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3氨基2羥基4苯基纈氨酰異亮氨酸及其制備方法和應用.pdf

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氨基 羥基 苯基 纈氨酰 異亮氨酸 及其 制備 方法 應用
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摘要
申請專利號:

CN201110076554.6

申請日:

2011.03.29

公開號:

CN102477067B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 5/087申請日:20110329|||公開
IPC分類號: C07K5/087; C12P21/02; A61K38/06; A61P31/04; C12R1/465(2006.01)N 主分類號: C07K5/087
申請人: 上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司
發明人: 戈梅; 李秋爽; 夏興; 羅敏玉; 蔣含嫣; 阮麗軍; 阮林高; 康懷俠; 楊天; 王天嬌; 饒敏
地址: 201203 上海市浦東新區張江牛頓路200號8號樓5樓
優先權: 2010.11.19 CN 201010554703.0
專利代理機構: 上海華工專利事務所(普通合伙) 31104 代理人: 應云平
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110076554.6

授權公告號:

102477067B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.11.20|||2012.05.30

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及3-氨基-2-羥基-4-苯基-纈氨酰-異亮氨酸及其制備方法和應用,其結構式為:由小鏈霉菌CGMCC?No.4027發酵制得,對革蘭氏陽性菌具有抑制作用,可以用于制備抑制革蘭氏陽性菌的藥物。

權利要求書

1: 一種化合物, 其結構式為 :
2: 如權利要求 1 所述的化合物的制備方法, 其特征在于, 由小鏈霉菌 CGMCCNo.4027 在 發酵培養基中發酵制得, 其中 : 所述發酵培養基的碳源選自 : 糊精、 可溶性淀粉、 檸檬酸鹽、 甘油、 葡萄糖、 甘露醇、 鼠李 糖、 L- 阿拉伯糖、 纖維二糖、 糖原、 水楊苷、 苦杏仁苷、 丙酸鈉、 琥珀酸鈉、 乙酸鈉、 蘋果酸鈉, 含量為 1.0 ~ 8.0% ; 氮源選自 : 酵母粉、 黃豆餅粉、 棉籽餅粉、 花生餅粉, 含量為 0.5 ~ 5.0% ; 發酵溫度為 28 ~ 30℃, 發酵時間為 4 ~ 6 天。
3: 如權利要求 2 所述的制備方法, 其特征在于, 所述發酵在搖瓶中進行, 轉速為 200 ~ 230rpm。
4: 如權利要求 2 所述的制備方法, 其特征在于, 所述發酵在發酵罐中進行, 攪拌轉速為 400 ~ 500rpm, 通氣量為 7 ~ 9L/min。 5. 如權利要求 2 所述的制備方法, 其特征在于, 所述發酵培養基含有糊精 3.5 ~ 4.0%, 葡萄糖 0.5 ~ 1.0%, 黃豆餅粉 2.0 ~ 2.5%, 硫酸亞鐵銨 0.05 ~ 0.15%。 6. 如權利要求 5 所述的制備方法, 其特征在于, 所述發酵培養基含有糊精 3.6%, 葡萄 糖 0.8%, 黃豆餅粉 2.2%, 硫酸亞鐵銨 0.1%。 7. 如權利要求 2 所述的制備方法, 其特征在于, 所述制備方法還包括發酵后進行分離 提取的步驟。 8. 如權利要求 1 所述的化合物的應用, 其特征在于, 用于制備抑制革蘭氏陽性菌的藥 物。 9. 如權利要求 8 所述的應用, 其特征在于, 所述革蘭氏陽性菌為藤黃微球菌或枯草芽 孢桿菌。
5: 0% ; 發酵溫度為 28 ~ 30℃, 發酵時間為 4 ~ 6 天。 3. 如權利要求 2 所述的制備方法, 其特征在于, 所述發酵在搖瓶中進行, 轉速為 200 ~ 230rpm。 4. 如權利要求 2 所述的制備方法, 其特征在于, 所述發酵在發酵罐中進行, 攪拌轉速為 400 ~ 500rpm, 通氣量為 7 ~ 9L/min。 5. 如權利要求 2 所述的制備方法, 其特征在于, 所述發酵培養基含有糊精 3.5 ~ 4.0%, 葡萄糖 0.5 ~ 1.0%, 黃豆餅粉 2.0 ~ 2.5%, 硫酸亞鐵銨 0.05 ~ 0.15%。
6: 如權利要求 5 所述的制備方法, 其特征在于, 所述發酵培養基含有糊精 3.6%, 葡萄 糖 0.8%, 黃豆餅粉 2.2%, 硫酸亞鐵銨 0.1%。
7: 如權利要求 2 所述的制備方法, 其特征在于, 所述制備方法還包括發酵后進行分離 提取的步驟。 8. 如權利要求 1 所述的化合物的應用, 其特征在于, 用于制備抑制革蘭氏陽性菌的藥 物。 9. 如權利要求 8 所述的應用, 其特征在于, 所述革蘭氏陽性菌為藤黃微球菌或枯草芽 孢桿菌。
8: 0% ; 氮源選自 : 酵母粉、 黃豆餅粉、 棉籽餅粉、 花生餅粉, 含量為 0.5 ~ 5.0% ; 發酵溫度為 28 ~ 30℃, 發酵時間為 4 ~ 6 天。 3. 如權利要求 2 所述的制備方法, 其特征在于, 所述發酵在搖瓶中進行, 轉速為 200 ~ 230rpm。 4. 如權利要求 2 所述的制備方法, 其特征在于, 所述發酵在發酵罐中進行, 攪拌轉速為 400 ~ 500rpm, 通氣量為 7 ~ 9L/min。 5. 如權利要求 2 所述的制備方法, 其特征在于, 所述發酵培養基含有糊精 3.5 ~ 4.0%, 葡萄糖 0.5 ~ 1.0%, 黃豆餅粉 2.0 ~ 2.5%, 硫酸亞鐵銨 0.05 ~ 0.15%。 6. 如權利要求 5 所述的制備方法, 其特征在于, 所述發酵培養基含有糊精 3.6%, 葡萄 糖 0.8%, 黃豆餅粉 2.2%, 硫酸亞鐵銨 0.1%。 7. 如權利要求 2 所述的制備方法, 其特征在于, 所述制備方法還包括發酵后進行分離 提取的步驟。 8. 如權利要求 1 所述的化合物的應用, 其特征在于, 用于制備抑制革蘭氏陽性菌的藥 物。
9: 如權利要求 8 所述的應用, 其特征在于, 所述革蘭氏陽性菌為藤黃微球菌或枯草芽 孢桿菌。

說明書


3- 氨基 -2- 羥基 -4- 苯基 - 纈氨酰 - 異亮氨酸及其制備方 法和應用

    【技術領域】
     本發明涉及一種新的化合物 3- 氨基 -2- 羥基 -4- 苯基 - 纈氨酰 - 異亮氨酸及其 制備方法和應用。背景技術
     上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司從采集自自然環境中的土壤樣品 中進行微生物分離, 得到了一株可產達托霉素的新型小鏈霉菌 (Streptomyces parvus), 于 2010 年 7 月 20 日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心正式保藏, 保藏號為 : CGMCC No.4027, 保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路 1 號院 3 號。目前已知的小鏈霉菌 CGMCC No.4027 的次級代謝產物僅限于達托霉素。 發明內容 本申請的發明人經過廣泛而深入的研究, 在小鏈霉菌 CGMCC No.4027 的次級代謝 產物中分離出一種新的化合物, 因此, 本發明的目的在于提供一種新型的化合物。
     本發明的另一目的在于提供該化合物的制備方法。
     本發明的再一目的在于提供該化合物的應用。
     本發明提供的化合物, 為 3- 氨基 -2- 羥基 -4- 苯基 - 纈氨酰 - 異亮氨酸 (3-amin o-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-valyl-isoleucine) 具有如下結構 :
     本發明的化合物的制備方法, 是由小鏈霉菌 CGMCC No.4027 在發酵培養基中發酵 制得, 其中, 所述發酵培養基的碳源選自 : 糊精、 可溶性淀粉、 檸檬酸鹽、 甘油、 葡萄糖、 甘露 醇、 鼠李糖、 L- 阿拉伯糖、 纖維二糖、 糖原、 水楊苷、 苦杏仁苷、 丙酸鈉、 琥珀酸鈉、 乙酸鈉、 蘋 果酸鈉, 含量為 1.0 ~ 8.0% ;
     氮源選自 : 酵母粉、 黃豆餅粉、 棉籽餅粉、 花生餅粉, 含量為 0.5 ~ 5.0% ;
     發酵溫度為 28 ~ 30℃, 發酵時間為 4 ~ 6 天。
     根據本發明, 所述發酵在搖瓶中進行, 轉速為 200-230rpm。
     根據本發明, 所述發酵在發酵罐中進行, 攪拌轉速為 400-500rpm, 通氣量為 7-9L/ min。
     根據本發明, 所述發酵培養基含有糊精 3.5 ~ 4.0%, 葡萄糖 0.5 ~ 1.0%, 黃豆餅
     粉 2.0 ~ 2.5%, 硫酸亞鐵銨 0.05 ~ 0.15%。優選的, 所述發酵培養基含有糊精 3.6%, 葡 萄糖 0.8%, 黃豆餅粉 2.2%, 硫酸亞鐵銨 0.1%。
     進一步的, 所述制備方法還包括發酵后進行分離提取的步驟。
     本發明提供的化合物, 用于制備抑制革蘭氏陽性菌的藥物。 其中, 所述革蘭氏陽性 菌為藤黃微球菌或枯草芽孢桿菌。 附圖說明
     圖 1 為 HPLC 分析圖。 圖 2 為正離子高分辨質譜圖。 圖 3 為正離子二級質譜圖。 圖 4 為氫譜譜圖。 圖 5 為碳譜譜圖。 圖 6 為 H-H COSY 譜圖。 圖 7 為 HMBC 譜譜圖。具體實施方式
     以下結合具體實施例, 對本發明做進一步說明。 應理解, 以下實施例僅用于說明本 發明而非用于限制本發明的范圍。
     本發明所用的菌種為小鏈霉菌 (Streptomyces parvus), 已于 2010 年 7 月 20 日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC), 保藏號 CGMCC No.4027。
     以下實施例中所述斜面培養基、 所述種子培養基、 所述發酵培養基的配方 (w/v) 如下 :
     斜面培養基 : 高氏一號培養基。
     種子培養基 : 葡萄糖 (2% )、 甘油 (2% )、 可溶性淀粉 (6% )、 黃豆餅粉 (5% )、 磷 酸二氫鉀 (0.02% )、 七水合硫酸鎂 (0.04% ), 其余為水。初始 pH 為 7.3-7.5。
     發酵培養基 : 黃豆餅粉 (2.2% )、 糊精 (3.6% )、 葡萄糖 (0.8% )、 六水合硫酸亞鐵 銨 (Fe(NH4)2(SO4)26H2O)(0.1% ), 其余為水。初始 pH 為 7.3-7.5。
     實施例 1 化合物的制備
     1.1 發酵
     將菌株 CGMCC No.4027 從凍干管中接種到高氏一號斜面培養基上, 于 28℃ -30℃ 培養四天后, 轉入裝有經 121℃高壓滅菌 30min 的種子培養基的三角瓶中, 置于搖床進行種 子培養, 其中, 搖床轉速為 200-230rpm, 溫度為 28-30℃, 培養時間為 46-50h。 種子培養結束 后再轉入裝有已滅菌的發酵培養基的三角瓶內, 轉種量 5%, 進行搖瓶發酵培養, 搖床轉速 200-230rpm, 溫度 28-30℃, 培養 6 天后, 發酵結束。
     經種子培養后也可轉入裝有已滅菌的發酵培養基的 5L 玻璃發酵罐內。轉種量為 5%, 在發酵罐內進行發酵, 攪拌轉速為 400-500rpm, 溫度控制在 28-30℃, 通氣量為 7-9L/ min, 培養 4-6 天后結束發酵。
     1.2 分離提取
     將經發酵后得到的發酵液置于 4℃冰箱中過夜, 沉淀蛋白。之后將發酵液于 4℃、4000rpm 離心 30min。棄下層沉淀, 上清液用大孔吸附樹脂吸附, 大孔吸附樹脂可以采用 XAD-1600, SP850, 或 JD-1, 于靜態或動態進行吸附皆可。 吸附后用兩倍柱體積的純水, 10%, 30%, 50%, 75%, 100%乙醇依次洗脫, 粗品集中在 50%乙醇洗脫液中。粗品液用旋轉蒸發 儀于 40℃減壓濃縮, 再采用中壓系統進行粗制。條件如下 : 粗品濃縮液用 30%乙腈稀釋 10 倍, 12000rpm 離心 10min, 上清為進樣樣品。 上樣量為 15-25ml, 采用中壓柱 ( 型號 : Biotage Si 25+M 1603-2, USA) 進行分離, 柱溫自然, 流動相為 30%乙腈 500ml, 等度洗脫。流速約 3-5ml/min, 樣品集中于 200-400ml 的洗脫液中。 洗脫液用旋轉蒸發儀于 40℃減壓濃縮后采 用 DIONEXP680 雙元泵制備液相系統或制備型 Agilent 1100 DAD 單泵液相系統進行制備, 收集到的制備液于 40℃旋蒸濃縮至干獲得目標化合物純品, 得到的純品為淡黃色粉末, 易 溶于甲醇, 乙醇, 水, 乙腈。不溶于氯仿。液相制備條件如下 :
     制備柱 : YMC CombiPreP ODS-A 5μm 20×250mm
     柱溫 : 自然 檢測器 : DAD(210nm, 223nm, 254nm, 280nm)
     流動相 ( 體積比 ) : 25%乙腈 +75%含 0.1% TFA 的水溶液
     流速 : 8ml/min 進樣量 : 60-700μl
     等度洗脫 實施例 2 化合物的結構鑒定
     將經制備液相系統制備收集的純品上分析型 Agilent 1100 DAD 雙元泵液相系統 進行分析, 條件如下 :
     分析用柱 : 菲羅門 C18 柱 5μm 4.6×250mm
     柱溫 : 30℃ 檢測器 : VWD 210nm
     流動相 ( 體積比 ) : 25%乙腈 +75%含 0.1% TFA 的水溶液
     流速 : 1ml/min 進樣量 : 5μl
     等度洗脫
     如圖 1 所示, 目標化合物在此條件下出峰保留時間在 8.6min 左右, 除去 3min 左右 的兩個溶劑峰, 純度> 95%。
     經高分辨質譜檢測 ( 圖譜如圖 2 所示 ), 目標化合物精確分子量為 407.2522, 分子 式為 C21H33N3O5。進一步, 經二維質譜 ( 圖 3) 檢測, 結合目標化合物的氫譜 ( 圖 4)、 碳譜 ( 圖 5) 及 COSY 譜 ( 圖 6)、 HMBC 譜 ( 圖 7) 及核磁數據 ( 表 1) 對其結構進行分析。
     表 1 NMR 核磁數據
     通過解析, 確定了所有碳原子和氫原子的歸屬, 得到了小鏈霉菌的次級代謝產物 的結構如下 :
     實施例 3 化合物的抑菌活性
     藤 黃 微 球 菌 CMCC28001 和 枯 草 芽 孢 桿 菌 CMCC63501 菌 懸 液 (5×107/ml) 各 加 100μl 于 25ml 細菌瓊脂培養基, 倒平板, 待培養基凝固后, 將加有樣品的紙敏片置于表面。 其中樣品濃度 1.9mg/ml, 加樣量 60μl, 紙片直徑 0.68cm。
     37 ℃培養 12-20h 后, 藤黃微球菌抑菌圈直徑 0.92cm, 枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑 1.04cm, 顯示該化合物對藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌都有抗菌活性。
    

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