。
一種權利要求5?8之一所述滅活疫苗的制備方法,其特征在于:將免疫增強劑與滅活的抗原溶液混合,得到水相溶液;將水相溶液與油相溶液混合,得到滅活疫苗。

說明書

說明書一種免疫增強劑、滅活疫苗及其制備方法
技術領域
本發明涉及生物制藥領域,具體涉及一種免疫增強劑、滅活疫苗及其制備方法。
背景技術
口蹄疫(Foot and moush disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot?and?Mouth Disease Virus, FMDV)引起的一種使偶蹄類動物發生的急性、熱性高度接觸性的傳染病。目前世界上很多國家都有這種疾病的流行,對畜牧業造成極大地經濟損失。而且該病的隱性感染可以使患病動物的生產能力下降,造成巨大的經濟損失,我國將其列為第一類動物疾病。
目前,國際上在口蹄疫的防控上主要采取兩種措施:緊急捕殺和免疫預防。在我國主要采取強制免疫預防,而對于急性爆發區采取封鎖捕殺政策。
疫苗的免疫注射是我國目前預防口蹄疫的主要措施,但現在使用的口蹄疫疫苗主要以滅活疫苗為主,現有的滅活疫苗的缺點也很明顯,在使用中存在疫苗免疫后抗體產生慢、抗體水平低、抗體持續期短及對變異毒株保護力差的缺點。蘭獸研資料表明,口蹄疫滅活疫苗免疫后40天抗體才能達到有效保護水平,抗體有效期只能維持90天。冉多良等調查發現當前豬口蹄疫疫苗免疫30天后,抗體合格率僅在26%?60%之間。曹波等研究表明豬O型口蹄疫滅活疫苗免疫后3個月抗體效價水平明顯下降,免疫保護率僅為67.77%;與孟國慶等研究結果一致(66.7%);另外,李云崗等檢測了3個廠家的O型疫苗抗體水平,結果免疫后3個月基本下降到免疫保護臨界值。所以在實際應用中,需要對免疫動物進行多次免疫,這些缺點不但造成了嚴重的經濟損失,也不利于口蹄疫的疫情防控。
豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起豬的一種急性腸道傳染病。該病由豬流行性腹瀉病毒感染豬而引起,以發熱、厭食、水樣腹瀉、嘔吐、嚴重脫水、消化道黏膜發炎及糜爛和食欲下降為主要特征,俗稱冬季拉稀病。該病己成為世界流行性的疾病,是各養豬國家導致仔豬早期死亡的重要疫病之一。給養豬業造成嚴重的經濟損失。豬流行性腹瀉的滅活疫苗為鋁膠佐劑,抗體產生期長,窗口期長,在冬季給免疫后未產生抗體的易感豬健康帶來極大的風險。
豬圓環病毒病是主要由豬2 型圓環病毒(PCV2)引起的免疫抑制性疾病,表現為斷奶后仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、繁殖障礙、仔豬心肌炎、增生性和壞死性肺炎、飼料報酬低、死亡率上升等。現有豬圓環病毒滅活苗,副反應較大,且需要免疫后3周加強免疫,給豬體帶來嚴重的外界刺激。
發明內容
本發明的目的是提供一種免疫增強劑,能夠顯著提高免疫動物對抗原的免疫應答,提高抗體水平,從而提高疫苗的免疫效果,同時能夠縮短免疫窗口期,延長保護期。
本發明的另一目的是提供含有所述免疫增強劑的滅活疫苗,其免疫后抗體水平高,免疫效果好,免疫窗口期短,保護期延長。
本發明的目的是提供上述滅活疫苗的制備方法,該方法簡單方便,成本低。
一種免疫增強劑,所述免疫增強劑含有0.1?21mg/mL的單磷酰脂質A、1.5?125mg/mL的胞壁酰二肽和0.7?4.5mg /mL的β?葡聚糖。
所述免疫增強劑為油乳劑。
所述油乳劑的制備方法如下:
(1)配制水相溶液:將含有單磷酰脂質A、胞壁酰二肽和β?葡聚糖的母液與吐溫?80混合,得到成水相溶液;
(2) 配制油相溶液:將白油和司盤?80混合,得到油相溶液;
(3) 將所述水相溶液與油相溶液混合乳化后,得所述獸用免疫增強劑。
一種含有所述免疫增強劑的滅活疫苗。
所述滅活疫苗還包括滅活的抗原溶液。
所述滅活疫苗還包括油相溶液。
所述免疫增強劑與滅活的抗原溶液組成了水相溶液,所述水相溶液與油相溶液的體積比為46:40?60;所述水相溶液中免疫增強劑與滅活的抗原溶液的體積比為1:1?3。
所述油相溶液為ISA206。
所述滅活的抗原溶液為滅活的豬O型口蹄疫病毒液、豬圓環病毒2型病毒液和豬流行性腹瀉病毒液。
一種所述滅活疫苗的制備方法,將免疫增強劑與滅活的抗原溶液混合,得到水相溶液;將水相溶液與油相溶液混合,得到滅活疫苗。
本發明免疫增強劑由于其組分之間的協同效應,提高機體的免疫水平、對抗原的免疫應答,從而提高免疫后的抗體水平、縮短免疫窗口期,增強疫苗的免疫效果。
本發明含有免疫增強劑的滅活疫苗,免疫后產生的抗體水平高,保護期長,免疫窗口期短。
本發明含有免疫增強劑的滅活疫苗的制備方法簡單,易操作,成本低。
附圖說明:
圖1表示仔豬免疫不同疫苗后平均液相阻斷ELISA抗體滴度隨時間的變化。
圖2表示仔豬免疫不同疫苗后平均液相阻斷ELISA抗體滴度隨時間的變化。
圖3:各組仔豬免疫后血清的平均中和抗體水平;其中PEDV滅活苗是豬流行性腹瀉滅活疫苗的縮寫,PEDV滅活苗B是豬流行性腹瀉滅活疫苗B的縮寫,PEDV滅活苗C是豬流行性腹瀉滅活疫苗C的縮寫,PEDV滅活苗D是豬流行性腹瀉滅活疫苗D的縮寫。
圖4 免疫后21天各組仔豬的ELISA抗體水平;其中PCV2自制滅活苗是豬圓環病毒滅活疫苗的縮寫,PCV2滅活苗B是豬圓環病毒滅活疫苗B的縮寫、PCV2滅活苗C是豬圓環病毒滅活疫苗C的縮寫、PCV2滅活苗D是豬圓環病毒滅活疫苗D的縮寫。
具體實施方式:
單磷酰脂質A縮寫為 MPL。
胞壁酰二肽縮寫為MDP 。
MPL、MDP和β?葡聚糖均購自InvivoGen公司。 
ISA206購自賽百克公司。 
本發明,采用口蹄疫液相阻斷ELISA試劑盒(蘭州獸醫研究所)檢測液相阻斷ELISA抗體滴度。
實施例1 免疫增強劑1對口蹄疫滅活疫苗免疫效力的影響
1、實驗材料
滅活的豬O型口蹄疫病毒液(毒株為豬O型口蹄疫病毒緬甸98株),經二乙烯亞胺滅活,146s含量為4ug/mL。
6?7周齡健康易感仔豬,液相阻斷ELISA抗體滴度≤1:8。
2、疫苗的配制:
免疫增強劑1含有2mg/mL的MPL、20mg/mL的MDP和0.4 mg/mL的β?葡聚糖,溶劑為蒸餾水。
將免疫增強劑1與滅活的豬O型口蹄疫病毒液按照體積比為1:3混合制備水相溶液。先將ISA206和水相溶液分別放置于室溫,大約30分鐘。將ISA206放入乳化罐中,在200轉/分,將水相溶液放入乳化罐中,攪拌均勻;在2000轉/分攪拌10分鐘,得到疫苗1。其中水相溶液與ISA206的體積比為46:54。疫苗1中MPL濃度為0.23mg/mL,MDP濃度為2.3mg/mL,β?葡聚糖濃度為0.046mg/mL。
配制MPL水溶液,其中MPL濃度為2mg/mL。采用MPL水溶液替代免疫增強劑1,按照疫苗1的制備方法制備對照疫苗1?1.
配制MDP水溶液,其中MDP濃度為20mg/mL。采用MDP水溶液替代免疫增強劑1,按照疫苗1的制備方法制備對照疫苗1?2.
配制β?葡聚糖水溶液,其中β?葡聚糖濃度為0.4 mg/mL。采用β?葡聚糖水溶液替代免疫增強劑1,按照疫苗1的制備方法制備對照疫苗1?3.
配制MPL、β?葡聚糖水溶液,其中MPL濃度為2mg/mL,β?葡聚糖濃度為0.4mg/mL。采用MPL、β?葡聚糖水溶液替代免疫增強劑1,按照疫苗1的制備方法制備對照疫苗1?4.
配制MPL、MDP水溶液,其中MPL濃度為2mg/mL,MDP濃度為20mg/mL。采用MPL、MDP水溶液替代免疫增強劑1,按照疫苗1的制備方法制備對照疫苗1?5.
配制MDP、β?葡聚糖水溶液,其中MDP濃度為20mg/mL,β?葡聚糖濃度為0.4 mg/mL。采用MDP、β?葡聚糖水溶液替代免疫增強劑1,按照疫苗1的制備方法制備對照疫苗1?6.
用蒸餾水替代免疫增強劑1,按照疫苗1的制備方法制備對照疫苗1?7。
3、分組、免疫和抗體檢測
將健康易感仔豬隨機分組,每組10頭,共8組。將疫苗1、對照疫苗1?1、對照疫苗1?2、對照疫苗1?3、對照疫苗1?4、對照疫苗1?5、對照疫苗1?6和對照疫苗1?7各免疫一組健康易感仔豬,免疫劑量為2 mL。
免疫后第14天和第28天,對各組健康易感仔豬采血分離血清,檢測液相阻斷ELISA抗體滴度。當液相阻斷ELISA抗體滴度大于等于26為抗體合格。
免疫后第14天和第28天抗體合格率如表1所示。
  
表1 各組仔豬免疫后第14天和第28天抗體合格率(抗體合格頭數/免疫總頭數)
仔豬的組別免疫的疫苗免疫后14d免疫后28d1疫苗17/1010/102對照疫苗1?11/103/103對照疫苗1?22/102/104對照疫苗1?32/103/105對照疫苗1?43/104/106對照疫苗1?51/103/107對照疫苗1?62/103/108對照疫苗1?72/104/10
從表1可以看出,免疫對照疫苗1?7的仔豬,第14天和第28天抗體合格率合格率僅為2/10和4/10;而免疫了疫苗1的仔豬,第14天和第28天抗體合格率很高,分別為7/10和10/10。該結果說明,免疫增強劑1能顯著提高仔豬對抗原的免疫應答,提高抗體水平,從而提高疫苗的免疫效果。對照疫苗1?1、對照疫苗1?2和對照疫苗1?3與對照疫苗1?7相比,分別添加了MPL、MDP和β?葡聚糖,但是并沒有提高抗體合格率;對照疫苗1?4、對照疫苗1?5和對照疫苗1?6與對照疫苗1?7相比,各添加了兩種成分,但是同樣,也沒有提高抗體水平,提高免疫效果。由于免疫增強劑1中MPL、MDP和β?葡聚糖的協同效應,能夠顯著提高仔豬對抗原的免疫應答,提高抗體水平和抗體合格率,從而提高疫苗的免疫效果。
實施例2 免疫增強劑2對口蹄疫滅活疫苗免疫效力的影響
1、實驗材料
滅活的O型豬口蹄疫病毒液(毒株為豬O型口蹄疫病毒緬甸98株),經二乙烯亞胺滅活,146s含量為5.87ug/mL。
6?7周齡健康易感仔豬,液相阻斷ELISA抗體滴度≤1:8。
2、疫苗的配制:
配制免疫增強劑2。免疫增強劑2含有2mg/mL的MPL、40mg/mL的MDP和0.4 mg/mL的β?葡聚糖,溶劑為蒸餾水。
將免疫增強劑2與滅活的豬口蹄疫病毒液按照體積比1:1混合,得到水相溶液。先將ISA206和水相溶液分別放置于室溫,大約30分鐘。將ISA206放入乳化罐中,在200轉/分,將水相溶液放入乳化罐中,攪拌均勻,在2000轉/分攪拌10分鐘,得到疫苗2。其中水相溶液與ISA206的體積比為46:46。疫苗2中MPL濃度為0.5mg/mL,MDP濃度為10mg/mL,β?葡聚糖濃度為0.1mg/mL。
配制MPL水溶液,其中MPL濃度為2mg/mL。采用MPL水溶液替代免疫增強劑2,按照疫苗2的制備方法制備對照疫苗2?1.
配制MDP水溶液,其中MDP濃度為40mg/mL。采用MDP水溶液替代免疫增強劑2,按照疫苗2的制備方法制備對照疫苗2?2.
配制β?葡聚糖水溶液,其中β?葡聚糖濃度為400 ug/mL。采用β?葡聚糖水溶液替代免疫增強劑2,按照疫苗2的制備方法制備對照疫苗2?3.
配制MPL、β?葡聚糖水溶液,其中MPL濃度為2mg/mL,β?葡聚糖濃度為400 ug/mL。采用MPL、β?葡聚糖水溶液替代免疫增強劑2,按照疫苗2的制備方法制備對照疫苗2?4.
配制MPL、MDP水溶液,其中MPL濃度為2mg/mL,MDP濃度為40mg/mL。采用MPL、MDP水溶液替代免疫增強劑2,按照疫苗2的制備方法制備對照疫苗2?5.
配制MDP、β?葡聚糖水溶液,其中MDP濃度為40mg/mL,β?葡聚糖濃度為400 ug/mL。采用MDP、β?葡聚糖水溶液替代免疫增強劑2,按照疫苗2的制備方法制備對照疫苗2?6.
用蒸餾水替代免疫增強劑2,按照疫苗2的制備方法制備對照疫苗2?7。
3、分組、免疫和抗體持續期監測
  將健康易感仔豬隨機分組,每組10頭,共8組。將疫苗2、對照疫苗2?1、對照疫苗2?2、對照疫苗2?3、對照疫苗2?4、對照疫苗2?5、對照疫苗2?6和對照疫苗2?7各免疫一組健康易感仔豬,免疫劑量為2 mL。
免疫后第14天、28天、60天、90天、120天和150天,對各組健康易感仔豬采血分離血清,檢測液相阻斷ELISA抗體滴度。當液相阻斷ELISA抗體滴度大于等于26抗體為合格。
免疫后,計算各組仔豬不同時間的平均抗體水平,具體結果如圖1所示。從圖1可以看出,疫苗2免疫后的仔豬在14天?150天內平均液相阻斷抗體滴度均大于27,顯著高于各對照疫苗;同時疫苗2免疫后的窗口期很短。從該結果,可以看出免疫增強劑2由于其各組分之間的協同效應,能夠顯著提高仔豬對抗原的免疫應答,提高抗體水平,縮短免疫窗口期,從而提高疫苗的免疫效果。
計算各組仔豬免疫后不同時間的抗體合格率,具體結果見表2.從表2可以看出,采用免疫增強劑2配制的疫苗2,免疫仔豬后14?150天內,所有被免仔豬的液相阻斷抗體滴度均合格。免疫各對照疫苗的仔豬,在14?150天內,抗體合格率均很低。該結果說明,MPL、MDP和β?葡聚糖中的任意一種或兩種的混合物添加到疫苗中,均不能提高仔豬對抗原的免疫應答,提高抗體水平,提高抗體合格率。但是,免疫增強劑2由于其各組分之間的協同效應,能夠顯著提高仔豬對抗原的免疫應答,提高抗體水平,提高抗體合格率。
表2 各組仔豬免疫后不同時間的抗體合格率(合格頭數/免疫總頭數)
仔豬組別接種的疫苗14d28d60d90d120d150d1疫苗210/1010/1010/1010/1010/109/102對照疫苗2?10/102/103/102/102/102/103對照疫苗2?21/101/102/102/102/102/104對照疫苗2?3.1/103/103/102/102/101/105對照疫苗2?42/103/103/102/102/102/106對照疫苗2?52/102/102/102/102/101/107對照疫苗2?6.1/103/103/103/102/102/108對照疫苗2?72/103/103/102/102/102/10
實施例3 免疫增強劑3對口蹄疫滅活疫苗免疫效力的影響
1、實驗材料
滅活的豬O型口蹄疫病毒液(毒株為豬O型口蹄疫病毒緬甸98株),經二乙烯亞胺滅活,146s含量為5.87ug/mL。
6?7周齡健康易感仔豬,采用口蹄疫液相阻斷ELISA試劑盒(蘭州獸醫研究所)檢測得到液相阻斷ELISA抗體滴度≤1:8。
2、疫苗的配制:
免疫增強劑3含有0.1 mg/mL的MPL、2 mg/mL的MDP和0.1 mg/mL的β?葡聚糖,溶劑為蒸餾水。
將免疫增強劑3與滅活的豬口蹄疫病毒液按照體積比為1:1混合,得到水相溶液。先將ISA206和水相溶液分別放置于室溫,大約30分鐘。將ISA206放入乳化罐中,在200轉/分,將水相溶液放入乳化罐中,攪拌均勻,在2000轉/分攪拌10分鐘,得到疫苗3。其中水相溶液與ISA206的體積比為46:46。
配制MPL水溶液,其中MPL濃度為0.1mg/mL。用MPL水溶液替代免疫增強劑3,按照疫苗3的制備方法制備對照疫苗3?1.
配制MDP水溶液,其中MDP濃度為2mg/mL。將MDP水溶液替代免疫增強劑3,按照疫苗3的制備方法制備對照疫苗3?2.
配制β?葡聚糖水溶液:其中β?葡聚糖濃度為100 ug/mL。將β?葡聚糖水溶液替代免疫增強劑3,按照疫苗3的制備方法制備對照疫苗3?3.
用蒸餾水替代免疫增強劑3,按照疫苗3的制備方法制備對照疫苗3?4.
3、免疫和分組
  將健康易感仔豬隨機分組,每組10頭,共5組。將疫苗3、對照疫苗3?1、對照疫苗3?2、對照疫苗3?3和對照疫苗3?4各免疫一組健康易感仔豬,免疫劑量為2 mL。
免疫后第14天、28天、60天、90天、120天和150天,對各組健康易感仔豬采血分離血清,檢測液相阻斷ELISA抗體滴度。當液相阻斷ELISA抗體滴度大于等于26為抗體合格。
免疫后,計算各組仔豬不同時間的平均抗體水平,具體結果如圖2所示。從圖2可以看出,疫苗3免疫后的仔豬在14天?150天內平均液相阻斷ELISA抗體滴度均大于27,顯著高于各對照疫苗,并且縮短了疫苗免疫后的窗口期。從該結果,可以看出免疫增強劑3由于其各組分之間的協同效應,能夠顯著提高仔豬對抗原的免疫應答,提高抗體水平,從而提高疫苗的免疫效果。
計算各組仔豬免疫后不同時間的抗體合格率,具體結果見表3.從表3可以看出,采用免疫增強劑3配制的疫苗3,免疫仔豬后14?150天內,所有被免仔豬抗體均合格。免疫各對照疫苗的仔豬,在14?150天內,抗體合格率均很低。該結果說明,MPL、MDP和β?葡聚糖中的任意一種或兩種的混合物添加到疫苗中,均不能提高仔豬對抗原的免疫應答,提高抗體水平,提高抗體合格率。但是,免疫增強劑3由于其各組分之間的協同效應,能夠顯著提高仔豬對抗原的免疫應答,提高抗體水平,提高抗體合格率,縮短免疫窗口期。
 
表3:疫苗免疫后不同時間各組抗體合格率(合格頭數/免疫總頭數)
組別接種疫苗免疫后14d免疫后28d免疫后60d免疫后90d免疫后120d免疫后150d1疫苗39/1010/1010/109/109/109/102對照疫苗3?11/102/103/102/101/101/103對照疫苗3?22/102/102/102/102/102/104對照疫苗3?32/103/103/102/102/102/105對照疫苗3?42/103/103/102/102/102/10
實施例4疫苗2的安全性檢測 
1、實驗材料
6?7周齡健康易感仔豬,液相阻斷ELISA抗體滴度≤1:8。
2、分組、免疫和抽檢
將健康易感仔豬隨機分組,每組10頭,共6組。
用實施例2中制備的疫苗2和對照疫苗2?7來評價本發明免疫增強劑的安全性。各組仔豬免疫情況見表4.
表4 各組仔豬的免疫方法
仔豬組別免疫方法一組免疫2mL疫苗2二組免疫4mL疫苗2三組免疫2ml對照疫苗2?7四組免疫2次,每次免疫2mL疫苗2,兩次免疫之間間隔14天五組免疫2次,每次免疫2mL對照疫苗2?7,兩次免疫之間間隔14天六組不免
其中一組、二組、三組和六組仔豬,均在免疫后第14天,從各組隨機抽出5只剖殺,觀察疫苗吸收情況;在免疫后第28天,取剩余的仔豬全部剖殺,觀察疫苗吸收情況。
四組和五組仔豬,在第二次免疫后第14天,從各組中隨機抽出5只剖殺,觀察疫苗吸收情況;在二次免疫后第28天,取剩余的仔豬全部剖殺,觀察疫苗吸收情況。
免疫后連續觀察28天,記錄是否出現任何發病癥狀。
結果:
連續觀察28天,所有試驗豬采食正常,無任何異常情況。
一組、二組和三組仔豬疫苗吸收情況:在免疫后第14天,一組、二組和三組仔豬在疫苗注射部位含有一些淡黃色米粒或粟粒大小類似脂肪樣顆粒物。六組仔豬無此淡黃色米粒大小類似脂肪樣顆粒物。在免疫后第28天,二組仔豬中有2頭在注射部位含有淡黃色粟粒大小類似脂肪樣顆粒物,其余均與六組仔豬無異。
四組和五組仔豬疫苗吸收情況:在第二次免疫后第14天,四組和五組仔豬在疫苗注射部位含有少量米粒大小乳白色顆粒,部分含有米粒大小淡黃色類似脂肪樣顆粒物。在免疫后第28天,四組和五組中個別仔豬有米粒大小淡黃色類似脂肪樣顆粒物。
安全性檢測實驗結果說明,本發明免疫增強劑不影響疫苗的正常吸收,對豬是安全的。
實施例5配制油乳劑型的免疫增強劑
配制免疫增強劑B:單磷酰脂質A濃度為0.78mg/mL,胞壁酰二肽濃度為1.56 mg/mL,β?葡聚糖為0.78mg/mL。
配制免疫增強劑C:單磷酰脂質A濃度為3.12mg/mL,胞壁酰二肽濃度為15.6mg/mL,β?葡聚糖為1.56mg/mL。
配制免疫增強劑D:單磷酰脂質A濃度為20.8mg/mL,胞壁酰二肽濃度為125mg/mLβ?葡聚糖為4.17mg/mL
配制方法如下:
(1)配制水相溶液:將單磷酰脂質A、胞壁酰二肽和β?葡聚糖溶于水,得到母液,將母液與吐溫?80按照體積比為96:4混合,得到水相溶液;
(2)配制油相溶液:將白油和司盤?80按照體積比為96:4混合,得到油相溶液。
(3) 將水相溶液與油相溶液按照體積比為1:2混合乳化后,得油乳劑型的免疫增強劑。
實施例6免疫增強劑對豬流行性腹瀉滅活疫苗的影響
1.實驗材料
滅活的豬流行性腹瀉病毒液(毒株:PEDV NJ株),滅活前毒價5x107TCID50/mL。將滅活的豬流行性腹瀉病毒液作為水相溶液。將白油佐劑和水相溶液按照體積2:1混合均勻后乳化制得豬流行性腹瀉滅活疫苗。 
將免疫增強劑B、C和D分別與豬流行性腹瀉滅活疫苗按照體積比為1:9混合均勻,獲得豬流行性腹瀉滅活疫苗B、C和D。
2. 分組、免疫及檢測
將健康易感仔豬隨機分成五組,每組20頭。將豬流行性腹瀉滅活疫苗B、豬流行性腹瀉滅活疫苗C、豬流行性腹瀉滅活疫苗D和豬流行性腹瀉滅活疫苗各免疫一組仔豬,免疫劑量為2mL/頭,免疫方法為肌肉注射。留一組仔豬不免作為空白對照。
免疫后14、28、60、74天采血,超凈臺內無菌分離血清,檢測血清的中和抗體(中和抗體滴度大于1:32為抗體陽性)。計算各組仔豬血清的中和抗體平均滴度,具體結果見圖3.從圖3可以看出,豬流行性腹瀉滅活疫苗B、C和D免疫后14天,中和抗體的平均滴度就合格,隨后一直升高直到74天,說明免疫增強劑B、C和D能夠縮短滅活疫苗的免疫窗口期,延長保護期,提高抗體水平。而豬流行性腹瀉滅活疫苗免疫后60天,中和抗體平均滴度才合格,到72天的時候又下降到合格抗體水平之下。
3.安全性實驗
分組和免疫:將6?7周齡健康易感仔豬分為四組,每組10頭。其中一組每頭免疫2ml豬流行性腹瀉滅活疫苗D;二組免疫4ml豬流行性腹瀉滅活疫苗D;三組免疫兩次豬流行性腹瀉滅活疫苗D,兩次之間間隔14天,免疫劑量為每次2ml/頭。四組不免作為空白對照。
(1)    觀察方法
其中一組、二組、四組仔豬,均在免疫后第14天,從各組中隨機抽出5只剖殺,觀察疫苗吸收情況;在免疫后第28天,取剩余的仔豬全部剖殺,觀察疫苗吸收情況。
三組仔豬,在第二次免疫結束后,第14天從各組中隨機抽出5只剖殺,觀察疫苗吸收情況;免疫后第28天,取剩余的仔豬全部剖殺,觀察疫苗吸收情況。
免疫后連續觀察28天,記錄是否出現任何發病癥狀。
(2)結果
觀察的結果如表5所示
表5 豬流行性腹瀉滅活疫苗D吸收情況

從表中可以看出采用本發明免疫增強劑制備的豬流行性腹瀉滅活疫苗對豬是安全的。
 
實施例7免疫增強劑對豬圓環滅活疫苗影響
1.實驗材料
試驗動物為3?4周齡健康易感仔豬。
豬圓環病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前動物生物制品有限公司,用于檢測血清的ELISA抗體。
豬圓環病毒2型滅活病毒液(毒株PCV2 NJ ),滅活前毒價106.5TCID50/mL。先將ISA206和豬圓環病毒2型滅活病毒液,分別放置于室溫,大約30分鐘。將ISA206放入乳化罐中,在200轉/分,將豬圓環病毒2型滅活病毒液放入乳化罐中,攪拌均勻;在2000轉/分攪拌10分鐘,得到豬圓環病毒滅活疫苗。其中豬圓環病毒2型滅活病毒液與ISA206的體積比為46:54。
將免疫增強劑B、C和D分別與豬圓環病毒滅活疫苗按照體積比為1:9混合均勻,獲得豬圓環病毒滅活疫苗B、C和D。
2. 分組、免疫和檢測
將健康易感仔豬隨機分成五組,每組10頭。將豬圓環病毒滅活疫苗B、豬圓環病毒滅活疫苗C、豬圓環病毒滅活疫苗D和豬圓環病毒滅活疫苗各免疫一組仔豬,免疫劑量為2mL/頭,免疫方法為頸部肌肉注射。留一組仔豬不免作為空白對照。
將各組仔豬,免疫后21天采血分離血清,檢測血清的ELISA抗體。當樣品OD630值>0.42,判為陽性。計算各組仔豬免疫后的平均抗體水平,具體結果見圖4.從圖4可以看出,仔豬免疫豬圓環病毒滅活疫苗B、C和D后21天,OD630值均達到陽性值之上,而免疫豬圓環病毒滅活疫苗的仔豬血清ELISA抗體沒有達到陽性。可見免疫增強劑B、C和D具有明顯的免疫增強效果,縮短免疫窗口期,提高血清抗體水平。而且,只需要免疫一次,即可達到陽性,降低生產成本,減少對豬體的應激,提高生產效率。
3.安全性實驗
分組和免疫:將6?7周齡健康易感仔豬分為四組,每組10頭。其中一組每頭免疫2ml豬圓環病毒滅活疫苗D;二組免疫4ml豬圓環病毒滅活疫苗D;三組免疫兩次豬圓環病毒滅活疫苗D,兩次之間間隔14天,免疫劑量為每次2ml/頭。四組不免作為空白對照。
(2)    觀察方法
其中一組、二組、四組仔豬,均在免疫后第14天,從各組中隨機抽出5只剖殺,觀察疫苗吸收情況;在免疫后第28天,取剩余的仔豬全部剖殺,觀察疫苗吸收情況。
三組仔豬,在第二次免疫結束后,第14天從各組中隨機抽出5只剖殺,觀察疫苗吸收情況;免疫后第28天,取剩余的仔豬全部剖殺,觀察疫苗吸收情況。
免疫后連續觀察28天,記錄是否出現任何發病癥狀。
(2)結果
觀察的結果如表6所示
表6 豬圓環病毒滅活疫苗D吸收情況

從表中可以看出采用本發明免疫增強劑制備的豬圓環病毒滅活疫苗對豬是安全的。   內容來自專利網www.wwszu.club轉載請標明出處

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