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一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物及其制備方法.pdf

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一種 治療 纖維化 組分 植物 組合 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310111278.1

申請日:

2013.04.01

公開號:

CN103191188B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 專利權的轉移號牌文件類型代碼:1602號牌文件序號:101731674962IPC(主分類):A61K 31/715專利號:ZL2013101112781登記生效日:20160411變更事項:專利權人變更前權利人:上海現代中醫藥股份有限公司變更后權利人:安徽致和堂藥業有限公司變更事項:地址變更前權利人:200050 上海市長寧區長寧路1027號兆豐廣場33樓變更后權利人:233608 安徽省亳州市渦陽縣城東經濟開發區|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 36/537申請日:20130401|||公開
IPC分類號: A61K31/715; A61K31/7048; A61K31/216; A61P1/16; A61K31/7028(2006.01)N 主分類號: A61K31/715
申請人: 上海現代中醫藥股份有限公司
發明人: 徐列明; 馮怡; 胡坪; 李醫明; 沈嵐; 劉崇敏; 李光偉; 涂馭斌; 潘一峰
地址: 200050 上海市長寧區長寧路1027號兆豐廣場33樓
優先權:
專利代理機構: 上海泰能知識產權代理事務所 31233 代理人: 黃志達
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310111278.1

授權公告號:

|||103191188B||||||

法律狀態公告日:

2016.05.04|||2014.12.10|||2013.08.14|||2013.07.10

法律狀態類型:

專利申請權、專利權的轉移|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物,按每公斤體重計分別為:蟲草粗多糖180-350mg、蟲草脂溶性組分0.06~0.82ml、丹參酚酸100-190mg、絞股藍皂苷2-68mg、絞股藍多糖3-12mg、苦杏仁苷0.1~4mg。制備包括:(1)提取蟲草粗多糖、蟲草脂溶性組分、丹參酚酸、苦杏仁苷、絞股藍皂苷和絞股藍多糖;(2)將丹參酚酸、蟲草粗多糖和絞股藍多糖制成水溶性微丸作為A部分,將絞股藍皂苷、蟲草脂溶性部分和苦杏仁苷制成固體分散體微丸作為B部分,按質量比8:0.3組成多元釋藥系統和各種臨床所用制劑。本發明具有顯著增強臨床療效,副作用小,是一種十分值得推薦的臨床用法。

權利要求書

權利要求書
1.   一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物,按每公斤體重計分別為:蟲草粗多糖180?350mg、蟲草脂溶性組分0.06~0.82ml、丹參酚酸100?190mg、絞股藍皂苷2?68mg、絞股藍多糖3?12mg、苦杏仁苷0.1~4mg。

2.   根據權利要求1所述的一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物,其特征在于:按每公斤體重計,所述分別為蟲草粗多糖230~250mg、蟲草脂溶性組分0.1~0.2ml、丹參酚酸120~140mg、絞股藍皂苷10~30mg、絞股藍多糖7~8mg、苦杏仁苷1~2mg。

3.   根據權利要求1所述的一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物,其特征在于:按每公斤體重計,所述分別為蟲草粗多糖240mg、蟲草脂溶性組分0.1ml、丹參酚酸130mg、絞股藍皂苷20mg、絞股藍多糖7.3mg、苦杏仁苷1mg。

4.   一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物的制備方法,包括:
(1)提取所述6組分:蟲草粗多糖、蟲草脂溶性組分、丹參酚酸、苦杏仁苷、絞股藍皂苷和絞股藍多糖;
①蟲草脂溶性組分:取蟲草菌絲體粉,以20vol%乙醇水溶液制粒后放入超臨界萃取儀的萃取釜中,萃取條件:溫度為45℃,壓力為30MPa,時間為2h,流量為35kg/h;分離條件為:第一級分離壓力為10MPa,溫度為50℃,第二級分離壓力為6MPa,溫度為40℃;收集分離解析出來的油狀物,得到蟲草脂溶性組分;
②蟲草粗多糖:將經超臨界萃取后的蟲草菌絲體渣在pH=8的10倍NaOH水溶液中煮沸3小時,共2次,合并后,離心去渣,上清液濃縮,加乙醇至終濃度為75vol%,冰箱放置,析出多糖,過濾,洗凈干燥,得到蟲草粗多糖;
③丹參酚酸:取丹參藥材1kg,加入10倍量去離子水,煮沸1h,將藥液傾出,藥渣中再加入10倍量去離子水,煮沸1h,將藥液傾出,合并兩次提取液,靜置,過濾;濃縮至1.5L,藥液比為1:1.5,加入4.2L95vol%乙醇至乙醇濃度約為70vol%,醇沉過夜,離心,將上溶液減壓濃縮至無醇味,1.5L,取預處理好的HZ?816樹脂2L,濕法裝柱,用去離子水沖洗至無醇味,以1/2床層體積/小時的流速將上述提取濃縮液上柱后,再以2.5BV40%的乙醇洗脫丹酚酸,流速為1BV/h,收集40%乙醇洗脫液,減壓干燥,得黃色固體粉末,經測定,丹參酚酸類組分的得率為8%,其中丹酚酸B等酚酸的含量為25%;
④苦杏仁苷:稱取桃仁藥材1kg,加入10倍量的50%乙醇,加熱回流90min,過濾,濾液減壓濃縮至料液比1:1,取預處理好的HZ?818樹脂250ml,濕法裝柱,用去離子水沖洗至無醇味,將桃仁提取濃縮液以1BV/h流速上柱后,先以2BV去離子水沖洗,速率為2BV/h,棄去水淋洗液,再以3BV50vol%乙醇洗脫苦杏仁苷,速率為2BV/h,收集50%乙醇洗脫液,減壓濃縮、干燥,得淺黃色固體粉末,經測定,苦杏仁苷類組分的得率約為0.8%,其中苦杏仁苷含量約為63%;
⑤絞股藍皂苷:稱取絞股藍藥材1kg,加入20倍量的60%乙醇,回流提取2h,過濾,濾液減壓濃縮至浸膏狀,加30%乙醇至料液比1:3,超聲溶解15min,離心,上清液過大孔吸附樹脂,取預處理好的HZ?816樹脂2L,濕法裝柱,用去離子水沖洗至無醇味,將絞股藍提取液以1/4BV/h流速上柱,以1/2BV/h流速用2BV水沖洗,棄去淋洗液,再在相同流速下,以2BV30%乙醇沖洗,棄去淋洗液,最后以3BV95%乙醇洗脫絞股藍皂苷,收集95%乙醇洗脫液,減壓濃縮、干燥,得淡黃色固體粉末,經測定,絞股藍皂苷類組分的得率約為1%,其中絞股藍總皂苷含量為40%;
⑥絞股藍多糖:將⑤提取絞股藍藥渣自然晾干,稱取藥渣500g,以15倍量去離子水回流提取1h,過濾,濾液減壓濃縮至料液比1:1,加95%的乙醇900ml,至含醇量70%,醇沉過夜,過濾,濾餅用95%乙醇兩次,烘干,粉碎,得黃色絞股藍多糖粉末,經測定,絞股藍皂多糖組分的得率為4%,其中絞股藍多糖含量為15%;
(2)按所述每公斤體重將丹參酚酸、蟲草粗多糖和絞股藍多糖制成水溶性微丸作為A部分,將絞股藍皂苷、蟲草脂溶性部分和苦杏仁苷制成固體分散體微丸作為B部分,A和B按質量比8:0.3;其中,A部分載藥量為33%,B部分載藥量為2.5%。

5.   根據權利要求1所述的一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物,其特征在于:制成應用于腸道的特定部位的制劑,用量根據患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴重程度調整,一次或多次施用。

6.   根據權利要求1或5所述的一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物,其特征在于:所述制劑為片劑或膠囊。

7.   根據權利要求6所述的一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物,其特征在于:所述膠囊制成微膠囊或分散體微丸。

8.   根據權利要求7所述的一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物,其特征在于:每100g體重灌胃劑量:A部分18.9~37.8mg,B部分0.709~1.418mg。

9.   根據權利要求8所述的一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物,其特征在于:每100g體重灌胃劑量:A部分18.9mg,B部分0.709mg或者A部分37.8mg,B部分1.418mg。

說明書

說明書一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物及其制備方法
技術領域
本發明屬于治療肝纖維化的植物藥組分組合物及其制備,特別涉及一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物及其制備方法。
背景技術
我國是世界上慢性乙型病毒性肝炎等肝臟疾病的高發地區,長期以來慢性肝病對我國人民的健康造成重大危害。但是,到目前肝纖維化治療還是慢性肝病治療中的一大難點。自上世紀80年代起,上海中醫藥大學成功創制抗肝纖維化國家中藥新藥“扶正化瘀膠囊”(國藥準字20020073),該藥由丹參、蟲草菌絲、桃仁、絞股藍、松花粉、五味子組成,功效為活血祛瘀、益精補虛。多年研究證實扶正化瘀膠囊可有效改善慢性乙型肝炎肝纖維化,肝組織纖維化分期的逆轉率(較治療前下降1期或1期以上)達52%,通過為期2年的臨床觀察,顯示該藥可降低肝硬化門脈高壓患者的上消化道出血率。
但是目前扶正化瘀膠囊的制劑比較落后,一次服藥5顆膠囊,引起部分患者胃腸道反應,雖然已經開發的片劑可以減少胃部不適,但仍然有進一步提高治療肝纖維化臨床療效的需求。《藥理學》記載,桃仁中的苦杏仁苷經腸道消化酶分解后可產生大量的氫氰酸,出現氫氰酸中毒。雖然在臨床上從未發生過患者因服用扶正化瘀復方出現中毒的事件,但是如何防止潛在的嚴重毒副作用非常必要。因此,進一步二次開發扶正化瘀中藥復方,在現有逆轉肝纖維化52%的基礎上再提高療效,減少毒副作用是仍然需要努力的方向。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物及其制備方法,具有顯著增強臨床療效,副作用小,是一種十分值得推薦的臨床用法。
本發明的一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物,原料由蟲草菌絲、丹參、桃仁和絞股藍組成。
所述6組分原液的配伍劑量,按每公斤體重計分別為:蟲草粗多糖180?350mg、蟲草脂溶性組分0.06~0.82ml、絞股藍皂苷2?68mg、絞股藍多糖3?12mg、丹參酚酸100?190mg、苦杏仁苷0.1~4mg。
優選的按每公斤體重計分別為:蟲草粗多糖230~250mg、蟲草脂溶性組分0.1~0.2ml、絞股藍皂苷10~30mg、絞股藍多糖7~8mg、丹參酚酸120~140mg、苦杏仁苷1~2mg。
進一步優選的按每公斤體重計分別為:蟲草粗多糖240mg、蟲草脂溶性組分0.1ml、絞股藍皂苷20mg、絞股藍多糖7.3mg、丹參酚酸130mg、苦杏仁苷1mg。
本發明中的一種治療肝纖維化的6組分植物藥組合物的制備方法,包括:
(1)提取所述的6組分:蟲草粗多糖、蟲草脂溶性組分、丹參酚酸、苦杏仁苷、絞股藍皂苷和絞股藍多糖;
①蟲草脂溶性組分:取蟲草菌絲體粉,以20vol%乙醇水溶液制粒后放入超臨界萃取儀的萃取釜中,萃取條件:溫度為45℃,壓力為30MPa,時間為2h,流量為35kg/h;分離條件為:第一級分離壓力為10MPa,溫度為50℃,第二級分離壓力為6MPa,溫度為40℃;收集分離解析出來的油狀物,得到蟲草脂溶性組分;
②蟲草粗多糖:將經超臨界萃取后的蟲草菌絲體渣在pH=8的10倍NaOH水溶液中煮沸3小時,共2次,合并后,離心去渣,上清液濃縮,加乙醇至終濃度為75vol%,冰箱放置,析出多糖,過濾,洗凈干燥,得到蟲草粗多糖;
③丹參酚酸:取丹參藥材1kg,加入10倍量去離子水,煮沸1h,將藥液傾出,藥渣中再加入10倍量去離子水,煮沸1h,將藥液傾出,合并兩次提取液,靜置,過濾。濃縮至1.5L,藥液比為1:1.5(比重為1.11),加入4.2L95vol%乙醇至乙醇濃度約為70vol%,醇沉過夜,離心,將上溶液減壓濃縮至無醇味,約1.5L,取預處理好的HZ?816樹脂2L,濕法裝柱,用去離子水沖洗至無醇味,以1/2床層體積/小時(BV/h)的流速將上述提取濃縮液上柱后,再以2.5BV40%的乙醇洗脫丹酚酸,流速為1BV/h,收集40%乙醇洗脫液,減壓干燥,得黃色固體粉末,經測定,丹參酚酸類組分的得率約為8%,其中丹酚酸B等酚酸的含量約為25%;
④苦杏仁苷:稱取桃仁藥材1kg,加入10倍量的50%乙醇,加熱回流90min,過濾,濾液減壓濃縮至料液比1:1,取預處理好的HZ?818樹脂250ml,濕法裝柱,用去離子水沖洗至無醇味,將桃仁提取濃縮液以1BV/h流速上柱后,先以2BV去離子水沖洗,速率為2BV/h,棄去水淋洗液,再以3BV50vol%乙醇洗脫苦杏仁苷,速率為2BV/h,收集50%乙醇洗脫液,減壓濃縮、干燥,得淺黃色固體粉末,經測定,苦杏仁苷類組分的得率約為0.8%,其中苦杏仁苷含量約為63%;
⑤絞股藍皂苷:稱取絞股藍藥材1kg,加入20倍量的60%乙醇,回流提取2h,過濾,濾液減壓濃縮至浸膏狀,加30%乙醇至料液比1:3,超聲溶解15min,離心,上清液過大孔吸附樹脂,取預處理好的HZ?816樹脂2L,濕法裝柱,用去離子水沖洗至無醇味,將絞股藍提取液以1/4BV/h流速上柱,以1/2BV/h流速用2BV水沖洗,棄去淋洗液,再在相同流速下,以2BV30%乙醇沖洗,棄去淋洗液,最后以3BV95%乙醇洗脫絞股藍皂苷,收集95%乙醇洗脫液,減壓濃縮、干燥,得淡黃色固體粉末,經測定,絞股藍皂苷類組分的得率約為1%,其中絞股藍總皂苷含量約為40%;
⑥絞股藍多糖:將⑤提取工藝中絞股藍藥渣自然晾干,稱取藥渣500g,以15倍量去離子水回流提取1h,過濾,濾液減壓濃縮至料液比1:1,加95%的乙醇900ml,至含醇量約70%,醇沉過夜,過濾,濾餅用95%乙醇兩次,烘干,粉碎,得黃色絞股藍多糖粉末,經測定,絞股藍皂多糖組分的得率約為4%,其中絞股藍多糖含量約為15%;
(2)按所述每公斤體重將丹參酚酸、蟲草粗多糖和絞股藍多糖制成水溶性微丸作為A部分,將絞股藍皂苷、蟲草脂溶性部分和苦杏仁苷制成固體分散體微丸作為B部分,A和B按質量比8:0.3組成多元釋藥系統;其中,A部分載藥量為33%,B部分載藥量為2.5%。
所述組分原液應用于腸道的特定部位緩釋的制劑,用量根據用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴重程度等調整,可以一次或多次施用。
所述植物藥組合物可制成固體制劑,如片劑或膠囊。
所述植物藥組合物可制成微膠囊或分散體微丸。
所述植物藥組合物每100g體重灌胃劑量:A部分18.9~37.8mg,B部分0.709~1.418mg。
所述植物藥組合物每100g體重灌胃劑量:A部分18.9mg,B部分0.709mg或者A部分37.8mg,B部分1.418mg。
經過多年的實驗和臨床研究,扶正化瘀膠囊抗肝纖維化的作用機制和物質基礎已經比較明確。研究發現蟲草菌絲中的蟲草多糖等組分、桃仁中的苦杏仁苷和丹參中的丹參酚酸A、B有顯著抗肝纖維化作用。如蟲草多糖能促進Ⅰ、Ⅲ型膠原降解,明顯降低免疫性肝纖維化大鼠肝臟組織TGF?β1及其TBRI的含量;桃仁中的苦杏仁苷可顯著抑制HSC的增殖與膠原基質成分的合成代謝,促進其分解代謝;丹參酚酸B有顯著的抗四氯化碳(CCl4)以及二甲基亞硝胺(DMN)誘導的大鼠肝纖維化作用,抑制傳代肝星狀細胞(HSC)增殖及膠原生成,抑制TGF?β1的HSC胞內信號轉導,從而減少傳代HSC分泌TGF?B1的總量并抑制其活化。而丹參酚酸A可通過顯著的抗脂質過氧化損傷作用抑制膠原合成。曾用扶正化瘀方治療CCl4誘導的已成型的大鼠肝纖維化,發現扶正化瘀方中的各味藥物主要有以下特點:1)桃仁是方中抗肝纖維化、促進肝內膠原纖維降解的主藥;2)丹參對改善肝功能,促白蛋白合成及降低血清膽紅素含量起主要作用;3)冬蟲夏草菌絲是降低血清總膽紅素含量的影響因子;4)絞股藍是該方保護肝細胞、降低血清ALT活性的主藥。
由于在扶正化瘀膠囊抗肝纖維化中,松花粉和五味子不起主要作用,所以本發明去掉了扶正化瘀原方中的松花粉和五味子,挑選了具有“扶正”功效的蟲草,具有“活血化瘀”功效的丹參、桃仁以及具有“清熱解毒”作用的絞股藍等4味中藥。從中提取并純化了6種有效組分:丹參酚酸(丹參),絞股藍皂苷、絞股藍多糖(絞股藍),苦杏仁苷(桃仁),蟲草粗多糖、蟲草菌絲體CO2超臨界提取物(蟲草菌絲體)。采用均勻設計的方法,對這6種提取組分進行篩選,通過驗證,篩選出扶正化瘀方的有效組分群最優配伍劑量為:蟲草粗多糖(240mg·kg?1)、蟲草脂溶性組分(0.1ml·kg?1)、絞股藍多糖(7.3mg·kg?1)、絞股藍皂苷(20mg·kg?1)、丹參酚酸(130mg·kg?1)和苦杏仁苷(1mg·kg?1)。最終選用這6種有效組分進入多元釋藥系統的開發,將其中水溶性較好的丹參酚酸、蟲草粗多糖、絞股藍多糖制成微丸(A部分),脂溶性較好的絞股藍皂苷、蟲草脂溶性部分、桃仁提取物制成固體分散體微丸(B部分),兩部分共同組成扶正化瘀組分復方多元釋藥系統,各部分的載藥量分別為:A部分為33%(即100g微丸含有相應混合效應組分33g);B部分為2.5%(即100g微丸含有相應混合效應組分2.5g)。配比:A:B為8:0.3(即每8g水溶性部分微丸,與0.3g固體分散體微丸進行配比)。研究人員經實驗證明扶正化瘀膠囊(含提取物0.5g/粒)與扶正化瘀復方釋藥系統(0.415g/粒,即A部分0.4g,B部分0.015g)顯示出相近的溶出行為。
本發明研制扶正化瘀復方的新劑型,通過不同層次的藥效實驗確定扶正化瘀復方有效組分的配伍,采用多元釋藥系統的新劑型研制組分復方中藥,以實現復方減毒增效、安全及質量可控。
有益效果
本發明植物藥組分組合物的藥物經動物實驗證實具有抗肝纖維化和其他臟器的抗纖維化治療作用,療效較原復方有明顯增效的趨勢,微丸藥物服用后,微丸可以全部散在胃腸道內,可以避免膠囊和片劑因胃腸道轉移時間有差異而滯留在某一部位釋放藥物而對胃腸道黏膜產生刺激,具有良好的臨床應用前景。
附圖說明
圖1為正常組、模型組、A組和B組大鼠肝臟HE染色圖(×200),A組為扶正化瘀原方浸膏組,B組為本發明;
圖2為正常組、模型組、A組和B組大鼠肝臟天狼猩紅染色圖(×100),A組為扶正化瘀原方浸膏組,B組為本發明;
圖3為正常組、模型組、A組和B組大鼠肝臟膠原沉積面積變化,A組為扶正化瘀原方浸膏組,B組為本發明;
圖4為正常組、模型組、A組和B組大鼠肝組織Hyp的含量變化,A組為扶正化瘀原方浸膏組,B組為本發明;
圖5為正常組、模型組、A組和B組大鼠血清ALT活性,A組為扶正化瘀原方浸膏組,B組為本發明;
圖6為正常組、模型組、A組和B組大鼠血清AST活性,A組為扶正化瘀原方浸膏組,B組為本發明;
圖7為正常組、模型組、A組和B組大鼠血清Alb含量,A組為扶正化瘀原方浸膏組,B組為本發明;
圖8為正常組、模型組、A組和B組大鼠血清TBiL含量,A組為扶正化瘀原方浸膏組,B組為本發明;
圖9為正常組、模型組、原方組、高劑量組和中劑量組大鼠肝臟HE染色圖(×200);
圖10為正常組、模型組、原方組、高劑量組和中劑量組大鼠肝臟天狼猩紅染色圖(×100);
圖11為正常組、模型組、原方組、高劑量組和中劑量組大鼠肝臟原沉積面積占總面積的百分比;
圖12為正常組、模型組、原方組、高劑量組和中劑量組大鼠肝組織Hyp的含量變化;
圖13為正常組、模型組、原方組、高劑量組和中劑量組大鼠血清ALT、AST活性;
圖14為正常組、模型組、原方組、高劑量組和中劑量組大鼠血清Alb含量;
圖15為正常組、模型組、原方組、高劑量組和中劑量組大鼠血清TBiL含量。
具體實施方式
下面結合具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解,在閱讀了本發明講授的內容之后,本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例1
扶正化瘀復方有效組分復方的抗肝纖維化療效:
1.1動物:
Wistar雄性大鼠59只,SPF級,體重150±10g,中科院上海實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(滬):2007?0005。所有大鼠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心SPF實驗室,普通飲食,自由飲水。
1.2主要試劑:
二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine,DMN),購自東京化成工業株式會社,批號:MAL05;檸檬酸,分析純,批號:F20080916;無水乙酸鈉,分析純,批號:F20080714;檸檬酸三鈉(Tri?sodium citrate),分析純,批號:F20070110;對二甲基氨基苯甲醛(4?Dimethylamino benzaldehyde),批號:F20090516;氯氨?T(chloramines?T),分析純,批號:T20061130;無水乙醇,分析純,批號:20090716;二甲苯,分析純,批號20100123;甲醛(Formal dehyde solution),批號:20071019;異丙醇(Iso?propanol),分析純,批號:T20070815;濃鹽酸,分析純,批號:T20090312,以上均購自中國醫藥集團上海化學試劑公司。中性樹膠,批號:60090715,購自上海懿洋儀器有限公司。0.9%氯化鈉注射液(Sodium Chloride Injection),批號:090903,購自安徽雙鶴藥業有限責任公司。戊巴比妥鈉(Pentobarbital Sodium,Lot.No.WS20090920,德國分裝。羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)標準品,分析純,Sigma?Aldrich Chemie GmbH,Germany產品。高氯酸(Perchloric acid),分析純,批號:20070807購自上海桃浦化工廠。血清肝功能試劑盒,包括谷丙轉氨酶(alanine aminotransamine,ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、白蛋白(albumin,Alb)、總膽紅素(total bilirubin,T.Bil),均購自南京建成生物工程研究所。
1.3藥物:
蟲草粗多糖、蟲草脂溶性組分、丹參酚酸、苦杏仁苷、絞股藍皂苷、絞股藍多糖同第一部分。扶正化瘀復方的浸膏干粉由上海現代中醫藥股份有限公司提供,批號:100306。主要質控指標(HPLC測定):丹參素鈉10.48mg/g;腺苷2.5mg/g;丹參酚酸B12.4mg/g;水份:6.9%。應用時稀釋為94.5mg/ml的溶液灌胃液。
1.4主要儀器:
FIM20制冰機,荷蘭菲利浦公司產品。上菱生化專用冰箱,購自上海上菱公司。低溫冰箱(?70℃),Forma scientific公司產品。臺式離心機(microfuge lite),Beckman公司產品。AA?200分析天平,倒置顯微鏡(37×B)美國Denver儀器公司產品。純水系統(HPLC/UP),Labconco公司產品。CQX25?12超聲波清洗器,上海必能超聲有限公司產品。輪轉切片機(RM2035)、HI1220烤片機、HI1210恒溫水浴鍋,LEICA ASP300自動脫水機、LEICA EG1160石蠟包埋機,均購自德國Leica公司。一次成像照相機,Polariod公司產品。XW?80A型旋渦混合器,江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。ML?902定時恒溫磁力攪拌器,上海浦江分析儀器廠生產。pH計,Beckmanwc公司產品。1000μl、200μl、20μl加樣器,法國Gilson公司制造。M5多功能酶標儀,美國Molecular Devices公司生產。Precellys24均質器,法國Bertin公司生產。
2.1模型制備
Wistar雄性大鼠59只,適應環境3天后,用隨機數字表的方法隨機分為正常組(10只)和造模組(49只)。造模組用0.5%DMN按2ml·kg?1體重腹腔注射,首次注射全劑量的2/3,每天1次,連續注射3d后休息4d,共3周,第4周的前3天分別注射0.5%DMN全量、2/3量和1/2量。正常組大鼠予相同的時間和部位腹腔注射等量的氯化鈉注射液。
2.2給藥
造模第4周,隨機取3只大鼠處死觀察肝臟病變情況,證實有肝纖維化改變后將剩余的46只大鼠用隨機數字表的方法分為1個模型組(18只)和2個治療組(A、B),A為扶正化瘀原方浸膏組;B為全組分組,每組14只。B治療組分別用對應的各組組分水溶液按照表1配制劑量,以5ml·kg?1體重灌胃。蟲草脂溶性組分由于不能很好溶于水中,且每100g大鼠體重需用量很小,所以用食用油稀釋后按0.5ml·kg?1體重另外灌胃。A組給藥扶正化瘀浸膏,給藥劑量5ml·kg?1體重,正常組和模型組用等劑量的飲用水和食用油灌胃,每天1次共4周。
表1中藥組分組灌胃組分提取物配伍劑量

2.3標本留取
實驗結束后大鼠禁食不禁水,24h后稱取大鼠體重,用3%戊巴比妥鈉2ml·kg?1體重的劑量腹腔注射,麻醉后的大鼠完全打開腹腔,如有腹水,以稱過重的干棉球吸干液體后稱取腹水重量。然后用10ml注射器經下腔靜脈采血,4℃下靜置2小時后,3000rpm,15min離心,取上清分裝于1.5ml離心管,?70℃低溫保存。動物取血處死后,取下肝臟和脾臟稱其重量記錄,然后取約1.0cm×0.8cm×0.3cm大小肝組織2塊,于10%中性甲醛緩沖液中固定。
2.4血清生化學檢測
ALT活性采用賴氏法;AST活性采用賴氏法;Alb含量采用溴甲酚綠法;TBiL含量采用苯甲酸鈉?咖啡因比色法。
2.5肝組織羥脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)含量測定
采用Jamall氏法測定
2.6肝組織學觀察
2.6.1染色
甲醛固定的肝組織,24h后逐級酒精脫水,二甲苯透明,56℃石蠟包埋,4μm厚切片,用于HE、天狼猩紅染色,光鏡觀察。
2.6.2肝組織出血壞死程度分級標準
DMN誘導的模型大鼠的肝損傷,以出血壞死為主。自定標準,在光鏡(200×)下觀察分級。(見表2)
表2肝組織出血壞死程度分級


2.6.3肝組織膠原纖維沉積程度的半定量標準
按照相關文獻的半定量標準,觀察肝臟纖維化程度。
表3肝組織膠原纖維沉積程度分期

2.6.4肝組織膠原纖維沉積面積圖像處理半定量分析
每張天狼猩紅染色片分別取四角和中央共5個部位拍攝圖片,采用image?pro plus6.1軟件計算出每張圖片膠原沉積面積,取平均值。
2.7統計學方法
采用SPSS18.0軟件統計系統進行統計處理。計量資料以表示,采用ANOVA程序進行單因素方差分析,進行方差齊性檢驗,并用LSD程序進行兩兩比較;等級資料用Ridit法檢驗。(以α=0.05為顯著水準進行統計檢驗)。
3結果
3.1大鼠一般情況
各組大鼠造模情況:造模4周結束時無大鼠死亡。8周實驗結束時正常組大鼠無死亡,模型組死亡2只,A組死亡2只,B組死亡3只,死亡時大鼠精神狀態很差,體重下降明顯,進食減少,可能系肝衰竭死亡。8周實驗結束時發現模型組11只大鼠有腹水,腹水發生率為68.8%。(見表4)
表4各組大鼠死亡及腹水發生情況


3.2各組大鼠體重、肝體比、脾體比比較
與正常組比較,模型組大鼠體重顯著降低,脾重明顯增加,脾體比增大;與模型組比較,各組大鼠體重均有回復,其中A組的幅度較大,有統計學差異。其余各指標變化在A、B組與模型組間無明顯差異。(見表5)
表5不同組大鼠肝重、脾重、肝體比、脾體比的比較

與正常組比較:#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05
3.3大鼠肝臟病理學觀察
3.3.1大體觀察
正常組大鼠肝臟顏色鮮紅,質嫩軟,表面光滑,邊緣銳利;脾臟色暗紅,質中等。模型組大鼠肝臟質地較硬,色暗紅,緣鈍,表面粗糙,與正常組相比肝臟體積明顯縮小,脾臟明顯增大。治療各組與模型組相比肝臟大小、色澤和質地都有改善,脾臟有不同程度的縮小。
3.3.2肝組織HE染色觀察
正常組大鼠肝小葉結構清晰,肝細胞沿肝索由中央靜脈向四周呈放射狀排列,無變性壞死,肝竇未見狹窄和擴張。與正常組相比,模型組正常結構破壞,匯管區輻湊;肝細胞排列紊亂,雖然肝細胞變性不嚴重,但是有5例有明顯的出血壞死伴炎癥細胞浸潤,有2例還有明顯淤膽;肝竇狹窄。上述各種病理改變在各治療組也有存在,但是較模型組有不同程度的減輕。各治療組之間比較,A組肝竇狹窄、肝細胞變性壞死程度較輕,B組的出血程度較輕。(見圖1,表6)
表6各組大鼠肝組織出血壞死程度分級

3.3.3肝組織天狼猩紅染色觀察
觀察結果顯示,正常組大鼠肝臟僅在匯管區和中央靜脈周圍有少量膠原纖維沉積。模型組大鼠匯管區擴大肝臟膠原纖維沉積,纖維間隔明顯形成,部分包繞形成假小葉。與模型組相比,各治療組膠原纖維增生、沉積程度明顯減輕。(見圖2)
3.4各組大鼠肝臟膠原沉積半定量分析
各組大鼠肝臟纖維化按標準半定量分級,并用Ridit進行分析顯示,與正常組相比,模型組有顯著意義(P<0.01),治療組中,與模型組相比無明顯差異。(見表7)
表7各組大鼠肝臟膠原沉積半定量Ridit分析

與正常組比較:##P<0.01。
3.5各組大鼠肝臟膠原沉積面積圖像處理
模型組大鼠膠原沉積面積與正常組相比有明顯的增加(P<0.01),B組有明顯的減輕,(P<0.05)(見表8,圖3)
表8組分配方對大鼠肝臟膠原沉積的影響


與正常組比較:##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05
3.6大鼠肝組織羥脯氨酸含量變化
與同期正常組相比,模型組大鼠肝組織的Hyp含量明顯增高(P<0.01);與模型組相比,A組大鼠肝組織的Hyp含量明顯降低(P<0.01);B組與模型組相比,大鼠肝組織的Hyp含量都有明顯降低(P<0.05)。(見表9,圖4)
表9組分配方對大鼠Hyp的影響

與正常組比較:##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01。
3.7大鼠肝臟生化指標
3.7.1組分配方對肝硬化大鼠血清ALT、AST活性的影響
與同期正常組相比,模型組大鼠血清ALT活性顯著升高,(P<0.01);藥物治療的各組與模型組相比,A組大鼠血清ALT活性顯著降低(P<0.05,P<0.01)。(見表10,圖5)。與同期正常組相比,模型組大鼠血清AST活性顯著升高,(P<0.05);各治療組與同期模型組相比對大鼠血清AST活性的影響無顯著改變。(見表10,圖6)
表10組分配方對大鼠肝功能ALT、AST的影響

與正常組比較:#P<0.05;##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05。
3.7.2組分配方對肝硬化大鼠血清Alb、TBiL活性的影響
與同期正常組相比,模型組大鼠血清Alb活性顯著降低(P<0.01);予藥物治療的各組與同期模型組相比有不同程度的改善,其中A組和B組有顯著統計學意義(P<0.01)。與正常組相比,模型組大鼠血清TBiL活性顯著升高,(P<0.05);予藥物治療的各組與同期模型組相比有不同程度的改善,其中A組、B組大鼠血清TBiL活性都顯著降低(P<0.01)。(見表11,圖7、8)。
表11組分配方對大鼠肝功能Alb、TBiL活性的影響

與正常組比較:#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01結論:
蟲草粗多糖、蟲草菌絲體CO2超臨界提取物、絞股藍多糖、絞股藍皂苷、丹參酚酸和苦杏仁苷的組分配伍能重現扶正化瘀原方的抗肝纖維化效應。
實施例2
扶正化瘀組分復方多元釋藥系統抗肝纖維化的療效
1.1材料
1.1.1動物
Sprague?Dawley(SD)雄性大鼠79只,SPF級,體重150±10g,中科院上海實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(滬):2007?0005。所有大鼠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心SPF實驗室,普通飲食,自由飲水。
1.1.2主要試劑
二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine,DMN),購自東京化成工業株式會社,批號:KWM6890;檸檬酸,分析純,批號:T20100811;無水乙酸鈉,分析純,批號:F20100707;檸檬酸三鈉(Tri?sodium citrate),分析純,批號:20100915;對二甲基氨基苯甲醛(4?Dimethylamino benzaldehyde),批號:20000428;氯氨?T(chloramines?T),分析純,批號:;無水乙醇,分析純,批號:20120104;二甲苯,分析純,批號20120112;甲醛(Formal dehyde solution),批號:20071019;異丙醇(Iso?propanol),分析純,批號:100625;濃鹽酸,分析純,批號:T20090312,以上均購自中國醫藥集團上海化學試劑公司。中性樹膠,批號:20080715,購自上海懿洋儀器有限公司。0.9%氯化鈉注射液(Sodium Chloride Injection),批號:G1108023,購自安徽雙鶴藥業有限責任公司。戊巴比妥鈉(Pentobarbital Sodium,Lot.No.WS20090920,德國分裝。羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)標準品,分析純,Sigma?Aldrich Chemie GmbH,Germany產品。高氯酸(Perchloric acid),分析純,批號:20100428,購自上海桃浦化工廠。血清肝功能試劑盒,包括谷丙轉氨酶(alanine aminotransamine,ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、白蛋白(albumin,Alb)、總膽紅素(total bilirubin,T.Bil),均購自上海科華生物工程股份有限公司。
1.1.3藥物
扶正化瘀復方的浸膏干粉由上海現代中醫藥股份有限公司提供,每克含7.3g生藥,批號:110202。主要質控指標(HPLC測定):丹參素鈉10.48g·kg?1;腺苷2.5g·kg?1;丹參酚酸B12.4g·kg?1;水份:6.9%。應用時稀釋為34.52g·kg?1的溶液灌胃液。
扶正化瘀組分復方多元釋藥系統制劑由上海中醫藥大學中藥現代制劑技術教育部工程研究中心提供,批號:111001。
1.1.4主要儀器
FIM20制冰機,荷蘭菲利浦公司產品。上菱生化專用冰箱,購自上海上菱公司。低溫冰箱(?70℃),Forma scientific公司產品。臺式離心機(microfuge lite),Beckman公司產品。AA?200分析天平,倒置顯微鏡(37×B)美國Denver儀器公司產品。純水系統(HPLC/UP),Labconco公司產品。CQX25?12超聲波清洗器,上海必能超聲有限公司產品。輪轉切片機(RM2035)、HI1220烤片機、HI1210恒溫水浴鍋,LEICA ASP300自動脫水機、LEICA EG1160石蠟包埋機,均購自德國Leica公司。一次成像照相機,Polariod公司產品。XW?80A型旋渦混合器,江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。ML?902定時恒溫磁力攪拌器,上海浦江分析儀器廠生產。pH計,Beckmanwc公司產品。1000μl、200μl、20μl加樣器,法國Gilson公司制造。M5多功能酶標儀,美國Molecular Devices公司生產。Precellys24均質器,法國Bertin公司生產。卓越450全自動生化儀,上海科華生物工程股份有限公司生產。Leica Scn400自動玻片掃描儀,購自德國Leica公司。
1.2方法
1.2.1模型制備
SD大鼠適應環境3d后,用隨機數字表法分為正常組(10只)和造模組(69只)。造模組用0.5%DMN按2ml·kg?1體重腹腔注射,首次注射全劑量的2/3,每天1次,連續注射3d后休息4d,共4周。第4周的前3天分別注射0.5%DMN全量、2/3量和2/3量。正常組大鼠予相同的時間和部位腹腔注射等量的生理鹽水。
1.2.2給藥
上海現代中醫藥股份有限公司提供的扶正化瘀浸膏干粉1g含生藥量7.3g,假設人臨床劑量為Amg·kg?1,大鼠的等效劑量=6.3×A。
造模第4周結束后,1只大鼠死亡,余下的大鼠用抽簽的方法隨機取2只大鼠處死觀察肝臟病變情況,證實有肝纖維化改變后將剩余的66只造模大鼠用隨機數字表法隨機分為模型組(21只)、扶正化瘀原方浸膏組、扶正化瘀組分復方多元釋藥系統的高劑量組、中劑量組,每組15只。各給藥組每組分別用對應劑量的水溶液按10ml·kg?1體重灌胃,扶正化瘀原方浸膏組給藥劑量為34.52g·kg?1(生藥含量,相當于體60kg正常成人每天的用量),扶正化瘀組分復方多元釋藥系統的2組給藥劑量見表12,每天1次共4周。模型組和正常組予等量的飲用水灌胃。
表12扶正化瘀組分復方多元釋藥系統治療組各組的給藥劑量

1.2.3標本留取
實驗結束后大鼠禁食不禁水,24h后稱取大鼠體重,用3%戊巴比妥鈉2ml·kg?1體重的劑量腹腔注射,麻醉后的大鼠完全打開腹腔,如有腹水,以稱過重的干棉球吸干液體后稱取腹水重量。然后用10ml注射器經下腔靜脈采血,4℃下靜置3h后,3000rpm,15min離心,取上清分裝于1.5ml離心管,?70℃低溫保存。動物取血處死后,取下肝臟和脾臟稱其重量記錄,然后約取1.0cm×0.8cm×0.3cm大小肝組織2塊,于10%中性甲醛緩沖液中固定。
1.2.4標本檢測、觀察和分析
均同實施例1。
1.2.5統計學方法
采用SPSS18.0軟件統計系統進行統計處理。計量資料以表示,采用ANOVA程序進行單因素方差分析,進行方差齊性檢驗,并用LSD程序進行兩兩比較,等級資料用Ridit法檢驗。(以α=0.05為顯著水準進行統計檢驗)
2結果
2.1各組大鼠一般情況變化
各組大鼠造模情況:造模4周結束時大鼠死亡1只。8周實驗結束時正常組大鼠無死亡,模型組死亡2只,原方組、高劑量組、中劑量組各死亡1只,死亡前大鼠精神狀態很差,體重下降明顯,進食減少,解剖發現胃腸脹氣明顯,可能系肝衰竭死亡。8周實驗結束時共發現11只大鼠有腹水,其中模型組3只,腹水發生率為15.8%。高劑量組4只。(見表13)
表13各組大鼠死亡及腹水發生情況

2.2各組大鼠體重、肝體比、脾體比比較
與正常組比較,模型組大鼠體重顯著降低,肝重明顯下降,脾重明顯增加,肝體比減小、脾體比增大;與模型組比較,原方組、高劑量組、中劑量組大鼠體重均有回復,其中中劑量組的幅度較大,有統計學意義。中劑量組的肝重、肝體比均有所回升,有統計學差異。(見表14)
表14各組大鼠肝重、脾重、肝體比、脾體比的比較

與正常組比較:##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。
2.3.大鼠肝臟病理學觀察
2.3.1大體觀察
正常組大鼠肝臟顏色鮮紅、質嫩軟、表面光滑、邊緣銳利;脾臟色暗紅,質中等。模型組大鼠肝臟明顯縮小、質地較硬、色暗紅、緣鈍、表面粗糙;脾臟明顯增大。治療各組與模型組相比肝臟大小、色澤和質地都有不同程度改善,脾臟有不同程度的縮小。
2.3.2肝組織HE染色觀察
正常組大鼠肝小葉結構清晰,肝細胞組成肝索由中央靜脈向四周呈放射狀排列,肝竇未見狹窄和擴張。與正常組相比,模型組小葉結構破壞,匯管區擴大;肝細胞排列紊亂,大量肝細胞胞漿疏松或水樣變性,有5例有明顯的肝細胞壞死伴出血和炎癥細胞浸潤;肝竇狹窄。各治療組的各項上述病理改變較模型組有不同程度的減輕。各治療組之間比較,原方組、中劑量組肝細胞變性程度較輕,原方組存在1例出血和肝細胞壞死,中劑量組無出血壞死;高劑量組則小葉結構紊亂、肝竇狹窄、肝細胞變性明顯。(見圖9)
2.3.3肝組織天狼猩紅染色觀察
觀察結果顯示,正常組大鼠肝臟僅在匯管區和中央靜脈周圍有少量膠原纖維沉積。模型組大鼠肝臟匯管區擴大,膠原纖維沉積,纖維間隔形成,部分分割包繞肝組織形成假小葉。與模型組相比,各治療組膠原纖維增生、沉積程度明顯減輕,其中以中劑量組最為明顯,少見完整的纖維間隔,有的間隔變得細長,纖薄。(見圖10)
2.4各組大鼠肝臟膠原沉積的半定量分析
各組大鼠肝臟纖維化按半定量標準分級,并用Ridit進行分析。結果顯示,與正常組相比,模型組膠原沉積明顯,有顯著差異(P<0.01)。與模型組相比,治療組中僅中劑量組膠原沉積的程度減輕有顯著統計學意義(P<0.01)。其余與模型組相比無明顯差異。(見表15)
表15各組大鼠肝臟膠原沉積半定量Ridit分析

與正常組比較:##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01
2.5各組大鼠肝臟膠原面積的圖像處理
模型組大鼠膠原面積與正常組相比有明顯的增加(P<0.01),各治療組與模型組相比,原方組、高劑量組、中劑量組的膠原面積均有顯著的減少,均有統計學意義(P<0.01)。(見表16,圖11)
表16各組大鼠肝臟膠原面積的比較

與正常組比較:##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01
2.6各組大鼠肝組織羥脯氨酸含量變化
與同期正常組相比,模型組大鼠肝組織的Hyp含量明顯增高(P<0.01);與模型組相比,原方組、中劑量組大鼠肝組織的Hyp含量都有明顯降低(P<0.05),高劑量組肝Hyp含量雖也較低,但與模型組比差異不明顯。(見表17,圖12)
表17各組大鼠肝組織Hyp含量比較

與正常組比較:##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05
2.7各組大鼠肝臟生化指標的變化
2.7.1各組大鼠血清ALT、AST活性的變化
與同期正常組相比,模型組大鼠血清ALT和AST活性顯著升高,(均P<0.01);各治療組與模型組相比,僅原方組、中劑量組大鼠血清ALT和AST活性顯著降低(均P<0.05)。(見表18,圖13)
表18各組大鼠血清ALT、AST活性比較


與正常組比較:##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05
2.7.2各組大鼠血清Alb、TBiL含量的比較
與同期正常組相比,模型組大鼠血清Alb含量顯著降低,(P<0.01);各治療組血清Alb含量與模型組相比有不同程度的提高,其中中劑量組有顯著統計學意義(P<0.01),原方組、高劑量組大鼠血清Alb含量也顯著升高(P<0.05)。
與正常組相比,模型組大鼠血清TBiL含量顯著升高,(P<0.05);與模型組相比,中劑量組大鼠血清TBiL含量顯著降低(P<0.01),原方組也有明顯降低(P<0.05);高劑量組的血清TBiL含量改變則較模型組無統計學差異。(見表19,圖14、15)。
表19各組大鼠血清Alb和TBiL含量的比較

與正常組比較:##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.05

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