一種免疫增強劑、滅活疫苗及其制備方法.pdf

(10)申請公布號 CN 103083663 A (43)申請公布日 2013.05.08 CN 103083663 A *CN103083663A* (21)申請號 201310042983.0 (22)申請日 2013.02.04 A61K 39/39(2006.01) A61K 9/107(2006.01) A61K 39/135(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61K 39/215(2006.01) A61P 31/20(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (71)申請人 江蘇省農業科學院 地址 210014 江蘇省南京市孝陵衛鐘靈街 50 號 (72)發明人 陳瑾 鄭其升 侯立婷 李鵬成 于曉明 徐海 侯繼波 (74)專利代理機構 南京匯盛專利商標事務所 ( 普通合伙 ) 32238 代理人 張立榮 (54) 發明名稱 一種免疫增強劑、 滅活疫苗及其制備方法 (57) 摘要 本發明提供一種免疫增強劑、 滅活疫苗及其 制備方法 , 涉及生物制藥領域。免疫增強劑含有 0.1-21mg/mL的單磷酰脂質A、 1.5-125mg/mL的胞 壁酰二肽和0.7-4.5mg/mL的 β- 葡聚糖。 一種含 有所述免疫增強劑的滅活疫苗。一種所述滅活疫 苗的制備方法， 將免疫增強劑與滅活的抗原溶液 混合， 得到水相溶液 ； 將水相溶液與油相溶液混 合， 得到滅活疫苗。 本發明免疫增強劑由于其組分 之間的協同效應， 提高機體的免疫水平、 對抗原的 免疫應答， 從而提高免疫后的抗體水平、 縮短免疫 窗口期， 增強疫苗的免疫效果。 本發明含有免疫增 強劑的滅活疫苗， 免疫后產生的抗體水平高， 保護 期長， 免疫窗口期短。 (51)Int.Cl. 權利要求書 1 頁 說明書 10 頁 附圖 2 頁 (19)中華人民共和國國家知識產權局 (12)發明專利申請 權利要求書1頁 說明書10頁 附圖2頁 (10)申請公布號 CN 103083663 A CN 103083663 A *CN103083663A* 1/1 頁 2 1. 一種免疫增強劑， 其特征在于 ： 所述免疫增強劑含有 0.1-21mg/mL 的單磷酰脂質 A、 1.5-125mg/mL 的胞壁酰二肽和 0.7-4.5mg /mL 的 β- 葡聚糖。 2. 根據權利要求 1 所述免疫增強劑， 其特征在于所述免疫增強劑為油乳劑。 3. 根據權利要求 2 所述免疫增強劑， 其特征在于所述油乳劑的制備方法如下 ： （1） 配制水相溶液 ： 將含有單磷酰脂質 A、 胞壁酰二肽和 β- 葡聚糖的母液與吐溫 -80 混合， 得到成水相溶液 ； （2） 配制油相溶液 ： 將白油和司盤 -80 混合， 得到油相溶液 ； （3） 將所述水相溶液與油相溶液混合乳化后， 得所述免疫增強劑。 4. 一種含有權利要求 1 所述免疫增強劑的滅活疫苗。 5. 根據權利要求 4 所述滅活疫苗， 其特征在于 ： 所述滅活疫苗還包括滅活的抗原溶液。 6. 根據權利要求 5 所述滅活疫苗， 其特征在于 ： 所述滅活疫苗還包括油相溶液。 7. 根據權利要求 6 所述滅活疫苗， 其特征在于 ： 所述免疫增強劑與滅活的抗原溶液組 成了水相溶液， 所述水相溶液與油相溶液的體積比為 46:40-60 ； 所述水相溶液中免疫增強 劑與滅活的抗原溶液的體積比為 1:1-3。 8. 根據權利要求 7 所述滅活疫苗， 其特征在于 ： 所述油相溶液為 ISA206。 9. 根據權利要求 8 所述滅活疫苗， 其特征在于 ： 所述滅活的抗原溶液為滅活的豬 O 型 口蹄疫病毒液、 豬圓環病毒 2 型病毒液和豬流行性腹瀉病毒液。 10. 一種權利要求 5-8 之一所述滅活疫苗的制備方法， 其特征在于 ： 將免疫增強劑與滅 活的抗原溶液混合， 得到水相溶液 ； 將水相溶液與油相溶液混合， 得到滅活疫苗。 權 利 要 求 書 CN 103083663 A 2 1/10 頁 3 一種免疫增強劑、 滅活疫苗及其制備方法 技術領域 [0001] 本發明涉及生物制藥領域， 具體涉及一種免疫增強劑、 滅活疫苗及其制備方法。 背景技術 [0002] 口蹄疫 （Foot and moush disease, FMD）是由口蹄疫病毒 （Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV） 引起的一種使偶蹄類動物發生的急性、 熱性高度接觸性的傳染病。 目前世界上很多國家都有這種疾病的流行， 對畜牧業造成極大地經濟損失。而且該病的隱 性感染可以使患病動物的生產能力下降， 造成巨大的經濟損失， 我國將其列為第一類動物 疾病。 [0003] 目前， 國際上在口蹄疫的防控上主要采取兩種措施 ： 緊急捕殺和免疫預防。 在我國 主要采取強制免疫預防， 而對于急性爆發區采取封鎖捕殺政策。 [0004] 疫苗的免疫注射是我國目前預防口蹄疫的主要措施， 但現在使用的口蹄疫疫苗主 要以滅活疫苗為主， 現有的滅活疫苗的缺點也很明顯， 在使用中存在疫苗免疫后抗體產生 慢、 抗體水平低、 抗體持續期短及對變異毒株保護力差的缺點。蘭獸研資料表明， 口蹄疫滅 活疫苗免疫后 40 天抗體才能達到有效保護水平， 抗體有效期只能維持 90 天。冉多良等調 查發現當前豬口蹄疫疫苗免疫 30 天后， 抗體合格率僅在 26%-60% 之間。曹波等研究表明豬 O型口蹄疫滅活疫苗免疫后3個月抗體效價水平明顯下降， 免疫保護率僅為67.77% ； 與孟國 慶等研究結果一致 （66.7%） ； 另外， 李云崗等檢測了3個廠家的O型疫苗抗體水平， 結果免疫 后 3 個月基本下降到免疫保護臨界值。所以在實際應用中， 需要對免疫動物進行多次免疫， 這些缺點不但造成了嚴重的經濟損失， 也不利于口蹄疫的疫情防控。 [0005] 豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起豬的一種急性腸道傳染病。 該病由豬流 行性腹瀉病毒感染豬而引起， 以發熱、 厭食、 水樣腹瀉、 嘔吐、 嚴重脫水、 消化道黏膜發炎及 糜爛和食欲下降為主要特征， 俗稱冬季拉稀病。 該病己成為世界流行性的疾病， 是各養豬國 家導致仔豬早期死亡的重要疫病之一。給養豬業造成嚴重的經濟損失。豬流行性腹瀉的滅 活疫苗為鋁膠佐劑， 抗體產生期長， 窗口期長， 在冬季給免疫后未產生抗體的易感豬健康帶 來極大的風險。 [0006] 豬圓環病毒病是主要由豬 2 型圓環病毒 （PCV2） 引起的免疫抑制性疾病， 表現為 斷奶后仔豬多系統衰竭綜合征 （PMWS） 、 豬皮炎腎病綜合征 （PDNS） 、 豬呼吸道疾病綜合征 （PRDC） 、 繁殖障礙、 仔豬心肌炎、 增生性和壞死性肺炎、 飼料報酬低、 死亡率上升等。現有豬 圓環病毒滅活苗， 副反應較大， 且需要免疫后 3 周加強免疫， 給豬體帶來嚴重的外界刺激。 發明內容 [0007] 本發明的目的是提供一種免疫增強劑， 能夠顯著提高免疫動物對抗原的免疫應 答， 提高抗體水平， 從而提高疫苗的免疫效果， 同時能夠縮短免疫窗口期， 延長保護期。 [0008] 本發明的另一目的是提供含有所述免疫增強劑的滅活疫苗， 其免疫后抗體水平 高， 免疫效果好， 免疫窗口期短， 保護期延長。 說 明 書 CN 103083663 A 3 2/10 頁 4 [0009] 本發明的目的是提供上述滅活疫苗的制備方法， 該方法簡單方便， 成本低。 [0010] 一種免疫增強劑， 所述免疫增強劑含有 0.1-21mg/mL 的單磷酰脂質 A、 1.5-125mg/ mL 的胞壁酰二肽和 0.7-4.5mg /mL 的 β- 葡聚糖。 [0011] 所述免疫增強劑為油乳劑。 [0012] 所述油乳劑的制備方法如下 ： （1） 配制水相溶液 ： 將含有單磷酰脂質 A、 胞壁酰二肽和 β- 葡聚糖的母液與吐溫 -80 混合， 得到成水相溶液 ； （2） 配制油相溶液 ： 將白油和司盤 -80 混合， 得到油相溶液 ； （3） 將所述水相溶液與油相溶液混合乳化后， 得所述獸用免疫增強劑。 [0013] 一種含有所述免疫增強劑的滅活疫苗。 [0014] 所述滅活疫苗還包括滅活的抗原溶液。 [0015] 所述滅活疫苗還包括油相溶液。 [0016] 所述免疫增強劑與滅活的抗原溶液組成了水相溶液， 所述水相溶液與油相溶液的 體積比為 46:40-60 ； 所述水相溶液中免疫增強劑與滅活的抗原溶液的體積比為 1:1-3。 [0017] 所述油相溶液為 ISA206。 [0018] 所述滅活的抗原溶液為滅活的豬 O 型口蹄疫病毒液、 豬圓環病毒 2 型病毒液和豬 流行性腹瀉病毒液。 [0019] 一種所述滅活疫苗的制備方法， 將免疫增強劑與滅活的抗原溶液混合， 得到水相 溶液 ； 將水相溶液與油相溶液混合， 得到滅活疫苗。 [0020] 本發明免疫增強劑由于其組分之間的協同效應， 提高機體的免疫水平、 對抗原的 免疫應答， 從而提高免疫后的抗體水平、 縮短免疫窗口期， 增強疫苗的免疫效果。 [0021] 本發明含有免疫增強劑的滅活疫苗， 免疫后產生的抗體水平高， 保護期長， 免疫窗 口期短。 [0022] 本發明含有免疫增強劑的滅活疫苗的制備方法簡單， 易操作， 成本低。 [0023] 附圖說明 ： 圖 1 表示仔豬免疫不同疫苗后平均液相阻斷 ELISA 抗體滴度隨時間的變化。 [0024] 圖 2 表示仔豬免疫不同疫苗后平均液相阻斷 ELISA 抗體滴度隨時間的變化。 [0025] 圖 3 ： 各組仔豬免疫后血清的平均中和抗體水平 ; 其中 PEDV 滅活苗是豬流行性腹 瀉滅活疫苗的縮寫， PEDV 滅活苗 B 是豬流行性腹瀉滅活疫苗 B 的縮寫， PEDV 滅活苗 C 是豬 流行性腹瀉滅活疫苗 C 的縮寫， PEDV 滅活苗 D 是豬流行性腹瀉滅活疫苗 D 的縮寫。 [0026] 圖 4 免疫后 21 天各組仔豬的 ELISA 抗體水平 ； 其中 PCV2 自制滅活苗是豬圓環病 毒滅活疫苗的縮寫， PCV2 滅活苗 B 是豬圓環病毒滅活疫苗 B 的縮寫、 PCV2 滅活苗 C 是豬圓 環病毒滅活疫苗 C 的縮寫、 PCV2 滅活苗 D 是豬圓環病毒滅活疫苗 D 的縮寫。 [0027] 具體實施方式 ： 單磷酰脂質 A 縮寫為 MPL。 [0028] 胞壁酰二肽縮寫為 MDP 。 [0029] MPL、 MDP 和 β- 葡聚糖均購自 InvivoGen 公司。 [0030] ISA206 購自賽百克公司。 [0031] 本發明， 采用口蹄疫液相阻斷 ELISA 試劑盒 （蘭州獸醫研究所）檢測液相阻斷 說 明 書 CN 103083663 A 4 3/10 頁 5 ELISA 抗體滴度。 [0032] 實施例 1 免疫增強劑 1 對口蹄疫滅活疫苗免疫效力的影響 1、 實驗材料 滅活的豬O型口蹄疫病毒液 （毒株為豬O型口蹄疫病毒緬甸98株） ， 經二乙烯亞胺滅活， 146s 含量為 4ug/mL。 [0033] 6-7 周齡健康易感仔豬， 液相阻斷 ELISA 抗體滴度≤ 1:8。 [0034] 2、 疫苗的配制 ： 免疫增強劑 1 含有 2mg/mL 的 MPL、 20mg/mL 的 MDP 和 0.4 mg/mL 的 β- 葡聚糖， 溶劑為 蒸餾水。 [0035] 將免疫增強劑 1 與滅活的豬 O 型口蹄疫病毒液按照體積比為 1:3 混合制備水相溶 液。先將 ISA206 和水相溶液分別放置于室溫， 大約 30 分鐘。將 ISA206 放入乳化罐中， 在 200 轉 / 分， 將水相溶液放入乳化罐中， 攪拌均勻 ； 在 2000 轉 / 分攪拌 10 分鐘， 得到疫苗 1。 其中水相溶液與 ISA206 的體積比為 46:54。疫苗 1 中 MPL 濃度為 0.23mg/mL， MDP 濃度為 2.3mg/mL， β- 葡聚糖濃度為 0.046mg/mL。 [0036] 配制 MPL 水溶液， 其中 MPL 濃度為 2mg/mL。采用 MPL 水溶液替代免疫增強劑 1， 按 照疫苗 1 的制備方法制備對照疫苗 1-1. 配制 MDP 水溶液， 其中 MDP 濃度為 20mg/mL。采用 MDP 水溶液替代免疫增強劑 1， 按照 疫苗 1 的制備方法制備對照疫苗 1-2. 配制 β- 葡聚糖水溶液， 其中 β- 葡聚糖濃度為 0.4 mg/mL。采用 β- 葡聚糖水溶液替 代免疫增強劑 1， 按照疫苗 1 的制備方法制備對照疫苗 1-3. 配制 MPL、 β- 葡聚糖水溶液， 其中 MPL 濃度為 2mg/mL， β- 葡聚糖濃度為 0.4mg/mL。采 用 MPL、 β- 葡聚糖水溶液替代免疫增強劑 1， 按照疫苗 1 的制備方法制備對照疫苗 1-4. 配制 MPL、 MDP 水溶液， 其中 MPL 濃度為 2mg/mL， MDP 濃度為 20mg/mL。采用 MPL、 MDP 水 溶液替代免疫增強劑 1， 按照疫苗 1 的制備方法制備對照疫苗 1-5. 配制 MDP、 β- 葡聚糖水溶液， 其中 MDP 濃度為 20mg/mL， β- 葡聚糖濃度為 0.4 mg/mL。 采用 MDP、 β- 葡聚糖水溶液替代免疫增強劑 1， 按照疫苗 1 的制備方法制備對照疫苗 1-6. 用蒸餾水替代免疫增強劑 1， 按照疫苗 1 的制備方法制備對照疫苗 1-7。 [0037] 3、 分組、 免疫和抗體檢測 將健康易感仔豬隨機分組， 每組 10 頭， 共 8 組。將疫苗 1、 對照疫苗 1-1、 對照疫苗 1-2、 對照疫苗 1-3、 對照疫苗 1-4、 對照疫苗 1-5、 對照疫苗 1-6 和對照疫苗 1-7 各免疫一組健康 易感仔豬， 免疫劑量為 2 mL。 [0038] 免疫后第 14 天和第 28 天， 對各組健康易感仔豬采血分離血清， 檢測液相阻斷 ELISA 抗體滴度。當液相阻斷 ELISA 抗體滴度大于等于 26為抗體合格。 [0039] 免疫后第 14 天和第 28 天抗體合格率如表 1 所示。 [0040] 表 1 各組仔豬免疫后第 14 天和第 28 天抗體合格率 （抗體合格頭數 / 免疫總頭數） 仔豬的組別免疫的疫苗免疫后 14d免疫后 28d 1疫苗 17/1010/10 2對照疫苗 1-11/103/10 3對照疫苗 1-22/102/10 說 明 書 CN 103083663 A 5 4/10 頁 6 4對照疫苗 1-32/103/10 5對照疫苗 1-43/104/10 6對照疫苗 1-51/103/10 7對照疫苗 1-62/103/10 8對照疫苗 1-72/104/10 從表 1 可以看出， 免疫對照疫苗 1-7 的仔豬， 第 14 天和第 28 天抗體合格率合格率僅為 2/10 和 4/10 ； 而免疫了疫苗 1 的仔豬， 第 14 天和第 28 天抗體合格率很高， 分別為 7/10 和 10/10。該結果說明， 免疫增強劑 1 能顯著提高仔豬對抗原的免疫應答， 提高抗體水平， 從而 提高疫苗的免疫效果。對照疫苗 1-1、 對照疫苗 1-2 和對照疫苗 1-3 與對照疫苗 1-7 相比， 分別添加了 MPL、 MDP 和 β- 葡聚糖， 但是并沒有提高抗體合格率 ； 對照疫苗 1-4、 對照疫苗 1-5和對照疫苗1-6與對照疫苗1-7相比， 各添加了兩種成分， 但是同樣， 也沒有提高抗體水 平， 提高免疫效果。由于免疫增強劑 1 中 MPL、 MDP 和 β- 葡聚糖的協同效應， 能夠顯著提高 仔豬對抗原的免疫應答， 提高抗體水平和抗體合格率， 從而提高疫苗的免疫效果。 [0041] 實施例 2 免疫增強劑 2 對口蹄疫滅活疫苗免疫效力的影響 1、 實驗材料 滅活的O型豬口蹄疫病毒液 （毒株為豬O型口蹄疫病毒緬甸98株） ， 經二乙烯亞胺滅活， 146s 含量為 5.87ug/mL。 [0042] 6-7 周齡健康易感仔豬， 液相阻斷 ELISA 抗體滴度≤ 1:8。 [0043] 2、 疫苗的配制 ： 配制免疫增強劑 2。免疫增強劑 2 含有 2mg/mL 的 MPL、 40mg/mL 的 MDP 和 0.4 mg/mL 的 β- 葡聚糖， 溶劑為蒸餾水。 [0044] 將免疫增強劑2與滅活的豬口蹄疫病毒液按照體積比1:1混合， 得到水相溶液。 先 將 ISA206 和水相溶液分別放置于室溫， 大約 30 分鐘。將 ISA206 放入乳化罐中， 在 200 轉 / 分， 將水相溶液放入乳化罐中， 攪拌均勻， 在 2000 轉 / 分攪拌 10 分鐘， 得到疫苗 2。其中 水相溶液與 ISA206 的體積比為 46:46。疫苗 2 中 MPL 濃度為 0.5mg/mL， MDP 濃度為 10mg/ mL， β- 葡聚糖濃度為 0.1mg/mL。 [0045] 配制 MPL 水溶液， 其中 MPL 濃度為 2mg/mL。采用 MPL 水溶液替代免疫增強劑 2， 按 照疫苗 2 的制備方法制備對照疫苗 2-1. 配制 MDP 水溶液， 其中 MDP 濃度為 40mg/mL。采用 MDP 水溶液替代免疫增強劑 2， 按照 疫苗 2 的制備方法制備對照疫苗 2-2. 配制 β- 葡聚糖水溶液， 其中 β- 葡聚糖濃度為 400 ug/mL。采用 β- 葡聚糖水溶液替 代免疫增強劑 2， 按照疫苗 2 的制備方法制備對照疫苗 2-3. 配制 MPL、 β- 葡聚糖水溶液， 其中 MPL 濃度為 2mg/mL， β- 葡聚糖濃度為 400 ug/mL。 采用 MPL、 β- 葡聚糖水溶液替代免疫增強劑 2， 按照疫苗 2 的制備方法制備對照疫苗 2-4. 配制 MPL、 MDP 水溶液， 其中 MPL 濃度為 2mg/mL， MDP 濃度為 40mg/mL。采用 MPL、 MDP 水 溶液替代免疫增強劑 2， 按照疫苗 2 的制備方法制備對照疫苗 2-5. 配制 MDP、 β- 葡聚糖水溶液， 其中 MDP 濃度為 40mg/mL， β- 葡聚糖濃度為 400 ug/mL。 采用 MDP、 β- 葡聚糖水溶液替代免疫增強劑 2， 按照疫苗 2 的制備方法制備對照疫苗 2-6. 用蒸餾水替代免疫增強劑 2， 按照疫苗 2 的制備方法制備對照疫苗 2-7。 [0046] 3、 分組、 免疫和抗體持續期監測 說 明 書 CN 103083663 A 6 5/10 頁 7 將健康易感仔豬隨機分組， 每組 10 頭， 共 8 組。將疫苗 2、 對照疫苗 2-1、 對照疫苗 2-2、 對照疫苗 2-3、 對照疫苗 2-4、 對照疫苗 2-5、 對照疫苗 2-6 和對照疫苗 2-7 各免疫一組 健康易感仔豬， 免疫劑量為 2 mL。 [0047] 免疫后第 14 天、 28 天、 60 天、 90 天、 120 天和 150 天， 對各組健康易感仔豬采血分 離血清， 檢測液相阻斷 ELISA 抗體滴度。當液相阻斷 ELISA 抗體滴度大于等于 26抗體為合 格。 [0048] 免疫后， 計算各組仔豬不同時間的平均抗體水平， 具體結果如圖 1 所示。從圖 1 可 以看出， 疫苗 2 免疫后的仔豬在 14 天 -150 天內平均液相阻斷抗體滴度均大于 27， 顯著高于 各對照疫苗 ； 同時疫苗 2 免疫后的窗口期很短。從該結果， 可以看出免疫增強劑 2 由于其各 組分之間的協同效應， 能夠顯著提高仔豬對抗原的免疫應答， 提高抗體水平， 縮短免疫窗口 期， 從而提高疫苗的免疫效果。 [0049] 計算各組仔豬免疫后不同時間的抗體合格率， 具體結果見表 2. 從表 2 可以看出， 采用免疫增強劑2配制的疫苗2， 免疫仔豬后14-150天內， 所有被免仔豬的液相阻斷抗體滴 度均合格。免疫各對照疫苗的仔豬， 在 14-150 天內， 抗體合格率均很低。該結果說明， MPL、 MDP 和 β- 葡聚糖中的任意一種或兩種的混合物添加到疫苗中， 均不能提高仔豬對抗原的 免疫應答， 提高抗體水平， 提高抗體合格率。但是， 免疫增強劑 2 由于其各組分之間的協同 效應， 能夠顯著提高仔豬對抗原的免疫應答， 提高抗體水平， 提高抗體合格率。 [0050] 表 2 各組仔豬免疫后不同時間的抗體合格率 （合格頭數 / 免疫總頭數） 仔豬組別接種的疫苗14d28d60d90d120d150d 1疫苗 210/1010/1010/1010/1010/109/10 2對照疫苗 2-10/102/103/102/102/102/10 3對照疫苗 2-21/101/102/102/102/102/10 4對照疫苗 2-3.1/103/103/102/102/101/10 5對照疫苗 2-42/103/103/102/102/102/10 6對照疫苗 2-52/102/102/102/102/101/10 7對照疫苗 2-6.1/103/103/103/102/102/10 8對照疫苗 2-72/103/103/102/102/102/10 實施例 3 免疫增強劑 3 對口蹄疫滅活疫苗免疫效力的影響 1、 實驗材料 滅活的豬O型口蹄疫病毒液 （毒株為豬O型口蹄疫病毒緬甸98株） ， 經二乙烯亞胺滅活， 146s 含量為 5.87ug/mL。 [0051] 6-7 周齡健康易感仔豬， 采用口蹄疫液相阻斷 ELISA 試劑盒 （蘭州獸醫研究所） 檢 測得到液相阻斷 ELISA 抗體滴度≤ 1:8。 [0052] 2、 疫苗的配制 ： 免疫增強劑 3 含有 0.1 mg/mL 的 MPL、 2 mg/mL 的 MDP 和 0.1 mg/mL 的 β- 葡聚糖， 溶 劑為蒸餾水。 [0053] 將免疫增強劑3與滅活的豬口蹄疫病毒液按照體積比為1:1混合， 得到水相溶液。 先將 ISA206 和水相溶液分別放置于室溫， 大約 30 分鐘。將 ISA206 放入乳化罐中， 在 200 轉 / 分， 將水相溶液放入乳化罐中， 攪拌均勻， 在 2000 轉 / 分攪拌 10 分鐘， 得到疫苗 3。其 中水相溶液與 ISA206 的體積比為 46:46。 [0054] 配制 MPL 水溶液， 其中 MPL 濃度為 0.1mg/mL。用 MPL 水溶液替代免疫增強劑 3， 按 說 明 書 CN 103083663 A 7 6/10 頁 8 照疫苗 3 的制備方法制備對照疫苗 3-1. 配制 MDP 水溶液， 其中 MDP 濃度為 2mg/mL。將 MDP 水溶液替代免疫增強劑 3， 按照疫苗 3 的制備方法制備對照疫苗 3-2. 配制 β- 葡聚糖水溶液 ： 其中 β- 葡聚糖濃度為 100 ug/mL。將 β- 葡聚糖水溶液替 代免疫增強劑 3， 按照疫苗 3 的制備方法制備對照疫苗 3-3. 用蒸餾水替代免疫增強劑 3， 按照疫苗 3 的制備方法制備對照疫苗 3-4. 3、 免疫和分組 將健康易感仔豬隨機分組， 每組 10 頭， 共 5 組。將疫苗 3、 對照疫苗 3-1、 對照疫苗 3-2、 對照疫苗 3-3 和對照疫苗 3-4 各免疫一組健康易感仔豬， 免疫劑量為 2 mL。 [0055] 免疫后第 14 天、 28 天、 60 天、 90 天、 120 天和 150 天， 對各組健康易感仔豬采血分 離血清， 檢測液相阻斷 ELISA 抗體滴度。當液相阻斷 ELISA 抗體滴度大于等于 26為抗體合 格。 [0056] 免疫后， 計算各組仔豬不同時間的平均抗體水平， 具體結果如圖 2 所示。從圖 2 可 以看出， 疫苗 3 免疫后的仔豬在 14 天 -150 天內平均液相阻斷 ELISA 抗體滴度均大于 27， 顯 著高于各對照疫苗， 并且縮短了疫苗免疫后的窗口期。從該結果， 可以看出免疫增強劑 3 由 于其各組分之間的協同效應， 能夠顯著提高仔豬對抗原的免疫應答， 提高抗體水平， 從而提 高疫苗的免疫效果。 [0057] 計算各組仔豬免疫后不同時間的抗體合格率， 具體結果見表 3. 從表 3 可以看出， 采用免疫增強劑3配制的疫苗3， 免疫仔豬后14-150天內， 所有被免仔豬抗體均合格。 免疫 各對照疫苗的仔豬， 在 14-150 天內， 抗體合格率均很低。該結果說明， MPL、 MDP 和 β- 葡聚 糖中的任意一種或兩種的混合物添加到疫苗中， 均不能提高仔豬對抗原的免疫應答， 提高 抗體水平， 提高抗體合格率。但是， 免疫增強劑 3 由于其各組分之間的協同效應， 能夠顯著 提高仔豬對抗原的免疫應答， 提高抗體水平， 提高抗體合格率， 縮短免疫窗口期。 [0058] 表 3 ： 疫苗免疫后不同時間各組抗體合格率 （合格頭數 / 免疫總頭數） 組別 接種疫苗免疫后 14d 免疫后 28d 免疫后 60d 免疫后 90d 免疫后 120d免疫后 150d 1疫苗 39/1010/1010/109/109/109/10 2對照疫苗 3-11/102/103/102/101/101/10 3對照疫苗 3-22/102/102/102/102/102/10 4對照疫苗 3-32/103/103/102/102/102/10 5對照疫苗 3-42/103/103/102/102/102/10 實施例 4 疫苗 2 的安全性檢測 1、 實驗材料 6-7 周齡健康易感仔豬， 液相阻斷 ELISA 抗體滴度≤ 1:8。 [0059] 2、 分組、 免疫和抽檢 將健康易感仔豬隨機分組， 每組 10 頭， 共 6 組。 [0060] 用實施例 2 中制備的疫苗 2 和對照疫苗 2-7 來評價本發明免疫增強劑的安全性。 各組仔豬免疫情況見表 4. 表 4 各組仔豬的免疫方法 仔豬組別 免疫方法 一組免疫 2mL 疫苗 2 說 明 書 CN 103083663 A 8 7/10 頁 9 二組免疫 4mL 疫苗 2 三組免疫 2ml 對照疫苗 2-7 四組免疫 2 次， 每次免疫 2mL 疫苗 2， 兩次免疫之間間隔 14 天 五組免疫 2 次， 每次免疫 2mL 對照疫苗 2-7， 兩次免疫之間間隔 14 天 六組不免 其中一組、 二組、 三組和六組仔豬， 均在免疫后第14天， 從各組隨機抽出5只剖殺， 觀察 疫苗吸收情況 ； 在免疫后第 28 天， 取剩余的仔豬全部剖殺， 觀察疫苗吸收情況。 [0061] 四組和五組仔豬， 在第二次免疫后第14天， 從各組中隨機抽出5只剖殺， 觀察疫苗 吸收情況 ； 在二次免疫后第 28 天， 取剩余的仔豬全部剖殺， 觀察疫苗吸收情況。 [0062] 免疫后連續觀察 28 天， 記錄是否出現任何發病癥狀。 [0063] 結果 ： 連續觀察 28 天， 所有試驗豬采食正常， 無任何異常情況。 [0064] 一組、 二組和三組仔豬疫苗吸收情況 ： 在免疫后第 14 天， 一組、 二組和三組仔豬在 疫苗注射部位含有一些淡黃色米粒或粟粒大小類似脂肪樣顆粒物。 六組仔豬無此淡黃色米 粒大小類似脂肪樣顆粒物。在免疫后第 28 天， 二組仔豬中有 2 頭在注射部位含有淡黃色粟 粒大小類似脂肪樣顆粒物， 其余均與六組仔豬無異。 [0065] 四組和五組仔豬疫苗吸收情況 ： 在第二次免疫后第 14 天， 四組和五組仔豬在疫苗 注射部位含有少量米粒大小乳白色顆粒， 部分含有米粒大小淡黃色類似脂肪樣顆粒物。在 免疫后第 28 天， 四組和五組中個別仔豬有米粒大小淡黃色類似脂肪樣顆粒物。 [0066] 安全性檢測實驗結果說明， 本發明免疫增強劑不影響疫苗的正常吸收， 對豬是安 全的。 [0067] 實施例 5 配制油乳劑型的免疫增強劑 配制免疫增強劑 B ： 單磷酰脂質 A 濃度為 0.78mg/mL， 胞壁酰二肽濃度為 1.56 mg/ mL,β- 葡聚糖為 0.78mg/mL。 [0068] 配制免疫增強劑 C ： 單磷酰脂質 A 濃度為 3.12mg/mL， 胞壁酰二肽濃度為 15.6mg/ mL， β- 葡聚糖為 1.56mg/mL。 [0069] 配制免疫增強劑 D ： 單磷酰脂質 A 濃度為 20.8mg/mL， 胞壁酰二肽濃度為 125mg/ mLβ- 葡聚糖為 4.17mg/mL 配制方法如下 ： （1） 配制水相溶液 ： 將單磷酰脂質 A、 胞壁酰二肽和 β- 葡聚糖溶于水， 得到母液， 將母 液與吐溫 -80 按照體積比為 96:4 混合， 得到水相溶液 ； （2） 配制油相溶液 ： 將白油和司盤 -80 按照體積比為 96:4 混合， 得到油相溶液。 [0070] （3） 將水相溶液與油相溶液按照體積比為 1:2 混合乳化后， 得油乳劑型的免疫增 強劑。 [0071] 實施例 6 免疫增強劑對豬流行性腹瀉滅活疫苗的影響 1. 實驗材料 滅活的豬流行性腹瀉病毒液 （毒株 ： PEDV NJ 株） ， 滅活前毒價 5x107TCID50/mL。將滅活 的豬流行性腹瀉病毒液作為水相溶液。將白油佐劑和水相溶液按照體積 2:1 混合均勻后乳 化制得豬流行性腹瀉滅活疫苗。 [0072] 將免疫增強劑 B、 C 和 D 分別與豬流行性腹瀉滅活疫苗按照體積比為 1:9 混合均 說 明 書 CN 103083663 A 9 8/10 頁 10 勻， 獲得豬流行性腹瀉滅活疫苗 B、 C 和 D。 [0073] 2. 分組、 免疫及檢測 將健康易感仔豬隨機分成五組， 每組20頭。 將豬流行性腹瀉滅活疫苗B、 豬流行性腹瀉 滅活疫苗 C、 豬流行性腹瀉滅活疫苗 D 和豬流行性腹瀉滅活疫苗各免疫一組仔豬， 免疫劑量 為 2mL/ 頭， 免疫方法為肌肉注射。留一組仔豬不免作為空白對照。 [0074] 免疫后 14、 28、 60、 74 天采血， 超凈臺內無菌分離血清， 檢測血清的中和抗體 （中和 抗體滴度大于 1:32 為抗體陽性） 。計算各組仔豬血清的中和抗體平均滴度， 具體結果見圖 3. 從圖 3 可以看出， 豬流行性腹瀉滅活疫苗 B、 C 和 D 免疫后 14 天， 中和抗體的平均滴度就 合格， 隨后一直升高直到 74 天， 說明免疫增強劑 B、 C 和 D 能夠縮短滅活疫苗的免疫窗口期， 延長保護期， 提高抗體水平。而豬流行性腹瀉滅活疫苗免疫后 60 天， 中和抗體平均滴度才 合格， 到 72 天的時候又下降到合格抗體水平之下。 [0075] 3. 安全性實驗 分組和免疫 ： 將 6-7 周齡健康易感仔豬分為四組， 每組 10 頭。其中一組每頭免疫 2ml 豬流行性腹瀉滅活疫苗 D ； 二組免疫 4ml 豬流行性腹瀉滅活疫苗 D ； 三組免疫兩次豬流行性 腹瀉滅活疫苗 D， 兩次之間間隔 14 天， 免疫劑量為每次 2ml/ 頭。四組不免作為空白對照。 [0076] （1） 觀察方法 其中一組、 二組、 四組仔豬， 均在免疫后第14天， 從各組中隨機抽出5只剖殺， 觀察疫苗 吸收情況 ； 在免疫后第 28 天， 取剩余的仔豬全部剖殺， 觀察疫苗吸收情況。 [0077] 三組仔豬， 在第二次免疫結束后， 第14天從各組中隨機抽出5只剖殺， 觀察疫苗吸 收情況 ； 免疫后第 28 天， 取剩余的仔豬全部剖殺， 觀察疫苗吸收情況。 [0078] 免疫后連續觀察 28 天， 記錄是否出現任何發病癥狀。 [0079] (2) 結果 觀察的結果如表 5 所示 表 5 豬流行性腹瀉滅活疫苗 D 吸收情況 從表中可以看出采用本發明免疫增強劑制備的豬流行性腹瀉滅活疫苗對豬是安全的。 [0080] 實施例 7 免疫增強劑對豬圓環滅活疫苗影響 1. 實驗材料 試驗動物為 3-4 周齡健康易感仔豬。 [0081] 豬圓環病毒 2 型 ELISA 抗體檢測試劑盒購自武漢科前動物生物制品有限公司， 用 于檢測血清的 ELISA 抗體。 說 明 書 CN 103083663 A 10 9/10 頁 11 [0082] 豬圓環病毒 2 型滅活病毒液 （毒株 PCV2 NJ ） ， 滅活前毒價 106.5TCID50/mL。先將 ISA206 和豬圓環病毒 2 型滅活病毒液， 分別放置于室溫， 大約 30 分鐘。將 ISA206 放入乳化 罐中， 在 200 轉 / 分， 將豬圓環病毒 2 型滅活病毒液放入乳化罐中， 攪拌均勻 ； 在 2000 轉 / 分攪拌 10 分鐘， 得到豬圓環病毒滅活疫苗。其中豬圓環病毒 2 型滅活病毒液與 ISA206 的 體積比為 46:54。 [0083] 將免疫增強劑 B、 C 和 D 分別與豬圓環病毒滅活疫苗按照體積比為 1:9 混合均勻， 獲得豬圓環病毒滅活疫苗 B、 C 和 D。 [0084] 2. 分組、 免疫和檢測 將健康易感仔豬隨機分成五組， 每組 10 頭。將豬圓環病毒滅活疫苗 B、 豬圓環病毒滅 活疫苗C、 豬圓環病毒滅活疫苗D和豬圓環病毒滅活疫苗各免疫一組仔豬， 免疫劑量為2mL/ 頭， 免疫方法為頸部肌肉注射。留一組仔豬不免作為空白對照。 [0085] 將各組仔豬， 免疫后 21 天采血分離血清， 檢測血清的 ELISA 抗體。當樣品 OD630值 ＞ 0.42， 判為陽性。計算各組仔豬免疫后的平均抗體水平， 具體結果見圖 4. 從圖 4 可以看 出， 仔豬免疫豬圓環病毒滅活疫苗 B、 C 和 D 后 21 天， OD630值均達到陽性值之上， 而免疫豬 圓環病毒滅活疫苗的仔豬血清 ELISA 抗體沒有達到陽性。可見免疫增強劑 B、 C 和 D 具有明 顯的免疫增強效果， 縮短免疫窗口期， 提高血清抗體水平。 而且， 只需要免疫一次， 即可達到 陽性， 降低生產成本， 減少對豬體的應激， 提高生產效率。 [0086] 3. 安全性實驗 分組和免疫 ： 將 6-7 周齡健康易感仔豬分為四組， 每組 10 頭。其中一組每頭免疫 2ml 豬圓環病毒滅活疫苗 D ； 二組免疫 4ml 豬圓環病毒滅活疫苗 D ； 三組免疫兩次豬圓環病毒滅 活疫苗 D， 兩次之間間隔 14 天， 免疫劑量為每次 2ml/ 頭。四組不免作為空白對照。 [0087] （2） 觀察方法 其中一組、 二組、 四組仔豬， 均在免疫后第14天， 從各組中隨機抽出5只剖殺， 觀察疫苗 吸收情況 ； 在免疫后第 28 天， 取剩余的仔豬全部剖殺， 觀察疫苗吸收情況。 [0088] 三組仔豬， 在第二次免疫結束后， 第14天從各組中隨機抽出5只剖殺， 觀察疫苗吸 收情況 ； 免疫后第 28 天， 取剩余的仔豬全部剖殺， 觀察疫苗吸收情況。 [0089] 免疫后連續觀察 28 天， 記錄是否出現任何發病癥狀。 [0090] (2) 結果 觀察的結果如表 6 所示 表 6 豬圓環病毒滅活疫苗 D 吸收情況 說 明 書 CN 103083663 A 11 10/10 頁 12 從表中可以看出采用本發明免疫增強劑制備的豬圓環病毒滅活疫苗對豬是安全的。 說 明 書 CN 103083663 A 12 1/2 頁 13 圖 1 圖 2 說 明 書 附 圖 CN 103083663 A 13 2/2 頁 14 圖 3 圖 4 說 明 書 附 圖 CN 103083663 A 14