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增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的方法及試劑.pdf

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增強 阿片 鎮痛劑 鎮痛 作用 方法 試劑
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摘要
申請專利號:

CN201110004969.2

申請日:

2011.01.12

公開號:

CN102580091B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 45/00申請日:20110112|||公開
IPC分類號: A61K45/00; A61K31/485; A61P29/00; C07K14/705; C12N15/12; C12N15/63; C12Q1/68 主分類號: A61K45/00
申請人: 中國科學院上海生命科學研究院
發明人: 張旭; 鮑嵐; 何紹球; 管吉松; 張振寧
地址: 200031 上海市岳陽路320號
優先權:
專利代理機構: 上海專利商標事務所有限公司 31100 代理人: 陳靜;范征
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110004969.2

授權公告號:

102580091B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2012.10.17|||2012.07.18

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的方法及試劑。公開了抑制δ阿片受體(DOR)與μ阿片受體(MOR)相互作用的物質的用途,用于制備增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的制劑。還公開了用于增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的蛋白以及藥物組合物。

權利要求書

1.抑制δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的物質的用途,用于制備增強阿片
鎮痛劑的鎮痛作用的制劑。
2.如權利要求1所述的用途,其特征在于,所述的抑制δ阿片受體與μ阿片
受體相互作用的物質選自:
δ阿片受體的抑制劑;
μ阿片受體的第一跨膜結構域蛋白;或
羧基端連接有穿膜肽的μ阿片受體的第一跨膜結構域蛋白。
3.如權利要求1所述的用途,其特征在于,所述的δ阿片受體的抑制劑選自:
naltrindole、ICI?174,864,TIPP,Naltriben。
4.如權利要求1所述的用途,其特征在于,所述的阿片鎮痛劑是作用在Mu
阿片受體上的鎮痛藥。
5.如權利要求1所述的用途,其特征在于,所述的阿片鎮痛劑是嗎啡。
6.抑制δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的蛋白,所述的蛋白是:
μ阿片受體的第一跨膜結構域蛋白;或
羧基端連接有穿膜肽的μ阿片受體的第一跨膜結構域蛋白。
7.如權利要求6所述的蛋白,其特征在于,所述的羧基端連接有穿膜肽的μ
阿片受體的第一跨膜結構域蛋白是一融合蛋白,其氨基端為μ阿片受體的第一跨膜
結構域蛋白,羧基端為穿膜肽。
8.如權利要求6所述的蛋白,其特征在于,所述的穿膜肽是反式激活蛋白,
Penetratin,polyarginine,MAP或Transportan。
9.如權利要求8所述的蛋白,其特征在于,所述的蛋白為:
氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4中第9-39位連接50-60位所示的蛋白;
氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4中第9-60位所示的蛋白;或
氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4所示的蛋白。
10.一種分離的多核苷酸,所述的多核苷酸編碼權利要求6-9任一所述的
抑制δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的蛋白。
11.權利要求10所述的多核苷酸的用途,用于制備增強阿片鎮痛劑的鎮痛作
用的制劑。
12.一種質粒載體,它含有權利要求10或11所述的多核苷酸。
13.一種遺傳工程化的宿主細胞,它含有權利要求12所述的載體;或其基
因組中整合有權利要求10或11所述的多核苷酸。
14.一種用于鎮痛的藥物組合物,其特征在于,所述的藥物組合物含有:
(1)選自下組的物質:權利要求6-9任一所述的蛋白或δ阿片受體的抑制劑;

(2)藥學上可接受的載體。
15.如權利要求14所述的藥物組合物,其特征在于,所述的藥物組合物還含
有:
(3)阿片鎮痛劑。
16.一種篩選增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的潛在物質的方法,其特征在于,
所述的方法包括:
(1)將候選物質與δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的體系接觸;
(2)檢測候選物質對δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的影響;
若所述候選物質可抑制δ阿片受體與μ阿片受體相互作用,則表明該候選物
質是增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的潛在物質。
17.如權利要求16所述的方法,其特征在于,在測試組中,將候選物質加入
到δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的體系中;和/或
步驟(2)包括:檢測測試組的體系中δ阿片受體與μ阿片受體相互作用情況,
并與對照組比較,其中所述的對照組是不添加所述候選物質的δ阿片受體與μ
阿片受體相互作用的體系;
如果測試組中δ阿片受體與μ阿片受體的相互作用在統計學上弱于對照組,
就表明該候選物質是增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的的潛在物質。
18.穿膜肽的用途,用于引導跨膜蛋白的跨膜區域在細胞膜上以與野生型跨
膜蛋白相同的方向插入。
19.如權利要求18所述的用途,其特征在于,所述的穿膜肽選自:反式激
活蛋白,Penetratin,polyarginine,MAP或Transportan。

說明書

增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的方法及試劑

技術領域

本發明屬于生物技術和藥學領域;更具體地,本發明涉及增強阿片鎮痛劑
的鎮痛作用的方法及試劑。

背景技術

δ阿片受體(DOR)和μ阿片受體(MOR)都屬于G蛋白偶聯受體超家族的成
員,它們在疼痛的調控中起作用。一般認為,DOR在痛覺傳入末稍主要介導了脊
髓背角神經元分泌的內源性阿片肽的抑制性作用,而MOR是阿片鎮痛劑——嗎啡
的主要藥物靶點。受體異源寡聚體的形成在G蛋白偶聯受體超家族成員中是普遍
存在的,早期藥理學研究發現DOR的配體分子能夠調控MOR的活性,暗示了DOR
和MOR間的相互關聯。利用生物化學的方法,研究者發現不僅在MOR和DOR
共轉染的細胞而且從脊髓中分離的膜結構都存在二者形成的異源寡聚體。更為重
要的是,藥理學方法阻斷或遺傳學方法敲除DOR都能夠增強MOR介導的痛覺喪
失。然而,MOR和DOR間物理上的相互作用在痛覺調控中的重要性仍然需要進
一步確定。此外,了解DOR激動劑誘導的MOR活性抑制作用機制,可以為增強
以MOR為靶點鎮痛劑的效用和降低副作用提供一種新的思路和方法。

選擇性激動劑刺激后,G蛋白偶聯受體被激活并內吞,接著通過再循環途徑
復敏或者進入降解途徑導致受體下調。研究表明,內吞后的MOR和DOR經歷不
同的加工過程。MOR激動劑DAMGO處理后,內吞的MOR主要通過再循環途徑
回到細胞膜上復敏,而DOR的激動劑處理后內吞的DOR主要被運輸到溶酶體降
解。激動劑誘導的阿片受體的磷酸化和泛素化在受體的內吞和降解中起了重要的
作用。然而,以前的研究都是在外源單獨轉染MOR或DOR的細胞上進行的,那
么在共表達兩種受體的轉染細胞或是神經元內MOR的運輸是否受到DOR的調控
還不清楚。以前的研究暗示當兩種受體共內吞時,它們共享相同的內吞后途徑,
而這一途徑在單獨表達其中一種受體時是不被采用的,因此受體的異源寡聚化可
能是其中的一種機制。

綜上,本領域目前對于DOR與MOR兩者的相互作用以及它們在細胞中的
內吞機制還存在諸多不清楚之處。因此,本領域還有必要對此進行進一步的研
究,從而開發出對于調控痛覺有用的產品。

發明內容

本發明的目的在于提供增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的方法及試劑。

在本發明的第一方面,提供抑制δ阿片受體(DOR)與μ阿片受體(MOR)
相互作用的物質的用途,用于制備增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的制劑。

在另一優選例中,所述的抑制δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的物質選自:

δ阿片受體的抑制劑;

μ阿片受體的第一跨膜結構域蛋白(MOR?TM1);或

羧基端連接有穿膜肽的μ阿片受體的第一跨膜結構域蛋白。

在另一優選例中,所述到抑制δ阿片受體(DOR)與μ阿片受體(MOR)相互
作用的物質還用于制備治療疼痛的制劑。

在另一優選例中,所述的羧基端連接有穿膜肽的μ阿片受體的第一跨膜結構
域蛋白是一融合蛋白,其氨基端為μ阿片受體的第一跨膜結構域蛋白,羧基端為穿
膜肽。

在另一優選例中,所述的融合蛋白的氨基端為μ阿片受體的第一跨膜結構域
蛋白,羧基端為反式激活蛋白(Transactivator,TAT),Polyarginine,Penetratin,
MAP或Transportan。

在另一優選例中,所述的δ阿片受體的抑制劑選自:naltrindole、ICI?174,864,
TIPP,Naltriben。

在另一優選例中,所述的阿片鎮痛劑是作用在Mu阿片受體上的鎮痛藥。

在另一優選例中,所述的阿片鎮痛劑包括但不限于:阿片生物堿類(如嗎
啡、可待因)或人工合成品(如哌替啶、丁丙諾啡、埃托啡、芬太尼、美沙酮、
二氫埃托啡等)。

在另一優選例中,所述的阿片鎮痛劑是嗎啡。

在另一優選例中,所述的鎮痛作用包括:脊髓水平的鎮痛作用,熱痛,炎性
痛以及機械痛等。

在另一優選例中,所述的痛是:慢性疼痛,急性疼痛。

在另一優選例中,所述的痛是:傷害感受器性疼痛,神經病理性疼痛。

在另一優選例中,所述的痛包括但不限于:頭痛,面部痛,頸痛,肩痛,背
痛,胸痛,腹痛,背部痛,腰痛,下肢痛,肌肉與骨骼疼痛,軀體疼痛,血管
疼痛,痛風,關節炎疼痛,與軀體病樣精神障礙有關的疼痛,內臟疼痛,感染
性疾病(如AIDS和帶狀皰疹后神經痛)導致的疼痛,多骨疼痛,鐮刀細胞貧血、
自身免疫性疾病、多發性硬化或炎癥有關的疼痛,急慢性炎癥疼痛,癌性疼痛,
神經病性疼痛,損傷或手術引起的疼痛,癌性痛,傷害感受性疼痛,糖尿病、
外周神經病、疤疹后神經痛,三叉神經痛,腰部或子宮頸神經根病,舌咽神經
痛,自主神經反射性疼痛,反射性交感神經營養不良、神經根撕脫、癌癥、化
學損傷、毒素、營養缺乏、病毒或細菌感染、燒傷或其聯合形式有關導致的神
經病理性疼痛,老齡化導致的退行性骨關節病,或它們的聯合形式。

在本發明到另一方面,提供抑制δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的蛋白,
所述的蛋白是:

μ阿片受體的第一跨膜結構域蛋白;或

羧基端連接有穿膜肽的μ阿片受體的第一跨膜結構域蛋白。

在另一優選例中,所述的羧基端連接有穿膜肽的μ阿片受體的第一跨膜結構
域蛋白是一融合蛋白,其氨基端為μ阿片受體的第一跨膜結構域蛋白,羧基端為穿
膜肽。

在另一優選例中,所述的穿膜肽是反式激活蛋白,Penetratin,polyarginine,
MAP或Transportan。

在另一優選例中,所述的羧基端連接有穿膜肽的μ阿片受體的第一跨膜結構
域蛋白為:

氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4中第9-39位連接50-60位所示的蛋白;

氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4中第9-60位所示的蛋白;或

氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4所示的蛋白。

在本發明到另一方面,提供一種分離的多核苷酸,所述的多核苷酸編碼所
述的抑制δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的蛋白。

在本發明到另一方面,提供所述的多核苷酸的用途,用于制備增強阿片鎮痛
劑的鎮痛作用的制劑。

在本發明到另一方面,提供一種質粒載體,它含有所述的多核苷酸。

在本發明到另一方面,提供一種遺傳工程化的宿主細胞,它含有所述的載
體;或其基因組中整合有所述的多核苷酸。

在本發明到另一方面,提供一種所述的抑制δ阿片受體與μ阿片受體相互作
用的蛋白的制備方法,該方法包含:(a)在適合表達的條件下,培養所述的宿主
細胞;(b)從培養物中分離出所述的蛋白。

在本發明到另一方面,提供一種用于鎮痛的藥物組合物,所述的藥物組合物
含有:

(1)有效量的選自下組的物質:所述的蛋白或δ阿片受體的抑制劑;和

(2)藥學上可接受的載體。

在另一優選例中,所述的藥物組合物還含有:

(3)有效量的阿片鎮痛劑。

在另一優選例中,所述的阿片鎮痛劑是嗎啡。

在本發明到另一方面,提供還提供一種藥盒,所述的藥盒中含有所述的用于
鎮痛的藥物組合物。

在本發明到另一方面,提供一種篩選增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的潛在物質
的方法,所述的方法包括:

(1)將候選物質與δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的體系接觸;

(2)檢測候選物質對δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的影響;

若所述候選物質可抑制(減弱、阻斷或解離)δ阿片受體與μ阿片受體相互
作用,則表明該候選物質是增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的潛在物質。

在另一優選例中,在測試組中,將候選物質加入到δ阿片受體與μ阿片受體
相互作用的體系中;和/或

步驟(2)包括:檢測測試組的體系中δ阿片受體與μ阿片受體相互作用情況,
并與對照組比較,其中所述的對照組是不添加所述候選物質的δ阿片受體與μ
阿片受體相互作用的體系;

如果測試組中δ阿片受體與μ阿片受體的相互作用在統計學上弱于(優選顯
著弱于,如弱20%以上,較佳的弱50%以上;更佳的弱80%以上)對照組,就
表明該候選物質是增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的的潛在物質。

在另一優選例中,所述的體系選自:細胞體系(或細胞培養物體系)、亞細胞
體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。

在另一優選例中,所述方法還包括:對獲得的潛在物質進行進一步的細胞
實驗和/或動物試驗,以從候選物質中進一步選擇和確定對于增強阿片鎮痛劑的
鎮痛作用有用的物質。

在本發明到另一方面,提供一種增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的方法,所述方
法包括:抑制對象中δ阿片受體與μ阿片受體的相互作用。

在本發明到另一方面,提供一種鎮痛的方法,所述方法包括:先給予需要鎮
痛的對象有效量的抑制δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的物質;之后給予需要鎮
痛的對象有效量的阿片鎮痛劑。

在本發明到另一方面,提供穿膜肽的用途,用于引導跨膜蛋白的跨膜區域(包
括含該跨膜區域的跨膜蛋白或其片段)在細胞膜上以與野生型跨膜蛋白相同的方
向插入。

在另一優選例中,所述的穿膜肽選自:反式激活蛋白,Penetratin,polyarginine,
MAP或Transportan。

本發明的其它方面由于本文的公開內容,對本領域的技術人員而言是顯而
易見的。

附圖說明

圖1.受體特異性的激動劑誘導DOR和MOR的共同內吞。

(A)將氨基端帶有HA標簽的MOR(HA-MOR)和氨基端帶有Myc標簽的
DOR(Myc-DOR)的質粒共轉入HEK293細胞中。為了標記在細胞膜上的受體,
先將培養的細胞在帶有兔抗HA抗體和小鼠抗Myc抗體的混合物中孵育半個小
時,在激動劑處理以后固定細胞進行免疫熒光雙標(MOR為綠色,DOR為紅色)。
在對照組(control)的細胞質中,只能看到很少的囊泡狀結構上有陽性標記,這
些是進行持續內吞的受體。在1μM?Delt?I,SNC-80,Delt?II或者DAMGO的刺
激下,本來位于細胞膜上在活細胞狀態被標記的DOR和MOR內吞進入共存的
囊泡狀結構中(箭頭所示)。根據內吞的受體信號和表面標記法標上的總受體信
號之間的比值而做出的統計表明,由Delt?I和DAMGO導致的DORs和MORs
的共同內吞可以分別被5μM的NTI,naloxone(NLX)或者CTOP所減弱(下圖)。

(B,C)將羧基端帶有Flag標簽的MOR(MOR-Flag)和Myc-DOR質粒共轉
入HEK293細胞中,在Delt?I處理后細胞膜表面的蛋白被生物素所標記,這些
標記上的蛋白被固定在小珠上的streptavidin所收集。在1μM?Delt?I或者SNC-80
處理30分鐘后,在細胞膜表面的DOR和MOR的水平顯著下降。免疫印跡的
實驗表明,30分鐘的Delt?I處理只能提高DOR的磷酸化水平,對MOR的磷酸
化水平并沒有影響。而DAMGO只能影響MOR的磷酸化。

(D)在表達MOR-Flag和DOR突變體(T352A,T353A,T358A,T361A和
S363A)[Myc-DOR(M)]的HEK293細胞中,兩種受體在細胞膜表面的表達在1
μM?Delt?I和SNC-80刺激下沒有變化。每個免疫印跡的結果代表三次獨立的實
驗,統計的數據均以對照組的百分數表示,**表示與不給予Delt?I處理的細胞
相比P<0.01。

圖2.激動劑誘導的MOR和DOR內吞后分揀途徑。

(A,B)將HA-MOR和Myc-DOR共轉入HEK293細胞中,用抗HA抗體
和抗Myc抗體進行預標記,溶酶體結構使用LysoTracker進行標記(紅色)。在
90分鐘的Delt?I或者是DAMGO的刺激下,固定細胞進行免疫熒光雙標。在
Delt?I處理過的細胞中,內吞的DOR和MOR共同進入LysoTracker標記的結
構中(箭頭所示),而受到DAMGO刺激內吞的兩類受體并不被LysoTracker所
標記。標尺為8μm。

(C)將MOR-Flag和Myc-DOR共轉入HEK293細胞中,免疫共沉淀的實
驗表明,Delt?I的刺激可以增加DOR和MOR的泛素化水平,而DAMGO則
降低。每個免疫印跡的結果代表三次獨立的實驗。

(D)在藥物處理之前表達DOR和MOR的HEK293細胞被生物素所標記,
在經過90分鐘1μM?Delt?I或者DAMGO的處理下,裂解細胞,被生物素標記
的蛋白通過固定在小珠上的streptavidin所收集。免疫印跡的實驗表明,在Delt
I刺激下被標記上的DOR和MOR數量顯著降低。100μM的Leupeptin+MG132
可以抑制這一過程。統計的數據均以對照組的百分數表示,**表示與不給予
Delt?I處理的細胞相比P<0.01。

圖3.在小鼠脊髓激活DOR可以下調MOR的水平并降低嗎啡的鎮痛作用。

(A)雙標的原位雜交表明,DOR和MOR的mRNA在小鼠DRG小神經元
中共存(箭頭)。小箭頭指向的是僅表達MOR的小神經元。標尺為8μm。

(B)使用DOR13-17的抗體在Oprd1第一外顯子敲除的小鼠脊髓組織樣品
中檢測不到免疫印跡的信號。

(C)使用DOR抗體在野生型小鼠脊髓切片I和II層的神經纖維上檢測到
的免疫染色信號在Oprd1第一外顯子基因敲除小鼠的切片中消失了,并且這一
染色信號同時也可以被相應的抗原所吸收掉。

(D)免疫熒光三標記的實驗表明,MOR(紅色)、DOR(綠色)和CGRP(藍色)
在脊髓背角的I和II層共存。高倍放大的圖顯示三者在神經纖維終末有共存。
標尺為8μm。

(E)免疫共沉淀的實驗表明,在鞘內注射2μg的Delt?I?15分鐘以后DOR
和MOR之間的相互作用顯著增強。每個免疫印跡的結果代表三次獨立的實驗。

(F)在免疫共沉淀實驗中使用的DOR的抗體在Oprd1第一外顯子敲除的
小鼠脊髓組織樣品中也檢測不到免疫印跡的信號。

(G)而使用5μg的Delt?I或者是L-ENK和SNC-80刺激15分鐘后,可以
使脊髓背角的MOR泛素化水平顯著提高。每個免疫印跡的結果代表三次獨立
的實驗。

(H)小鼠在鞘內注射(5x1μg,每15分鐘1次)Delt?I處理后,免疫熒光標
記顯示在小鼠脊髓I和II層MOR的染色明顯降低。依據3只小鼠和每只小鼠
3-5切片進行定量分析,**表示與給予鹽水組的小鼠相比P<0.01。

(I,J,K)小鼠52℃水浴甩尾實驗顯示,鞘內預先給予Delt?I可以顯著降
低鞘內給予嗎啡的鎮痛作用,而且這一效應具有劑量依賴性。DOR的拮抗劑
NTI,可以阻止DOR激動劑Delt?I對嗎啡的鎮痛作用降低的效用(J)。SNC-80
也有和Delt?I同樣的效果(J)。**表示與給予鹽水組的小鼠相比P<0.01(每組10
只小鼠)。

圖4.MOR的第一個穿膜結構域介導了MOR和DOR的相互作用。

(A)圖示各種MOR或變體的結構(其中灰色區段表示跨膜結構域),包括:
野生型MOR;用MOR的第三個跨膜結構域取代第一跨膜結構域的MOR突變
體[MOR(M)];含TM1的MOR突變體[MOR(63-93)]。

(B,C)免疫共沉淀實驗顯示,DOR可以和MOR上的第一個穿膜結構域
相互作用,DOR只與野生型的MOR存在相互作用,而與的突變體之間沒有相
互作用,MOR第一個跨膜結構域的過量表達可以顯著降低DOR和MOR之間
的相互作用。

(D)在共轉了DOR和MOR突變體的細胞中,1μM?Delt?I可以減少DOR
在細胞膜上的表達,而對MOR的突變體沒有作用。每個免疫印跡的結果代表
三次獨立的實驗。

(E)在三轉(同時轉入HA-MOR,Myc-DOR,MOR(63-93))的細胞中,由激
動劑刺激導致的DOR和MOR共同內吞可以被過量表達的MOR的第一個跨膜
結構域所阻止。每組統計的細胞數為30個,**表示與不共轉MOR第一個跨膜
結構域的細胞相比P<0.01。標尺為4μm。

(F)免疫組化實驗,過量表達的MOR的第一個跨膜結構域可以干擾由Delt?I
或者使DAMGO引起的受體共內吞。

圖5.用TM1-TAT融合蛋白打斷DOR和MOR之間的相互作用。

(A)圖示四種含有TM1和TM3的融合蛋白,TAT在TM1和TM3的氨基
端或羧基端。培養的小鼠背根神經節神經元經過TAT融合蛋白的處理后,透膜
后GST抗體標記細胞顯示所有的TAT融合蛋白都主要位于細胞膜上,用非穿
透膜方法GST的抗體標記的是暴露在細胞膜外的GST蛋白,表明只有TAT肽
在跨膜段的羧基端的融合蛋白插入到神經元細胞膜上的方向與野生型MOR一
致,而TAT肽在跨膜段的氨基端則插入的方向相反。標尺為8μm。anti-GST
表示抗GST抗體。

(B)小鼠在TM1-TAT蛋白處理2.5個小時以后進行包埋前免疫金標-銀加
強標記。在光鏡下,TM1-TAT蛋白主要分布在脊髓背角淺層的神經纖維終末
中,而電鏡圖片顯示TM1-TAT蛋白主要分布在脊髓突觸球的神經纖維終末的
膜上。箭頭表示的是突觸后區域。

(C,D)免疫共沉淀的實驗顯示,在2.5小時的TM1-TAT蛋白處理以后,
DOR和MOR之間基礎水平的相互作用顯著降低,而由鞘內注射5μg?Delt?I使
MOR的泛素化水平的增加也可恢復到基礎水平。統計中加入了α2A-AR和
NK1-R與MOR的免疫共沉淀信號,在MOR?TM1-TAT蛋白處理的情況下并不
受影響這一結果。每個免疫印跡的結果代表三次獨立的實驗。

圖6.用TM1-TAT融合蛋白可以提高嗎啡的鎮痛效果。

(A)小鼠52℃水浴甩尾實驗顯示,皮下注射嗎啡的鎮痛效果可以被腹腔注
射TM1-TAT蛋白(在2.5h/day內,10mg/kg/每次或者5mg/kg/每次,共注射三
次)顯著增強,而注射TAT-TM1和TM3-TAT則沒有影響,這一效應也具有劑
量依賴性。另外,鞘內注射Delt?I?2.5μg/kg的鎮痛效果不能被腹腔注射TM1-TAT
蛋白增強(B)。(C)在小鼠皮下注射5mg/kg的嗎啡,在5天過后嗎啡的鎮痛效
果完全消失,表明嗎啡耐受效應的產生。而如果每天小鼠在注射嗎啡前都先經
過TM1-TAT的處理(在2.5h/day內,10mg/kg/每次,共注射三次),則嗎啡的
耐受情況會得到緩解。而同樣條件下使用TM3-TAT對小鼠進行處理對嗎啡的
耐受效應沒有影響。

具體實施方式

本發明人經過廣泛的研究,發現δ阿片受體(DOR)與μ阿片受體(MOR)
之間的相互作用與MOR對于阿片鎮痛劑的敏感性直接相關,阻斷或弱化DOR與
MOR的相互作用可增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用。在此基礎上本發明人還找到了可
增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的試劑。

如本文所用,“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……
構成”、“基本上由……構成”、和“由……構成”;“主要由……構成”、
“基本上由……構成”和“由……構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”
的下位概念。

如本文所用,“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的
物質,原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多
肽是沒有分離純化的,但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其
他物質中分開,則為分離純化的。

如本文所用,術語“疼痛”或“痛”是指機體對損傷組織或潛在的損傷產
生的一種不愉快的反應,是一種復雜的生理心理活動,也是臨床上最常見的癥
狀之一。疼痛可分為身源性(somatogenic)疼痛和心因性(psychogenic)疼痛。身源
性疼痛又可分感受性疼痛(如傷害感受性疼痛,nociceptive?pain)與神經病理性疼
痛(Neuropathic?Pain)。疼痛根據其發生和持續的時間和進程可分為:急性疼痛
和慢性疼痛,慢性疼痛也包括慢性感受性疼痛或慢性神經病理性疼痛。

如本文所用,“神經病理性疼痛”是由于中樞或周圍神經系統的損傷或病
理改變引起,包括但不限于腰背痛(lower?back?pain)、神經痛(neuralgia)、纖維
性肌痛(Fibromyalgia)、糖尿病相關的神經痛(diabetic?neuropathic?pain,DNP)、
多發性硬化相關的神經痛(pain?associated?with?multiple?sclerosis)、帶狀皰疹后神
經痛(PHN)和HIV有關聯的(神經病理性)神經痛(HIVNP)等。

如本文所用,“傷害感受器性疼痛”是由于人體內的傷害感受器受到機械、
熱、化學刺激或損傷引起,可分為軀體傷害感受器性疼痛和內臟傷害感受器性
疼痛,包括但不限于癌痛(cancer-related?pain)、關節炎痛(arthritic?pain)、術后痛
(post-operative?pain)和HIV有關聯的(傷害感受器性)神經痛(HIVNP)等。其中,
神經痛(neuralgia)包括但不限于三叉神經痛(Trigeminal?neuralgia)、坐骨神經痛
(sciatic?neuralgia)等。

疼痛根據其發生和持續的時間和進程可分為:急性疼痛和慢性疼痛。

急性疼痛是一群隨損傷或各種急癥等明顯刺激因素迅速發生的復雜而不
愉快的感受、知覺和情感上的體驗,伴有自主的、心理的和行為的反應,其包
括手術后、創傷后疼痛、燒傷和各種內外科急癥,例如:心梗,急性胰腺炎,
膽絞痛,腎絞痛,急性闌尾炎、病理性骨折,急性腸梗阻患者出現急性疼痛等。
急性疼痛的治療方法包括:病房開展自控鎮痛(PCA),將局麻藥和/或阿片類
藥于硬膜外腔輸注等。在機理或動物試驗中常采用甲醛法、熱板法等模型或方
法造成動物的急性疼痛,并立即給予待測藥物,以觀察待測藥物對急性疼痛的
緩解作用。

慢性疼痛是是指疼痛持續較長時間(如超過數周~1個月),超過一般急性病
的進展,或者超過傷口愈合的合理時間,或與引起持續疼痛的慢性病理過程有
關,或者經過數月或數年的間隔時間疼痛復發。在機理或動物試驗中常采用完
全弗氏佐劑等誘導造成動物的慢性疼痛,并在誘導數日乃至數周后給予待測藥
物,以觀察待測藥物對慢性疼痛的緩解作用。

慢性疼痛的病程長、病因復雜;中樞和外周神經系統的不同結構和功能的
異常;自主神經系統和情緒的變化;以及社會適應能力、生活或/和工作能力
的降低;精神、家庭多方面的心理障礙的特點,決定了康復治療手段對于慢性
疼痛治療的重要意義。

慢性疼痛不緩解,會從心理上、生理上給患者造成不良影響;不能緩解的
疼痛將延遲患者的恢復,延長住院日期,給患者和家屬增加負擔,加大醫療保
險費用,使之喪失工作、家庭、尊嚴,引起抑郁、焦慮、自殺,使心理殘廢的
群體擴大。不僅如此,還增加了社會的不安定因素。相比較而言,現在一般認
為急性疼痛是疾病的一個癥狀,而慢性疼痛是一類疾病。

慢性疼痛包括但不限于:①軟組織、關節和骨疼痛:各種骨關節炎、創傷
后畸形性疼痛、骨骼肌疼痛、腰痛、肌筋膜疼痛綜合征、頭痛、燒傷后疼痛。
②深部組織和內臟痛:心血管疼痛、眼痛、口面部疼痛、慢性婦科疼痛、性交
痛、泌尿生殖系統慢性疼痛。③神經和神經根損傷性疼痛:截肢后幻肢痛、周
圍神經性疼痛、反射性交感神經營養不良和交感神經持續痛、三叉神經痛和非
典型性面部痛、神經根損傷和蛛網膜炎、帶狀皰疹后神經痛。④中樞性疼痛:
腦、脊髓的血管損傷,如出血、梗塞、血管畸形;多發性硬化;外傷性脊髓損
傷,腦損傷;脊髓空洞癥和延髓空洞癥;腫瘤;帕金森病。⑤兒童疼痛:生長
痛。⑥老年人疼痛:各種頸椎病、腰椎間盤突出癥、腰椎滑脫等所致疼痛。⑦
癌性疼痛。

本發明中所述的“痛”包括但不限于:頭痛,面部痛,頸痛,肩痛,背痛,
胸痛,腹痛,背部痛,腰痛,下肢痛,肌肉與骨骼疼痛,軀體疼痛,血管疼痛,
痛風,關節炎疼痛,與軀體病樣精神障礙有關的疼痛,內臟疼痛,感染性疾病
(如AIDS和帶狀皰疹后神經痛)導致的疼痛,多骨疼痛,鐮刀細胞貧血、自身免
疫性疾病、多發性硬化或炎癥有關的疼痛,急慢性炎癥疼痛,癌性疼痛,神經
病性疼痛,損傷或手術引起的疼痛,癌性痛,傷害感受性疼痛,糖尿病、外周
神經病、疤疹后神經痛,三叉神經痛,腰部或子宮頸神經根病,舌咽神經痛,
自主神經反射性疼痛,反射性交感神經營養不良、神經根撕脫、癌癥、化學損
傷、毒素、營養缺乏、病毒或細菌感染、燒傷或其聯合形式有關導致的神經病
理性疼痛,老齡化導致的退行性骨關節病,或它們的聯合形式。

DOR、MOR及其片段

DOR和MOR是本領域技術人員熟知的,它們都屬于G蛋白偶聯受體超家
族的成員,在疼痛的調控中起作用。其中,MOR是阿片鎮痛劑(如嗎啡)的主
要藥物靶點。一般地,人的DOR蛋白具有SEQ?ID?NO:2所示的序列或參見
GenBank登錄號AAA18789.2所示的序列,其編碼序列參見GenBank登錄號
NM_000911.3所示的序列。一般地,人的MOR蛋白具有SEQ?ID?NO:1所示的
序列或參見GenBank登錄號AAH74927.1所示的序列,其編碼序列參見
GenBank登錄號AY521028.1所示的序列。DOR或MOR的經過一個或多個氨
基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的變異形式也包括在本發明中。其變異形
式包括一部分保守氨基酸的替代序列,所述經氨基酸替換的序列并不影響其活
性或保留了其部分的活性。適當替換氨基酸是本領域公知的技術,所述技術可
以很容易地被實施,并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術使本領域
人員認識到,一般來說,在一種多肽的非必要區域改變單個氨基酸基本上不會
改變生物活性。見Watson等Molecular?Biology?of?The?Gene,第四版,1987,
The?Benjamin/Cummings?Pub.Co.P224。

本發明還提供一種來源于MOR的生物活性片段,其是MOR的第一跨膜結
構域蛋白片段(MOR?TM1)。本發明人的研究發現,激活DOR能夠使DOR-MOR
復合體中的MOR與DOR一起進入到內吞后降解途徑,從而導致了MOR相對
于其激動劑如嗎啡的脫敏作用。這些過程依賴于MOR通過其第一個穿膜結構
域與DOR的相互作用。表達的MOR?TM1蛋白片段能夠競爭性地減弱DOR與
MOR的相互作用。因此,所述的MOR?TM1蛋白片段可通過減弱DOR與MOR
的相互作用而促進阿片鎮痛劑如嗎啡的鎮痛效果。

所述的MOR的第一跨膜結構域蛋白片段的序列如SEQ?ID?NO:3所示。

此外,本發明還涉及來源于MOR蛋白的、具有SEQ?ID?NO:3所示序列的
蛋白片段。也即包含有SEQ?ID?NO:3所示氨基酸序列且一端或兩端還帶有其它
氨基酸的MOR蛋白片段也是可用的,只要其也具有競爭性結合DOR的功能。

MOR?TM1的經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的變
異形式也包括在本發明中。其變異形式包括一部分保守氨基酸的替代序列,所
述經氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當替換氨基
酸是本領域公知的技術,所述技術可以很容易地被實施,并且確保不改變所得
分子的生物活性。這些技術使本領域人員認識到,一般來說,在一種多肽的非
必要區域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等Molecular
Biology?of?The?Gene,第四版,1987,The?Beniamin/Cummings?Pub.Co.P224。

一旦分離獲得了所述MOR?TM1蛋白或其變異體的序列,就可以用重組法來
大批量地獲得該蛋白。這通常是將其編碼基因克隆入載體,再轉入細胞,然后
通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到。此外,對于較短的蛋白而言,
也可采用人工合成(如通過多肽合成儀合成)的方法來合成有關序列,人工合
成的方法可簡便且快速地得到所需要的蛋白。

本發明還包括了編碼所述的MOR?TM1蛋白或其變異體的分離的核酸,其可
以全序列人工合成,也可用PCR擴增的方法獲得。在獲得了編碼所述的核酸序
列之后,將其連入合適的表達載體,再轉入合適的宿主細胞。最后通過培養轉
化后的宿主細胞,通過分離純化得到所要的蛋白。

本發明還包括了包含編碼所述MOR?TM1蛋白或其變異體的核酸分子的載
體。所述的載體還可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達調控序列,
以便于蛋白的表達。所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀
況,即線性DNA序列的某些部分能夠調節或控制同一線性DNA序列其它部分
的活性。例如,如果啟動子控制序列的轉錄,那么它就是可操作地連于編碼序
列。此外,含有編碼所述MOR?TM1蛋白或其變異體核酸序列的重組細胞也包
括在本發明中。

融合蛋白

本發明還提供了一種融合蛋白,其從氨基端到羧基端依次包括:MOR?TM1
和穿膜肽。如本文所用,所述的“穿膜肽”是指一類具有細胞穿透作用的多肽,
其自身或其與其它蛋白的融合蛋白可通過細胞膜進入到細胞內。

作為本發明的優選方式,所述的穿膜肽是反式激活蛋白(Transactivator,
TAT)。本發明人發現,TAT蛋白融合TM1后,能夠使外源多肽TM1選擇性地
插入到細胞膜上,在體注射此融合蛋白能夠競爭性地抑制脊髓中MOR-DOR的
相互作用,從而增強嗎啡的鎮痛效果。

作為本發明的優選方式,所述的TAT的氨基酸序列可以與SEQ?ID?NO:4
中第50-60位所示的序列基本上相同。

所述的MOR?TM1和穿膜肽之間可以直接相連接,或者通過多肽連接子(連
接肽)連接。連接子本身并不擁有連接以外以的其他功能,因此所屬技術領域人
員了解可能的氨基酸組成。所述的連接子包括0-20個氨基酸;較佳地為0-15
個氨基酸;如10個。所述的連接肽例如是由10個Gly組成。

在體注射MOR?TM1和TAT的融合蛋白能夠被運輸到小鼠脊髓背角痛覺傳
入的末端,阻斷DOR-MOR的相互作用,從而促進嗎啡鎮痛效果。

本發明還發現當TAT融合在TM1和TM3的羧基端時,免疫標記試驗顯示
TM1和TM3能于細胞膜上類似于野生型那樣的插入,并不會導致這些跨膜蛋
白的入胞行為,因此,TAT肽不僅可以作為一個穿膜的載體,而且由于疏水
性的跨膜段的存在這一肽段還可以引導跨膜蛋白在細胞膜上的插入方向。

所屬技術領域人員應該了解,為方便組化的檢測,本發明的實施例中融合
蛋白TM1-TAT添加了標記蛋白flag,對于執行TM1的功能并不是必需的,所
述的標記蛋白flag可以省略或者換成其他的標記,比如Myc、HA等。

DOR的抑制劑

本發明人發現,DOR的抑制劑可以通過抑制DOR的活性,從而抑制DOR
與MOR的相互作用。因此,DOR的抑制劑也可以用于促進阿片鎮痛劑的鎮痛作
用。

如本文所用,所述的DOR的抑制劑包括了拮抗劑、下調劑、阻滯劑、阻斷
劑等。任何可降低DOR的活性、降低DOR的穩定性、抑制DOR的表達、減少DOR
有效作用時間、或抑制DOR的轉錄和翻譯的物質均可用于本發明,作為可用于
促進阿片鎮痛劑的鎮痛作用的有效物質。

作為本發明的優選方式,所述的DOR的抑制劑是(但不限于):naltrindole、
ICI?174,864,TIPP,Naltriben。

藥物組合物

本發明還提供了一種藥物組合物,它含有有效量(如0.000001-50wt%;較
佳的0.00001-20wt%;更佳的,0.0001-10wt%)的抑制δ阿片受體與μ阿片受體
相互作用的物質,以及藥學上可接受的載體。所述的抑制δ阿片受體與μ阿片受
體相互作用的物質是:MOR?TM1或其變異體;或MOR?TM1與穿膜肽的融合蛋白;
或DOR的抑制劑。

作為本發明的優選方式,所述的藥物組合物還含有:有效量(如
0.000001-50wt%;較佳的0.00001-20wt%;更佳的,0.0001-10wt%)的阿片鎮痛
劑。優選地指作用在Mu阿片受體上的鎮痛藥,如阿片生物堿類(嗎啡、可待
因)和人工合成品(哌替啶、丁丙諾啡、埃托啡、芬太尼、美沙酮、二氫埃托
啡等)。其它一些Mu阿片受體可參見Clin?Drug?Investig.2009;29?Suppl?1:3-16.
Pain?treatment?with?opioids:achieving?the?minimal?effective?and?the?minimal
interacting?dose.Geppetti?P,Benemei?S等文獻,這些文獻引入本發明,以提供可
供選擇的Mu阿片受體。更優選地,所述的阿片鎮痛劑是嗎啡。

本發明的藥物組合物可直接用于哺乳動物機體的鎮痛。此外,還可同時與其
它治療劑或輔劑聯合使用。

通常,可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介
質中,其中pH通常約為5-8,較佳地,pH約為6-8。

如本文所用,術語“含有”表示各種成分可一起應用于本發明的混合物或
組合物中。術語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術語“含有”中。如
本文所用,術語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物產生功能或活
性的且可被人和/或動物所接受的量。

如本文所用,“藥學上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過
度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的,即具有合理的效益/風險比的物
質。術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體,包括各種賦形劑
和稀釋劑。

所述的藥學上可接受的載體包括(但并不限于):鹽水、緩沖液、葡萄糖、
水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應與給藥方式相匹配,本發明的藥
物組合物可以被制成針劑形式,例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水
溶液通過常規方法進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。活性成
分的給藥量是治療有效量。本發明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。

本發明所述的抑制δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的物質的有效量可隨
給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由
本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包
括但不限于:所述的抑制δ阿片受體與μ阿片受體相互作用的物質的藥代動力學
參數例如生物利用率、代謝、半衰期等;患者所要治療的疾病的嚴重程度、患
者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常,當本發明的抑制δ阿片受
體與μ阿片受體相互作用的物質每天以約0.00001mg-50mg/kg動物體重(較佳的
0.0001mg-10mg/kg動物體重)的劑量給予,能得到令人滿意的效果。例如,由
治療狀況的迫切要求,可每天給予若干次分開的劑量,或將劑量按比例地減少。

篩選方法

在得知了所述的DOR與MOR相互作用與MOR對于阿片鎮痛劑的敏感性直
接相關后,可以基于該機制來篩選抑制DOR與MOR相互作用的物質。

因此,本發明提供一種篩選可用于調增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的潛在物
質的方法,所述的方法包括:將候選物質與DOR與MOR相互作用的體系接觸;
和檢測候選物質對DOR與MOR相互作用的影響;若所述候選物質可抑制(包
括:減弱、阻斷或解離)DOR與MOR相互作用,則表明該候選物質是可用于增
強阿片鎮痛劑的鎮痛作用的潛在物質。

在本發明的優選方式中,在進行篩選時,為了更易于觀察到DOR與MOR
相互作用的改變,還可設置對照組,所述的對照組可以是不添加所述候選物質
的DOR與MOR相互作用的體系。

所述的體系包括(但不限于):溶液體系、亞細胞體系、細胞體系、組織體
系、器官體系、或動物體系。

作為本發明的優選方式,所述的方法還包括:對獲得的潛在物質進行進一
步的細胞實驗和/或動物試驗,以進一步選擇和確定對于增強阿片鎮痛劑的鎮痛
作用真正有用的物質。

另一方面,本發明還提供了采用所述篩選方法獲得的可用于增強阿片鎮痛
劑的鎮痛作用的潛在物質。這些初步篩選出的物質可構成一個篩選庫,以便于
人們最終可以從中篩選出能夠對于增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用真正有用的物質。

本發明的主要優點在于:

(1)本發明清楚地確立了DOR激動劑誘導的DOR和MOR共同內吞和共
降解是造成MOR脫敏的原因之一,從而提供了一種通過抑制MOR-DOR物理
上的相互作用來增強嗎啡鎮痛效果的新策略。

(2)本發明找到了可用于抑制MOR-DOR相互作用的物質,可作為鎮痛藥
物用于臨床。

下面結合具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實施例僅用于說
明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方
法,通常按照常規條件如Sambrook等人,分子克隆:實驗室指南(New?York:
Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條
件。除非另外說明,否則百分比和份數按重量計算。

除非另行定義,文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟
悉的意義相同。此外,任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于
本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

I.材料和方法

表達帶有HA標簽的MOR(HA-MOR)的質粒參見Guan?JS,Xu?ZZ,Gao?H,
He?SQ,Ma?GQ,Sun?T,Wang?LH,Zhang?ZN,Lena?I,Kitchen?I,et?al:Interaction
with?Vesicle?Luminal?Protachykinin?Regulates?Surface?Expression?of?delta-Opioid
Receptors?and?Opioid?Analgesia.Cell?2005,122:619-631。

表達帶有Myc標簽的DOR(Myc-DOR)的質粒參見Bao?L,Jin?SX,Zhang
C,Wang?LH,Xu?ZZ,Zhang?FX,Wang?LC,Ning?FS,Cai?HJ,Guan?JS,et?al:
Activation?of?delta?opioid?receptors?induces?receptor?insertion?and?neuropeptide
secretion.Neuron?2003,37:121-133。

表達帶有Myc標簽的DOR突變體[Myc-DOR(M)]的質粒參見Whistler,
J.L.,Tsao,P.,and?von?Zastrow,M.(2001).A?phosphorylation-regulated?brake
mechanism?controls?the?initial?endocytosis?of?opioid?receptors?but?is?not?required
for?post-endocytic?sorting?to?lysosomes.J?Biol?Chem?276,34331-34338。

表達帶有Flag標簽的MOR(MOR-Flag)的質粒的構建:以HA-MOR質粒
為模板,以表1中MOR2引物進行PCR擴增,獲得的擴增產物經HindIII和
KpnI酶切后插入到pEGFP-N3(Clontech)載體中的相應位點中,獲得表達帶有
Flag標簽的MOR的質粒。

表達帶有Flag標簽的MOR突變體[MOR(M)]的質粒的構建:以HA-MOR
質粒為模板,先使用TM1(第一次循環)以及TM3(第一次循環)引物(見表1)進行
PCR擴增,再提純的將擴增產物使用TM1和TM3(第二次循環)引物分別進行
PCR反應,再將產物回收提純經HindIII和KpnI酶切,連接入pEGFP-N3
(Clontech)載體中。

表達帶有GFP標志、α-CGRP(1-25)-MOR突變體[MOR(63-93)]的質粒的
構建:將α-CGRP1-25寡核苷酸復性,然后連接入經EcoRI,BamHI酶切過的
pEGFP-N3載體中。

表達MOR?TM1-TAT(帶有GST、FLAG標簽)的質粒的構建:先將TM1
寡核苷酸復性,連接入經EcoRI和SalI酶切過的pGEX-KG(GE?Healthcare?Life
Sciences)中,再將復性的編碼C端帶有10個Gly的TAT肽的寡核苷酸連接
入經過SalI和HindIII酶切過的前述質粒中。表達后可以獲得如下融合蛋白:
DYKDDDDKPSMVTAITIMALYSIVCVVGLFGNFLVMYVIGGGGGGGGGGYG
RKKRRQRRR(其中,TAT肽段位于TM1的羧基末端,在TM1之前帶有FLAG
標記,在MOR的第一跨膜和TAT肽段之間加入了10個甘氨酸)。

表達TAT-MOR?TM1(帶有GST、FLAG標簽)的質粒的構建:先將TM1
寡核苷酸復性,連接入經EcoRI和SalI酶切過的pGEX-KG(GE?Healthcare?Life
Sciences)中,再將復性編碼的C端帶有10個Gly的TAT肽的寡核苷酸連接入
經過BamHI和HindIII酶切過的剛才構建好的質粒中。

表達MOR?TM3-TAT(帶有GST、FLAG標簽)的質粒的構建:和MOR
TM1-TAT(帶有GST、FLAG標簽)的質粒的構建類似,只是將TM1寡核苷酸
換成TM3寡核苷酸。

表達TAT-MOR?TM3(帶有GST、FLAG標簽)的質粒的構建:和TAT-MOR
TM1(帶有GST、FLAG標簽)的質粒的構建類似,只是將TM1寡核苷酸換成
TM3寡核苷酸。

表1、質粒構建所用的引物和寡核苷酸



DOR的激動劑-L-ENK(Sigma)、Delt?I參見Wang,H.B.,Zhao,B.,Zhong,
Y.Q.,Li,K.C.,Li,Z.Y.,Wang,Q.,Lu,Y.J.,Zhang,Z.N.,He,S.Q.,
Zheng,H.C.,et?al.(2010).Coexpression?of?δ-and?μ-opioid?receptors?in
nociceptive?sensory?neurons.Proc?Natl?Acad?Sci?U?S?A?107,13117-13122;MOR
激動劑DAMGO獲自Sigma;DOR的抑制劑naltrindole獲自Tocris。

各種抗體

HA和Myc抗體分別購自Roche和Sigma公司。

DOR抗體購自Santa?Cruz。

MOR抗體購自Dia?Sorin。

DOR13-17的抗體獲自Department?of?Cell?Biology?and?Neuroanatomy,
University?of?Minnesota,Minneapolis,MN?55455,USA。

細胞表面生物素標記的方法

在1微摩爾Delt刺激處理30分鐘之前或者之后,加入生物素與細胞孵育。
將細胞使用RIPA液吹打下來,在4℃的冰箱中裂解一個小時。在細胞的裂解
液使用streptavidin的珠子將生物素標記的蛋白收集下來。為了檢測受體的磷酸
化情況,培養的細胞使用1微摩爾的Delt或者DAMGO刺激30分鐘之后再進
行裂解。所有的細胞均在冰浴的RIPA緩沖液中(150mM?NaCl,30mM?HEPES,
10mM?NaF,1%Triton?and?0.01%SDS)裂解。來自小鼠脊髓的樣品在藥物處理
后,先經過超聲勻漿,然后離心。處理好的樣品在SDS-PAGE進行電泳,轉膜,
加入一抗,然后使用enhanced?chemiluminescence(ECL;Thermo?Scientific)顯色。
使用了Flag(1∶1,000,Sigma),Myc(1∶2,000),p-DOR(1∶1000,Neuromics),p-MOR
(1∶1000,Neuromics),DOR(1∶3,000,Santa?Cruz),MOR(1∶1,000)和actin
(1∶10,000,Santa?Cruz)等各種不同的抗體。每次實驗至少重復三次。結果使用
Scion?Image軟件量化分析。

原位雜交

用來檢測小鼠DOR1和MOR1表達的探針先使用各自特定的引物進行擴增。
DOR1的探針用digoxigenin標記上,而MOR1的探針則是用熒光素(fluorescein)
標記上的。成年小鼠的L4和L5(指腰段第四和第五對)的背根神經節(DRG)在10
μg/ml蛋白激酶K中處理30分鐘,并在67℃的雜交液中預雜交2.5小時。之后切
片使用1μg/ml?DOR1和2μg/ml?MOR1的探針在67℃的條件下雜交18小時。在使
用1%的封閉液處理之后,切片在抗熒光素的二抗中4℃過夜。然后切片在
tyramide信號增強液中處理20分鐘。在信號得到增強以后,切片再在含有抗
digoxigenin堿性磷酸酶和抗二硝基苯基(dinitrophenyl)Alexa488的封閉液中在4
℃的條件下孵育24小時。在切片使用堿性磷酸酶緩沖液清洗之后,再加入1μl/ml
nitroblue?tetrazolium和3.5μl/ml5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸
(5-bromo-4-chloro-3-indolyl?phosphate)進行顯色。

組織免疫組化/細胞免疫組化方法

轉染的HEK293細胞在37℃使用兔源抗HA(1∶500,Clontech)或者/和小鼠
源抗Myc(1∶200,Developmental?Studies?Hybridoma?Bank)的抗體,或是
LysoTracker?Red?DND-99(1∶500,Molecular?Probes),預先孵育30分鐘。接下
來細胞使用1微摩爾的Delt?I或者是DAMGO刺激30或者是90分鐘。處理完
的細胞經過4%多聚甲醛和0.2%苦味酸固定15分鐘,在清洗兩次后,使用各
自相對應的二抗孵育。神經元在37℃的培養箱中培養,加入0.5nM的TAT肽
蛋白處理12個小時后,使用兔源抗GST(1∶1000,Proteintech?Group)的抗體在
37℃水浴中孵育30分鐘。經過如此處理的神經元被固定,并加入帶有熒光素
(fluorescein)的二抗,然后封片。圖片經過Leica?SP2共聚焦顯微鏡獲取,并經
過Scion?Image軟件進行量化分析。

小鼠經過4%多聚甲醛和0.2%苦味酸的固定液灌流固定后進行冰凍切
片,挑選脊髓L4-5位置的組織進行切片。使用豚鼠抗Mu阿片受體(1∶400,
Neuromics),兔源抗Delta阿片受體(1∶400,Neuromics),小鼠源抗CGRP(1∶400,
Celltech)處理,然后加入相應的帶有fluorescein或者rhodamine或是CY5(1∶100,
Jackson?ImmunoResearch)的二抗。染好色的切片使用共聚焦顯微鏡采集圖片。
有些切片使用間接的Immunoperoxidase組織化學方法。

小鼠甩尾實驗

所有的動物實驗均在the?Society?for?Neuroscience(USA)的規范下進行。成
年的雄性的小鼠在以12小時為晝夜周期的條件下飼養。所有的實驗均在白天
進行。實驗前兩天,在實驗環境中使小鼠適應,穩定基礎痛閾值。鎮痛效果使
用52℃水浴的小鼠甩尾實驗來檢測。輕輕握著小鼠,將小鼠尾1/3部分豎直浸
入52℃熱水浴中,如果小鼠有明顯甩尾反應,記錄從入水到甩尾的反應時間,
作為痛覺閾值。篩選基礎閾值(Lbase)在2-3s左右的小鼠為正常反應小鼠進
行后續實驗,為避免小鼠被燙傷,選擇10s作為極限值(cut?off),同一小鼠
連續測定時,間隔時間為15-20s。小鼠快速甩尾的最開始反應時間點作為每次
使用計時的終點。進行藥物處理前測得的反應時間作為小鼠甩尾反應的基準時
間。Delt或者嗎啡均溶于在5微升的生理鹽水中,使用特殊的針頭經過腰段的
椎骨間小孔注射到脊髓腔內。TAT蛋白在嗎啡處理前2.5小時,1.5小時,0.5
小時經腹腔注射200微克/2毫升。本發明人使用10秒作為小鼠甩尾反應的最
大截至時間。鎮痛的效果使用一下公式計算:最大可能效果(MPE)=100×
(測得反應時間-基準反應時間/(10-基準反應時間)。數據使用均值±SEM的
方式表示。每一個劑量的數據在組間t檢測后使用one-way?ANOVA進行分析。

II.實施例

實施例1、在激動劑的激活下DOR和MOR可以共同內吞

為了弄清楚MOR的轉運是否受到DOR的調節,本發明人在HEK293細胞
(購自ATCC)中共轉帶有HA標簽蛋白的MOR和帶有Myc標簽蛋白的DOR,
在各自特異性的激動劑刺激下,DOR或者MOR都可以內吞。由于HA或者
Myc標記接在受體的氨基端,面向細胞外,可以用HA和Myc抗體,在活細胞
的狀態,標記細胞膜上的受體,在激動劑刺激后將細胞固定,加入相應的二抗,
可以檢測受體受激動劑刺激后的重分布情況。在正常情況下,DOR和MOR主
要分布在細胞膜上。1μM?DOR激動劑Delt?I,Delt?II或者是SNC-80的刺激下,
細胞膜上被標記上的DOR和MOR可以共同內吞,共存于同樣的囊泡狀結構中。
在單獨轉染了MOR的細胞中,Delt?I并不能導致膜上MOR的內吞,表明Delt
I造成的MOR的內吞需要DOR的共同表達。當1μM?MOR激動劑DAMGO的
刺激下,共轉的兩種受體也可以共同內吞,而這種共同內吞可以分別被5μM
的NTI,naloxone(NLX)或者CTOP所減弱。見圖1A。

本發明人進一步通過細胞表面生物素標記的方法確認了通過免疫組化實
驗得到的結果。在激動劑的刺激后,停留在轉染的細胞表面的受體被生物素所
標記,并通過固定在小珠上的streptavidin所收集,Delt?I和SNC-80的刺激可
以使位于細胞表面的DOR和MOR的水平大大降低,見圖1B。這些結果表明,
兩種受體共同表達的細胞在阿片受體特異性的激動劑刺激下,DOR和MOR可
以共同內吞。

受體的磷酸化在阿片受體的內吞過程中起著重要作用。本發明人發現受體
的磷酸化參與到激動劑引起的受體內吞過程中。免疫印跡的實驗表明,DOR和
MOR本底水平的磷酸化很低,Delt?I的刺激可以特異性地增加DOR的磷酸化
水平,而DAMGO的刺激可以特異性地提高MOR的磷酸化水平,見圖1C。

本發明人進一步通過共轉MOR和有五個磷酸化位點突變(T352A,T353A,
T358A,T361A和S363A位點的計算基于SEQ?ID?NO:2)的DOR突變體
DOR(M),驗證了磷酸化在兩個受體內吞過程中的重要性。該突變體在受到刺
激以后不能被磷酸化。在共轉了兩種受體的細胞系中,在Delt?I和SNC-80的
刺激下,DOR(M)和MOR均不能被內吞,見圖1D。上述結果表明激活的DOR
對于MOR和DOR的共內吞是必需的。

實施例2、通過DOR的激活引導細胞膜表面的MOR進入降解途徑

為了確定這些和DOR一起內吞的MOR最后的情況,激活DOR引導MOR
和DOR一起進入溶酶體結構中。使用免疫三標記的方法,本發明人發現Delt?I
可以誘導DOR和MOR進入到用LysoTracker標記的溶酶體結構中,但DAMGO
刺激不能,見圖2A-B。

免疫共沉淀的實驗表明,在共同表達DOR和MOR的293細胞系中,Delt
I處理提高DOR和MOR泛素化的水平,而DAMGO則對DOR和MOR泛素化
的水平沒有影響,見圖2C。

本發明人進一步用生化的方法,來檢測被內吞的受體是否真的降解了。在
使用藥物處理細胞之前,先用生物素標記活細胞表面。再用Delt?I或者DAMGO
刺激細胞90min,將細胞裂解,并收集被生物素標記的蛋白,結果發現Delt?I
可以顯著減少生物素標記上的受體數量,但DAMGO刺激則不能,溶酶體內的
蛋白酶抑制劑Leupeptin和MG132能夠完全阻斷Delt?I導致的受體降解,見圖
2D。以上實驗表明,共內吞的DOR和MOR進入到溶酶體進行降解。

實施例3、在脊髓水平激活DOR導致MOR的下調并降低嗎啡的鎮痛效應

雙標的原位雜交表明,DOR和MOR的mRNA在小鼠DRG小神經元中共
存(箭頭),見圖3A。

而使用DOR13-17的抗體在Oprd1第一外顯子敲除的小鼠(購自Jackson
Laboratory)脊髓組織樣品中檢測不到免疫印跡的信號,這證明了使用的這一抗
體的特異性,見圖3B。

使用DOR抗體在野生型小鼠脊髓切片I和II層的神經纖維上檢測到的免
疫染色信號在Oprd1第一外顯子基因敲除小鼠的切片中消失了,并且這一染色
信號同時也可以被相應的抗原所吸收掉,這就驗證了在實驗中使用的抗體染色
的特異性問題,見圖3C。

DOR和MOR都在表達神經肽P物質和CGRP的背根神經節小神經元中有
表達,這些神經元的傳入纖維終止于脊髓的I和II層。免疫染色的三標記實驗
表明,DOR和MOR在小鼠脊髓的傳入纖維和終末中與CGRP共存,見圖3D。

免疫共沉淀的實驗顯示,DOR和MOR的相互作用在脊髓水平依然存在,
而且這一作用在Delt?I的刺激下可以得到增強,見圖3E。

同時本發明人也驗證了在免疫共沉淀實驗中使用的DOR的抗體在Oprd1
第一外顯子敲除的小鼠脊髓組織樣品中也檢測不到免疫印跡的信號,圖3F。

此外,5μg?Delt?I(2次,5μg/次,間隔15分鐘)或者5μg內源性的DOR的
激動劑-L-ENK(2次,5μg/次,間隔15分鐘)鞘內注射可以顯著提高MOR的泛
素化水平,見圖3G。

與生化實驗一致,免疫組化的實驗也顯示,在鞘內注射Delt?I(2μg/15分
鐘)時,脊髓I和II層的MOR免疫染色顯著減弱,見圖3H。這些結果都表明,
激活脊髓背角的感覺傳入纖維中的DOR導致MOR的表達水平下調。

本發明人進一步的實驗發現,DOR的激活可以降低嗎啡在脊髓水平的鎮痛
作用。小鼠52℃的甩尾實驗顯示,在鞘內注射嗎啡前30min,預先鞘內注射
Delt?I,嗎啡的鎮痛作用將大大下降,Delt?I的作用具有劑量依賴性,這一類似
的效應也可以通過鞘內預先注射L-ENK和SNC-80得到,NTI與Delt?I合用會
阻斷Delt?I對嗎啡鎮痛作用的抑制效果,見圖3I,J,K以及表2。預先鞘內注
射DOR的抑制劑naltrindole可以提高嗎啡的鎮痛作用,見表3。

表2、在嗎啡處理前(1.5μg,i.t.)30分鐘小鼠接受Delt?I或L-ENK和
SNC-80處理(i.t.)可顯著地削弱嗎啡引起的脊髓鎮痛作用



注:與給予嗎啡前接受生理鹽水預處理組相比,*P<0.05,**P<0.01?and?***P
<0.001。

表3、DOR拮抗劑naltrindole的處理(NTI,i.t.)增強嗎啡引起的脊髓鎮痛作用


注:與給予嗎啡前接受生理鹽水預處理組相比,*P<0.05和***P<0.001。

上述一系列的實驗表明,在感受傳入纖維中DOR介導的MOR的下調致使
共介導的鎮痛作用的下降。

實施例4、MOR上的第一個穿膜結構域介導了MOR和DOR之間的相互
作用

為了更加全面地評價DOR和MOR之間的相互作用,在MOR活性的負調
控中的作用,本發明人尋求DOR和MOR間物理相互作用的區域。通過計算機
模擬計算,預測MOR上的第一個穿膜結構域是最有可能和DOR結合的界面。

本發明人構建的質粒中將MOR的第一個穿膜結構域(TM1,位于MOR氨
基酸的第63-93位,MOR蛋白上序列位置計數基于SEQ?ID?NO:1所示序列)的
N端接上一段CGRP的信號肽,以使融合到綠色熒光蛋白GFP的第一個穿膜結
構域蛋白能正確插入到細胞膜上,該質粒同myc-DOR質粒共轉入HEK293細
胞中,研究MOR與DOR之間的相互作用,見圖4A。免疫共沉淀的實驗顯示,
這段表達的穿膜結構域可以和全長的DOR相互作用,進一步的實驗證實,如
果將MOR上的第一個跨膜結構域用它的第三次跨膜段(TM3,位于MOR氨基
酸的第144-163位)取代,這一突變體,即圖4A,MOR(M),和DOR的相
互作用大大減弱。如果在共同表達DOR和MOR同時再表達MOR的第一個穿
膜結構域的肽段,兩個受體之間的相互作用也被顯著減弱,這表明第一個穿膜
結構域的過量表達可以干擾DOR和MOR之間的相互作用,見圖4B和圖4C。
以上結果表明,MOR的第一個穿膜結構域確實介導了其與DOR的相互作用。

使用MOR的突變體和MOR的第一個穿膜結構域的肽段作為工具,本發
明人進一步驗證了DOR和MOR之間的相互作用對于兩種阿片受體共同內吞的
重要性。見圖4D,Delt?I(1μM)的處理可以使DOR內吞,而對MOR突變體的
膜上表達并不影響(圖4E),這一共同內吞的失效,并不是由于突變體本身的轉
運出了問題,因為DAMGO(1μM)處理可以使MOR的突變體內吞。

本發明人進一步通過免疫組化的實驗發現,過量表達的MOR的第一個跨
膜結構域可以干擾由Delt?I或者使DAMGO引起的受體共內吞,見圖4F。

這一系列的實驗表明,MOR的第一個跨膜結構域可以將DOR和MOR分
離,從而影響受體的共同內吞。

實施例5、TAT肽段引導MOR的跨膜結構域在細胞膜上的正確插入

要評價受體的異源寡聚體的生理意義就需要一種打斷G蛋白偶聯受體物
理上相互作用的方法。可以將蛋白與TAT肽段融合來達到蛋白細胞內輸送的目
的,TAT肽是一段擁有11個酸性氨基酸的轉導肽段(序列是YGRKKRRQRRR),
它來源于人類的免疫缺陷病毒載體。人們前期的實驗表明,這一段短短的肽段
作為一種穿透細胞的載體,可以將小的物質或大的蛋白分子帶入到細胞內。

本發明人首先將TAT肽段接在MOR的TM1的羧基端,在TM1-TAT多肽
的氨基端融合GST和Flag標簽蛋白,可以使用抗GST和Flag的抗體進行檢測。
為了檢測TM1-TAT融合蛋白在細胞中的定位,本發明人將小鼠的背根神經節
神經元進行培養,然后加入帶有TAT的融合蛋白進行處理,使用GST的抗體
進行透膜性的或者非透膜性的孵育標記。結果發現,TAT蛋白大多分布在背根
神經節小神經元(91%)的細胞膜上,也有少部分定位于小神經元胞質囊泡狀的
結構中,見圖5A。同時,本發明人也發現,背根神經節大神經元被標記的比例
要小很多,僅有43%。因此,這些TAT融合蛋白能夠很有效率地插入到小神
經元的細胞膜上,這一現象可能是由于TAT肽的穿膜能力和跨膜段的疏水性在
膜上的停滯作用共同形成的。

同時,本發明人還發現TAT融合的TM1蛋白在細胞膜上的插入具有方向
性。TAT在TM1羧基端的融合蛋白在細胞膜上的插入方向和MOR中跨膜段的
插入方向相同,用GST抗體非透膜性活細胞標記的方法可以看到,TAT在羧
基端的TM1蛋白的GST標記明顯,說明GST主要位于細胞膜外;而與之形成
鮮明對比的是,TAT位于氨基端的TM1蛋白的GST標記不強,說明GST主要
在細胞內,這一蛋白在細胞膜中插入的方向和MOR中TM1的插入方向相反。
在MOR的第三個跨膜結構域(TM3)的TAT肽融合蛋白上也發現了同樣的分布
情況,見圖5A。

因此,TAT肽不僅可以作為一個穿膜的載體,而且由于疏水性的跨膜段的
存在這一肽段還可以引導跨膜蛋白在細胞膜上的插入方向。

實施例6、注射TM1-TAT蛋白可以增強嗎啡的鎮痛效應

本發明人進一步在脊髓背角檢驗了TM1-TAT蛋白(TAT在TM1羧基端)是
否可以打斷DOR和MOR之間的相互作用。實驗證實在腹腔注射TM1-TAT蛋
白(3次,10mg/kg/次)(該蛋白溶于常規的GST蛋白提純洗脫液中,濃度0.1
毫克每毫升)2.5小時后在脊髓水平可以檢測到蛋白的表達,包埋前免疫金標-
銀加強標記的實驗顯示在脊髓背角I和II層的初級感覺傳入末梢中TM1-TAT
位于細胞膜上,68.8±7.9%的標記顆粒位于小鼠脊髓I和II層的感受傳入纖
維終末的膜上,見圖5B。這一結果提示,在小鼠中給予的TAT融合蛋白可以
被運送到脊髓背角,并插入到感覺傳入纖維終末的膜上。在嗎啡處理前2.5小
時給予TM1-TAT蛋白增強嗎啡引起的脊髓鎮痛作用,見表4。

表4、在嗎啡處理(2mg/kg,s.c.)前2.5小時給予TM1-TAT(i.p.3次)增強嗎啡引起
的脊髓鎮痛作用


注:與給予嗎啡前接受生理鹽水預處理組相比,*P<0.05和**P<0.01。

同時,本發明人發現給予TM1-TAT蛋白可以降低DOR介導的對嗎啡鎮痛
作用的抑制。免疫共沉淀的實驗證實,在腹腔注射TM1-TAT蛋白2.5小時后,
DOR和MOR之間的相互作用顯著降低了,同樣的處理也可以使鞘內注射Delt
I刺激所致的脊髓MOR泛素化的增加恢復到基礎水平,見圖5C-D。這些結果
都表明,TM1-TAT在插入到感覺傳入終末的膜上以后可以打斷DOR和MOR
之間的相互作用。

本發明人進一步的行為學實驗發現,在給小鼠注射嗎啡之前2.5小時左右
腹腔注射TM1-TAT蛋白,可以顯著增強皮下注射嗎啡的鎮痛效果,其增強效
果達到三倍多,而DOR介導的鎮痛作用則絲毫不受影響,見圖6B及表5。并
且TAT-TM1蛋白造成的效應具有特異性,因為TAT融合在TM1的氨基端、
TAT接在TM3羧基端或氨基端的融合蛋白均不能影響DOR介導的對嗎啡鎮痛
的抑制作用,見圖6A。這些結果提示,正常情況下脊髓水平MOR的功能就受
到DOR的抑制,嗎啡的鎮痛作用可以通過打斷DOR和MOR之間相互作用得
到增強。同時本發明人也發現TM1-TAT的處理(在2.5h/天內,10mg/kg/每次,
共注射三次),可以緩解嗎啡耐受作用的1產生。而同樣條件下使用TM3-TAT
對小鼠進行處理對嗎啡的耐受效應沒有影響,圖6C及表6。

表5、在Delt?I處理(2.5μg,i.t.)前2.5h給予TM1-TAT蛋白(10mg/kg,i.p.),DOR
介導的脊髓鎮痛作用不受影響


表6、在嗎啡處理前2.5h(5mg/kg,i.p.)給予TM1-TAT蛋白(10mg/kg,i.p.),可
以緩解嗎啡耐受作用的產生



注:與給予嗎啡前接受生理鹽水(control)預處理組相比,*P<0.05,**P<0.01
and?***P<0.001。

實施例8.篩選藥物

以前述實施例1構建的共轉帶有HA標簽蛋白的MOR和帶有Myc標簽蛋
白的DOR的HEK293細胞作為用于篩選的細胞模型。

測試組:用候選物質處理的上述細胞的培養物;

對照組:不用候選物質處理的上述細胞的培養物。

通過免疫共沉淀法鑒定MOR和DOR的相互作用情況,如果與對照組相比,
測試組中MOR和DOR的相互作用減弱(弱50%或以上),則表明候選物質是可
以抑制MOR和DOR的相互作用的物質,其對于增強阿片鎮痛劑的鎮痛作用是
有用的。

具體地,本發明人利用前述實施例5制備的TM1-TAT蛋白,以及TM3-TAT
蛋白作為候選物質,結果發現,TM1-TAT蛋白能夠顯著地抑制MOR和DOR
的相互作用;而TM3-TAT作用不明顯。因此可見TM1-TAT蛋白對于增強阿片
鎮痛劑的鎮痛作用是有用的。

討論

本發明人的研究表明,DOR-MOR復合體中DOR的激活可以導致細胞膜
上的兩種阿片受體的內吞,共同內吞的阿片受體進入到降解途徑。MOR的第
一個穿膜結構域介導了DOR和MOR之間的相互作用,將TAT肽段融合在MOR
的第一個穿膜結構域的羧基端,融合蛋白在細胞中的插入方向和MOR整體分
子中第一個穿膜結構域的方向相同,給予小鼠TM1-TAT融合蛋白可以打斷脊
髓水平DOR和MOR之間的相互作用,從而增強嗎啡的鎮痛效應。這些結果表
明,打斷DOR和MOR間物理性的相互作用可以作為一種提高MOR介導的鎮
痛作用的策略。

已經知道在單獨表達DOR和MOR時,兩種受體會被分揀到不同的轉運途
徑中。內吞的DOR常進入溶酶體中進行降解,而內吞的MOR進入到再生途徑
回到細胞膜上重新敏化。本發明人的實驗表明,在兩種受體共表達時選擇性的
MOR或DOR激動劑會使兩類受體共同內吞,并分揀到相同的途徑。這一效應
受到不同的生化過程的影響,阿片受體選擇性的激動劑引起相應受體的磷酸
化,那種跨受體間的磷酸化修飾曾出現在MOR和somatostatin受體或者是P
物質受體之間,但是在DOR和MOR之間并沒有出現。更進一步的實驗表明,
DOR選擇性激動劑的刺激可以導致兩類受體的泛素化,而DAMGO卻減少了
兩種受體泛素化的基礎水平,這一發現也和人們已有的認識一致,受體的內吞
可以通過泛素依賴性的或者非依賴型的方式進行。

不斷積累的實驗數據顯示DOR在痛覺調控中有多重作用。DOR的激動劑
只具有很弱或者較溫和的鎮痛作用,但DOR表現出對MOR的負調控作用。基
于受體相互作用引起的細胞膜上DOR和MOR數目的共同減少可能會是一種調
節神經元對阿片肽敏感性的重要機制。在背根神經節小神經元中,MOR主要
是分布于細胞膜上,而DOR主要位于胞質中含有神經肽的大致密性囊泡中,
DOR激動劑的處理可以使細胞內的DOR插入到細胞膜上,導致在脊髓背角神
經纖維中MOR的泛素化水平增加和受體數目降低。因此,由于大致密性囊泡
中DOR的上膜,DOR和MOR之間的相互作用顯著增加,這一過程可能是在
脊髓水平DOR介導的對MOR活性抑制作用的一種內在機制。

用藥物抑制DOR的活性或者敲除DOR基因均可以增強嗎啡的效應。在本
文中,本發明人使用一種方法來打斷DOR和MOR之間的相互作用,來檢測對
嗎啡鎮痛作用的影響。腹腔注射的TM1-TAT可以被轉運到脊髓中,并插入到
感覺傳入纖維終末的胞膜上,削弱DOR和MOR基礎水平上的相互作用,使嗎
啡在脊髓水平上的鎮痛效應顯著增強。這些發現提示,位于DOR-MOR復合體
中的DOR在基礎水平時就已經被內源性的阿片肽激活,如在痛覺刺激下能被
脊髓背角神經元釋放的內啡肽(enkephalin),這些肽類的釋放能夠使在正常情況
下就使DOR對MOR的功能產生抑制作用。在嗎啡處理之前給予TM1-TAT蛋
白,可以競爭性地結合被痛覺刺激或嗎啡處理所致的插入到細胞膜上的DOR,
從而減少DOR和MOR在細胞膜表面的結合。

在本發明中有一重要的發現,TAT肽在TM1-TAT蛋白中能夠作為一個導
向成份,引導外源的TM1多肽按正確的方向插入到細胞膜上,這對TM1行使
功能非常重要。這一方法能給本發明人提供一種新的手段,通過打斷兩類G蛋
白偶聯受體之間在細胞膜上物理性的相互作用在在體情況下來分析對神經元
活動的影響,而同時對各自受體的正常功能大部分不產生影響。為了設計出能
有效打斷受體相互作用的分子探針,本發明人必須首先來確認G蛋白耦聯受體
之間相互作用形成異源多聚體的分子界面。本發明人的實驗表明,通過確認介
導受體相互作用的穿膜結構域,將TAT肽連接在穿膜結構域的氨基端或者羧基
端來控制穿膜結構域在細胞膜上的插入方向。這種具有高選擇性的干擾G蛋白
偶聯受體在細胞膜上的物理性相互作用的方法,不僅為本發明人研究受體相互
作用的功能提供了一種強有力的工具,同時也是一種藥物干涉的新策略。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻
被單獨引用作為參考那樣。此外應理解,在閱讀了本發明的上述講授內容之后,
本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申
請所附權利要求書所限定的范圍。











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