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受體型激酶調節劑和多囊性腎病的治療方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201180051631.0

申請日:

2011.08.25

公開號:

CN103313713B

公開日:

2014.12.31

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 31/517申請日:20110825|||公開
IPC分類號: A61K31/517; A61P13/12 主分類號: A61K31/517
申請人: 和諧進化股份有限公司
發明人: P·弗羅斯特; W·W·N·寥; E·K·羅文斯基
地址: 美國馬里蘭州
優先權: 2010.08.26 US 61/377,211
專利代理機構: 上海專利商標事務所有限公司 31100 代理人: 陶家蓉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201180051631.0

授權公告號:

103313713B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.31|||2013.10.23|||2013.09.18

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明包括治療哺乳動物多囊性腎病(PKD)的方法,該哺乳動物例如人或貓(例如波斯貓),該方法包括向哺乳動物給予治療有效量的式的化合物。還提供所述化合物在制備治療PKD的藥物中的應用以及用于治療PKD的上述化合物和包含其的組合物。

權利要求書

權利要求書
1.   一種治療哺乳動物PKD的方法,所述方法包括給予治療有效量的式

的化合物,或其藥學上可接受的鹽。

2.   如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述哺乳動物是人。

3.   如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述哺乳動物是貓。

4.   如權利要求3所述的方法,其特征在于,所述貓是波斯貓。

5.   如權利要求1?4中任一項所述的方法,其特征在于,所述化合物以藥物組合物的形式遞送,所述藥物組合物包含所述化合物或其鹽以及藥學上可接受的載體、賦形劑、和/或稀釋劑。

6.   一種式

的化合物或其藥學上可接受的鹽在制造治療哺乳動物PKD的藥物中的應用。

7.   如權利要求6所述的應用,其特征在于,所述哺乳動物是人。

8.   如權利要求6所述的應用,其特征在于,所述哺乳動物是貓。

9.   如權利要求8所述的應用,其特征在于,所述貓是波斯貓。

10.   一種化合物或包含用于治療哺乳動物PKD的化合物的組合物,其中所述化合物具有式


11.   如權利要求10所述的化合物或組合物,其特征在于,所述哺乳動物是人。

12.   如權利要求10所述的化合物或組合物,其特征在于,所述哺乳動物是貓。

13.   如權利要求12所述的化合物或組合物,其特征在于,所述貓是波斯貓。

說明書

說明書受體型激酶調節劑和多囊性腎病的治療方法
相關申請的交叉參考
本申請要求2010年8月26日提交的美國臨時申請61/377,211的優先權,其內容通過引用全文納入本文。
技術背景
技術領域
本發明涉及化合物,該化合物調節多種蛋白激酶的酶活性以影響細胞活性例如增殖、分化和程序性細胞死亡。具體地,本發明涉及喹唑啉,該喹唑啉抑制、調控和/或調節一系列上文所述與細胞活性變化有關的激酶和受體信號轉導通路、包含這些化合物的組合物和用其治療激酶依賴性疾病和病癥的方法。更具體地,本發明涉及下調多囊性腎病(PKD)進展中一組獨特活性激酶的激酶抑制劑化合物的應用和治療PKD的方法。
相關技術概述
靶向治療的發展起初聚焦于能特異性靶向癌細胞增殖所必需的選定激酶的藥物研究。該選擇性研究的目的在于試驗和限制毒性。該方法通常無法成功,因為由于已知540種激酶的活性激酶結構域存在“重疊”和同源性而難以實現單一的激酶靶標抑制。其次,逐漸清楚聚焦靶向的結果是選擇能避免通路中任何單一抑制點的細胞。目前的觀點傾向于靶向單一或多個通路中的多個位點。可將該腫瘤學經驗中得到的觀察結果應用到其它疾病中(如下所述)。
蛋白激酶是催化蛋白質磷酸化的酶,尤其是蛋白質的酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基上的羥基。該看似簡單的活性結果驚人,其可影響細胞分化和增殖。實際上細胞生命在單向或另一方向中的所有方面依賴蛋白激酶活性。因此,異常的蛋白激酶活性與宿主紊亂有關,范圍從相對非危及生命疾病例如銀屑病到極其致命疾病例如角質母細胞瘤(腦癌)。
蛋白激酶可分為受體型或非受體型。受體型酪氨酸激酶具有細胞外、跨膜和細胞內結構域,而非受體型酪氨酸激酶都在細胞內。
受體型酪氨酸激酶包括大量具有不同生物活性的跨膜受體。事實上,已鑒定了大約20個不同亞家族的受體型酪氨酸激酶。一種稱為HER亞家族的酪氨酸激酶亞家族包括EGFR(HER1)、HER2、HER3和HER4。已鑒定的該亞家族受體配體目前包括表皮生長因子、TGF?α、雙調蛋白、HB?EGF、β動物纖維素和調蛋白。這些受體型酪蛋白激酶的另一亞家族是胰島素亞家族,其包括INS?R、IGF?IR和IR?R。PDGF亞家族包括PDGF?α和β受體、CSFIR、c?kit和FLK?II。另外還有FLK家族,其包括激酶插入結構域受體(KDR)、胎兒肝臟激酶?1(FLK?1)、胎兒肝臟激酶?4(FLK?4)和fms?樣酪氨酸激酶?1(flt?1)。通常一起考慮PDGF和FLK家族,因為所述兩組具有相似性。為更具體地討論受體型酪氨酸激酶,可參見Plowman等,1994DN&P7(6):334?339,其通過引用納入本文以用于所有目的。
非受體型酪氨酸激酶也包含許多亞家族,包括Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes/Fp、Fak、Jak、Ack和LIMK。各個這些亞家族進一步細分為不同受體。例如,Src亞家族是最大的家族之一,包括Src、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr和Yrk。Src亞家族酶與癌發生有關。為更具體地討論非受體型酪氨酸激酶,可參見Bolen,Oncogene,8:2025?2031(1993),其通過引用納入本文以用于所有目的。
蛋白激酶活性的失調會導致細胞特性改變,例如與癌相關的不受控細胞生長。除了腫瘤學表現,改變的激酶信號轉導涉及許多其它病理性疾病。這些疾病包括但不限于:免疫紊亂、心血管疾病、炎性疾病和變性疾病。因此,受體和非受體蛋白激酶是小分子藥物開發中具有吸引力的靶標。
激酶調節的治療性應用中一個特別吸引人的目標涉及腫瘤學表現。例如,已成功證實用于癌癥治療的蛋白激酶活性調節,用獲得FDA批準的(甲磺酸伊馬替尼,新澤西州東漢諾威的諾華制藥公司(Novartis Pharmaceutical Corporation))以治療慢性骨髓性白血病(CML)和腸胃道間質瘤(GIST)。伊馬替尼是c?Kit和Abl激酶抑制劑。
細胞增殖和血管發生(腫瘤生長和存活所需的兩個關鍵細胞過程(Matter A.2001Drug Disc Technol6:1005?1024)的調節(特別是抑制)是小分子藥物開發中吸引人的目標。抗血管治療代表一種可能的重要治療方法,該方法用于治療與失調血管化有關的實體瘤和其它疾病,包括缺血性冠狀動脈病、糖尿病視網膜病變、銀屑病和風濕性關節炎。細胞抗增殖因子也適于減緩或終止腫瘤生長。
EGF、VEGF和肝配蛋白信號轉導的抑制會阻止細胞增殖和血管發生,這是腫瘤生長和存活所需的兩個關鍵細胞過程(Matter A.2001Drug Disc Technol6:1005?1024)。VEGF受體是上文所述的小分子抑制靶標。
Eph受體包括最大受體酪氨酸激酶家族并在其序列同源性的基礎上分為兩組即EphA和EphB。Eph受體的配體是肝配蛋白,其為膜錨定。肝配蛋白A配體優選結合EphA受體而肝配蛋白B配體結合EphB受體。肝配蛋白與Eph受體的結合引起受體自身磷酸化并一般需要細胞?細胞相互作用,因為受體和配體兩者都是膜結合。
Eph受體的過度表達與各種腫瘤中增加的細胞增殖有關(Zhou R1998Pharmacol Ther.77:151?181;Kiyokawa E、Takai S、Tanaka M等1994Cancer Res 54:3645?3650;Takai N Miyazaki T、Fujisawa K、Nasu K和Miyakawa.2001Oncology Reports8:567?573)。該Eph受體酪氨酸激酶家族和其肝配蛋白配體在胚胎發育期間各過程以及病理性血管發生和潛在性轉移中起重要作用。因此Eph受體激酶活性的調節應提供治療或預防疾病狀態的方法,該疾病與異常的細胞增殖(例如上文所述的那些)有關。
表皮生長因子受體(EGFR,HER1,erbB1)是質膜受體酪氨酸激酶家族的一部分,其調控細胞生長、增殖和凋亡。EGFR配體是表皮生長因子且EGFR信號轉導通路失調涉及腫瘤生成和癌發展,因此使其成為新型抗癌治療的臨床相關靶標(Drevs J等2003Curr Drug Targets4,113?121;Ciardiello F和Tortora G.2001Clin.Cancer Res.7:2958?2970;Thomas M.2002Semin Onc.Nurs.18:20?27)。
EGFR在不同的人類癌癥中表達,尤其在非小細胞肺癌和成膠質細胞瘤中。在這些癌中,EGFR過度表達通常與晚期疾病和較差的預后有關(Baselga J等,1999Semin.Oncol.26:78?83)。
“多囊性腎病”(PKD)指一組單基因病,其引起雙側腎囊腫發展最終導致腎衰竭。PKD是所有威脅生命的遺傳疾病中最常見的疾病,且影響全球12?1500萬人。PKD有兩種主要形式:常染色體隱性(ARPKD)和常染色體顯性(ADPKD)。ARPKD是該疾病的較低頻遺傳形式,其常常在出生的第一個月中引起顯著死亡率。ARPKD由PKHD1基因突變引起,而ADPKD由PKD1或PKD2基因突變引起(因此這些種形式稱為1型或2型ADPKD)。這些單一突變使腎小管細胞維持其平面極性(器官中的位置)和調控其增殖的能力發生顯著變化。ADPKD是最常見的遺傳病。因為每個個體具有一個遺傳自其非攜帶父母的正常等位基因,顯性突變基因無法體現其作用直到正常的等位基因喪失或失活。因此,一些患者在兒童期發展癥狀而大部分直到40歲才有癥狀,這取決于正常等位基因何時喪失。認為PKD相關臨床發現的生化機理涉及鈣離子通道異常。
如上所述,PKD的表征是雙側形成并生長多個囊腫導致腎結構改變、腎單位變性和腎衰竭。ADPKD中,腎小管細胞增殖時形成囊腫,這導致正常腎小管流堵塞。形成囊腫內襯的腎小管細胞維持其正常分泌功能,并使該囊腫填充有含許多受體配體(信號蛋白)的液體,該受體配體例如TGF?α和EGF(Wilson SJ等2006Biochim Biophys Acta Jul;1762(7):647?55)。隨著囊腫增大,該腎在晚期疾病中增大至20?30磅。
ADPKD患者的人臨床癥狀包括腹痛和脅腹痛(隨著囊腫增大)、高血壓、肝囊腫、血尿感染和最終腎衰竭。沒有預防PKD發展的特異性治療(Grantham JJ2008NEJM359:1477?1485)。
相似地,PKD影響大約全球38%波斯貓,這使其成為最顯著的貓科遺傳疾病(Young AE等,2005Mammalian Genome16:59–65)。其模擬人疫病且繼發于PKD1基因突變。
發明內容
已提出許多策略用于治療PKD,但鮮有應用。我們在本文中提出一種治療模式,該治療模式基于抑制至少四(4)種激酶–三種受體酪氨酸激酶(HER1、HER2和VEGFR)和一種胞質酪氨酸激酶(SRC)。我們的提議著重靶向所有4種激酶的需要以實現對PKD發展的有效抑制。
因此,一方面,本發明涉及用本文所述化合物和組合物治療PKD的方法。
另一方面,本發明包括用本文所述化合物和組合物在制造治療PKD的藥物中的應用。
另一方面,本發明包括用于治療PKD的化合物和組合物。
本發明的這些和其他特點和優勢將于下文進一步詳述。
發明詳述
我們認識到,XL?647(也稱為PRIM?001和KD019)和相關化合物(描述于美國專利號7,576,074,其通過引用全文納入本文)在靶向EGFR信號級聯的關鍵元件以及VEGF?R中獨特,VEGF?R如下所述涉及PKD。因此認識到該化合物提供了以單一化合物治療PKD的所有必需抑制。XL?647抗每個靶標的活性效力如此以預測低于腫瘤臨床研究所用的劑量。XL?647的毒性低于各單獨使用的單一靶向試劑,并且顯然毒性低于組合使用的那些試劑。因此XL?647在PKD中的應用提供了抗關鍵靶標的廣譜活性,并增加了降低VEGF?R活性和可能改善腎臟安全性概況的益處。
Du和Wilson提供了表皮生長因子受體(EGFR)在PKD中作用的早期描述(Grantham JJ2008NEJM359:1477?1485;Wilson PD等,1993Eur J Cell Biol Jun;61(1):131?8;Du J和Wilson PD1995Am J Physiol Cell Physiol269:C487?C495),并由Sweeney和Avner擴展(weeney WE和Avner ED1998Am J Physiol275:387?394)。細胞系來自種間交配育種的bpk小鼠(ARPKD的鼠模型)和Immorto小鼠(Sweeney WE等2001Am J Physiol Cell Physiol281:1695?1705)。這些動物發展增大的囊性腎臟以及膽管擴張,導致腎衰竭和肝臟異常。囊性細胞系在體外建立并證實將EGFR錯誤定位至其頂端表面。這點被體內確定并由Wilson和Du證實(Wilson PD等1993Eur J Cell Biol Jun;61(1):131?8;Du J和Wilson PD1995Am J Physiol Cell Physiol269:C487?C495),他們還證實TGF?α和EGF在PKD的腎小管細胞增殖中的作用。另外,人囊腫液顯示含有EGF和TGF?α(Wilson SJ等2006Biochim Biophys Acta Jul;1762(7):647?55;Klinger R等1992Am J Kidney Dis19(1):22?30)。EGFR的錯誤定位在另外的ARPKD和ADPKD鼠模型以及人組織中得以驗證(Wilson PD等1993Eur J Cell Biol Jun;61(1):131?8;Du J和Wilson PD1995Am J Physiol Cell Physiol269:C487?C495;Avner ED和Sweeney WE1995Pediatr Res37:359A;Orellana SA等1995Kidney Int47:490?499;Richards WG等1998J Clin Invest101:935?939)。Pugh等(Pugh JL等1995Kidney Int47:774?781)進一步表明PKD中提高的EGFR酪氨酸激酶活性。最后,將EGFR亞等位基因(waved?2)雜交到帶有orpk(Oak Ridge多囊腎)小鼠突變的囊腫小鼠中,這顯著降低EGFR活性和囊腫形成(Richards WG等1998J Clin Invest101:935?939)。后續研究已表明EGFR配體在促進囊腫生成疾病(cytogenic disease)中的潛在作用。EGF和TGF?α都能在體引起外囊腫生成(Pugh JL等1995Kidney Int47:774?781;Avner ED和Sweeney WE1990Pediatr Nephrol4:372?377;Neufield TK等1992Kidney Int41:1222?1236)。囊性腎提高了EGF?αRNA表達且來自PKD鼠的腎囊腫液和大鼠模型含有促有絲分裂濃度的多種EGF肽(Lowden DA等1994J Lab ClinMed124,386?394)。
雖然突變PKD基因產生EGFR異常的確切機制還未明確鑒定,但評估EGFR抑制對PKD嚙齒動物模型中囊腫發展的作用是合理的。Sweeney等(Sweeney WE等2000Kidney Int57:33?40)表明用EGFR激酶抑制劑(EKI?785)治療bpk小鼠對預防PKD發展有效。以EKI?785維持的小鼠存活時間長但移除該藥物時會發展(Sweeney等2000Kidney Int57:33?40)。該發現通過使用兩種不同EGFR抑制劑來確定。
通過證實抑制EGFR配體釋放也可改善PKD來進一步支持證明EFGR在PKD中的作用。用TACE(TNF?α轉化酶)抑制劑治療bpk小鼠引起小鼠腎尺寸減小并增加動物存活(Dell KM等2001Kidney Int60:1240?1248)。TACE是金屬蛋白酶家族成員,其功能是加工前多肽原以切碎活性肽。PKD中,TACE酶ADAM?17抑制會減少TGF?α釋放致使EGFR活化降低。
Wilson等的后續分析(Wilson SJ等2006Biochim Biophys Acta Jul;1762(7):647?55)進一步表明HER?2作為EGFR復合物錯誤定位一部分的作用。在一些動物模型中,HER?2似乎是誘導管細胞增殖的主導EGFR。PCK大鼠模型中,特異性HER?2抑制劑(已測兩種)有效防止PKD發展。有一些爭論提出異二聚體和HER?1和HER?2是疾病發展的主要因素(Wilson SJ等2006Biochim Biophys Acta Jul;1762(7):647?55)。因此雙功能HER?1/HER?2激酶抑制劑更有可能在治療中有效。
EGFR活化產生事件級聯,最終影響DNA轉錄因子和蛋白的產生。來自EGFR的信號轉導事件中關鍵元素之一由胞質酶SRC介導。如果抑制EGFR激酶結構域可抑制疾病發展,通過抑制信號通路成員(例如SRC)會發生相同結果是合理的。將SRC選為靶標,因為其通過影響至少兩個信號通路(MER/ERK和PKA/bRAF)中的多個步驟來作用。另外,已知SRC促進EGFR活性并增強下游靶標的EGFR磷酸化(Browman PA等2004Oncogene23:7957–68;Roskoski R2005Biochem Biophys Res Commun331:1?14)。SRC還會促進細胞膜上的MMP活化并增強配體釋放。用SRC抑制劑SKI?606治療bpk小鼠或PCK大鼠可改善HER?1和HER?2依賴性嚙齒模型中的腎囊腫形成和膽管異常(Roskoski R2005Biochem Biophys Res Commun331:1?14)。SRC抑制也與減少cAMP升高有關(Roskoski R2005Biochem Biophys Res Commun331:1?14)。
VEGF在傷口愈合和腫瘤形成期間的血管發生中起主要作用。VEGF配體響應缺氧和HIF1?α生成而產生。VEGF存在于PKD囊腫液且被認為是對由囊腫所引起機械性破壞和血管限制而產生的缺氧的應答。VEGR?1和VEGR?2存在于腎內皮細胞中,且推測VEGF通路活化促進囊腫生長,該促進通過與就腫瘤所建議相似的方法培養新生血管形成。因此,抑制VEGFR會防止血管生長并降低腎囊腫增大。
針對HER?1、HER?2或SRC的活性單獨激酶抑制劑(Wilson SJ等2006Biochim Biophys Acta Jul;1762(7):647?55;Lowden DA等1994J.Lab.Clin.Med.124,386?394;Swenney WE等2008J Am Soc Nephrol19:1331?1341)已表明在PKD嚙齒動物模型中有活性。本發明是基于試劑組合會在臨床上更有效且劑量更低。組合治療的使用在腫瘤學中有先例但單一試劑幾乎未被采用過。事實上,通過PKD模型中的實驗已證實該原理,其中我們用EGFR(EKB?569)和TACE抑制劑的組合治療動物。雖然EGFR抑制劑有效減少囊腫形成并維持正常的腎功能;加入TACE抑制劑使EKB?569劑量減少67%,同時實現并相當于單獨EKB?569在較高劑量時的作用(Sweeney WE等2003Kidney Int64:1310?1319)。
雖然理論上可通過簡單改善單獨靶向HER?1、HER?2、SRC和VEGF?R的藥物來使用組合治療,但由于調控復雜性和商業規范的原因,這在實際情況中不可能發生。另外,激酶活性范圍會非常廣泛,導致毒性風險增加。例如,拉帕替尼(Lapatanib)與舒尼替尼(Sunitinib)的組合不僅影響ERB?1、ERB?2和VEGF?R而且靶向ERK?1、ERK?2、AKT、Cyclin?D、PDGFR、cKIT和FLT?3,但不影響SRC。如果將達沙替尼(Dastinib)加入該組合,其會影響SRC但也會影響ABL,并且cKIT和PDGFR的過度抑制也可能增加毒性。此外,這些組合的臨床試驗極其復雜且可能在合理的時間段內不能實現。例如,每種藥物具有不同的PK/PD特性,可能存在重疊毒性因而使給藥方案復雜化。最后,組合來自不同生產商的三種或四種試劑可能成本高昂。
我們已發現XL?647和相關化合物可靶向HER?1、HER?2、SRC和VEGF?R,因此這就避免了需要并克服與組合治療有關的復雜性。
因此本發明的一方面涉及用XL?647或相關化合物或其藥學上可接受的組合物來治療PKD的方法。該藥學上可接受的組合物包括XL?647或相關化合物和藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑。在一些實施方式中,載體是水。在其它實施方式中,載體不是水。
本發明的方法包括將治療有效量的XL?647或相關化合物治療(或其藥學上可接受的鹽)給予有PKD的哺乳動物。在一個實施方式中,XL?647或相關化合物是以藥學上可接受的組合物形式。在一些實施方式中,哺乳動物是人。在其它實施方式中,哺乳動物是貓,例如波斯貓。
在另一方面,本發明包括使用本文公開的化合物或組合物在制造治療哺乳動物(例如人或貓,特別是波斯貓)PKD的藥物中的應用。
在另一方面,本發明包括用于治療哺乳動物(例如人或貓,特別是波斯貓)PKD的化合物和組合物。
XL?647是N?(3,4?二氯?2?氟苯基)?7?({[(3aR,5r,6aS)?2?甲基八氫環戊并[c]吡咯?5?基]甲基}氧基)?6?(甲氧基)喹唑啉?4?胺:

該化合物可根據美國專利7,576,074所述的方法合成(參見實施例14)。
如上文所述以及如本文所用,有關化合物是在美國專利7,576,074中具有式I的那些化合物

或其藥學上可接受的鹽、水合物或前藥,式中:
R1是任選取代有1?3個R50取代基的C1?C3烷基;
R2選自:?H、鹵素、三鹵代甲基、?CN、?NH2、?NO2、?OR3、?N(R3)R4、?S(O)0?2R4、?SO2N(R3)R4、?CO2R3、?C(=O)N(R3)R4、?N(R3)SO2R4、?N(R3)C(=O)R3、?N(R3)CO2R4、?C(=O)R3、任選取代的低級烷基、任選取代的低級烯基和任選取代的低級炔基;
R3是?H或R4;
R4選自任選取代的低級烷基、任選取代的芳基、任選取代的低級芳基烷基、任選取代的雜環基和任選取代的低級雜環烷基;或
R3和R4,與其所連的共同氮一起時,形成任選取代的5至7元雜環基,所述任選取代的5至7元雜環基任選地含有至少一個選自N、O、S和P的額外雜原子;
q是0?5;
Z選自?OCH2?、?O?、?S(O)0?2?、?N(R5)CH2?和?NR5?;
R5是?H或任選取代的低級烷基;
M1是?H、任選由R50取代的C1?C8烷基?L2?L1?、G(CH2)0?3?、或R53(R54)N(CH2)0?3?;其中G是含1或2個環雜原子的飽和5至7元雜環基并任選取代有1?3個R50取代基;L1是–C=O?或?SO2?;L2是直接鍵、?O?、或?NH?;并且R53和R54是任選取代有1?3個R50取代基的獨立C1?C3烷基;
M2是飽和或者單或多不飽和C3?C14單或融合?多環烴基,其每個環上任選地含1、2或3個環雜原子并任選取代有0?4個R50取代基;和
M3是?NR9?、?O?、或缺失;
M4是?CH2?、?CH2CH2?、?CH2CH2CH2?或缺失;
R9是?H或任選取代的低級烷基;
R50是?H、鹵素、三鹵代甲基、?OR3、?N(R3)R4、?S(O)0?2R4、?SO2N(R3)R4、?CO2R3、?C(=O)N(R3)R4、?C(=NR25)N(R3)R4、?C(=NR25)R4、?N(R3)SO2R4、?N(R3)C(O)R3、?NCO2R3、?C(=O)R3,任選取代的烷氧基、任選取代的低級烷基、任選取代的芳基、任選取代的低級芳基烷基、任選取代的雜環基和任選取代的低級雜環烷基;或
兩個R50,一起在同一個碳上時是氧代;或
兩個R50,與其所連的共同碳一起時,形成任選取代的3至7元螺環基,所述任選取代的3至7元螺環基任選地含有至少一個選自N、O、S和P的額外雜原子;且
R25選自?H、?CN、?NO2、?OR3、?S(O)0?2R4、?CO2R3,任選取代的低級烷基、任選取代的低級烯基和任選取代的低級炔基,
并包括美國專利7,576,074公開的亞屬和種類。
XL?647在關鍵鼠模型即ARPKD的BPK模型中是有效的治療劑。ARPKD的BPK模型保留了與鼠和人ADPKD中所見相同的EGFR變化位置。因此該模型廣泛接受為影響PKD(ARPKD和ADPKD)中EGFR異常的總體方法。BPK模型作為BALB/c小鼠近交克隆中的自發性突變產生。純合bpk小鼠發展出大幅增大腎臟并在平均出生后24天(PN?24)死于腎衰竭。未經處理的受影響動物平均死亡年齡為25天,范圍為21?29天。其它的腎表現包括膽道增殖和膽管擴張。由于該疾病的隱性特性,野生型+/+和純合bpk/+小鼠表型正常。用于這些研究的主要測定是比較腎臟重量與體重的比例(KW/BW)。該比例已一致顯示為pkd治療有效性的準確評估。其它測定包括評估腎功能(BUN、肌酸酐和MUCA)和腎臟尺寸的組織學評估以及腎小管?囊腫指數(CT?CI)。
在下文所述的bpk小鼠模型中,相比未經處理的動物,XL?647處理降低了小鼠的腎臟重量與體重比例,7.5mg/kg隔天一次降低了21.5%,15.0mg/kg隔天一次降低了36.7%,以及15.0mg/kg每天一次降低了41.19%。這些比例相當于或優于單一試劑實驗所見的那些(“Src Inhibition ameliorates Polycystic Kidney Disease (Src抑制改善多囊性腎病)”J Am Soc Nephrol19:2008,第1331?1341頁;“Treatment of PKD with a novel tyrosine kinase inhibitor(用新型酪氨酸激酶抑制劑治療PKD)”Kidney International,第57卷,2000,第33?40頁)。以7.5mg/kg每天一次XL?647處理使腎臟重量降低21.8%,以15mg/kg每天一次處理降低40.3%。另外,BUN降低42%和60.5%,肌酸酐降低8.3%和25%,而MUCA改善20.1%和66.2%(分別用于7.5mg/kg每天一次和15mg/kg每天一次)。CT?CI指數分別降低25%和45.8%。這些發現證實XL?647是預防PKD發展的有效方法。
相似地,XL?647在嚙齒模型(PCK大鼠模型)中是有效療法。以7.5mg/kg每天一次和15mg/kg每天一次的XL?647處理分別使腎臟重量降低13.4%和26.0%。這對應經處理PCK(患病)大鼠中KW/BW比例的劑量依賴性降低。7.5mg/kg每天一次和15mg/kg每天一次使CT?CI分別降低19.6%和35.7%。7.5mg/kg每天一次和15mg/kg每天一次使BUN水平分別降低19.2%和28.8%。
以純化形式或合適的藥物組合物給予XL?647或相關化合物或其藥學上可接受的鹽能通過任何可接受的給予方式或用于類似效用的試劑實施。因此,給予可以是,例如,口服、經鼻、胃腸道外(靜脈內、肌內或皮下)、局部、透皮、陰道內、膀胱內、腦池內(intracistemally)或直腸,以固體、半固體、凍干粉或液體劑型(例如片劑、栓劑、丸劑、軟彈性和硬明膠膠囊、粉末、溶液、懸液或氣溶膠等,優選適于簡單給予精確劑量的單位劑型)的形式給予。
該組合物可包含常規藥物載體或賦形劑以及作為活性試劑的本發明化合物,另外,可包含其它醫用試劑、藥用試劑、載體、佐劑等。本發明組合物可與抗癌試劑或其它試劑聯用,所述其它試劑通常給予接受癌癥治療的患者。佐劑包括防腐劑、潤濕劑、助懸劑、甜味劑、調味劑、芳香劑、乳化劑和分散劑。也可通過各種抗細菌劑和抗真菌劑,如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸等確保防止微生物的作用。也可能需要包含等滲劑,如糖、氯化鈉等。可通過使用延遲吸收試劑,例如單硬脂酸鋁和明膠延長可注射藥物形式的吸收。
如果需要,本發明的藥物組合物也可包含少量的輔助性物質,例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、抗氧化劑等,例如檸檬酸、去水山梨糖醇酯、三乙醇胺油酸酯、丁羥甲苯等。
適合胃腸道外注射的組合物可包含生理上可接受的水性或非水性無菌溶液、分散劑、混懸劑或乳劑,以及用于重建成無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。合適的水性或非水性載體、稀釋劑、溶劑或載劑的例子包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等),其合適混合物,植物油(如橄欖油)和可注射有機酯如油酸乙酯。例如可通過使用涂層如卵磷脂、保持所需粒度(在分散液的情況中)以及使用表面活性劑,來維持合適的流動性。
一種優選的給予途徑是通過方便的每日給藥方案口服給予,其可根據待治療的疾病狀態嚴重程度進行調節。
用于口服給予的固體劑型包括膠囊、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。在該固體劑型中,活性化合物混合至少一種常規惰性賦形劑(或載體)例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣或(a)填料或補充劑,例如,淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸,(b)粘合劑,例如,纖維素衍生物、淀粉、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠,(c)潤濕劑,例如甘油,(d)崩解劑,例如,瓊脂?瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、交聯羧甲基纖維素鈉、復合硅酸鹽和碳酸鈉,(e)溶液阻滯劑,如石蠟,(f)吸收促進劑,例如,季銨化合物,(g)濕潤劑,例如,十六烷醇和單硬酯酸甘油酯,硬脂酸鎂等,(h)吸附劑,例如,高嶺土和膨潤土,以及(i)潤滑劑,例如,滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉或其混合物。在膠囊、片劑和丸劑的情況下,劑型還可包含緩沖劑。
可用包衣或外殼,如腸溶衣或本領域熟知的其它材料制備上述固體劑型。它們可含有乳濁劑,或者也可具有以延遲方式在腸道某部分釋放活性化合物的所述組合物。可以使用的包埋組合物的例子是聚合物和蠟。若合適,這些活性化合物與一種或多種上述賦形劑還可采用微囊化形式。
口服給藥的液體劑型包括藥學上可接受的乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。該劑型可通過例如以下方法制備:溶解、分散等本發明化合物,或其藥學上可接受的鹽,和載體中任選的藥用佐劑,例如水、鹽水、水性右旋糖、甘油、乙醇等;增溶劑和乳化劑,例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3?丁二醇、二甲基甲酰胺;油,尤其是棉花籽油、花生油、玉米胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和去水山梨糖醇脂肪酸酯;或這些物質的混合物等,從而形成溶液劑和混懸劑。
除活性化合物外,混懸劑還可含有助懸劑,如乙氧基化異硬脂酰醇、聚氧乙烯山梨糖醇和去水山梨糖酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂?瓊脂和黃芪膠、或這些物質的混合物等。
用于直腸給藥的組合物是例如栓劑,其可通過將本發明化合物與諸如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟(它們在室溫為固態但在體溫下為液態,因此在合適的體腔內融化并在其內釋放活性化合物)等適當的無刺激賦形劑或載體混合而制備。
用于局部給予本發明化合物的劑型包括軟膏劑、粉末劑、噴霧劑和吸入劑。在無菌條件下將活性成分與生理上可接受的載體和任何可能需要的防腐劑、緩沖劑或推進劑混合在一起。眼科制劑、眼膏、粉末劑和溶液劑也視作本發明范圍內。
根據所需的給予方式,通常藥學上可接受的組合物含有約1%?約99%重量的本發明化合物或其藥學上可接受的鹽,以及99%?1%重量的合適藥物賦形劑。在一個實施例中,組合物是約5%?約75%重量的本發明化合物或其藥學上可接受的鹽,其余部分是適合的藥物賦形劑。
制備這種劑型的實際方法是已知的,或對本領域技術人員顯而易見;例如參見Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明頓藥物科學),第18版(賓夕法尼亞州伊斯頓的馬克出版公司(Mack Publishing Company),1990)。在任何情況下待給予的組合物含有治療有效量的本發明化合物或其藥學上可接受的鹽,以根據本發明的教導治療病癥。
給予治療有效量的本發明化合物或其藥學上可接受的鹽,所述治療有效量根據各種因素而變化,包括所用特定化合物的活性、該化合物的代謝穩定性和作用時長、年齡、體重、總體健康狀況、性別、飲食、給予方式和時間、消除速率、聯合用藥、具體病癥的嚴重程度和接受治療的個體。可以每天約0.1?1,000mg范圍的劑量水平向患者給予本發明的化合物。對于體重大約70公斤的正常成人,示例為每天約0.01?約100mg/千克體重的劑量范圍。然而可改變所用的特定劑量。例如,劑量可取決于眾多因素,包括患者需求、待治療的病癥嚴重程度以及所用化合物的藥理學活性。就具體患者確定最優劑量為本領域技術人員熟知。
實施例
體外和體內方案的示例可參見Gendreau SB,Ventura R,Keast P等,Inhibition of the T790M Gatekeeper Mutant of the Epidermal Growth Factor Receptor by EXEL?7647(通過EXEL?7647抑制表皮生長因子受體的T790M門控突變體)Clin Cancer Res3713,13(12)(2007),其通過引用全文納入本文。
化合物制備
對于體外試驗,在DMSO中制備XL?647的10mmol/L母液并在最佳試驗緩沖液或培養基中稀釋。最終DMSO試驗濃度不超過0.3%(v/v)。對于體內研究,口服給予的XL?647通過將干粉(HCL或甲苯磺酸鹽)溶于過濾除菌(0.45μm;NNI公司(Nalge Nunc International))的鹽水(0.9%USP,巴克斯特公司(Baxter Corp.))或無菌水中來配制。通過渦旋混合所有化合物并在水浴中超聲處理以破壞大顆粒。每日新鮮制備所有給藥溶液/懸液。
實施例1
ARPKD的BPK模型
使用ARPKD的BPK模型測試XL?647治療ARPKD的有效性。bpk小鼠具有BALB/c背景,且含有EGFR基因中與鼠和人ADPKD所觀察到的相同突變。這些動物在威斯康星醫學院動物房設施(Medical College of Wisconsin vivarium facilities)中飼養。根據NIH實驗動物管理及使用指南和威斯康星醫學院實驗動物護理和使用委員會的政策進行所有動物實驗。
從出生后第7天(PN?7)開始,來自經證實bpk雜合繁殖動物的完整仔畜包括純合(患病的)以及雜合和野生型動物,其每兩天接受注射7.5或15mg/kg的XL?647,或每天接受注射15mg/kg的XL?647。從PN?7至PN?21處理動物并評價疾病程度。可通過死后存在顯著增大的腎臟來容易地確定bpk+/+動物。第PN?21天終止該實驗并處死動物。測定每只動物的質量。切除每只動物的兩個腎臟并稱重。腎臟重量與體重的比例(KW/BW)通過以下方程式確定:KW/BW=[兩個腎臟的質量]/[動物質量]。
另外,計算腎囊腫指數(CI)。對近端腎管(PT)(翅莢百脈根(lotus tetragonolobus)[LTA])和集合小管(CT)(雙花扁豆凝集素(Dolichos biflorus agglutins)[DBA])特異的凝集素進行染色并用于0?5級的囊腫擴大嚴重性評估。通過心臟穿刺得到的BUN和肌酸酐水平評估腎功能。動物禁水12小時后測定MUCA。
結果示于表1,證實XL?647在經處理bpk小鼠中使腎臟重量顯著降低21.8%(7.5mg/kg每天一次:1.61±0.23)和40.3%(15mg/kg每天一次:1.28±0.09)。經處理后KW/BW降低21.5%(7.5mg/kg每天一次:15.34±1.26)和36.7%(15mg/kg每天一次)。減小的腎臟尺寸也反映,以7.5mg和15mg/kg每天一次處理bpk小鼠使CT?CI分別降低25%和45.8%。
表1:經PRIM?001處理和對照BALB/C和bpk小鼠在PN第21天的重量和腎臟形態


經載劑處理bpk小鼠相比經XL647處理bpk小鼠的p值:*p<0.05;**p<0.001
表2的結果顯示用XL?647處理顯著改善腎功能。7.5mg/kg每天一次和15mg/kg每天一次的處理分別使BUN水平降低42.0%和60.5%,同時分別使肌酸酐水平降低8.3%和25%。經XL?647處理的bpk小鼠中MUCA測量分別改善20.1%和66.2%。使用蛋白質印跡分析確定XL?647有效性。
表2:經PRIM?001處理和對照BALB/C及bpk小鼠在PN第21天時的腎臟功能評價


經載劑處理的患病小鼠相比經XL647處理小鼠的p值:*p<0.05;**p<0.001
實施例2
PCK模型
將XL?647用于ARPKD直向同源模型PCK大鼠模型以測定抑制ErbB2的有效性。PCK大鼠表型不同于人的表型,其疾病發展較慢且腎功能衰退較慢。PCK大鼠來自藤田保健衛生大學(Fujita Health University)Sprague?Dawley大鼠的突變克隆并飼養在威斯康星醫學院。所有動物實驗都根據NIH實驗動物管理及使用指南和威斯康星醫學院實驗動物護理和使用委員會的政策進行。
PN30至PN90中,PCK(患病)大鼠通過強飼接受7.5mg/kg/每天一次和15mg/kg/每天一次的XL?647。在PN90接受最后一次注射后兩個小時將大鼠處死,移除并稱重腎臟和肝臟。死后測量包括用來自皮層、髓和乳突部位(papilla)的腎切片得到的KW/BW比例和囊腫指數(CI)。根據囊腫指數測定CT?CI,其基于PN0至PN135中15天間隔期的腎囊腫尺寸。用心臟穿刺得到的BUN和肌酸酐水平評估腎功能。
表3顯示經XL?647處理的PCK大鼠表現出KW/BW比例顯著下降且腎臟重量相應降低13.4%(7.5mg/kg每天一次:5.77±0.47)和26.0%(15mg/kg每天一次:4.93±0.42)。通過減小腎臟尺寸,CT囊腫變小。表3顯示7.5mg和15mg/kg每天一次的XL?647處理分別使CT?CI降低19.6%和35.7%。
表3:對照SD大鼠以及經載劑和PRIM?001處理的PCK大鼠在PN第90天時的重量和腎臟形態


*載劑處理SD大鼠相比PCK大鼠的p值:p<0.001;**經載劑處理相比經PRIM?001處理的PCK大鼠的p值:p<0.05;***經載劑處理相比經PRIM?001處理的PCK大鼠的p值:p<0.001
表4顯示腎功能測量。接受處理的PCK大鼠的BUN水平降低了19.2%(7.5mg/kg每天一次:27.50±3.74)和28.8%(15mg/kg每天一次:24.25±4.3)。使用蛋白質印跡分析來確定和驗證XL?647有效性。
表4:對照SD大鼠以及經載劑和PRIM?001處理的PCK大鼠在PN第90天時的臨床腎臟化學參數

經載劑處理的患病小鼠相比經XL647處理小鼠的p值:*p<0.05;**p<0.001
實施例3
XL?647抑制的體外生化試驗
用三種實驗模式之一來測定XL?647化合物對數種激酶活性的影響,所述激酶包括EGFR、ErbB2/HER2和KDR/VEGFR2。采用10種不同的抑制劑濃度在384孔微孔板中進行劑量反應實驗。用于各實驗的ATP濃度相當于每種激酶的Km。使用四個變量的方程式通過非線性回歸分析來計算IC50值:Y=min+(max?min)/[1+([I]/IC50)N],其中Y是觀察到的信號,[I]是抑制劑濃度,min是不存在酶的情況下(0%酶活性)的背景信號,max是不存在抑制劑的情況下(100%酶活性)的信號,IC50是在50%酶抑制時的抑制劑濃度,N代表經驗Hill斜率(Hill slope)作為協同性量度。結果總結在表5中。
使用放射性測量的3P?磷酰基轉移激酶試驗測定EphB4、胰島素樣生長因子I受體(IGFR?1)和胰島素受體(IRK)活性。在384孔、白色、透明底、高結合性微孔板(Greiner)上進行反應。用2μg/孔的肽底物以50μL體積包被平板。包被緩沖液含有40μg/mL EphB4和IRK底物聚(Ala?Glu?Lys?Tyr)或IGFR?1底物聚(Glu?Tyr)6:2:5:1(帕金埃爾默公司(Perkin?Elmer))、22.5mmol/L Na2CO3、27.5mmol/L NaHCO3、150mmol/L NaCl和3mmol/L NaN3。室溫孵育過夜后用50μL試驗緩沖液清洗包被平板一次。將測試化合物和5nmol/L EphB4(人EphB4的E605?E890殘基,含有6個組氨酸NH2?末端標簽,在桿狀病毒表達系統中表達并使用金屬螯合色譜純化)、4nmol/L胰島素樣生長因子I受體(人胰島素樣生長因子I受體的M954?C1367殘基,Proqinase公司)或15nmol/L胰島素受體1(人胰島素受體l受體的P948?S1343殘基,Proqinase公司)與[33P]g?ATP(5μmol/L,3.3μCi/nmol)在20μL總體積中混合。反應混合物在室溫孵育1.5至2.5小時并通過抽吸終止反應。然后用0.05%吐溫PBS緩沖液清洗微孔板6次。加入閃爍液(50μL/孔)并通過液體閃爍光譜法使用MicroBeta閃爍計數儀(帕金埃爾默公司)測定引入的33P。
使用螢光素酶偶聯的化學發光試驗來測定EGFR和KDR(VEGFR2)活性。使用螢光素酶-螢光素偶聯的化學發光法在激酶反應后由消耗的ATP百分數測定激酶活性。在384孔、白色、中等結合微孔板(葛萊娜(Greiner))上進行反應。通過將XL?647、3μmol/L ATP、1.6μmol/L底物(聚(Glu,Tyr)4:1;帕金埃爾默公司)以及EGFR(7nmol/L,人EGFR的H672?A1210殘基,Proqinase公司)或KDR(5nmol/L,人KDR的D807?V1356,Proqinase公司)在20mL體積中混合來起始激酶反應。反應混合物在室溫孵育4小時。激酶反應后,加入20μL等份的激酶Glo(普洛麥格公司(Promega))并用Victor2讀板機(帕金埃爾默公司)測定發光信號。ATP總消耗量限制在50%內。
使用AlphaScreen酪氨酸激酶試驗測定ErbB2和Flt?4活性。使用包被鏈霉親和素的供體珠和包被PY100抗磷酸酪氨酸抗體(帕金埃爾默公司)的受體珠。生物素化聚(Glu,Tyr)4:1用作底物。通過加入供體?受體珠然后形成復合物之后的發光測定底物磷酸化。在384孔、白色、中等結合微孔板(葛萊娜)的20μL試驗緩沖液(20mM TrisHCl、pH7.5、10mM MgCl2、3mM MnCl2、1mM DTT、0.01%曲通)體積中混合測試化合物、3μmol/L ATP、3nmol/L生物素化聚(Glu,Tyr)4:1和1nmol/L ErbB2(人ErbB2的Q679?V1255殘基,Proqinase公司)或Flt?4(人Flt?4的D725?R1298殘基,Proqinase公司)。反應混合物在室溫孵育1小時。通過加入10μL15?30μg/mL AlphaScreen珠懸液猝滅反應,該懸液中含有75mmol/L HEPES(pH7.4)、300mmol/L NaCl、120mmol/L EDTA、0.3%牛血清白蛋白和0.03%吐溫20。室溫孵育2?16小時后,使用AlphaQuest讀取器(帕金埃爾默公司)讀取板。
表5:XL?647的體外激酶抑制概況。
激酶IC50±SD(nmol/L)EGFR0.3±0.1ErbB216±3KDR1.5±0.2Flt?48.7±0.6EphB41.4±0.2Src10.3±2.0IGF1R>10,000InsR>26,000
結果表示為至少三次單獨測定的平均值±SD。
研究EGFR、ErbB2、KDR和EphB4的作用機理確定XL?647是可逆的而且是ATP競爭性抑制劑。將高濃度的酶和XL?647(>>Ki)混合并在冰上孵育2小時。使用以下濃度的酶和XL?647:200nM EphB4,400nM XL?647;0.5nM EGFR;5nMXL?647;3nM KDR,1000nM XL?647。稀釋酶?抑制劑復合物后用標準方法測定酶活性。在相同條件下與DMSO對照處理比較活性。
表6:XL?647對所選激酶的Ki測定。
參數EphB4EGFRErbB2KDR可逆ATP?競爭性KM(μM)(ATP)5.00.52.50.7Ki(nM)10.0530.6
實施例3
XL?647特異性的體外生化篩選
針對藥理學靶標組進行XL?647特異性評估,所述靶標包括受體、轉運蛋白和酶(NovaScreen公司,馬里蘭州漢諾威)。XL?647在10μM的體外單一濃度時顯示僅和極少藥理學靶標相互作用(表7)。只有人羥色胺轉運蛋白以IC50<1μM(IC50=188nM)受到抑制。也觀察到對毒蕈堿受體、α2腎上腺素受體和多巴胺轉運蛋白的影響,其顯示IC50值為1?2.7μM。
表7:針對XL?647的NovaScreen試驗組
靶標試驗抑制,10μM XL?647IC50(nM)腺苷,非選擇性47.89% 腎上腺素能,α1,非選擇性49.40% 腎上腺素能,α2,非選擇性84.56%1800腎上腺素能,β,非選擇性18.01% 多巴胺轉運蛋白87.14%2480多巴胺,非選擇性34.88% GABA A,激動劑位點1.07% GABA?B*?1.19% 谷氨酸,AMPA位點10.79% 谷氨酸,紅藻氨酸位點0.89% 谷氨酸,NMDA激動劑位點?1.66% 
靶標試驗抑制,10μM XL?647IC50(nM)谷氨酸,NMDA,甘氨酸(Stry?insens位點)*6.46% 甘氨酸,番木鱉堿敏感性12.95% 組胺,H159.82% 組胺,H2*45.68% 組胺,H338.64% 褪黑激素,非選擇性0.18% 褪黑激素,M1(人重組)*98.13%2330褪黑激素,M2(人重組)*98.73%1180褪黑激素,非選擇性,中樞97.91%2570褪黑激素,非選擇性,外周87.74%2650煙堿(a?金杯蛇毒素非敏感性)53.97% 去甲腎上腺素轉運蛋白?5.38% 阿片,非選擇性39.73% 羥色胺轉運蛋白100.94%188羥色胺,非選擇性24.52% Sigma,非選擇性50.90% 雌激素15.75% 睪酮(胞質)18.09% 鈣通道,L型(二氫吡啶位點)46.77% 鈣通道,N型16.82% 鉀通道,ATP敏感性5.02% 鉀通道,Ca2+Act.,VI17.02% 鉀通道,Ca2+Act.,VS22.72% 鈉,位點288.06% NOS(神經元?結合)16.80% GABA A,BDZ,α1,中樞7.34% 白三烯B4,LTB432.17% 白三烯D4,LTD4?11.89% 
靶標試驗抑制,10μM XL?647IC50(nM)血栓烷A2(人)1.51% 促腎上腺皮質素釋放因子,非選擇性32.32% 縮宮素?2.59% 血小板活化因子,PAF*11.72% 促甲狀腺素釋放激素,TRH4.59% 血管緊張素II,AT1(人)6.85% 血管緊張素II,AT216.64% 緩激肽,BK248.81% 膽囊收縮素,CCK1(CCKA)47.54% 膽囊收縮素,CCK2(CCKB)17.12% 內皮肽,ET?A(人)?11.07% 內皮肽,ET?B(人)?13.61% 加蘭肽,非選擇性1.57% 神經激肽,NK120.44% 神經激肽,NK2(NKA)(人重組)*34.23% 神經激肽,NK3(NKB)19.96% 血管活性腸肽,非選擇性17.02% 加壓素132.83% 乙酰膽堿脂酶49.40% 膽堿乙酰轉移酶1.27% 谷氨酸脫羥酶?8.46% 單胺氧化酶A,外周1.66% 單胺氧化酶B,外周2.03% 
XL?647對一組10種酪氨酸激酶(包括胰島素和胰島素樣因子?1受體)和55種絲氨酸?蘇氨酸激酶(包括細胞周期蛋白依賴性激酶、應激活化蛋白激酶和蛋白激酶C同種型)沒有活性。
使用實施例2的生化試驗方法做進一步篩選。以下的表8、表9和表10中總結了對組分和濃度的其他說明。篩選結果列于表11。
表8:放射性測量激酶試驗的試驗組分


表9:AlphaScreen激酶試驗的試驗組分


表10:化學發光激酶試驗的試驗組分



表11:XL?647的進一步體外抑制概況。
激酶IC50±SD(nmol/L)EphA26.8±0.8Flt156.5±15.5PDGFR?α64.4±7.2PDGFR?β345.7±37.0
激酶IC50±SD(nmol/L)c?Kit132.2±8.2c?Abl336.8±3.6FGFR1855.3±96.3Tie?254.0±13.4ZAP?707806.0±655.3c?Met332.0±50.7Fyn41.0±8.1Lck31.0±0.3Blk15Yes1.1Fes474Lyn2CSK402
IC50值超過1μM的酶包括:AMPK、c?Raf、CamKII、CamKIV、CDK1、CDK2、CDK3、CDK5、CDK6、CDK7、CK2、GSK3β、IKKα、IKKβ、JNK1α、JNK2α、JNK3α、MAPK1、MAPK2、PRAK MEK1、MKK4、MKK6、MKK7β、MAP4K3、MAP4K5、p70S6K、PAK2、Plk1、CK1PRAK2、ROCK II、Rsk1、Rsk2、Rsk3、SAPK3、SAPK4、Syk。IC50值超過10μM的酶包括:Chk1、Chk2、Clk1、Clk2、EMK、MAPKAP2、PKBα、PKBβ、PKCα、PKC?γ、PKC?ε、PKC?ζ、PKA、p70S6K、SGK。
實施例4
基于細胞的體內活性試驗
使用A431人表皮樣癌(美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection))、MDA?MB?231人腺癌(喬治城大學(Georgetown University))、H1975NSCLC腺癌(美國典型培養物保藏中心)和Lx?1鱗狀細胞癌(腫瘤藥物開發部,施貴寶公司(Bristol?Myers Squibb))細胞,體內確定XL?647對EGFR的抑制。A431含有過度表達的野生型人EGFR。H1975包含EGFR的活化突變(L858R)和賦予對吉非替尼和埃羅替尼抗性的第二位點突變(T790M)。Lx?1細胞不表達內源性EGFR,而是用來表達外源性EGFR構建體。其它細胞系總結在表12中。
A431和MDA?MB?231細胞系在37°C、5%CO2潮濕培養箱內于DMEM(Mediatech)中作為單層培養物維持和增殖,該DMEM含有L谷氨酰胺并補充有10%的熱滅活胎牛血清(海克隆公司(Hyclone))、100單位/mL青霉素G、100μg/mL鏈霉素(1%青霉素/鏈霉素,Mediatech)和1%非必需氨基酸(Mediatech)。H1975和Lx?1細胞系在完全RPMI1640(30?2,001;美國典型培養物保藏中心;含有L谷氨酰胺并補充有10%的熱滅活胎牛血清,1%青霉素/鏈霉素和1%非必需氨基酸)中于37°C、5%CO2潮濕培養箱內維持。其它細胞系通過標準方法在標準培養基中維持和增殖。
通過基于細胞的EGFR自身磷酸化試驗在A431細胞中體內測定XL?647對野生型EGFR的作用。A431細胞以每孔5x104接種于96孔微孔板(904Costar,VWR)并在完全補充的DMEM中孵育16小時,之后用無血清的DMEM取代生長培養基并將細胞再孵育24小時。向靜息細胞加入無血清培養基中的XL?647(一式三份)連續稀釋物并孵育1小時,之后用100ng/mL重組人EGF(安迪生物(R&DSystems))刺激10分鐘。陰性對照孔不接受EGF。處理后,用冷PBS清洗細胞單層然后立即用冷裂解緩沖液(50mmol/L Tris?HCl(pH8.0)、150mmol/L NaCl、10%甘油、1%NP40、0.1%SDS、0.5%脫氧膽酸鈉、1mmol/L EDTA、50mmol/L NaF、1mmol/L焦磷酸鈉、1mmol/L釩酸鈉、2mmol/L苯甲基磺酸氟、10μg/mL抑肽酶、5μg/mL亮抑氨酸、5μg/mL抑胃酶肽)裂解。將裂解物離心,轉移至96孔鏈霉親和素包被平板上(皮爾斯公司(Pierce)),該板含有與生物素偶聯的小鼠單克隆抗人EGFR(2μg/mL;研究診斷公司(Research Diagnostics))并孵育2小時。用TBST(5mmol/L Tris、150mmol/L NaCl(pH7.2)、0.1%牛血清白蛋白和0.05%吐溫20)清洗平板三次并用與辣根過氧化物酶偶聯的抗磷酸酪氨酸抗體(1:10,000;Zymed實驗室(Zymed laboratories))孵育。加入ELISA Femto底物(皮爾斯公司)后通過用Victor2讀板機讀取平板來測定辣根過氧化物酶活性。IC50值的測定是基于經XL?647處理的總EGFR酪氨酸磷酸化相比單獨生長因子處理的總EGFR酪氨酸磷酸化,根據受體水平標準化。
通過瞬時轉染Lx?1細胞體內測定XL?647對野生型和突變EGFR的作用。使用Lx?1細胞,因為其缺乏背景EGFR活性。使用對應于最長EGFR同種型(Genbank登錄號:NM_005228.3/NP_005219.2#21?176,Upstate生物技術公司)的克隆作為模板來通過定點誘變產生2個突變EGFR基因(編碼L858R和L861Q)。將野生型和兩個已驗證序列的突變轉移到COOH末端帶Flag標簽的逆轉錄巨細胞病毒啟動子驅動的哺乳動物表達載體中。這兩種Tet?On表達載體即EGFR WT(Tet?On)和EGFRvIII(Tet?On)在COOH末端帶標簽Flag,由Abhijit Guha博士(多倫多大學,加拿大安大略省多倫多)慷慨提供。
使用Lipofectamine2000(英杰公司(Invitrogen))根據制造商的方案對Lx?1細胞進行瞬時轉染。對于轉染WT、L858R和L861Q構建體,每次轉染使用1μg質粒DNA(12孔板的各孔中)。對于轉染Tet?調控的EGFR WT和變體III構建體,就每次轉染而言將0.5μg的任一構建體與0.5μg pTet?On質粒(BD生物科學公司(BD Biosciences))組合。轉染后24小時收集細胞并再次接種于96孔板(每孔4x104細胞)以用于化合物處理或12孔板(2x105細胞)以用于免疫印跡試驗。轉染后通過向培養基中加入1μg/mL多西環素來誘導EGFRvIII轉基因表達。在多西環素存在下維持這些細胞以用于剩余實驗。孵育12小時后,所述細胞進行血清饑餓(置于胎牛無血清培養基中)并立即用所示化合物一式三份處理24小時,然后用重組人EGR(100ng/mL)處理10分鐘。每孔中加入125μL放射免疫沉淀試驗緩沖液(波士頓生物制品公司(Boston Bioproducts))來制備全細胞裂解物以用于EGFR磷酸化ELASA或免疫印跡,該試驗緩沖液中除了50mmol/L NaF、1mmol/L焦磷酸鈉、1mmol/L釩酸鈉、2mmol/L苯甲基磺酸氟、10μg/mL抑肽酶和5μg/mL抑胃酶肽以外,還含有蛋白酶抑制劑(蛋白酶抑制劑混合物藥片,羅氏公司(Roche))。
對于EGFR磷酸化ELISA,用2μg/mL與生物素偶聯的抗Flag抗體(西格瑪公司(Sigma))來包被Reacti?結合(Reacti?Bind)鏈霉親和素包被平板(皮爾斯公司)。然后將全細胞裂解物(10μg)加到抗?Flag包被的孔中形成100μL終體積并在室溫孵育2小時然后用TBST清洗3次。用抗磷酸酪氨酸、辣根過氧化物酶偶聯二抗(1:10,000;Zymed公司)檢測磷酸化的EGFR(pEGFR;室溫孵育1小時然后用TBST清洗3次)。加入ELISA Femto底物后通過用Victor2讀板機讀取平板來測定辣根過氧化物酶活性。
表12:XL?647在A431和Lx?1細胞中對WT和突變EGFR磷酸化的抑制

EphB4自身磷酸化ELISA采用EphB4/Hep3B細胞。以2x104細胞/孔在96孔微孔板(Costar3904)的MEME(Cellgro)中接種細胞,該MEME含有10%FBS(熱滅活,海克隆公司)、1%青霉素?鏈霉素(Cellgro)和450μg/ml G418(英杰公司)。然后將細胞在37°C、5%CO2孵育24小時。用無血清的MEME取代生長培養基并將細胞再孵育16小時。向靜息細胞加入新鮮無血清培養基中的XL?647連續稀釋物并孵育1小時,之后用重組小鼠肝配蛋白B2/Fc嵌合蛋白(2μg/ml,安迪生物)和羊抗人IgG/Fc(20μg/ml,皮爾斯公司)的混合物刺激30分鐘。陰性對照孔不經生長因子處理。處理后,移除培養基,用冷PBS清洗該細胞單層并立即用冷裂解緩沖液(50mM Tris?HCl、pH8.0、200mM NaCl、0.5%NP?40、0.2%脫氧膽酸鈉、1mM EDTA、50mM NaF、1mM焦磷酸鈉、1mM釩酸鈉、2mM苯甲基磺酸氟、10μg/ml抑肽酶、5μg/ml亮抑肽酶和5μg/ml抑胃酶肽A)裂解。將裂解物離心并在包被有抗小鼠EphB4(2.5μg/ml,安迪生物)的封閉(1%BSA)高結合性96孔板(Costar3925)上孵育。然后用HRP偶聯的抗磷酸酪氨酸混合物(1:10,000,Zymed實驗室公司(Zymed Laboratories,Inc))對平板進行孵育,之后加入基于氨基苯二酰肼的底物溶液。使用Victor分光光度儀(華萊克公司(Wallac))讀取板。基于經XL?647處理的總EphB4受體酪氨酸磷酸化對比僅經生長因子處理的總EphB4受體酪氨酸磷酸化來測定IC50值。
EphA2自身磷酸化ELISA采用PC?3(ATCC)細胞。以2.5x104細胞/孔在96孔微孔板(Costar3904)的MEME(Cellgro)中接種細胞,該MEME含有10%FBS(熱滅活,海克隆公司)、1%青霉素?鏈霉素(Cellgro)和1%NEAA溶液(Cellgro)。然后將細胞在37°C、5%CO2下孵育16小時。用無血清的DMDEM取代生長培養基且細胞再孵育24小時。向靜息細胞加入新鮮無血清培養基中的連續XL?647稀釋物并孵育1小時,然后用重組小鼠Ephrin A1/Fc嵌合蛋白(1μg/ml,安迪生物)和羊抗人IgG/Fc(10μg/ml,皮爾斯公司)的混合物刺激20分鐘。陰性對照孔不經生長因子處理。處理后,移除培養基,用冷PBS清洗細胞單層并立即用冷裂解液裂解。將裂解物離心并在96孔鏈霉親和素包被平板(皮爾斯)中孵育,該平板包被有生物素偶聯、小鼠抗磷酸酪氨酸PY20(2μg/ml,卡爾生物化學公司(Calbiochem))。用兔多克隆抗EphA2,C?20(1:500,圣克魯斯生物技術公司(Santa Cruz Biotechnology,Inc))孵育平板,然后加入二抗(與HRP偶聯的羊抗兔IgG,1:1000,來自細胞信號轉導公司(Cell Signaling))并加入基于氨基苯二酰肼的底物溶液。使用Victor分光光度儀(華萊克公司)讀取板。基于經XL?647處理的總EphA2受體酪氨酸磷酸化對比僅經生長因子處理的總EphA2受體酪氨酸磷酸化來測定IC50值。
c?Kit自身磷酸化ELISA采用HeLa(ATCC)細胞。以6x105細胞/孔在100mm皿上接種細胞。24小時后,用含有CMV啟動子的哺乳動物表達質粒轉染HeLa細胞,該啟動子操作性連接于C末端有Flag表位標簽的人c?kit開放閱讀框。24小時后,用胰蛋白酶消化已轉染c?Kit的HeLa細胞并以6x103細胞/孔再接種于96孔微孔板(Costar3904)的MEME(Cellgro)中,該MEME含有10%FBS(熱滅活,海克隆公司)、1%青霉素?鏈霉素(Cellgro)和1%NEAA溶液(Cellgro)。然后將細胞在37°C,5%CO2下孵育24小時。向細胞加入新鮮無血清培養基中的XL?647連續稀釋物并孵育1小時然后用重組人SCF刺激(100ng/ml,安迪生物)10分鐘。陰性對照孔不經受刺激。刺激后,移除培養基,用冷PBS清洗細胞單層并立即用冷裂解液裂解。將裂解物在96孔鏈霉親和素包被平板(皮爾斯公司)上孵育,該平板包被有生物素偶聯、羊抗人c?Kit(1μg/ml,安迪生物)。用TBST清洗平板3次,并用與HRP偶聯的抗磷酸酪氨酸((1:10,000,Zymed實驗室公司)或HRP偶聯的抗Flag(M2)(1:2,000,西格瑪公司)孵育。如上所述再清洗平板,然后加入基于氨基苯二酰肼的底物溶液并用Victor分光光度儀(華萊克公司)讀取。標準化后,基于經XL?647處理的c?Kit酪氨酸磷酸化對比僅經SCF處理的c?Kit酪氨酸磷酸化來測定IC50值。
Flt?4自身磷酸化ELISA采用COS細胞。細胞以每孔200,000個細胞接種于6孔板的含10%FBS的DMEM中,并在5%CO2和37°C下生長。生長24小時后,使用3μl FuGENE–6(羅氏公司)用1μg/孔Flt?4cDNA轉染細胞。轉染后24小時用新鮮無血清DMEM中的XL?647處理細胞,然后用300ng/ml VEGF?C刺激10分鐘。用冷PBS清洗細胞單層2次并將其刮下收集到150μl的冰冷裂解緩沖液中。將細胞裂解物在13,000g下離心15分鐘,在冰冷PBS中1:10稀釋,并轉移至透明鏈霉親和素平板(皮爾斯),該平板包被有抗人VEGF?C(Flt?4)的生物素化羊IgG(2μg/孔,安迪生物)。清洗后,使用抗Flag M2小鼠IgG?HRP(西格瑪公司,1比10,000稀釋)或抗磷酸酪氨酸兔IgG?HRP(Zymed公司,61?5820,1:10,000)檢測總Flt?4和磷酸化Flt?4。將樣品標準化,通過將經XL?647處理的Flt?4酪氨酸磷酸化對比僅經VEGF?C處理的Flt?4酪氨酸磷酸化來測定IC50值。
ErbB2自身磷酸化ELISA采用BT474(ATCC)細胞。以3x104細胞/孔在96孔微孔板(Costar3904)的1:1(DMEM:F12K)(Cellgro)中接種細胞,所述DMEM:F12K含有10%FBS(熱滅活,海克隆公司)、1%青霉素?鏈霉素(Cellgro)、1%NEAA溶液(Cellgro)和2%L?谷氨酰胺(Cellgro)。然后將細胞在37°C,5%CO2下孵育40小時。用新鮮無血清培養基中的XL?647連續稀釋物處理細胞并孵育1小時。處理后,移除培養基,用冷PBS沖洗細胞單層并立即用冷裂解液裂解。將裂解物離心并轉移至封閉(1%BSA)的96孔高結合性平板(Costar3925),該平板包被有兔多克隆抗ErbB2(1.3μg/ml,細胞信號轉導公司)。然后用HRP偶聯的抗磷酸酪氨酸混合物(1:10,000,Zymed實驗室公司)孵育平板,之后加入基于氨基苯二酰肼的底物溶液。使用Victor分光光度儀(華萊克公司)讀取板。基于經化合物處理的總ErbB2酪氨酸磷酸化對比無化合物處理的總ErbB2酪氨酸磷酸化來測定IC50值。
表13:XL?647對自身磷酸化的抑制。
酪氨酸激酶細胞IC50(nM)EGFR1EphB43KDR137c?Kit90
Flt?490ErbB2552EphA21100PDGFRβ>1200
實施例5
免疫印跡分析
通過免疫印跡分析經XL?647處理的H1975細胞裂解物。對于H1975免疫印跡研究,每孔(12孔板)中接種3x105個細胞,并在完全RPMI1640中孵育16小時,用胎牛無血清RPMI1640沖洗,并用胎牛無血清培養基中的測試化合物連續稀釋物孵育2小時,之后用100ng/mL人重組EGF刺激10分鐘。如上所述制備全細胞蛋白裂解物并在13,000x g,4°C下離心10分鐘以去除任何不溶性物質。用二辛可寧酸試劑測定總蛋白并根據制造商說明書將等量蛋白與LDS加樣緩沖液(英杰公司)混合。蛋白通過在4%?15%聚乙烯酰胺凝膠上進行凝膠電泳來分離,轉移到硝酸纖維素膜并用免疫印跡檢測。用化學發光法檢測抗體:抗原復合物。以1:1,000稀釋度使用來自細胞信號轉導技術公司的以下抗體:抗EGFR、抗pEGFRTyr1068、抗AKT、抗pAKTSer473、抗ERK和抗pERKThr202/Tyr204。以1:10,000使用抗β肌動蛋白一級抗體(阿曲瑞特化學科學公司(Accurate Chemical and Scientific)),從杰克遜免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)購得與辣根過氧化物酶偶聯的二級抗體并以1:5,000使用。
免疫印跡顯示,30和10μmol/的LXL?647抑制EGFR磷酸化,也抑制EGFR磷酸化下游的AKT和ERK磷酸化。免疫印跡示例可參見Gendreau SB,Ventura R,Keast P等,Inhibition of the T790M Gatekeeper Mutant of the Epidermal Growth Factor Receptor by EXEL?7647(通過EXEL?7647抑制表皮生長因子受體的T790M門控突變)Clin Cancer Res3713,13(12)(2007),其通過引用全文納入本文。
實施例6
A431異種移植模型
從杰克遜實驗室(Jackson Laboratory)和泰克尼克公司(Taconic)分別購得5?8周齡重約20?25克的嚴重混合免疫缺陷雌性小鼠和無胸腺雌性裸鼠。根據Exelixis研究所動物護理和使用委員會所示指南在Exelixis動物房設施中飼養這些動物。所有實驗中,任意提供動物食物和水并在70°F?75°F和60%相對濕度的室內條件下飼養。
處理前,從指數生長的培養物中收集H1975、A431或MDA?MB?231細胞,通過簡單的胰蛋白酶處理將其脫離,用冷HBSS沖洗兩次,重懸于冰冷HBSS中并將其通過皮下(H1975,每小鼠3x106個細胞)或皮內((A431,每小鼠1x106個細胞)植入背部后脅處或皮下植入乳腺脂肪墊中(MDA?MB?231,每小鼠1x106個細胞)。用卡尺每周兩次測定可觸摸腫瘤直到腫瘤平均重量在約80?120mg的范圍中。測定腫瘤重量是通過用卡尺測量垂直直徑并乘以兩個維度的直徑測量:腫瘤體積(mm3)/2=長度(mm)x寬度2(mm2)/2。通過假設轉化因子為1,根據腫瘤體積(mm3)推斷腫瘤重量(mg)。在移植后合適天數將小鼠分組(每組10只小鼠)使小組腫瘤平均重量為約100±15mg。在給藥期間,每周兩次對各對照組和處理組中的每只動物平均腫瘤重量進行測定。在雌性小鼠中建立腫瘤異種移植并在處理前使該腫瘤達到大約100mg。示例描述于Gendreau SB,Ventura R,Keast P等,Inhibition of the T790M Gatekeeper Mutant of the Epidermal Growth Factor Receptor by EXEL?7647(通過EXEL?7647抑制表皮生長因子受體的T790M門控突變)Clin Cancer Res3713,13(12)(2007),其通過引用全文納入本文。
通過將治療組的平均腫瘤重量與合適對照組作比較來測定腫瘤對處理的響應。用以下方程式測定腫瘤生長的百分數抑制。百分數抑制=100x[1?(Xf?Xo)/(Yf?Yo)],其中Xf和Yf分別是在第f天時處理組和對照組的平均腫瘤重量,Xo和Yo分別是第0天處理組和對照組的平均腫瘤重量(分組后的分期腫瘤重量)。
為了在口服給予XL?647后測定血漿中的化合物水平,將全血液置于冰上的肝素化Eppendorf管中并在20,000x g離心4分鐘。將血漿上清液(50μL)加入100μL內標溶液(含250ng/mL內標的乙腈),通過渦旋混合并離心。通過LC/MS/MS分析分析樣品提取物(20μL)的XL?647。使用真實標準曲線計算血漿水平。XL?647的定量極限為0.004μmol/L(2ng/mL)。就每個時間點計算平均值和SD并評估劑量濃度。
對于H1975、MDA?MB?231和其它異種移植的免疫組化分析,施以安樂死后切除腫瘤并在加工成石蠟塊前于鋅固定劑(BD生物科學公司(BD Biosciences))中固定48小時。在每個腫瘤的盡可能大的表面區域以5μm獲得連續切片并用標準方法染色。使用以下抗體:Ki67(SP6;Labvision)、CD31(MECA.32;BD生物科學公司、pERKThr202/Tyr204(磷酸?p44/42絲裂原活化蛋白激酶;細胞信號轉導技術公司)、pAKTSer473(細胞信號轉導技術公司)、和pEGFRTyr1068(細胞信號轉導技術公司)。對于免疫熒光染色,切片隨后用與Alexa594偶聯的羊抗兔二級抗體(英杰公司)孵育,并在含有4’,6?二脒基?2?苯基吲哚的熒光封固劑(Fluorescent Mounting Medium)(DAKO)中封固作為核復染。使用Zeiss AxioImager呈現熒光染色并使用連接AxioVision圖像分析軟件的Zeiss高分辨率照相機進行數字捕獲。根據通過Metamorph軟件(UIC公司(Universal Imaging Corp.))的集成形態測量分析功能根據組織學讀取和定量分析,以200或400倍的放大倍數捕獲2至3個非重疊代表性視野。根據生產商的說明書(羅式診斷公司(Roche Diagnostics GmbH))使用末端脫氧核糖轉移酶介導的原位dUTP缺口末端標記細胞死亡檢測試劑盒來檢測凋亡細胞。
每個腫瘤切片中的CD31陽性腫瘤血管、Ki67陽性增殖細胞、和pERK染色使用ACIS自動細胞成像系統(科萊恩公司(Clarient,Inc.))的綜合形態測定分析功能進行鑒定和定量,并由盲觀察者檢查。CD31陽性血管數目通過在100倍放大可視腫瘤組織的5?10個隨機選擇相等尺寸視野中確定,并計算為就每個腫瘤而言每平方毫米的血管數目、對各處理組取平均值并與經載劑處理的對照作比較。根據可視腫瘤組織的5?10個隨機選擇相等尺寸視野中Ki67陽性細胞除以所鑒定總細胞數的比例來計算百分數Ki67陽性細胞。對各腫瘤組和處理組結果取平均值并與經載劑處理對照作比較。如上所述測定pERK染色水平并計算為抗體染色除以已確定總細胞數的比例,對各處理組取平均值并與載劑處理對照作比較。
結果表示為均值±SD或SE,如每個圖或表格所示。對于A431細胞活力實驗中IC50比較,采用雙樣品斯氏t檢驗來測定每對IC50的P值,假設圍繞劑量反應曲線的重復隨機浮動是對數正態分布,單獨重復用作t檢驗的“樣品尺寸”(一式三份完成9點劑量響應)。為了統計學分析體內研究的免疫組化結果,進行雙尾斯氏t檢驗分析和Bonferroni校正,以確定相較載劑對照組(單一載劑對照組的多種應用)的顯著差異,其中累積最低要求是P<0.05。用單向ANOVA分析H1975功效研究結束時的最終腫瘤重量測定以及H1975異種移植中的百分數pEGFR、pAKT、Ki67指數,CD31和末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記,之后用SNK事后分析(post hoc Student?Newman?Keul analysis)測定XL?647和埃羅替尼間的統計學顯著性。
在A431異種移植小鼠中,每天一次口服給予XL?647(10、30和100mg/kg/天)持續14天可以劑量依賴性方式顯著抑制腫瘤生長。以10毫克/千克/天給予時觀察到65%的腫瘤生長抑制,有證據顯示腫瘤生長停止趨向于研究結束時。100毫克/千克/天的劑量產生顯著的腫瘤消退(起始重量:109±20mg;最終重量:36±15mg)。
免疫組化分析顯示,用XL?647以100mg/kg對無胸腺雌性裸鼠中生長的A431腫瘤每天皮下處理14天會顯著提高總腫瘤壞死的百分數,相對載劑處理的腫瘤提高了2.9倍(表14)。經10、30和100mg/kg的XL?647處理,可視腫瘤組織中的CD31陽性血管百分數顯著降低。對腫瘤血管生成的抑制證實了劑量依賴性。A431腫瘤中Ki67表達細胞的百分數在所有劑量水平都顯著降低,這說明研究結束時腫瘤中的增殖細胞數目降低。
表14:14天給藥方案的A431免疫組化分析概述

MVC,平均血管數;NA,不適用。
數值為均值±SD。
給藥第14天時,通過最終心臟穿刺采集全血液并以質譜法(LC/MS/MS)通過液相色譜測定XL?647的血漿濃度概況。觀察至30和100mg/kg劑量的最終研究劑量給予后24小時,XL?647顯示以微摩爾血漿濃度延長血漿藥物接觸的PK概況。
實施例7
其它異種移植腫瘤學模型
采用數種其它模型來研究XL?647在體內腫瘤生長抑制和腫瘤退化方面的功效和效能。所用的腫瘤細胞系是實體瘤代表并列于表15。根據上文的詳細說明,為這些實驗設計的標準實驗涉及在所建實體瘤達到設定質量(就大部分異種移植模型為約100mg)時開始每天一次口服給予XL?647。在整個給藥期間,每周對腫瘤尺寸測量兩次(可應用時),并每天測量體重。XL?647在這些研究中展現出有效的抗腫瘤活性,就實體瘤觀察到明顯消退。在一些研究結束時切除腫瘤并組織學檢測微血管密度(CD31染色)、增殖細胞(Ki67染色)和壞死(蘇木精/伊紅染色)。腫瘤生長抑制通常與腫瘤壞死增加、腫瘤血管化減少和腫瘤細胞增殖指數降低有關,提示抗血管生成活性作用于XL?647的強效抗腫瘤功效。
通過每天測量體重監控這些研究的耐受性。XL?647看來在小鼠中總體耐受較好,在100毫克/千克/天的14天給藥期間沒有出現明顯的體重下降。
在檢測的系列中,A431和HN5最敏感,有效XL?647劑量引起50%腫瘤生長抑制(ED50),分別在就A431模型給藥14天或28天后于5.9毫克/千克/天和3.8毫克/千克/天估計,低于HN5模型給藥14天后的3毫克/千克/天(概括在表15中)。
表15:人腫瘤異種移植中XL?647的ED50值

431表皮樣癌;BT474,乳腺癌;Calu-6,NSCLC:H1975,含有EGFR活化突變(L858R)和第二位點突變(T790M)的NSCLC,該突變賦予對吉非替尼和埃羅替尼的抗性(Pao等,2005);HN5,頭頸癌;HT?29,結腸癌;MDA?MD?231,乳腺癌;ND,未完成;PC?3,前列腺癌;qd,每天一次。
a ED50=50%腫瘤抑制所需的劑量。荷瘤無胸腺小鼠經XL?647處理14或28天。
表16:14天給藥方案的H1975免疫組化分析概述

MVC,平均血管計數;NA,不適用;TUNEL,末端脫氧核苷酸轉移酶生物素?dUTP缺口末端標記。
數值為均值±SD。
a P<0.0001。
b P<0.005。
表17:14天給藥方案的H1975免疫組化分析磷酸化概括

NA,不適用。
數值為均值±SD。
a P<0.0001。
通過測量口服(PO)給予XL?647后腫瘤異種移植(EGFR,HER2/ErbB2)或鼠肺(VEGFR2/KDR)中受體磷酸化水平用與先前所述相似的方法評估XL?647對靶受體酪氨酸激酶(RTK)(EGFR、HER2/ErbB2、VEGFR2/KDR)活性的體內影響(表18)。
表18:肺和異種移植模型中XL?647對磷酸化的抑制概括

這些藥效學實驗的數據表明,XL?647體內抑制關鍵RTK,該RTK涉及促進腫瘤增殖和血管生成且還涉及PKD(EGFR、HER2/ErbB2、VEGFR2/KDR)。這為以下假設提供了支持:XL?647針對多個異種移植的功效來自抑制腫瘤細胞分裂和宿主內皮細胞應答。總體而言,血漿藥物濃度提高與測試劑量下受體磷酸化抑制增加有良好關聯。100mg/kg單次劑量的XL?647延長抑制受體磷酸化(>72小時)。
比較EGFR抑制的血漿接觸與藥效學顯示劑量依賴性。在A431異種移植中4μM的血漿濃度產生89%的EGFR磷酸化抑制(表19)。基于血漿濃度/磷酸化EGFR抑制關系,預計50%的EGFR磷酸化抑制在0.72μM血漿濃度發生。
表19:XL?647血漿濃度相比EGFR抑制


EGFR,表皮生長因子受體;IC50,抑制50%所需的濃度;SD,標準差。
給予EGF前3.5小時給予XL647。給予EGF后30分鐘測定p?Y?EGFR水平。
XL?647影響腫瘤增殖和血管化的動力學通過切片MDA?MB?231異種移植腫瘤的定量免疫組化和組織學測定,該異種移植腫瘤取自每天用XL?647處理持續3、5或7天的小鼠。通過對Ki67染色測定腫瘤增殖,該染色選擇性鑒定S期細胞。腫瘤血管化程度通過用內皮細胞標記物CD31染色測定(表20)。
表20:XL?647對MDA?MB?231腫瘤細胞增殖和血管化的體內作用

a相對于載劑
100mg/kg的XL?647引起血管化快速下降,3天后明顯抑制76%,7天后腫瘤中幾乎完全喪失內皮細胞。實驗持續期間增殖細胞數目逐漸減少,第7天發現減少50%。
來自這些腫瘤的微血管喪失的快速開始和程度提示XL?647影響新血管系統中的內皮細胞存活,而不是單單抑制正在發生的血管生成。
實施例8
臨床前實施例-非臨床藥代動力學
在小鼠、大鼠、狗和猴中研究XL?647的非臨床藥代動力學(PK)。根據下表21和22所述對動物一次給藥或數天內每天給藥。結果概括也可參見下表21和22。XL?647作為有100%生理鹽水的液體制劑給藥或作為明膠膠囊中的固體以10mg/kg或30mg/kg給藥。單次劑量研究中,全身性藥物接觸(即,AUC)看來大致提高了大鼠(10?100mg/kg)、猴(2?20mg/kg)和狗(3?30mg/kg)中較低劑量范圍的成比例劑量,但低于較高劑量范圍的成比例劑量(大鼠中200?2000mg/kg、猴中5?300mg/kg和狗中100?1000mg/kg)。通過重復地每天給藥觀察到血漿中XL?647的最小(<2倍)累積。平均tmax值大約為4?8小時,血漿終末半衰期范圍為9.41?20.9小時。XL?647PK中沒有觀察到明顯的性別相關差異。所有物種中都觀察到大分布體積(即,靜脈給藥后>18L/kg)。XL?647在小鼠、大鼠和狗中為口服生物可利用。在狗中測得最高的生物利用度(63%?74%),而且就片劑和液體制劑而言相似。
使用標準方法通過超濾所測,XL?647顯示在大鼠、小鼠和人血漿中與血漿蛋白的適度較高蛋白結合,結合為91?96%。平衡透析表明人血漿中XL?647的蛋白結合率為93?97.5%
表21:XL?647的非臨床單劑量藥代動力學
研究種類GLP途徑劑量AUC0?tCmaxt1/2    (mg/kg)(ng·h/mL)(ng/mL)(小時)XL?647?NC?011大鼠po200294701001NA    600412411327NA    2000529611687NAXL?647?NC?001po100M:896940710.4     F:21174110314.2    300M:779393612.7     F:17106160812.1    1000M:27251376913.2     F:34211508816.1XL?647?NC?012po50M:1111948520.5     F:1146561114.8    150M:1453273719.8     F:703237920.4    300M:1511654720.7
研究種類GLP途徑劑量AUC0?tCmaxt1/2    (mg/kg)(ng·h/mL)(ng/mL)(小時)     F:1307860320.9
AUC0?t,從0小時至最后取樣時間點,血漿濃度相比時間的曲線下面積;Cmax,最大血漿濃度;F,雌性;GI,胃腸道的;GLP,良好實驗室管理規范(Good Laboratory Practices);HCT,血細胞比容;HGB,血紅蛋白;LOAEL,可觀察的最低不良影響水平;M,雄性;MTD,最大耐受劑量;NA,未獲得;NOAEL,無可觀察的不良影響水平;po,口服;RBC,紅細胞;t1/2,終末半衰期
表22:XL?647的非臨床重復劑量藥代動力學


A/G比例,白蛋白與球蛋白比例;ALT,丙氨酸氨基酸轉移酶;AST,天冬氨酸轉移酶;AUC0?24,0?24小時血漿藥物濃度時間曲線下面積;BUN,血液尿素氮;Cmax,最大血漿濃度;F,雌性;GI,胃腸道的;GLP,良好實驗室管理規范;HGB,血紅蛋白;HCT,血細胞比容;M,雄性;NA,未獲得;NG,鼻胃的;NOAEL,無可觀察的不良影響水平;po,口服;qd,每日;t1/2,終末半衰期
a最終劑量后測定并以平均值表示,適用于雄性和雌性的組合,除非另有說明
b第7天的毒物代謝動力學值
c基于第7天0?48小時取樣的數值。
實施例9
人臨床實驗概述
XL?647以50mg白色至灰白色片劑供給。這些片劑以兩種構型提供:1)白色至灰白色橢圓形片劑,一面二等分且另一面為平面,其在33.33%藥物濃度制劑中含有50mg XL?647,和2)白色至灰白色圓形片劑,其在50%藥物濃度制劑中含有50mgXL?647。
下表23和24中提供用于即釋和基于乳糖制劑的組合物。在與體內生物利用度相關條件下評價兩種XL?647制劑的比較溶出研究并確定兩種制劑的可比性。所有研究藥物在室溫儲存并根據適用的州和聯邦規定制定存貨清單。如果研究藥物重新包裝,其分裝在高密度聚乙烯(HDPE)小瓶中。
表23:XL?647片劑的定量單位組成(33.3%制劑)

表24:XL?647片劑的定量單位組成(50%制劑)

單獨研究如下進行:
XL?647?001研究:對晚期實體瘤對象(n=41)以14天周期進行間斷給藥方案(“間斷5&9方案”)。對象在第1?5天接受XL?647,之后的9天內(第6?14天)不處理。在間斷5&9方案中以范圍0.06?7.00mg/kg的劑量水平對患有各種實體瘤的41名對象給予XL?647。招募完成,所有對象已在2007年5月31日結束研究。對象一開始用基于質量給藥來接受瓶中粉末(PIB)制劑。MTD測定為4.68mg/kg,其轉化為350mg的固定劑量。最后一組接受片劑制劑中的350mg固定劑量。
XL?647?002研究:將患晚期實體瘤的對象招募入連續組,以每天單次口服劑量接受XL?647。總共31名對象接受范圍75?350mg的5個劑量水平的處理。MTD測定為300mg,18名對象以該劑量水平進行處理。
XL?647?004研究:對健康志愿者(n=24)在進食或禁食狀態下給予300mg單次劑量的XL?647,22天后換另一手臂。分析對生物利用度的食物影響。
XL?647?005研究:對健康志愿者(n=8)給予單次口服劑量的300mg經標記XL?647(14C?XL?647),評估藥物代謝和消除。分析吸收、代謝、排出和質量平衡。
XL?647?201研究:招募具有腺瘤組織學的非小細胞肺癌(NSCLC)對象(n=52),有惡性腹膜滲漏的IIIB期或之前未接受轉移疾病治療的IV期。就預測響應EGFR抑制劑的臨床特征(亞洲,女性,和/或最短或較早的吸煙史)選擇對象。以350mg的間隔5&9方案(n=41)或300mg的每天方案(n=13)給予XL?647。
XL?647?203實驗:招募復發或再次出現NSCLC(IIIB或IV期)的對象(n=41),其在受益于埃羅替尼或吉非替尼的單次劑量處理后記載有進行性疾病,或具有已知EGFR T790M突變。對象每天一次口服接受300mg XL?647。
自2008年8月1日起,接受XL?647處理的159名癌癥病人有臨床安全數據。接受單一試劑XL?647的對象經歷的最常見不良事件(AE)(頻率≥10%,按頻率的降序排列)是:腹瀉、皮疹、疲勞、惡心、干燥皮膚、咳嗽、呼吸困難、厭食、腦電圖QT延長(機器讀取)、嘔吐、便秘、味覺障礙、上呼吸道感染、腹痛、背痛、發熱、頭暈和口腔干燥。這些AE中大部分是1級或2級且不導致研究藥物終止。沒有出現因研究藥物引起的死亡。
以間隔5&9和每天給予方案接受XL?647的對象中都觀察到抗腫瘤活性。在使用間隔方案的1期研究中,獲得未確定的部分反應(PR)且14名其它對象(包括三名患NSCLC對象)具有持續超過3個月的延長穩定疾病(SD)時,一名患NSCLC的對象具有穩定疾病直至第228天。在第二1期研究XL?647?002中,包括3名患NSCLC對象在內的16名對象實現SD持續超過3個月。2期XL?647?201研究(一線,在就富集EGFR突變的臨床特征選擇的對象中)的間隔5&9方案中招募的38名可評估對象中,10人出現PR且17名對象發生SD并持續3個月或更長,臨床益處率(PR+SD)為71%。在這些實現臨床益處的對象中,6名腫瘤含EGFR外顯子19缺失的對象以及1名有L858R突變的對象發生了PR,2名有L858R點突變的對象出現SD。第二2期研究的復發或再次出現NSCLC(IIIB或IV期,n=41)的對象中,其受益于單一試劑埃羅替尼或吉非替尼處理后記載有進行性疾病或具有已知EGFR T790突變,一名對象達到PR,19名對象達到SD作為其最佳反應。
以間隔5&9方案接受XL?647口服劑量的對象的臨床藥代動力學(PK)數據初步分析中,濃度時間曲線(AUC)下面積和最大血漿藥物濃度(Cmax)通常在研究的全劑量范圍(即,3.4?586mg的總劑量)隨劑量按比例增長。5個連續劑量后的終末半衰期中值大約是60小時,并且看來通常不依賴于劑量。XL?647在口服給予后被迅速吸收,中值tmax約為4小時。以300毫克/天(MTD)每日口服給藥之后,XL?647在血漿中大約累積4倍,直至約第15天達到穩定狀態。相比350mg的間隔5&9給藥,以300mg XL?647每天給藥一次引起28天階段中平均接觸大約提高2倍。
非臨床和體外代謝概況研究提示XL?647是人肝臟微粒體中CYP3A4介導代謝的底物。XL?647是同工酶CYP2D6和CYP2C8的體外抑制劑但不是人肝臟微粒體中CYP3A4的抑制劑。XL?647在多個物種中為口服生物可利用并在人血漿中有高度蛋白結合性(93?99%)。
健康對象的臨床食物影響研究(XL?647?004)中,AUC在食物存在下提高約18%,而Cmax只提高約5%。因此,XL?647與食物一起給予或與抑制CYP3A4活性的藥物或物質聯合時可產生提高的XL?647接觸。
質量平衡研究的初步數據提示XL?647可顯著代謝并主要通過排泄物排出。

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