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具有改變的細胞信號傳導活性的修飾的抗原結合分子.pdf

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具有 改變 細胞 信號 傳導 活性 修飾 抗原 結合 分子
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摘要
申請專利號:

CN201310053310.5

申請日:

2006.08.25

公開號:

CN103204935B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 16/28申請日:20060825|||公開
IPC分類號: C07K16/28; C12N15/13; C12N15/63; C12N5/10; C12P21/02; A61K39/395; A61P35/00 主分類號: C07K16/28
申請人: 羅氏格黎卡特股份公司
發明人: 巴勃羅·烏馬納; 埃克哈德·默斯納
地址: 瑞士施利倫-蘇黎士
優先權: 2005.08.26 US 60/711,454
專利代理機構: 中科專利商標代理有限責任公司 11021 代理人: 張瑩
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310053310.5

授權公告號:

103204935B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.08.14|||2013.07.17

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及修飾的抗原結合分子(ABMs)。在具體的實施方案中,本發明涉及重組單克隆抗體或片段,包括嵌合的,靈長類化或人源化的抗體或片段,其具有改變的由靶抗原介導細胞信號傳導活性的能力,和/或改變的介導一個或多個靶抗原交聯的能力。另外,本發明涉及編碼所述修飾的ABM的核酸分子,以及包含所述核酸分子的載體和宿主細胞。本發明進一步涉及用于產生本發明修飾的ABM的方法,以及在治療疾病中應用這些修飾的ABM的方法。另外,本發明涉及具有改善的治療特性的具有修飾的糖基化的修飾ABM,所述修飾的ABM包括具有增強的Fc受體結合和增加的效應子功能的抗體。

權利要求書

權利要求書
1.   包含重鏈或輕鏈可變區的修飾的抗原結合分子,所述重鏈或輕鏈可變區與母體抗原結合分子的重鏈或輕鏈可變區相比,在所述重鏈或輕鏈可變區的至少一個構架區中包含至少一個氨基酸殘基置換,其中當所述修飾的抗原結合分子與靶抗原復合時,所述置換導致所述靶抗原改變的細胞信號傳導活性。

2.   包含重鏈或輕鏈可變區的修飾的抗原結合分子,所述重鏈或輕鏈可變區與母體抗原結合分子的重鏈或輕鏈可變區相比,在所述重鏈或輕鏈可變區的至少一個構架區中包含至少一個氨基酸殘基置換,其中作為所述置換的結果,所述修飾的抗原結合分子具有改變的能力以介導一個或多個靶抗原交聯。

3.   包含CH1結構域的修飾的抗原結合分子,所述CH1結構域與母體多肽的CH1結構域相比,包含至少一個氨基酸殘基置換,其中當所述修飾的抗原結合分子與靶抗原復合時,所述置換導致所述靶抗原改變的細胞信號傳導活性,或者作為所述置換的結果,導致改變的能力以介導一個或多個靶抗原交聯。

4.   編碼包含重鏈或輕鏈可變區的多肽的分離的多核苷酸,其中所述重鏈或輕鏈可變區與母體重鏈或輕鏈可變區相比,在至少一個構架區中包含至少一個氨基酸殘基置換,并且其中當所述多肽與靶抗原復合時,所述置換導致所述靶抗原改變的細胞信號傳導活性,或者作為所述置換的結果,導致改變的能力以介導一個或多個靶抗原交聯。

5.   載體,其包含權利要求4的多核苷酸。

6.   宿主細胞,其包含權利要求5的載體。

7.   被改造為以一定量表達至少一種這樣的核酸的宿主細胞,所述核酸編碼具有β(1,4)?N?乙酰葡糖胺基轉移酶III活性的多肽,所述量足以修飾由所述宿主細胞產生的多肽Fc區域中的寡糖,其中所述多肽是按照權利要求1或2的修飾的抗原結合分子。

8.   用于產生包含重鏈或輕鏈可變區的修飾的抗原結合分子的方法,所述重鏈或輕鏈可變區與母體抗原結合分子的重鏈或輕鏈可變區相比,在所述重鏈或輕鏈可變區的至少一個構架區中包含至少一個氨基酸殘基置換,其中當所述修飾的抗原結合分子與靶抗原復合時,所述置換導致所述靶抗原改變的細胞信號傳導活性,所述方法包括:
(i)在允許所述多核苷酸表達的條件下培養權利要求6的宿主細胞;和
(ii)從培養基中回收所述修飾的抗原結合分子。

9.   用于產生包含重鏈或輕鏈可變區的修飾的抗原結合分子的方法,所述重鏈或輕鏈可變區與母體抗原結合分子的重鏈或輕鏈可變區相比,在所述重鏈或輕鏈可變區的至少一個構架區中包含至少一個氨基酸殘基置換,其中作為所述置換的結果,所述置換導致改變的能力以介導交聯,所述方法包括:
(i)在允許所述多核苷酸表達的條件下培養權利要求6的宿主細胞;和
(ii)從培養基中回收所述修飾的抗原結合分子。

10.   藥物組合物,其包含權利要求1或2任一項的修飾抗原結合分子和藥用載體。

說明書

說明書具有改變的細胞信號傳導活性的修飾的抗原結合分子
本申請是國際申請號PCT/TR2006/003294,國際申請日為2006年8月25日,進入中國國家階段日期為2008年4月18日,中國申請號為200680038849.1的分案申請。
發明背景
發明領域
本發明涉及抗原結合分子(ABMs)。在具體的實施方案中,本發明涉及重組單克隆抗體或片段,包括嵌合的,靈長類化(primatized)的或人源化的抗體或片段,其具有改變的介導靶抗原的細胞信號傳導(signaling)活性的能力,和/或改變的介導一個或多個靶抗原交聯的能力。另外,本發明涉及編碼所述ABMs的核酸分子,以及包含所述核酸分子的載體和宿主細胞。本發明進一步涉及用于產生本發明的ABMs的方法,以及在疾病治療中利用這些ABMs的方法。另外,本發明涉及具有提高的治療特性的具有修飾的糖基化的ABMs,其包括具有增加的Fc受體結合和增加的效應子功能的抗體。
背景技術
抗體,也稱為免疫球蛋白,其具有包括四條多肽鏈的基本結構:兩條相同的重(H)鏈,與之成對的兩條相同的輕(L)鏈。每條重鏈和輕鏈包括可變區(分別地,VH和VL)和恒定區(分別地,CH和CL)。CH區域具有3個結構域(CH1,CH2,和CH3),而較小的CL區域僅具有1個結構域(簡單地稱為CL)。每個VH和VL區域包括3個互補決定區(CDRs),其側鄰處于下列順序的四個構架區域:FR1?CDR1?FR2?CDR2?FR3?CDR3?FR4。CDRs是V區域最可變的部分,并且決定抗體的抗原特異性。總之,一對VH和VL形成抗原結合位點,并且二價抗體具有兩個這樣的抗原結合位點。應該注意的是該基本抗體結構可以通過多種方法修飾(例如,通過產生該結構的片段),而仍然保持或甚至改善所需的功能和/或抗原結合活性。
VH和CH1結構域之間的界面包含保守的氨基酸。可以將該接觸區域描述為“分子球窩關節”。該關節決定了“肘運動”以及還有所謂的VH和VL區域相對于CH1和CL區域的“肘角度”,并且防止在V和C區域間形成剛性接觸(Lesk和Chothia,自然(Nature)(1988)335(8):188?190))。所述球窩關節的窩通過VH構架區中的氨基酸殘基,特別是在位置11,110和112的那些形成(按照Kabat等,(1987)免疫性靶標的蛋白質的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第4版(公共健康服務部(Public Health Services),NIH,華盛頓(Washington),DC)的編號系統)。(參見Lesk和Chothia,自然(Nature)(1988)335(8):188?190.)所述球窩關節的“球”在CH1結構域中,并且主要通過位置148和149的兩個氨基酸形成(參見Landolfi等,免疫學雜志(J.Immunol.)(2001)166:1748?1754;Lesk和Chothia,自然(Nature)(1988)335(8):188?190)(其中將形成所述“球”的CH1殘基分別編號為149和150))。這些位置的氨基酸的區別可以指示在V和C區域間形成的肘角度,以及由此的VH?VL二聚體的方向(參見Lesk和Chothia,自然(Nature)(1988)335(8):188?190)。占據這些VH位置的氨基酸殘基在全免疫球蛋白序列上是高度保守(參見,例如Lesk和Chothia,自然(Nature)(1988)335(8):188?190)。該關節中所涉及的所有殘基(例如,位置11,110,112,148,和149)都位于構架區(例如,殘基11,110,和112)或恒定結構域(例如,按照Landolfi等,148和149;按照Lesk和Chothia,149和150)中,并且似乎不直接涉及于抗原結合中。Landolfi等,免疫學雜志(J. Immunol.)(2001)166:1748?1754。
除介導效應子功能,如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)外,單克隆抗體可以通過誘導或抑制細胞信號傳導途徑調節細胞功能。例如,已顯示出單克隆抗體介導抗原交聯,激活死亡受體(例如,通過促進受體的低聚作用或模仿配體的結合),并阻斷細胞生長分化和/或增殖途徑中配體介導的細胞信號傳導(參見,例如Ludwig等,致癌基因(Oncogene)(2003)22:9097?9106)。
程序性細胞死亡(Apoptosis或programmed cell death)可以通過若干不同的機制觸發。例如,通過細胞膜結合的“死亡受體”,例如腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員的信號傳導途徑活化可以導致程序性細胞死亡的誘發。同樣地,表面抗原,例如CD20的二聚作用或交聯也可以誘導程序性細胞死亡(參見,例如,Ludwig等,致癌基因(Oncogene)(2003)22:9097?9106)。
仍舊存在對增強的靶向與細胞信號傳導有關的抗原的治療方法的需要,以治療靈長類動物包括,但不限于,人的疾病,所述細胞信號傳導包括,但不限于,程序性細胞死亡的誘導。
發明簡述
認識到修飾的抗原結合分子(ABMs)巨大的治療潛力,所述ABMs具有改變的介導靶抗原的細胞信號傳導活性的能力,和/或改變的介導一個或多個靶抗原交聯的能力,本發明人開發了所述ABMs,以及產生所述ABMs的方法。此外,該方法還涉及產生重組、嵌合抗體或其嵌合片段。這些修飾的ABMs的功效進一步通過改造抗體Fc區域的糖基化模式來增強。
因此,在一個方面。本發明涉及包括重鏈或輕鏈可變區的修飾抗原結合分子,所述重鏈或輕鏈可變區與母體抗原結合分子的重鏈或輕鏈的可變區相比較,在所述重鏈或輕鏈的可變區的至少一個構架區中包括至少一個氨基酸殘基的替換,其中當所述修飾的抗原結合分子與所述靶抗原復合時,所述替換導致靶抗原改變的細胞信號傳導活性。在具體實施方案中,所述改變的細胞信號傳導活性是程序性細胞死亡。在一個實施方案中,修飾的抗原結合分子具有增強的誘導程序性細胞死亡的能力。在另一個實施方案中,修飾的抗原結合分子具有降低的誘導程序性細胞死亡的能力。
在另一個方面,本發明涉及包括重鏈或輕鏈可變區的修飾抗原結合分子,所述重鏈或輕鏈可變區與母體抗原結合分子的重鏈或輕鏈的可變區相比較,在所述重鏈或輕鏈可變區的至少一個構架區中包括至少一個氨基酸殘基的替換,其中作為所述替換的結果,所述修飾的抗原結合分子具有改變的介導一個或多個靶抗原交聯的能力。
在一個實施方案中,本發明修飾的抗原結合分子包括重鏈可變區的FR1中的替換。在另一個實施方案中,所述替換包括選自由至少2,至少3或至少4個氨基酸組成的組中的取代。
在一個實施方案中,所述替換包括重鏈可變區的整個FR1的取代。在進一步的實施方案中,所述整個FR1被種系VH FR1所取代。在具體的實施方案中,所述種系VH FR1包括Kabat位置8?13的氨基酸序列,其選自由下列各項組成的組:SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,和SEQ ID NO:105。
在一個實施方案中,修飾的ABM包括重鏈可變區的FR1中的替換,其包括位于Kabat位置8,9,10,11,12,或13的一個或多個的氨基酸殘基的取代。
在特殊的實施方案中,重鏈可變區的FR1中的替換包括位于Kabat位置8的氨基酸殘基的取代。在更具體的實施方案中,重鏈可變區的FR1中的替換包括將位于Kabat位置8的氨基酸殘基取代為選自由精氨酸和甘氨酸組成的組的氨基酸殘基。
在另一個具體的實施方案中,重鏈可變區的FR1中的替換包括位于Kabat位置9的氨基酸殘基的取代。在更具體的實施方案中,重鏈可變區的FR1中的替換包括將位于Kabat位置9的氨基酸殘基取代為選自由下列各項組成的組的氨基酸殘基:丙氨酸,脯氨酸,甘氨酸,絲氨酸和組氨酸。
在一個具體的實施方案中,重鏈可變區的FR1中的替換包括位于Kabat位置10的氨基酸殘基的取代。在更具體的實施方案中,該替換包括將位于Kabat位置10的氨基酸殘基取代為選自由下列各項組成的組的氨基酸殘基:谷氨酸,蘇氨酸,甘氨酸,丙氨酸和纈氨酸。
在另一個具體的實施方案中,重鏈可變區的FR1中的替換包括位于Kabat位置11的氨基酸殘基的取代。在具體的實施方案中,該替換包括將位于Kabat位置11的氨基酸殘基取代為除亮氨酸以外的任意氨基酸。在另一個具體的實施方案中,該替換包括將位于Kabat位置11的氨基酸殘基取代為非極性氨基酸。在另一個特定的實施方案中,該替換包括將位于Kabat位置11的氨基酸殘基取代為選自由下列各項組成的組的氨基酸殘基:纈氨酸,亮氨酸,異亮氨酸,絲氨酸和苯丙氨酸。在具體的實施方案中,該替換包括將位于Kabat位置11的氨基酸殘基取代為亮氨酸。
在另一個具體的實施方案中,重鏈可變區的FR1中的替換包括位于Kabat位置12的氨基酸殘基的取代。在特定的實施方案中,該替換包括將位于Kabat位置12的氨基酸殘基取代為選自由下列各項組成的組的氨基酸殘基:賴氨酸,纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸。
在另一個特殊的實施方案中,重鏈可變區的FR1中的替換包括位于Kabat位置11和12的氨基酸殘基的取代。在具體的實施方案中,該替換包括將位于Kabat位置11的氨基酸殘基取代為纈氨酸和將位于Kabat位置12的氨基酸殘基取代為賴氨酸;將位于Kabat位置11的氨基酸殘基取代為亮氨酸和將位于Kabat位置12的氨基酸殘基取代為纈氨酸;將位于Kabat位置11的氨基酸殘基取代為纈氨酸和將位于Kabat位置12的氨基酸殘基取代為異亮氨酸;或將位于Kabat位置11的氨基酸殘基取代為纈氨酸和將位于Kabat位置12的氨基酸殘基取代為纈氨酸。
在另一個特殊的實施方案中,重鏈可變區的FR1中的替換包括位于Kabat位置13的氨基酸殘基的取代。在特定的實施方案中,該替換包括將位于Kabat位置13的氨基酸殘基取代為選自由下列各項組成的組的氨基酸殘基:賴氨酸,精氨酸,谷氨酰胺和谷氨酸。
在本發明的另一個方面中,ABM的替換包括重鏈可變區的FR4中的至少一個氨基酸殘基取代。在特殊的實施方案中,重鏈可變區的FR4中的替換包括Kabat位置110或112的一個或多個的氨基酸殘基的取代。
在特殊的實施方案中,該替換包括將位于Kabat位置110的氨基酸殘基取代為選自由下列各項組成的組的氨基酸:亮氨酸,異亮氨酸,蘇氨酸或絲氨酸。在更特定的實施方案中,該替換包括將位于Kabat位置110的氨基酸殘基取代為異亮氨酸。
在另一個實施方案中,該替換包括將位于Kabat位置112的氨基酸殘基取代為選自由下列各項組成的組的氨基酸:纈氨酸,亮氨酸,異亮氨酸或蘇氨酸。在更特定的實施方案中,該替換包括將位于Kabat位置112的氨基酸殘基取代為異亮氨酸。
在一個方面。本發明進一步涉及包括CH1結構域的修飾抗原結合分子,所述CH1結構域與母體多肽的CH1結構域相比較,包括至少一個氨基酸殘基的替換,其中當修飾的抗原結合分子與靶抗原復合時,所述替換導致該靶抗原改變的細胞信號傳導活性。
在另一個方面,本發明進一步涉及包括CH1結構域的修飾的抗原結合分子,所述CH1結構域與母體多肽的CH1結構域相比較,包括至少一個氨基酸殘基的替換,其中作為該替換的結果,所述抗原結合分子具有改變的介導一個或多個靶抗原交聯的能力。
在特殊的實施方案中,CH1中的替換包括位于位置148,149或150的一個或多個處的氨基酸殘基的取代。在更特定的實施方案中,該替換包括將位置149的氨基酸殘基取代為亮氨酸。在另一個實施方案中,該替換包括整個CH1結構域的取代。在另一個實施方案中,該替換包括將IgGCH1結構域取代為IgM CH1結構域。
在另一個方面,本發明涉及包含至少一個氨基酸替換的修飾抗原結合分子,其中所述替換包括位于可變和恒定區之間界面區域中的輕鏈中的氨基酸殘基取代,其中當所述修飾的抗原結合分子與所述靶抗原復合時,所述替換導致靶抗原結合分子的改變的細胞信號傳導活性。
在另一個方面。本發明涉及包含至少一個氨基酸替換的修飾的抗原結合分子,其中所述替換包括位于可變和恒定區之間界面區域中的輕鏈中氨基酸殘基的取代,其中作為該替換的結果,所述修飾的抗原結合分子具有改變的介導一個或多個靶抗原交聯的能力。
在具體的實施方案中,ABM的輕鏈可變區中的替換包括位于Kabat位置10,12,39,40,41,80,81,83,84,103,105,106,和108的一個或多個處的氨基酸的取代。在具體的實施方案中,ABM的輕鏈可變區中的替換包括位于Kabat位置40,80,83,105,或106的一個或多個處的氨基酸殘基的取代。
在另一個具體的實施方案中,ABM的輕鏈中的替換包括將位于Kabat位置40,80,83,105,或106的一個或多個處的氨基酸殘基取代為非極性氨基酸。
在另一個具體的實施方案中,ABM的輕鏈中的替換包括將位于Kabat位置40的氨基酸殘基取代為丙氨酸。
在另一個具體的實施方案中,ABM的輕鏈中的替換包括將位于Kabat位置80的氨基酸殘基取代為脯氨酸。
在另一個具體的實施方案中,ABM的輕鏈中的替換包括將位于Kabat位置83的氨基酸殘基取代為苯丙氨酸。
在另一個具體的實施方案中,ABM的輕鏈中的替換包括將位于Kabat位置105的氨基酸殘基取代為丙氨酸。
在另一個具體的實施方案中,ABM的輕鏈中的替換包括將位于Kabat位置106的氨基酸殘基取代為丙氨酸。在更具體的實施方案中,ABM的輕鏈中的替換包括位于Kabat位置106的氨基酸殘基的取代,其中減弱了抗原結合分子誘導程序性細胞死亡的能力。
在一些實施方案中,本發明的替換包括上述重鏈和/或輕鏈可變和/或恒定區中任何氨基酸殘基取代的組合。
在一個方面,當修飾的ABM與靶抗原復合時,本發明的修飾的ABMs中的氨基酸替換導致該靶抗原改變的細胞信號傳導活性。
在本發明的一個方面,改變的細胞信號傳導活性是增強的激動劑活性。在一個實施方案中,該增強的激動劑活性選自由下列各項組成的組:程序性細胞死亡的誘導和細胞分化的誘導。
在本發明的另一個方面,改變的細胞信號傳導活性是增強的拮抗劑活性。在一個實施方案中,該拮抗劑活性是細胞信號傳導途徑的阻斷,所述細胞信號傳導途徑選自由下列各項組成的組:細胞生存,細胞生長,細胞增殖和血管發生。
在進一步的方面,本發明修飾的抗原結合分子與人CD20特異性結合。在另一個方面,該修飾的抗原結合分子與人TNF受體超家族的成員特異性結合。在具體的實施方案中,TNF受體超家族選自由下列各項組成的組:TNFR1,CD95,TRAILR1,TRAILR2,EDAR,和p75NGFR。
在本發明的另一個方面,修飾的抗原結合分子與受體酪氨酸激酶特異性結合。在具體的實施方案中,受體酪氨酸激酶選自由下列各項組成的組:HER1(EGFR1),HER2/neu,HER3,HER4,IGF?1R,FGFR,PDGFR,VEGFR1,VEGFR2,和VEGFR3。在更具體的實施方案中,受體酪氨酸激酶是HER1(EGFR1)。
在另一個方面,本發明進一步涉及修飾的ABM,其可以選自,但不限于,由下列各項組成的組:完整抗體,Fab片段或其融合蛋白,F(ab′)2片段或其融合蛋白,微型抗體(minibody),雙抗體,三鏈抗體和四鏈抗體。在具體的實施方案中,修飾的ABM是嵌合或完全人的。在更具體的實施方案中,嵌合的修飾ABM是人源化的。在另一個具體的實施方案中,修飾的ABM是多特異性的。在更具體的實施方案中,修飾的ABM是雙特異性的。
在另一個方面,按照本發明的母體抗原結合分子包括重鏈可變區,所述重鏈可變區選自由下列各項組成的組:SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ IDNO:61,和SEQ ID NO:62。
在另一個方面,按照本發明的母體抗原結合分子包括輕鏈,所述輕鏈選自由下列各項組成的組:SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:130,SEQ IDNO:131,SEQ ID NO:132,SEQ ID NO:133,和SEQ ID NO:134。
在進一步的方面,本發明還涉及進一步包括人Fc區域的修飾ABM。按照一個實施方案,已將修飾的ABM的Fc區域修飾為具有改變的寡糖。在更具體的實施方案中,已將Fc區域修飾為與未修飾Fc區域相比具有減少比例的巖藻糖殘基。在另一個具體的實施方案中,Fc區域與未修飾的Fc區域相比,具有增高比例的等分寡糖。在另一個具體實施方案中,修飾的寡糖是等分的復合物。在另一個特定的實施方案中,修飾的寡糖在Fc區域中與未修飾的Fc區域相比具有增加比例的等分的非巖藻糖基化的寡糖。在另一個特定的實施方案中,Fc區域在修飾的Fc區域中與未修飾的Fc區域相比,具有增高的GlcNAc殘基相對于巖藻糖殘基的比率。在另一個特定的實施方案中,等分的非巖藻糖基化的寡糖是雜化物。在另一個特定的實施方案中,等分非巖藻糖基化的寡糖是復合物。
按照另一個方面,按照本發明的靶抗原是細胞表面受體,其選自由下列各項組成的組:膜輸送受體,G?蛋白?連接的受體,和酶?連接的受體。在具體的實施方案中,膜輸送受體是通道?連接的受體。在另一個具體的實施方案中,酶?連接的受體選自由下列各項組成的組:受體鳥苷酸環化酶,受體酪氨酸激酶,酪氨酸激酶相關受體,受體酪氨酸磷酸酶和受體絲氨酸/蘇氨酸激酶。
在另一個方面,本發明涉及包含本發明修飾的ABM的藥物組合物。預期該藥物組合物可以進一步包含藥用載體,佐劑或其組合。
本發明還涉及治療患者中可以通過改變的細胞信號傳導活性治療的疾病的方法,該方法包括向所述患者施用治療有效量的藥物組合物,所述藥物組合物包含按照本發明的修飾ABM和藥用載體。
在另一個方面,本發明涉及分離的多核苷酸,其編碼包括重鏈或輕鏈可變區的多肽,其中所述重鏈或輕鏈可變區與母體重鏈或輕鏈可變區相比,在至少一個構架區包括至少一個氨基酸殘基替換,并且其中當所述多肽與靶抗原復合時,所述替換導致該靶抗原改變的細胞信號傳導活性。
在進一步的方面中,本發明涉及分離的多核苷酸,其編碼包括重鏈或輕鏈可變區的多肽,其中所述重鏈或輕鏈可變區與母體重鏈或輕鏈可變區相比,在至少一個構架區包括至少一個氨基酸殘基替換,并且其中作為該替換的結果,所述多肽具有改變的介導一個或多個靶抗原交聯的能力。
在一個實施方案中,按照本發明的多核苷酸編碼這樣的多肽,其中所述多肽包括抗體重鏈或輕鏈。在另一個實施方案中,按照本發明的多核苷酸編碼這樣的多肽,其中所述多肽包括融合蛋白。本發明還涉及由本發明的多核苷酸編碼的多肽。
本發明還涉及包含按照本發明的多核苷酸的載體和包含該載體的宿主細胞。
本發明進一步涉及編碼包括重鏈或輕鏈可變區的多肽的多核苷酸,所述重鏈或輕鏈可變區與母體抗原結合分子的重鏈或輕鏈可變區相比,在所述重鏈或輕鏈可變區的至少一個構架區包括至少一個氨基酸殘基替換,其中所述多肽是按照本發明的修飾ABM。
本發明還涉及宿主細胞,其被改造為表達至少一種編碼多肽的核酸,所述多肽具有一定量的β(1,4)?N?乙酰葡糖胺轉移酶III活性,該量足以修飾由所述宿主細胞產生的多肽Fc區域中的寡糖,其中所述多肽是按照本發明的修飾ABM。在一個實施方案中,具有β(1,4)?N?乙酰葡糖胺轉移酶III活性的多肽是融合多肽。在特殊的實施方案中,所述融合多肽包括β(1,4)?N?乙酰葡糖胺轉移酶III的催化結構域。在另一個實施方案中,所述融合多肽進一步包括異源高爾基體定居多肽的高爾基體定位結構域。高爾基體定位結構域可以選自,但不限于,由下列各項組成的組:甘露糖苷酶II的定位結構域,β(1,2)?N?乙酰葡糖胺轉移酶I的定位結構域,β(1,2)?N?乙酰葡糖胺轉移酶II的定位結構域,甘露糖苷酶I的定位結構域,和α1?6核心巖藻糖基轉移酶的定位結構域。
在另一個實施方案中,修飾的ABM包括與人IgG的Fc區域等價的區域。
在進一步的實施方案中,作為寡糖修飾的結果,由本發明的宿主細胞產生的修飾ABM表現出增強的Fc受體結合親和性和/或增強的效應子功能。按照本發明,增強的效應子功能選自由下列各項組成的組:增強的Fc介導的細胞的細胞毒性,與NK細胞增強的結合,與巨噬細胞增強的結合,與多形核細胞增強的結合,與單核細胞增強的結合,增強的誘導程序性細胞死亡的定向信號傳導,增強的樹突細胞的成熟,和增強的T細胞引發。在一個實施方案中,Fc受體是Fcγ激活受體。在另一個實施方案中,Fc受體是FcγRIIIA受體。
本發明的宿主細胞可以選自包括,但不限于下列各項組成的組:CHO細胞,HEK293?EBNA細胞,BHK細胞,NSO細胞,SP2/0細胞,YO骨髓瘤細胞,P3X63小鼠骨髓瘤細胞,PER細胞,PER.C6細胞或雜交瘤細胞。
在另一個方面,本發明涉及用于產生包括重鏈或輕鏈可變區的修飾的ABM的方法,其中所述重鏈或輕鏈可變區與母體ABM的重鏈或輕鏈可變區相比,在所述重鏈或輕鏈可變區的至少一個構架區中包括至少一個氨基酸殘基替換,其中當所述修飾的ABM與靶抗原復合時,所述替換導致該靶抗原改變的細胞信號傳導活性,所述方法包括:(i)在允許多核苷酸表達的條件下培養本發明的宿主細胞;和(ii)從培養基中回收修飾的ABM。
在進一步的方面,本發明涉及用于產生包括重鏈或輕鏈可變區的修飾ABM的方法,其中所述重鏈或輕鏈可變區與母體抗原結合分子的重鏈或輕鏈可變區相比,在所述重鏈或輕鏈可變區的至少一個構架區中包括至少一個氨基酸殘基替換,其中作為該替換的結果,所述修飾的抗原結合分子具有改變的介導交聯的能力,所述方法包括:(i)在允許多核苷酸表達的條件下培養本發明的宿主細胞;和(ii)從培養基中回收修飾的ABM。
在進一步的方面,本發明涉及用于改變ABM以促進包含ABM靶抗原的復合物形成的能力的方法,該方法包括:取代母體ABM的至少一個重鏈或輕鏈可變區構架區中的至少一個氨基酸殘基。在一個實施方案中,ABM在表達靶抗原的細胞中增加程序性細胞死亡的誘導。在另一個實施方案中,ABM在表達靶抗原的細胞中增加細胞分化的誘導。
本發明還涉及用于在細胞中誘導程序性細胞死亡的方法,該方法包括用包括重鏈或輕鏈可變區的修飾ABM接觸所述細胞,所述重鏈或輕鏈可變區與母體ABM的重鏈或輕鏈可變區相比,在所述重鏈或輕鏈可變區的至少一個構架區中包括至少一個氨基酸殘基替換,其中所述修飾的ABM與母體多肽相比,具有增強的誘導程序性細胞死亡的能力。在具體的實施方案中,所述細胞是腫瘤細胞。在一個實施方案中,所述接觸發生在體內。
在另一個方面,本發明還涉及用于治療可以通過靶抗原改變的細胞信號傳導活性治療的疾病或病癥的方法,該方法包括向需要其的受試者施用治療有效量的修飾的ABM,其中所述修飾的ABM包括重鏈或輕鏈可變區,所述重鏈或輕鏈可變區與母體ABM的重鏈或輕鏈可變區相比,在重鏈或輕鏈可變區的至少一個構架區中包括至少一個氨基酸殘基替換,并且其中當所述修飾的ABM與靶抗原復合時,所述替換導致該靶抗原改變的細胞信號傳導活性。
在進一步的方面,本發明涉及用于治療可以通過改變的介導一個或多個靶抗原交聯的能力治療的疾病或病癥的方法,該方法包括向需要其的受試者施用治療有效量的修飾的ABM,其中所述修飾的ABM包括重鏈或輕鏈可變區,所述重鏈或輕鏈可變區與母體ABM的重鏈或輕鏈可變區相比,在重鏈或輕鏈可變區的至少一個構架區中包括至少一個氨基酸殘基替換,并且其中作為該替換的結果,所述修飾的ABM具有改變的介導一個或多個靶抗原交聯的能力。
在具體的實施方案中,按照本發明施用的修飾的ABM包括重鏈可變區,所述重鏈可變區其選自由下列各項組成的組:SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:36,和SEQ ID NO:38。
在一個方面,將利用本發明的修飾的ABM治療的疾病或病癥是細胞增殖病癥。在一個實施方案中,細胞增殖病癥是癌癥。在另一個方面,將利用本發明修飾的ABM治療的疾病或病癥是B細胞病癥。在特定的實施方案中,B細胞病癥是B細胞淋巴瘤。
本發明還涉及按照本發明的修飾的ABM用于制備治療或預防癌癥藥物的應用。
在具體的實施方案中,本發明還涉及按照本發明的修飾的ABM用于制備治療或預防癌癥藥物的應用,其中所述癌癥選自由下列各項組成的組:B細胞淋巴瘤,乳腺癌,膀胱癌,頭和頸部癌癥,皮膚癌,胰腺癌,肺癌,卵巢癌,結腸癌,前列腺癌,腎癌和腦癌。
在另一個具體的實施方案中,本發明還涉及按照本發明的修飾的ABM用于制備治療或預防癌癥藥物的應用,其中所述抗原結合分子以約1.0mg/kg?約15mg/kg的治療有效量使用。在進一步的實施方案中,治療有效量是約1.5mg/kg?約12mg/kg。在進一步的實施方案中,治療有效量是約1.5mg/kg?約4.5mg/kg。在進一步的實施方案中,治療有效量是約4.5mg/kg?約12mg/kg。在進一步的實施方案中,治療有效量是約1.5mg/kg。在進一步的實施方案中,治療有效量是約4.5mg/kg。在進一步的實施方案中,治療有效量是約12mg/kg。
本發明還涉及用于治療或預防癌癥的方法,其包括向需要其的患者施用治療有效量的本發明的藥物組合物。在具體的實施方案中,癌癥選自由下列各項組成的組:B細胞淋巴瘤,乳腺癌,膀胱癌,頭和頸部癌癥,皮膚癌,胰腺癌,肺癌,卵巢癌,結腸癌,前列腺癌,腎癌和腦癌。
本發明還涉及用于治療或預防癌癥前期病癥或病灶的方法,其包括向需要其的患者施用治療有效量的權利要求85或158的藥物組合物。在特殊的實施方案中,癌癥前期病癥或病灶選自由下列各項組成的組:口腔粘膜白斑病,光化性角化病(日光性角化病),結腸或直腸癌癥前期息肉,胃上皮發育不良,腺瘤發育不良,遺傳性非息肉性結腸癌綜合征(HNPCC),巴雷特食道,膀胱發育不良,和癌癥前期宮頸病癥。
本發明還涉及為了用于治療或預防癌癥的本發明修飾的抗原結合分子。在特殊的實施方案中,癌癥選自由下列各項組成的組:B細胞淋巴瘤,乳腺癌,膀胱癌,頭和頸部癌癥,皮膚癌,胰腺癌,肺癌,卵巢癌,結腸癌,前列腺癌,腎癌和腦癌。
本發明還涉及為了用于治療或預防癌癥前期病癥或病灶的本發明修飾的抗原結合分子。在具體的實施方案中,癌癥前期病癥或病灶選自由下列各項組成的組:口腔粘膜白斑病,光化性角化病(日光性角化病),結腸或直腸癌癥前期息肉,胃上皮發育不良,腺瘤發育不良,遺傳性非息、肉性結腸癌綜合征(HNPCC),巴雷特食道,膀胱發育不良,和癌癥前期宮頸病癥。
本發明還涉及這樣的根據本發明的修飾的抗原結合分子,其用于治療與改變的細胞信號傳導活性和/或改變的一個或多個靶抗原的交聯相關的病癥。

附圖簡述
圖1.多種抗CD20抗體重鏈可變區構建體的氨基酸序列的排比。單克隆抗體1F5的可變重鏈區的氨基酸序列用作參比序列。用陰影顯示與1F5的氨基酸區別。
圖2.不同的人源化抗CD20抗體與Raji B細胞的結合。母體(嵌合)B?ly1與那兩個人源化重鏈變體,以及(人源化,非程序性細胞死亡的)B?HL8變體的那些衍生物進行比較,所述人源化重鏈變體被識別為誘導強大的程序性細胞死亡(BHH2和BHH6),所述B?HL8變體被假設為恢復該作用(B?HL11?17)。所有人源化重鏈變體與相同的BKV1人源化輕鏈變體配對。
圖3.利妥昔單抗(O)和chB?ly1(Δ)與Raji B淋巴瘤細胞上CD20的結合。
圖4.通過三種抗CD20抗體進行抗體依賴性程序性細胞死亡的比較。chB?ly1wt代表嵌合B?ly1抗體構建體,其具有鼠的可變區和人的恒定區。BHH2?BKV1代表人源化變體,其包含鼠的B?ly1CDRs和人的源自重鏈的VH1種類人種系V基因并且與BKV1人源化B?ly1輕鏈配對的構架區。BHL8?BKV1wt代表人源化變體,其包含鼠的B?ly1CDRs和人的源自2個不同人種系V基因,并且與BKV1人源化B?ly1輕鏈配對的構架區。
圖5.通過5種B?ly1抗CD20抗體的人源化變體進行抗體依賴性程序性細胞死亡的比較。BHH2?BKV1代表人源化變體,其包含鼠的B?ly1CDRs和人的源自重鏈的VH1類(BHH2)并且與BKV1人源化B?ly1輕鏈配對的構架區。BHL8?BKV1wt代表人源化變體,其包含鼠的B?ly1CDRs和人的源自2個不同人種系V基因并且與BKV1人源化B?ly1輕鏈配對的構架區。BHL14?BKV1代表BHL8的衍生物,其在重鏈可變區Kabat位置12處具有纈氨酸到賴氨酸的替換,且在Kabat位置48處具有纈氨酸到甲硫氨酸的替換,并且與BKV1輕鏈構建體配對。BHL15?BKV1W1也源自BHL8,其在重鏈可變區Kabat位置16處具有甘氨酸到絲氨酸的替換,且在Kabat位置48處具有纈氨酸到甲硫氨酸的替換,并且與BKV1輕鏈構建體配對。BHL16?BKV1W1源自BHL8,其在重鏈可變區Kabat位置20處具有亮氨酸到纈氨酸的替換,且在Kabat位置48處具有纈氨酸到甲硫氨酸的替換,并且與BKV1輕鏈構建體配對。BHL17?BKV1W1源自BHL8,其在重鏈可變區Kabat位置48處具有纈氨酸到甲硫氨酸的替換,并且與BKV1輕鏈構建體配對。
圖6.通過C2B8抗CD20單克隆抗體和B?ly1抗體的兩種人源化變體,即BHH2?BKV1和BHL13?BKV1,在Z?138細胞內進行抗體依賴性程序性細胞死亡的比較。BHH2?BKV1代表人源化變體,其包含鼠的B?ly1CDRs和人的源自重鏈的VH1種類人種系V基因并且與BKV1人源化B?ly1輕鏈配對的構架區。BHL13?BKV1源自BHL8(見圖5,見上),其在重鏈可變區Kabat位置11處具有亮氨酸到纈氨酸的替換,且在Kabat位置48處具有纈氨酸到甲硫氨酸的替換,并且與BKV1輕鏈配對。
圖7.由三種不同種類FcγRIIIa?158V/F基因型的全血中的利妥昔單抗(◇)和chB?ly1(■)引起的B細胞損耗:(A)來自F/F供體的全血,對更低親和性受體純合;(B)來自F/V供體的全血,對親和性受體雜合;和(C)來自V/V供體的全血,對更高親和性受體純合。
圖8.糖改造的嵌合B?ly1抗體的MALDI?TOF模式圖。(A)詳細描述特異性峰百分比的表;(B)糖改造的嵌合B?ly1的光譜;(C)經Endo?H處理過的糖改造嵌合B?Ly1的光譜。
圖9.不同的人源化抗CD20抗體與Raji B細胞的結合。在所有3個CDRs相同的條件下,B?HH2構建體和B?HL8和B?HL11構建體之間的區別位于構架1和2區。B?HL8和B?HL11具有源自任何VH3類的FR1和FR2序列,而完整的B?HH2構架是人VH1來源的。B?HL11是具有單一突變Glu1Gln的B?HL8的衍生物,其中Gln是B?HH2構建體中的氨基酸殘基。這意味著Glu1Gln交換不改變結合親和性或強度。B?HH2和B?HL8之間的其他區別是14個FR殘基,其中的一個或多個影響該抗體的抗原結合表現。
圖10.Raji靶細胞上人源化抗CD20抗體BHL4?BKV1的結合。B?HL4構建體通過將B?HH2的FR1取代為人種系序列IGHV1?45(Acc No X92209)的FR1,來源于B?HH2抗體。該構建體盡管僅在FR1內的4個位置具有不同的氨基酸,但卻顯示出被極大降低了的抗原結合能力。按照Kabat編號,這些殘基位于位置2,14,28和30。在其中,位置28和30似乎是有影響力的位置,其原因在于它們是CDR1的Chothia定義的一部分。
圖11.B?HH1,B?HH2,B?HH3(全部與BKV1人源化B?ly1輕鏈配對),和母體抗體B?ly1之間結合表現的比較。數據顯示全部Abs表現出相似的EC50值,但是B?HH1構建體以比變體B?HH2和B?HH3更低的強度/化學計量結合。B?HH1可以通過其部分的人CDR1和CDR2區域(Kabat定義),以及位置28(Kabat編號)處的Ala/Thr多態性,與B?HH2和B?HH3相區別。這顯示位置28,完整CDR1,和/或完整CDR2任一對于抗體/抗原相互作用很重要。
圖12.B?HL1,B?HH1,和B?ly1母體抗體之間結合表現的比較。數據顯示了B?HL1構建體中任意結合活性的缺乏,以及與B?ly1相比,B?HH1大約一半的結合強度/化學計量。B?HL1和B?HH1都是基于源自人VH1種類的受體構架而設計的。在其他區別中,B?HL1構建體的位置71(Kabat.編號)明顯地不同,這顯示出其對抗原結合推定的重要性。
圖13.抗CD20抗體重鏈構建體B?HL2和B?HL3之間對其抗原結合表現的比較。在全部兩種情形中,鼠的VL序列與人源化重鏈組合。數據顯示B?HL2和B?HL3構建體不表現出CD?20的結合活性。
圖14.抗CD20抗體對Z?138MCL細胞的程序性細胞死亡作用。
圖15.抗CD20抗體的程序性細胞死亡。測定的詳述:將5x105細胞/孔接種于24孔板中的培養基(5x105細胞/ml)中。向孔中加入最終濃度為10μg/ml的各種抗體,對于陰性對照加入PBS,或對于陽性對照加入5mM喜樹堿(CPT)。過夜(o/n)培養樣品(16小時),用AnnV?FITC染色,并且通過FACS進行分析。測定一式三份地進行。(*):被減去的單獨PBS的信號(單獨的PBS對于PR?1和Z?138細胞分別給出8%和2%的AnnV+)。所使用的抗體是:C2B8(嵌合的,非糖改造的);BHH2?BKV1(人源化的,非糖改造的)。注意:該測定不涉及任何其他效應細胞,僅是靶標加抗體或對照。
圖16.由抗CD20抗體和免疫效應物細胞引起的靶細胞殺傷。測定的詳細信息:通過過夜培養和由FACS進行的CD19+/CD3+的分析確定了正常全血中B細胞的損耗。利用PBMC作為效應物,以4小時的培養和25:1的效應子:靶標比,確定ADCC。通過相對于去污劑?裂解(100%)和無抗體的裂解(0%)的鈣熒光素?保留測量靶標殺傷。所使用的抗體是:C2B8(嵌合的,非糖改造的形式);BHH2?BKV1?wt(BHH2?BKV1的人源化的,非糖改造形式);BHH2?BKV1?GE(BHH2?BKV1的人源化的,糖改造形式)。
圖17.未修飾非糖改造BHH2?BKV1的人源化IgG1B?ly1抗人CD20抗體的PNGaseF?釋放Fc?寡糖的MALDI/TOF?MS模式圖。
圖18.糖改造BHH2?BKV1g1的人源化IgG1B?ly1抗人CD20抗體的PNGaseF?釋放Fc?寡糖的MALDI/TOF?MS模式圖。糖改造是通過在宿主細胞中共表達抗體基因和編碼具有β?1,4?N?乙酰葡糖胺轉移酶III(GnT?III)催化活性的酶的基因而進行的。
圖19.糖改造BHH2?BKV1g2的人源化IgG1B?ly1抗人CD20抗體的PNGaseF?釋放Fc?寡糖的MALDI/TOF?MS模式圖。糖改造是通過在宿主細胞中共表達抗體基因以及編碼具有β?1,4?N?乙酰葡糖胺轉移酶III(GnT?III)催化活性的酶和編碼具有高爾基體α?甘露糖苷酶II催化活性的酶的基因而進行的。
圖20.非糖改造和糖改造(g2形式;見圖17?19的糖基化的模式圖)抗體與呈現在表達重組CD16的CHO細胞表面上的人FcγRIIIa受體的結合。
圖21.非Fc改造的和Fc改造的抗CD20抗體對Z?138MCL細胞的程序性細胞死亡作用。測定的詳細信息:將5x105細胞/孔接種于24孔板中的培養基(5x105細胞/ml)中。向孔中加入最終濃度為10μg/ml的各種抗體,或對于陰性對照加入PBS。過夜培養樣品(16小時),用AnnV?FITC染色,并且通過FACS進行分析。測定一式三份地進行。所使用的抗體是:C2B8=利妥昔單抗(嵌合的,非糖改造形式);BHH2?BKV1(人源化的,非糖改造的?關于糖改造模式,見圖17?19);BHH2?BKV1g1(人源化的,糖改造的);BHH2?BKV1g2(人源化的,糖改造的)。注意:該測定不涉及任何其他效應細胞,僅是靶標加抗體或對照。(*):減去單獨PBS的信號。
圖22.不同的人源化抗CD20抗體與Raji B細胞的結合。人源化重鏈構建體BHH2與其衍生物BHH4和BHH7進行比較。還顯示了變體,所述變體顯示Kabat位置28和30(BHH8和BHH9)的影響。
圖23.單一氨基酸交換通過Z?138MCL細胞上的抗CD20抗體對程序性細胞死亡的作用。測定的詳細信息:將5x105細胞/孔接種于中24孔板的培養基(5x105細胞/ml)中。向孔中加入最終濃度為10μg/ml的各種抗體,或對于陰性對照(無Ab)加入PBS。過夜培養樣品(16小時),用AnnV?FITC染色,并且通過FACS進行分析。測定一式三份地進行。所使用的抗體是:C2B8(嵌合的,非糖改造的),BHH2(人源化的,非糖改造的),BHH2?A(BHH2的衍生物,其在Kabat位置11處具有纈氨酸到亮氨酸的替換),和BHH2?B(BHH2的衍生物,其在Kabat位置12處具有賴氨酸到纈氨酸的替換),后三者與BKV1輕鏈配對。抗原結合的KD通過替換保持不變。注意:該測定不涉及任何其他效應細胞,僅是靶標加抗體或對照。
圖24.單一氨基酸交換通過Z?138MCL細胞上先前的失活抗CD20抗體對程序性細胞死亡的作用。測定的詳細信息:將5x105細胞/孔接種于24孔板中的培養基(5x105細胞/ml)中。向孔中加入最終濃度為10μg/ml的各種抗體,或對于陰性對照加入PBS。過夜培養樣品(16小時),用AnnV?FITC染色,并且通過FACS進行分析。測定一式三份地進行。所使用的抗體是:C2B8(嵌合的,非糖改造的),BHL8(人源化的,非糖改造的),BHL13(BHL8的衍生物,其在Kabat位置11處具有亮氨酸到纈氨酸的替換,以及在Kabat位置48處具有纈氨酸到甲硫氨酸的替換),和BHL14(BHL8的衍生物,其在Kabat位置12處具有纈氨酸到賴氨酸的替換,以及在Kabat位置48處具有纈氨酸到甲硫氨酸的替換),后三者與BKV1輕鏈配對。注意:該測定不涉及任何其他效應細胞,僅是靶標加抗體或對照。
圖25.輕鏈中單一氨基酸交換通過Z?138MCL細胞上的抗CD20抗體對程序性細胞死亡的作用。測定的詳細信息:將5x105細胞/孔接種于24孔板中的培養基(5x105細胞/ml)中。向孔中加入10μg/ml最終濃度的各種抗體,對于陰性對照(無Ab)加入PBS,或對于陽性對照加入5mM喜樹堿(CPT)。過夜培養樣品(16小時),用AnnV?FITC染色,并且通過FACS進行分析。測定一式三份地進行。所使用的抗體是:BHH2?A(BHH2的衍生物,其在Kabat位置11處具有纈氨酸到亮氨酸的替換),其與BKV1輕鏈配對,BHH6(BHH2的衍生物,其在Kabat位置34處具有甲硫氨酸到異亮氨酸的替換),其與BKV1輕鏈配對,和與BKV14輕鏈(BKV1的衍生物,其在Kabat位置106處具有異亮氨酸到丙氨酸的替換)配對的BHH6。
圖26.VH和CH1結構域之間界面處分子“球窩關節”的三維描述。
發明詳述
除非另外如下和在本文中進行定義,術語在本文中的使用如同本領域中的一般用法。
用于本文時,術語抗原結合分子(ABM)在其最廣泛的意義上指特異性結合于抗原決定子的分子。所謂“特異性結合”意指該結合對于抗原是選擇性的并且可以與不需要的或非特異性相互作用區別開。用于本文時,術語修飾的抗原結合分子(或修飾的ABM)意欲指這樣的ABM,其包括重鏈可變區和/或CH1區域中的至少一個氨基酸殘基替換和/或輕鏈可變區和/或CL區域中的至少一個氨基酸殘基替換。
用于本文時,術語抗體意欲包括完整抗體分子,以及具有Fc區域并保留結合特異性的抗體片段,和包括等價于免疫球蛋白的Fc區域的區域并保留結合特異性的融合蛋白,所述完整抗體分子包括單克隆抗體,多克隆抗體和多特異性(例如,二特異性)的抗體。還包括保留結合特異性的抗體片段,其包括,但不限于,VH片段,VL片段,Fab片段,F(ab’)2片段,scFv片段,Fv片段,微型抗體,二抗體,三鏈抗體,和四鏈抗體(見,例如,Hudson和Souriau,自然醫學(Nature Med.)9:129?134(2003),將其全部內容引入本文作為參考)。還包括人源化的,靈長類化的和嵌合的抗體。用于本文時,完整抗體指包括兩條重鏈和兩條輕鏈的免疫球蛋白分子,其中每條鏈包括可變區和恒定區。
用于本文時,術語可變區意指免疫球蛋白重鏈或輕鏈的N末端結構域。按照本發明的一個實施方案,修飾的ABM可以包括可變區的功能片段。
用于本文時,術語重鏈可變區意指免疫球蛋白重鏈的N末端結構域。在一個實例中,重鏈可變區通過Kabat位置1?113(如Kabat等,美國健康與人類服務部(U.S.Dept.of Health and Human Services),“免疫性靶標的蛋白質的序列”(″Sequence ofProteins of Immunological Interest″)(1983)所指定地,在特殊殘基處具有可能的插入)定義。按照本發明的一個實施方案,修飾的ABM可以包括重鏈可變區的功能片段。
用于本文時,術語重鏈恒定區意指免疫球蛋白重鏈的C末端結構域。存在5類天然存在的重鏈恒定區:IgA,IgG,IgE,IgD,和IgM。在一個實例中,重鏈恒定區包括CH1結構域,CH2結構域和CH3結構域。
用于本文時,術語CH1區域意指這樣的免疫球蛋白重鏈僅從C末端到可變區和從N末端到鉸鏈區的結構域。例如,在IgG類型的免疫球蛋白中,CH1通常由Kabat位置114?228定義。
用于本文時,術語程序性細胞死亡意指程序性的細胞死亡,其由某些細胞事件表征,所述細胞事件諸如細胞核斷裂和/或通過濃縮細胞質、質膜和/或細胞器形成程序性細胞死亡體。
用于本文時,術語激動劑活性意指試劑(例如,抗原結合分子)在與結合于細胞表面的分子相互作用(例如,結合于),并起始或誘導反應時的活性。
用于本文時,術語拮抗劑活性意指試劑(例如,抗原結合分子)在與細胞上的分子相互作用(例如,結合于),并阻止反應的起始或誘導,或停止正在進行的反應時的活性。
用于本文時,術語融合和嵌合,當關于多肽如ABM使用時,指這樣的多肽,所述多肽包括來自兩個或更多異源多肽的氨基酸序列,諸如來自不同物種的抗體的部分。例如,對于嵌合ABMs而言,非抗原結合成分可以來自廣泛種類的物種,包括靈長類動物諸如黑猩猩和人。最優選嵌合ABM的恒定區與天然人抗體的恒定區基本相同;最優選嵌合抗體的可變區源自與目標抗原特異性結合的非人(即,供體)抗原結合分子。嵌合ABM可以包括完整的供體可變區;備選地,嵌合抗體可以包括人源化的或靈長類化的抗體。人源化的抗體是融合或嵌合抗體特別優選的形式。
用于本文時,術語“人源化”用于指源自非人抗原結合分子的抗原結合分子,例如,鼠抗體,其保持或基本保持母體分子的抗原結合特性,但是在人中具有較少的免疫原性。這可以通過多種方法來實現,所述方法包括(a)將完整非人可變結構域結合到人恒定區上,從而產生嵌合抗體,(b)僅將非人CDRs結合到人構架和恒定區上,保留或不保留關鍵的構架殘基(例如,對于保持良好的抗原結合親和性或抗體功能是重要的那些),或(c)移植整個非人的可變結構域,但是通過取代表面殘基,用人樣片段來“遮蔽”它們。這些方法公開于Jones等,Morrison等,國家科學院會刊(Proc.Natl.Acad.Sci.),81:6851?6855(1984);Morrison和Oi,免疫學進展(Adv.Immunol.),44:65?92(1988);Verhoeyen等,科學(Science),239:1534?1536(1988);Padlan,免疫分子學(Molec.Immun.),28:489?498(1991);Padlan,免疫分子學(Molec.Immun.),31(3):169?217(1994),將它們全部并入本文作為參考。
在抗體的每一個重鏈和輕鏈可變結構域中通常存在3個互補決定區,或CDRs(CDR1,CDR2和CDR3),在抗體的每一個重鏈和輕鏈可變結構域中它們側鄰四個構架亞區域(即,FR1,FR2,FR3,和FR4):FR1?CDR1?FR2?CDR2?FR3?CDR3?FR4。人源化抗體的討論可以,見于特別是美國專利號6,632,927,和公開的美國申請號2003/0175269中,將它們兩者全文并入本文作為參考。
類似地,用于本文時,術語靈長類化用于指來自非靈長類動物抗原結合分子的抗原結合分子,例如,鼠抗體,其保留或基本保留母體分子的抗原結合性質,但是在靈長類動物中具有更少的免疫原性。
在本領域使用和/或接受的術語存在兩個或多個定義的情形中,用于本文時的術語的定義傾向于包括所有的這些含義,除非明確地以相反的意思指出。具體的實例是使用術語“互補決定區”(″CDR″)來描述在重鏈和輕鏈多肽的可變區中發現的非連續抗原結合位點。這一特定區域已經在Kabat等,美國健康與人類服務部(U.S.Dept.ofHealth and Human Services),“免疫性靶標的蛋白質的序列”(″Sequences of Proteins of Immunological Interest″)(1983)和Chothia等,分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)196:901?917(1987)中進行了描述,將它們并入本文作為參考,其中當針對彼此比較時,所述定義包括氨基酸殘基的重疊或子集。然而,將任一定義用于指抗體或其變體的CDR的應用傾向于在本文所限定和使用的術語的范圍內。涵蓋如上面引用的參考文獻的每個所定義的CDRs的適合的氨基酸殘基在下面的表1中提出作為比較。涵蓋特定CDR的精確殘基數目將根據CDR的序列和大小而變化。假定已知抗體的可變區氨基酸序列,本領域技術人員可以常規地確定哪些殘基包含特定的CDR。
表1.CDR定義1
 KabatChothiaOxAbM2VH CDR131?3526?3226?35VH CDR250?6552?5850?58VH CDR395?10295?10295?102VL CDR124?3426?3224?34VL CDR250?5650?5250?56VL CDR389?9791?9689?97
1表1中的所有的CDR定義的編號是按照Kabat等(見下)的編號方式進行的。
2“OxAbM”指由牛津分子(Oxford Molecular)的“AbM”抗體模型軟件定義的CDRs。
Kabat等還定義了用于可變結構域序列的編號系統,其可應用于任何抗體。本領域普通技術人員可以明確地將這種“Kabat編號”系統用于任何可變結構域序列,而不依賴于超出序列本身之上的任何實驗數據。用于本文時,“Kabat編號”指由Kabat等,美國健康與人類服務部,“免疫性靶標的蛋白質的序列”(″Sequences of Proteins of Immunological Interest″)(1983)提出的編號系統。除非另外指定,ABM中特異性氨基酸殘基位置的編號參考按照Kabat編號系統。序列表的序列不是按照Kabat編號系統編號的。
用于本文時,具有“GnTIII”活性的多肽指這樣的多肽,所述多肽能夠催化以β?1?4連接將N?乙酰基葡糖胺(GlcNAc)殘基添加到N?連接的寡糖中的三甘露糖基核心的β?連接的甘露糖苷上。這包括融合多肽,所述多肽顯示類似于但不必須相同于β(1,4)?N?乙酰葡糖胺轉移酶III的活性的酶活性。按照國際生化和分子生物學命名委員會(Nomenclature Committee ofthe International Union of Biochemistry and Molecular Biology)(NC?IUBMB),其也被稱為β?1,4?甘露糖基?糖蛋白4?β?N?乙酰基葡糖胺基?轉移酶(EC2.4.1.144),如通過存在或不存在劑量依賴性的特殊生物測定來測量。在其中確實存在劑量依賴性的情形中,其不需要與GnTIII的劑量依賴性相同,但是與GnTIII活性相比,基本類似于在給定活性中的劑量依賴(即,相對于GnTIII,候選多肽將顯示更大的活性或不超過約25倍更少,并且優選地,不超過約10倍更少的活性,并且最優選地,不超過約三倍更少的活性)。
用于本文時,術語變體(或類似物)指通過使用,例如重組DNA技術產生的氨基酸插入,缺失,和替換而與本發明特別陳述的多肽區別開的多肽。本發明的ABMs的變體包括嵌合的,靈長類化或人源化的抗原結合分子,其中氨基酸殘基的一個或數個通過以這樣的方式替換,添加和/或缺失進行修飾,所述方式基本上不影響抗原結合親和性。可以通過將特定多肽的序列與同源肽的序列進行比較并使在高同源性的區域(保守區域)中所作的氨基酸序列變化的數量最少化,或通過用共有序列來取代氨基酸來發現確定哪個氨基酸殘基可以被替換,添加,或缺失而不會破壞目標活性的指導。
或者,編碼這些相同或類似多肽的重組變體可以通過使用在遺傳密碼中的“豐余性”來合成或選擇。各種密碼子替換,諸如產生各種限制性位點的沉默改變可以被引入從而優化克隆到質粒或病毒載體中,或在特定原核或真核系統中的表達。在多核苷酸序列中的突變可以反映在多肽或被加入多肽的其它肽的結構域中從而修飾多肽的任何部分的特性,從而改變特性諸如配體結合親和性,鏈間親和性,或降解/更新率。
用于本文時,氨基酸殘基替換意指取代參比序列(例如,母體分子,如抗原結合分子)中的一個或多個氨基酸。在一個實施方案中,氨基酸殘基替換可以通過,例如,編碼多肽的核酸序列中與母體序列相比的點突變實現。在另一個實施方案中,氨基酸殘基的替換可以通過將母體多肽的整個構架區取代為,例如來自種系VH序列的構架區來實現,所述種系VH序列的構架區包括在待替換位置處參比母體所需要的氨基酸。
“保守性”氨基酸替換是通過將一個氨基酸取代為另一個具有相似結構和/或化學性質的氨基酸形成的那些,即保守性氨基酸取代,并且可以在涉及的殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性性質的相似性基礎上進行。例如,非極性(疏水)氨基酸包括甘氨酸,丙氨酸,亮氨酸,異亮氨酸,纈氨酸,脯氨酸,苯丙氨酸,色氨酸和甲硫氨酸;極性中性氨基酸包括絲氨酸,蘇氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,天冬酰胺,和谷氨酰胺;帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸,賴氨酸和組氨酸;并且帶負電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。“插入”或“缺失”優選地在約1到約20個氨基酸的范圍內,更優選在約1?約10個氨基酸范圍內。容許的變化可以使用重組DNA技術系統性在多肽分子中進行氨基酸插入,缺失或替換,和通過測定得到的重組變體的活性,來實驗性地進行確定。
用于本文時,術語母體抗原結合分子,或母體分子指具有由多核苷酸序列編碼的特殊氨基酸序列的多肽。母體分子的序列(即,母體序列)用作進行氨基酸殘基替換的參比序列,所述氨基酸殘基替換改變由此生成的分子(例如,修飾的抗原結合分子)誘導或阻斷細胞信號傳導活性和/或抗原交聯的能力。同樣地,母體分子的活性在確定替換是否具有對細胞信號傳導活性和/或抗原交聯的作用,以及如果相關時,確定作用的程度時用作參比。與其母體(例如,修飾的ABM)相比,含有一個或多個氨基酸替換的序列可以又起到母體序列的作用,進行進一步替換。
用于本文時,術語改變的細胞信號傳導活性意指ABM增強的或降低的誘導或抑制靶抗原細胞信號傳導活性的能力。
用于本文時,術語改變的一個或多個靶抗原交聯意指ABM增強的或降低的將彼此引至更近的鄰近狀態,和/或將其引至與其他膜結合分子更近的鄰近狀態,和/或將其引至更有利于與靶抗原相互作用的構象中的能力,所述靶抗原能夠形成復合物(例如,通過蛋白質的交聯,或膜結合的受體的低聚作用),從而起始細胞信號傳導途徑。
用于本文時,細胞信號傳導機制或細胞信號傳導活性意指完整的信號傳導(即,信號轉導)途徑,其導致特殊細胞事件或生物功能,以及沿著該途徑的任何信號傳導步驟。
至于與本發明的參比核苷酸序列具有至少,例如95%“同一性”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸,意指多核苷酸的核苷酸序列與參比序列相同,除了多核苷酸序列可以包括參比核苷酸序列的每100個核苷酸中多到5個的點突變。換言之,為了獲得具有與參比核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸,在參比序列中多到5%的核苷酸可以缺失或被另一個核苷酸所替換,或在參比序列中多到總核苷酸數目5%的核苷酸可以插入參比序列中。
作為實踐的問題,可以使用已知的計算機程序來常規確定是否任何特定的核酸分子或多肽與本發明的核苷酸序列或多肽序列具有至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%的同一性。確定在查詢序列(本發明的序列)和目標序列之間的最佳全面匹配的優選方法,也被稱為全域序列比對,可以使用基于Brutlag等,生物科學編輯附錄(Comp.App.Biosci.)6:237?245(1990)的算法的FASTDB計算機程序進行確定。在序列比對中,查詢序列和目標序列都是DNA序列。RNA序列可以通過將U′s轉化為T′s進行比較。所述全域序列比對的結果以百分比同一性表示。用在DNA序列的FASTDB比對中計算百分比同一性的優選參數是:矩陣=單式,k?字長=4,不匹配罰分=1,合并罰分(Joining Penalty)=30,隨機組長=0,截斷值評分=1,空隙罰分=5,空隙大小罰分0.05,窗口大小=500或目標核苷酸序列的長度,無論哪一個更短。
如果目標序列比查詢序列更短是因為5′或3′缺失,而不是因為內部缺失,必須對結果進行手工校正。這是因為當計算百分比同一性時,該FASTDB程序并不說明目標序列的5′和3′截短。對于相對于查詢序列,在5′或3′末端被截短的目標序列,通過將不匹配/比對的在目標序列的5′和3′的查詢序列的堿基的數量計算為查詢序列的總堿基百分比來對百分比同一性進行校正。通過FASTDB序列排列的結果來確定是否核苷酸匹配/比對。接著,將該百分比從使用指定參數通過上述FASTDB程序進行計算的百分比同一性中減去來達到最終的百分比同一性評分。這種校正評分用于本發明的目的。如通過FASTDB比對展示,僅有不與查詢序列匹配/比對的,在目標序列的5′和3′堿基外側的堿基出于手工調整百分比同一性評分的目的進行計算。
例如,將90個堿基的目標序列與100個堿基的查詢序列進行比對來確定百分比同一性。該缺失發生在目標序列的5′末端,并且因此,FASTDB比對沒有顯示在5′末端首先的10個堿基的匹配/比對。這10個未配對堿基代表序列的10%(未匹配的在5′和3′末端堿基的數量/在查詢序列中的堿基總數),因此將10%從通過FASTDB程序計算的百分比同一性評分中減去。如果剩余的90個堿基完全匹配,最終的百分比同一性將是90%。在另一個實例中,將90個堿基的目標序列與100個堿基的查詢序列進行比較。這次,缺失是內部缺失從而使在目標序列的5′或3′末端上不存在與查詢序列不匹配/比對的堿基。在該情形中,通過FASTDB計算的百分比同一性沒有進行手工校正。再一次,只對在不與查詢序列匹配/比對的目標序列的5′和3′末端的堿基進行手工校正。出于本發明的目的,沒有進行其它的手工校正。
至于與本發明的查詢氨基酸序列具有至少,例如95%“相同”的氨基酸序列的多肽,意指目標多肽的氨基酸序列與查詢序列相同,除了目標多肽序列可以在查詢氨基酸序列的每100個氨基酸中包括多到5個氨基酸改變。換言之,為了獲得具有與查詢氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的多肽,在目標序列中多到5%的氨基酸殘基可以被插入,缺失,或被另一個氨基酸替換。參比序列的這些改變可以發生在參比氨基酸序列的氨基或羧基末端位點,或在那些末端位點之間的任何地方,其單獨散在參比序列的殘基中或在參比序列的一個或多個連續組中。
作為實踐的問題,可以使用已知的計算機程序來常規確定是否任何特定的多肽與參比多肽至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%的相同。確定在查詢序列(本發明的序列)和目標序列之間的最佳全面匹配的優選方法,也被稱為全域序列比對,可以使用基于Brutlag等,Comp.App.Biosci.(生物科學編輯附錄)6:237?245(1990)的算法的FASTDB計算機程序進行確定。在序列比對中,查詢序列和目標序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述全域序列比對的結果以百分比同一性表示。用在FASTDB氨基酸比對中的優選參數是:矩陣=PAM0,k字長=2,不匹配罰分=1,合并罰分(Joining Penalty)=20,隨機組長=0,截斷值評分=1,窗口大小=序列長度,空隙罰分=5,空隙大小罰分=0.05,窗口大小=500或目標氨基酸序列的長度,無論哪一個更短。
如果目標序列比查詢序列更短是因為N端或C端缺失,而不是因為內部缺失,必須對結果進行手工校正。這是因為當計算全域百分比同一性時,該FASTDB程序并不說明目標序列的N端和C端截短。對于相對于查詢序列,在N端和C端被截短的目標序列,通過將與相應的目標殘基不匹配/比對的在目標序列的N端和C端的查詢序列的殘基的數量計算為查詢序列的總堿基百分比來對百分比同一性進行校正。通過FASTDB序列比對的結果來確定是否殘基是匹配/比對的。接著,將該百分比從使用指定參數通過上述FASTDB程序進行計算的百分比同一性中減去來達到最終的百分比同一性評分。這種最終百分比同一性評分用于本發明的目的。出于手工調整百分比同一性評分的目的,僅考慮不與查詢序列匹配/比對的,在目標序列的N端和C端的殘基。即,僅是在目標序列的最遠N和C端殘基外側的查詢殘基位點。
例如,將90個氨基酸殘基的目標序列與100個殘基的查詢序列進行比對來確定百分比同一性。該缺失發生在目標序列的N端,并且因此,FASTDB比對沒有顯示在N端前10個殘基的匹配/比對。這10個未配對殘基代表序列的10%(未匹配的在N端和C端殘基的數量/查詢序列的殘基總數),因此將10%從通過FASTDB程序計算的百分比同一性評分中減去。如果剩余的90個殘基完全匹配,最終的百分比同一性將是90%。在另一個實例中,將90個殘基的目標序列與100個殘基的查詢序列進行比較。這次,缺失是內部缺失從而使在目標序列的N端或C端上不存在與查詢序列不匹配/比對的殘基。在該情形中,通過FASTDB計算的百分比同一性沒有進行手工校正。再一次,如通過FASTDB比對所顯示的,只對在不與查詢序列匹配/比對的目標序列的N端和C端末端外側的殘基位點進行手工校正。出于本發明的目的,沒有進行其它的手工校正。
用于本文時,“在嚴格條件下雜交于”本發明的核酸序列的核酸指在這樣的條件下進行雜交的多核苷酸,所述條件為在包括以下各項的溶液中于42℃進行過夜溫育:50%的甲酰胺,5x SSC(750mM NaCl,75mM檸檬酸鈉),50mM磷酸鈉(pH7.6),5x Denhardt′s溶液,10%硫酸葡聚糖,和20μg/ml的變性、已剪切的鮭精DNA,隨后于約65℃在0.1x SSC中洗滌濾器。
用于本文時,術語Fc區域意欲指IgG重鏈的C?末端區域。盡管IgG重鏈的Fc區域的邊界可以輕微變化,人IgG重鏈的Fc區域通常定義為從位于Cys226的氨基酸殘基延伸到羧基末端的一段序列。
用于本文時,術語等價于免疫球蛋白的Fc區域的區域意欲包括免疫球蛋白的Fc區域的天然存在的等位基因變體以及具有改變的變體,所述改變產生替換,添加,或缺失,但是基本不會減少免疫球蛋白介導效應子功能(諸如抗體依賴性的細胞的細胞毒性)的能力。例如,在免疫球蛋白的Fc區域的N?末端或C末端可以缺失一個或多個氨基酸,而基本不喪失生物學功能。可以按照本領域已知的一般規則來選擇這些變體從而對活性具有最小的影響。(見,例如Bowie,J.U.等科學(Science)247:1306?10(1990)。在一個實施方案中,等價于Fc區域的區域還可以形成異源融合蛋白的一部分。在一些實施方案中,等價于Fc區域的區域還包括來自另一類免疫球蛋白重鏈(例如,IgA,IgE,IgD,和IgM)的相應區域。
用于本文時,術語高爾基體定位結構域指負責將多肽錨定在高爾基復合體的位置中的高爾基體定居多肽的氨基酸序列。通常,定位結構域包括酶的氨基末端“尾”。
用于本文時,術語效應子功能指可歸因于抗體的Fc區域(天然序列Fc區域或氨基酸序列變體Fc區域)的那些生物學活性。抗體效應子功能的實例包括,但不限于,Fc受體結合親和性,抗體依賴性細胞毒性(ADCC),抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP),細胞因子分泌,免疫復合體介導的抗原呈遞細胞的抗原吸收,細胞表面受體的下調等。
用于本文時,認為術語改造,改造的,進行改造,糖改造,糖改造的,進行糖改造和糖基化改造包括天然存在或重組多肽,如抗原結合分子(ABM)或其片段的糖基化模式的任何操作。糖基化改造包括細胞的糖基化作用的代謝改造,所述代謝改造包括對寡糖合成途徑進行遺傳操作從而獲得改變的在細胞中表達的糖蛋白的糖基化。在一個實施方案中,糖基化改造是糖基轉移酶活性的改變。在特定的實施方案中,改造導致葡糖胺轉移酶活性和/或巖藻糖基轉移酶活性的變化。
用于本文時,術語宿主細胞包括任何種類的細胞系統,能夠對該細胞系統進行改造從而產生本發明的多肽和抗原結合分子。宿主細胞包括培養的細胞,例如,哺乳動物培養細胞,諸如CHO細胞,BHK細胞,HEK293?EBNA細胞,NS0細胞,SP2/0細胞,Y0骨髓瘤細胞,P3X63小鼠骨髓瘤細胞,PER細胞,PER.C6細胞或雜交瘤細胞,酵母細胞,昆蟲細胞,和植物細胞,僅舉幾個例子,但是還包括被包含在轉基因動物,轉基因植物或培養的植物或動物組織中的細胞。在一個實施方案中,對宿主細胞進行改造從而容許產生具有修飾的糖形的抗原結合分子。在一個優選的實施方案中,抗原結合分子是抗體,抗體片段,或融合蛋白。在某些實施方案中,對宿主細胞進一步操作從而使其表達增加水平的一種或多種具有GnTIII活性的多肽。在其它實施方案中,對宿主細胞進行改造從而具有消除的,減弱的或抑制的核心α1,6?巖藻糖基轉移酶活性。術語核心α1,6?巖藻糖基轉移酶活性涵蓋核心α1,6?巖藻糖基轉移酶基因的表達以及核心α1,6?巖藻糖基轉移酶與其底物的相互作用。
用于本文時,術語Fc?分導的細胞毒性包括抗體依賴性細胞毒性和由包含人Fc?區域的可溶性Fc?融合蛋白介導的細胞的細胞毒性。這是一種導致“人免疫效應細胞”裂解“抗體靶向細胞”的免疫機制,其中:
人免疫效應細胞是在它們的表面上顯示Fc受體的白細胞群,通過所述Fc受體它們結合于抗體或Fc?融合蛋白的Fc?區域并且執行效應子功能。這樣的群可以包括,但不限于,外周血單核細胞(PBMC)和/或天然殺傷(NK)細胞。
抗體靶向細胞是由抗體或Fc融合蛋白結合的細胞。抗體或Fc融合蛋白通過Fc區N末端的蛋白部分結合靶細胞。
用于本文時,將術語增加的Fc?介導的細胞的細胞毒性定義為通過上述定義的Fc?介導的細胞的細胞毒性的機制,在圍繞靶細胞的培養基中,以給定濃度的抗體,或給定濃度的Fc?融合蛋白,在給定時間內裂解的“抗體?靶向細胞”的數量的增加,和/或將其定義為通過Fc介導的細胞的細胞毒性的機制,在給定的時間內,獲得給定數量的“抗體靶向細胞”的裂解所需要的在圍繞靶細胞的培養基中抗體濃度,或Fc?融合蛋白的濃度的減少。Fc?介導的細胞的細胞毒性的增加涉及由相同的抗體,或Fc?融合蛋白介導的細胞的細胞毒性,所述抗體或Fc?融合蛋白使用本領域那些技術人員已知的相同的標準產生,純化,配制和貯存方法由相同類型的宿主細胞產生,若非不是由通過本文所述的方法進行了改造從而表達糖基轉移酶GnTIII的宿主細胞產生。
所謂具有增加的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的抗體,意指如本文所定義的術語的抗體,所述抗體如通過本領域那些普通技術人員已知的任何適合方法所確定的具有增加的ADCC。在下文所述的實施例中描述了一種被接受的ADCC測定。另一種被接受的體外ADCC測定如下:
1)該測定使用已知表達靶抗原的靶細胞,所述靶抗原由抗體的抗原結合區域所識別;
2)該測定使用分離自隨機選擇的健康供體的血液的人外周血單核細胞(PBMCs),來作為效應細胞;
3)該測定按照下列方法進行;
i)使用標準的密度離心方法來分離PBMCs并將其以5x106細胞/ml懸浮在RPMI細胞培養基中;
ii)通過標準的組織培養方法培養靶細胞,在生存力大于90%的指數生長階段來收集細胞,在RPMI細胞培養基中將其進行洗滌,用100微居的51Cr將其進行標記,并用細胞培養基將其洗滌兩次,并以105細胞/ml的密度將其重懸于細胞培養基中;
iii)將100微升的上述最終靶細胞混懸液轉移到96孔微量滴定板的每孔中;
iv)將抗體從4000ng/ml到0.04ng/ml在細胞培養基中進行系列稀釋,并將50微升的得到的抗體溶液加入96孔微量滴定板中的靶細胞,一式三份地測試各個抗體濃度,所述抗體濃度覆蓋整個的上述范圍的抗體濃度;
v)對于最大釋放(MR)對照,在包含標記的靶細胞的板中的3個另外的孔接受50微升的2%(V/V)的非離子去污劑(Nonidet,希格瑪(Sigma),St.Louis)的水溶液,替換抗體溶液(上述的第iv點);
vi)對于自發釋放(SR)對照而言,在包含標記的靶細胞的板中的3個另外的孔接受50微升的RPMI細胞培養基,替換抗體溶液(上述的第iv點);
vii)接著將96孔微量滴定板以50xg離心1分鐘并在4℃溫育1小時;
viii)將50微升的PBMC混懸液(上述第i點)加入每個孔中從而產生25∶1的效應物:靶細胞比率,并將板置于溫箱中于37℃在5%CO2氣氛下達4小時。
ix)從每個孔中收集無細胞的上清液,并使用γ射線計數器來量化實驗釋放的放射性(ER);
x)按照式(ER?MR)/(MR?SR)x100來計算每個抗體濃度的特異性裂解的百分比,其中ER是對于該抗體濃度量化的平均放射性(見上述第ix點),MR是對于MR對照而言(見上面的第v點)量化的平均放射性(見上面的第ix點),并且SR是對于SR對照而言(見上面的第vi點)量化的平均放射性(見上面的第ix點);
4)將“增加的ADCC”定義為在上述測試的抗體濃度范圍內觀察的特異性裂解的最大百分比的增加,和/或在上面測試的抗體濃度范圍內觀察到的獲得特異性裂解的最大百分比的一半所需要的抗體的濃度的減少。在ADCC中的增加涉及這樣的ADCC,其是在上述測定中測量的,由相同抗體介導的ADCC,所述抗體使用本領域那些技術人員已知的相同的標準產生,純化,配制和貯存方法由相同類型的宿主細胞產生,若非不是由被改造從而過表達GnTIII的宿主細胞所產生。
具有重鏈和/或輕鏈氨基酸替換的抗原結合分子
在一個方面中,本發明涉及包括修飾的重鏈和/或輕鏈V區域和/或C區域的ABMs,并且涉及對通過所述修飾可以增強(即,誘導或增強)或減弱(即,抑制或降低)這些ABMs誘導靶抗原細胞信號傳導活性和/或介導靶抗原交聯能力的發現。因此,本發明提供具有修飾的重鏈和/或輕鏈V區域和/或C區域的多肽,其包括ABMs,編碼所述多肽的核酸序列(例如,載體),用于產生具有修飾的重鏈和/或輕鏈V區域和/或C區域的多肽的方法,以及在多種疾病和病癥的治療中使用其的方法。
已知若干機制涉及抗體的治療功效,包括抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC),補體依賴性細胞毒性(CDC),和生長停滯或程序性細胞死亡的誘導以及細胞生長的阻滯或抑制,細胞增殖,細胞存活和/或其他細胞事件。例如,已經報告了由對抗單克隆抗體誘導細胞死亡以及其他細胞信號傳導事件的實例。Cerisano等,顯示了由程序性細胞死亡樣特性(包括磷脂酰絲氨酸(PS)的暴露,形態的改變和/或碘化丙錠(PI)的吸收)表征的胱天蛋白酶不依賴性細胞死亡的誘導,以及通過用針對穿膜糖蛋白的對抗抗體,即CD99(例如,抗CD99013MAb和O662MAb)的刺激引起的尤文肉瘤細胞的同型集聚(Cerisano等,致癌基因(Oncogene)23:5664?5674(2003))。同樣地,Hahn等,報告了通過用抗CD99單克隆抗體(例如,DN16和YG32)接合CD99引起的MAPK信號傳導途徑的活化,其導致細胞的同型集聚(Hahn等,FEBS通訊(FEBSLetters)470:350?354(2000))。Pettersen等,識別了可以被抗CD99單克隆抗體,即Ad20活化的CD99的新功能結構域,其活化作用誘導轉化T細胞中的程序性細胞死亡(Pettersen等,免疫學雜志(J. Immunol.)166:4931?4942(2001))。針對CD47的單克隆抗體(例如,B6H12)也可以誘導胱天蛋白酶不依賴性細胞死亡,其與細胞骨架重構信號傳導途徑有關(Mateo等,血液(Blood)100:2882?2890(2002))。將上述每篇參考文獻的全部內容引入本文作為參考。
在其他實例中,針對CD20的某些抗體(例如,利妥昔單抗和托昔莫單抗)和針對CD52的某些抗體(CAMPATH?1H)已經顯示出直接誘導腫瘤細胞中的程序性細胞死亡。見Ludwig等,致癌基因(Oncogene)22:9097?9106(2003)。對于利妥昔單抗和若干其他具有很小或無信號傳導活性的單克隆抗體(抗CD19,CD21,CD22和Her2),誘導程序性細胞死亡或生長停滯的能力通過將抗體化學轉換為IgG?IgG同型二聚體得到增強。Ghetie等,國家科學院會刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)94:7509?14(1997)。推測該增強是因為增加的負信號傳導和/或四價抗體同型二聚體的超交聯(hypercrosslinking)。Ghetie等,國家科學院會刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)94:7509?14(1997)。還通過使用二級抗體或具有Fc受體的佐細胞獲得了交聯和增加的程序性細胞死亡。見Jazhirehi和Bonavida,致癌基因(Oncogene)24:2121?43(2005)。將上述每篇參考文獻的全部內容引入本文作為參考。
在不希望受到理論限制的條件下,本發明人確定了抗原結合分子肘鉸鏈區中氨基酸殘基的修飾可以影響ABM誘導或抑制信號傳導活性和/或靶抗原交聯的能力。肘鉸鏈區的角度控制免疫球蛋白V區域相對于C區域的方向,并且同樣地,促進抗體與抗原和效應子蛋白的相互作用。見Lesk和Chothia,自然(Nature)335:188?90(1988)。Lesk和Chothia鑒定了組成抗體中肘鉸鏈區分子球窩關節的殘基,即VH區域中Kabat位置11,110和112,以及CH1區域中位置149和150,并且注意到了組成該關節的殘基的抗體的高度保守性。Lesk和Chothia,自然(Nature)335:188?90(1988)。(將其全部內容引入本文作為參考)。然而,他們沒有對球窩殘基或在他們附近的殘基做出修飾。Landolfi等顯示在AF2,一種針對人IFNγ的中和抗體的Kabat位置10?13的修飾導致抗體的中和活性的明顯損失,但是沒有影響抗體與其靶抗原的結合。Landolfi等,J.Immunol.(免疫學雜志).166:1748?54(2001)(將其全部內容結合在本文作為參考)。然而,Landolfi等沒有顯示出對抗體誘導細胞信號傳導或介導抗原交聯的能力的影響。
關于多價ABM,改變抗原結合位點方向的能力容許當結合的抗原單位與多抗原結合位點復合時,調節其接近度。抗原單位彼此間的接近度促進抗原單位間較大或較小的相互作用(例如,交聯,二聚體形成,等)。例如,如果定向ABM中每個VH/VL?CH1/CL對的肘角度,以使抗原結合位點彼此更接近,則結合的抗原單位(例如,細胞表面受體分子)也應該彼此更加接近,或形成更加有利于相互作用的構象。該接近度或構象改變可以介導結合的抗原間的相互作用,例如,交聯和低聚作用。在另一方面,定向抗原結合位點,以使它們更加遠離或具有更加不適合的構象,可以防止它們相互作用。
還可以修飾位于VL?CL界面處的氨基酸殘基,從而影響抗原結合位點的定向。例如,輕鏈可變區構架中的Kabat殘基40,80,83,105,和106位于VL/CL界面處。
任何細胞信號傳導機制的活性可以受到本發明ABM的影響(即,受到誘導或抑制)。在本發明的一個方面,涉及的細胞信號傳導機制是通過細胞表面受體蛋白,包括離子通道連接的、G蛋白連接的和酶聯細胞表面受體蛋白起始的那些。一般見于,第15章:Cell Signaling in MOLECULARBIOLOGY OF THE CELL(細胞分子生物學中的細胞信號傳導),Alberts等,eds.(第3版,1994)(引入本文作為參考)。因此,例如,本發明的細胞信號傳導活性包括,但不限于,導致程序性細胞死亡、細胞分化、細胞生長、細胞增殖和細胞生存的那些,以及沿該途徑的任何信號傳導步驟。在一個實施方案中,細胞信號傳導活性通過酶聯受體發生;在具體的實施方案中,所述酶聯受體是受體酪氨酸激酶。在另一個實施方案中,細胞信號傳導活性是通過離子通道連接的受體。
本發明ABM的修飾的重鏈或輕鏈V區域和/或C區域以至少一個氨基酸替換區別于相應的未修飾母體多肽(例如,母體抗原結合分子)區域。該“母體,”“起始,”或“未修飾”多肽優選地包含抗體重鏈或輕鏈的至少部分,并且可以通過利用本領域中用于產生包含重鏈V區域或CH1區域或其部分和/或輕鏈V或C區域或其部分的多肽的可用技術而制備。在具體的實施方案中,母體多肽是抗原結合分子,并且包括VH或VL區域的至少部分。在某些實施方案中,可以產生修飾的重鏈和/或輕鏈V區域(例如,按照本文所公開的方法)并且可以將其與選擇的異源多肽,如抗體Fc相融合。在本發明的一個實施方案中,修飾的ABM或其片段包括融合蛋白,其中修飾的重鏈V區域或其片段與選自由下列各項組成的組的重鏈恒定區相融合;IgA,IgG,IgE,IgD,和IgM,或其片段或衍生物。在具體的實施方案中,重鏈恒定區是IgG。在本發明的另一個實施方案中,修飾的ABM或其片段包括融合蛋白,其中修飾的輕鏈V區域或其片段與選自下列各項組成的組的輕鏈恒定區相融合:IgA,IgG,IgE,IgD,和IgM,或其片段或衍生物。在具體的實施方案中,輕鏈恒定區是IgG。在具體的實施方案中,本發明的多肽包括完整的抗體(例如,IgG),其包括具有修飾的重鏈和/或輕鏈V區域的輕鏈和重鏈。
編碼這樣的多肽的多核苷酸可以通過本領域中已知的利用對特殊序列現有說明的指導方法進行制備,所述多肽包括修飾的重鏈V區域或CH1區域或輕鏈V區域或CL區域。這些方法包括,但不限于,通過位點定向的(或寡核苷酸介導的)誘變,PCR誘變和早期制備的編碼該多肽的核酸的盒式誘變的制備。位點定向的誘變是用于制備替換變體的優選方法。該技術在本領域中眾所周知(見,例如,Carter等,核酸研究(Nucleic Acids Res.)13:4431?4443(1985)和Kunkel等,美國國家科學院會刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82:488(1987),將其二者都引入本文作為參考)。簡要地,在進行DNA的位點定向誘變中,通過首先對編碼所需突變的寡核苷酸和起始DNA單鏈的進行雜交,改變該起始DNA。雜交后,利用雜交的寡核苷酸作為引物,并利用該起始DNA單鏈作為模板,使用DNA聚合酶合成完整的第二條鏈。由此,將編碼所需突變的寡核苷酸引入到由此生成的雙鏈DNA中。
PCR誘變還適合于制備未修飾的起始多肽的氨基酸序列變體(見,例如,Vallette等,核酸研究(Nuc.Acids Res.)17:723?733(1989),將其引入本文作為參考)。簡要地,當少量模板DNA在PCR中用作起始材料時,與模板DNA中相應區域的序列稍有不同的引物可以用于產生相對大量的特異性DNA片段,其僅與模板序列區別在引物與模板相區別的位置。
用于制備ABM變體的另一種方法,即盒式誘變,基于Wells等,基因(Gene)34:315?323(1985)所述的技術,將其引入本文作為參考。原材料是包含待修飾的起始多肽DNA的質粒(或其他載體)。鑒定了待突變起始DNA中的密碼子。在鑒定的突變位點每一側必須存在唯一的限制性核酸內切酶位點。如果沒有該限制性位點存在,則可以利用上述寡核苷酸介導的誘變方法產生它們,從而將它們引入到起始多肽DNA中合適的位置。在這些位點切割質粒DNA,從而使其線性化。利用標準步驟合成編碼所述限制性位點之間但含有所需突變的DNA序列的雙鏈寡核苷酸,其中分別合成寡核苷酸的兩條鏈,并再利用標準技術將它們雜交在一起。該雙鏈寡核苷酸稱為盒。將該盒設計為具有與線性化質粒末端相容的5’和3’末端,由此,它可以直接與質粒連接。該質粒現在含有突變的DNA序列。
備選地,或另外地,可以確定編碼多肽變體的所需氨基酸序列,并且可以合成地產生編碼該氨基酸序列變體的核酸序列。
可以修飾母體多肽的氨基酸序列,從而產生這樣的ABM,所述ABM具有修飾的重鏈V區域和/或修飾的CH1區域,和/或修飾的輕鏈V區域和/或修飾的CL區域,當修飾的ABM與靶抗原復合(例如,結合)時,其具有改變的誘導靶抗原細胞信號傳導活性的能力。細胞信號傳導活性可以是激動劑活性或拮抗劑活性。按照本發明的一個方面,修飾的抗原結合分子當其與細胞膜結合受體結合,并起始細胞信號傳導途徑時,誘導激動劑活性。在特定的實施方案中,細胞信號傳導途徑是程序性細胞死亡途徑。在另一個實施方案中,細胞信號傳導途徑是細胞分化途徑。按照本發明的另一個方面,由修飾的抗原結合分子引起的拮抗劑活性發生在,例如,當ABM與細胞膜結合受體結合,并且阻止細胞信號傳導途徑的誘導或中斷正在進行的信號傳導時。拮抗劑活性可以通過,例如,阻斷內源配體的結合和后繼的信號轉導,和/或通過阻止受體或其他對誘導細胞信號傳導途徑必要的分子的交聯或低聚作用獲得。在一個實施方案中,受抑制或中斷的細胞信號傳導途徑是細胞生長途徑。在另一個實施方案中,受抑制或中斷的細胞信號傳導途徑是細胞分裂途徑。在另一個實施方案中,受抑制或中斷的細胞信號傳導途徑是細胞生存途徑。
同樣地,還可以修飾母體多肽的氨基酸序列,以產生這樣的ABM,所述ABM具有修飾的重鏈V區域或修飾的C區域(例如,修飾的CH1區域),和/或修飾的輕鏈V區域和/或修飾的CL區域,當修飾的ABM與靶抗原復合(例如,結合)時,其具有改變的介導一個或多個靶抗原交聯的能力。在一個實施方案中,與由相應的未修飾母體ABM所引起結合的靶抗原的情形相比,結合的靶抗原(例如,細胞表面受體分子)被引至彼此更加接近的狀態,和/或者形成更加適合相互作用的構象,由此增加結合的抗原之間的交聯和低聚作用。在另一個實施方案中,與由相應的未修飾母體ABM所引起的結合的靶抗原的情形相比,結合的靶抗原(例如,細胞表面受體分子)保持為彼此更加遠離的狀態,和/或更加不利于相互作用的構象中,由此降低或阻止結合的抗原之間的交聯和低聚作用。在具體的實施方案中,增加的交聯或低聚作用導致增加的程序性細胞死亡。在另一個實施方案中,增加的交聯或低聚作用導致增加的細胞分化。在另一個實施方案中,交聯或低聚作用的降低導致減少的細胞生長,減少的細胞分裂,或減少的細胞生存。
重鏈V區域或CH1區域,或輕鏈V區域或CL區域生物特性中的大量修飾可以通過選擇替換完成,所述替換在維持下列各項作用中顯著不同:(a)替換區域中多肽主鏈的結構,例如作為片層或螺旋構象,(b)靶位點處分子的電荷或疏水性,或(c)側鏈的大小。基于下列常見側鏈特性,將天然存在的殘基分類:
(1)疏水性:met,ala,val,leu,ile;
(2)中性親水性:cys,ser,thr;
(3)酸性:asp,glu;
(4)堿性:asn,gln,his,lys,arg;
(5)影響鏈方向的殘基:gly,pro;和
(6)芳香族的:trp,tyr,phe。
非保守性替換引起這些分類中一類中的成員與另一類中成員間的交換。保守性替換引起這些分類中一類中的成員與該相同種類中另一成員間的交換。
包含修飾的ABM的示范多肽
在一個方面,本發明涉及具有氨基酸修飾的抗原結合分子,其改變ABM誘導細胞信號傳導活性和/或介導抗原交聯的能力。在一個實施方案中,對ABM的修飾,與母體分子相比,包括重鏈或輕鏈可變區中至少一個構架區中的至少一個氨基酸殘基替換。在具體的實施方案中,該替換取代重鏈FR1中的氨基酸殘基。在優選的實施方案中,對ABM的修飾包括重鏈可變區中Kabat位置8,9,10,11,12,或13一個或多個處氨基酸殘基的替換。在另一個實施方案中,對ABM的修飾包括重鏈FR4中氨基酸殘基的替換。在具體的實施方案中,對ABM的修飾包括重鏈可變區中Kabat位置110或112一個或多個處氨基酸殘基的替換。在另一個實施方案中,對ABM的修飾包括輕鏈中V和C區域間界面處的至少一個氨基酸殘基替換。在更具體的實施方案中,對ABM的修飾包括Kabat位置40,80,83,105,或106的一個或多個處的氨基酸殘基的替換。
在一個實施方案中,可以通過在母體序列中產生導致氨基酸殘基中所需改變的點突變替換氨基酸。備選地,對ABM的修飾可以包括將母體分子的完整構架區取代為在特定位置包含所需氨基酸殘基的構架區。在具體的實施方案中,對ABM的修飾包括將母體分子的FR1取代為由種系可變基因序列編碼的FR1。
在本發明的另一個實施方案中,ABM至少包括CH1區域,并且ABM的修飾與母體多肽相比,包括至少一個氨基酸殘基替換。在具體的實施方案中,對ABM的修飾包括位于重鏈恒定區位置148,149和/或150處的一個或多個氨基酸殘基的替換。
在另一個方面,本發明涉及修飾的抗原結合分子,其包含母體抗原結合分子的一個或多個截短的CDRs。對于給定的CDR,該截短的CDRs應該含有,最低限度地,特異性決定氨基酸殘基。“特異性決定殘基”意指在與抗原的相互作用中直接涉及的那些殘基。一般而言,在給定CDR中僅有大約1/5?1/3的殘基參與與抗原的結合。可以通過,例如,按照Padlan等,FASEB雜志(FASEB J.)9(1):133?139(1995)中所述的方法計算來自三維模型的原子間接觸以及確定給定殘基位置處的序列可變性,鑒定特定CDR中的特異性決定殘基,將其全部內容引入本文作為參考。
因此,本發明還涉及分離的多核苷酸,其包括母體分子的至少一個互補決定區,或其至少含有所述互補決定區特異性決定殘基的變體或截短形式,其中所述分離的多核苷酸編碼融合多肽。優選地,該分離的多核苷酸編碼這樣的融合多肽,其為修飾的抗原結合分子。在一個實施方案中,多核苷酸包含母體分子的三個互補決定區,或其至少含有所述三個互補決定區中每個的特異性決定殘基的變體或截短形式。在另一個實施方案中,多核苷酸編碼嵌合(例如,人源化的)抗體輕鏈或重鏈的完整可變區。本發明進一步涉及由該多核苷酸編碼的多肽。
在另一個實施方案中,本發明涉及這樣的修飾抗原結合分子,其包含母體分子的至少一個互補決定區,或其至少含有所述互補決定區特異性決定殘基的變體或截短形式,并包含源自異源多肽的序列。在一個實施方案中,修飾的抗原結合分子包含母體分子的三個互補決定區,或其至少含有所述三個互補決定區中每個的特異性決定殘基的變體或截短形式。在另一個方面,修飾的抗原結合分子包含抗體輕鏈或重鏈的可變區。在一個特別有效的實施方案中,抗原結合分子是嵌合,例如,人源化的抗體。本發明還涉及制備所述修飾的抗原結合分子的方法,及其在疾病,包括細胞增殖病癥的治療中的應用。
已知若干機制涉及抗體的治療功效,其包括抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC),互補依賴性細胞毒性(CDC),以及生長停滯、細胞分化或程序性細胞死亡的誘導。
本發明涉及這樣的修飾ABM,其與相應的未修飾母體ABM相比,具有增強的誘導程序性細胞死亡的能力。例如,按照本發明可以修飾具有很小或無誘導程序性細胞死亡能力的母體ABM,從而產生修飾的ABM,其確實具有誘導程序性細胞死亡能力或具有增強的誘導程序性細胞死亡能力。本發明還涉及這樣的修飾ABM,其與相應的未修飾母體ABM相比,具有增強的誘導生長停滯或細胞分化的能力。例如,按照本發明可以修飾具有很小或無誘導生長停滯或細胞分化能力的母體ABM,從而產生修飾的ABM,其確實具有誘導生長停滯或細胞分化能力或具有增強的誘導生長停滯或細胞分化能力。
例如特別地,關于抗CD20抗體,大多數試驗證據顯示利妥昔單抗通過由CDC和ADCC測量的常規效應子機制起作用。相似地,顯示了不同淋巴瘤細胞對利妥昔單抗的體內抗性是它們對于體外CDC敏感性的函數。相反地,另一種已經被批準進行治療應用的抗CD20抗體,即B1的體內作用模式既不需要補體也不需要天然殺傷細胞(NK)細胞活性。更適合地,B1的體內功效歸因于其誘導有效程序性細胞死亡的能力。通常,基于它們在根除淋巴瘤細胞中的作用機制,抗體CD20單克隆抗體分成2個不同的種類。I型抗CD20抗體首先利用補體殺傷靶細胞,而II型抗體通過不同的機制進行起作用,主要是程序性細胞死亡。利妥昔單抗和1F5是I型抗CD20抗體的實例,而B1是II型抗體的實例。見,例如,Cragg,M.S.和Glennie,M.J.,血液(Blood)103(7):2738?2743(2004年4月);Teeling,J.L.等,血液(Blood)104(6):1793?1800(2004年9月),將其全部內容引入本文作為參考。
等的美國專利申請公開號2005/0123546(其全部內容被引入本文作為參考)公開了第一個已知的實例,其中將I型抗CD20抗體改造為具有增強的效應子功能,如ADCC,和產生有效的程序性細胞死亡能力,從而有效地將I型抗CD20抗體改變為II型抗CD20抗體。在一個實施方案中,本發明涉及修飾的抗CD20抗體,其與I型母體抗CD20抗體相比,在重鏈或輕鏈可變區中包含替換,其中所述替換通過修飾的抗CD20抗體導致增強的程序性細胞死亡的誘導。在另一個實施方案中,本發明涉及改造的II型抗CD20抗體,其具有作為增強的效應子功能改造結果的增強的ADCC,并且不缺失誘導程序性細胞死亡的基本能力。在一個實施方案中,II型抗CD20抗體與母體分子相比,在重鏈或輕鏈可變區中包含一個或多個氨基酸的替換。在另一個實施方案中,將I型和/或II型抗CD20抗體改造為在Fc區域中具有改變的糖基化模式。在特定的實施方案中,修飾ABM的改變的糖基化包括Fc區域中增高水平的等分復合物殘基。在另一個具體的實施方案中,修飾ABM的改變的糖基化包括Fc區域中降低水平的巖藻糖殘基。見于Shitara等的美國專利申請公開號20040093621,將其全部內容引入本文作為參考。在另一個實施方案中,I型或II型抗CD20抗體經歷了如下列文獻所講述的多肽改造,所述文獻是Presta的美國專利號6,737,056或美國專利申請公開號20040185045(Macrogenics)或美國專利申請公開號20040132101(Xencor),將其每篇的全部內容引入本文作為參考。本發明進一步涉及制備所述改造的I型或II型抗體的方法,以及在治療多種B細胞病癥,包括B細胞淋巴瘤中應用所述抗體的方法。
嵌合的和人源化的修飾ABM
描述了嵌合小鼠/人抗體。見于例如,Morrison,S.L.等,PNASI1:6851?6854(1984年11月);歐洲專利公開號173494;Boulianna,G.L,等,自然(Nature)312:642(1984年12月);Neubeiger,M.S.等,自然(Nature)314:268(1985年3月);歐洲專利公開號125023;Tan等,免疫學雜志(J.Immunol.)135:8564(1985年11月);Sun,L. K等,雜交瘤(Hybridoma)5(1):517(1986);Sahagan等,免疫學雜志(J. Immunol.)137:1066?1074(1986)。通常見于,Muron,自然(Nature)312:597(1984年12月);Dickson,遺傳工程消息(Genetic Engineering News)5(3)(1985年3月);Marx,科學(Science)229:455(1985年8月);和Morrison,科學(Science)229:1202?1207(1985年9月)。Robinson等,在PCT公開號WO/88104936中描述了具有人恒定區和鼠可變區的嵌合抗體,其具有對CD20表位的特異性;Robinson參考文獻中嵌合抗體的鼠部分源自2H7小鼠單克隆抗體(λ2b,κ)。雖然參考文獻注意到所述嵌合抗體是治療B細胞病癥的“最初候選者”,但是該陳述可以僅被看作是對本領域技術人員的建議,從而確定該建議對于該特定抗體是否準確,特別地,這是因為參考文獻缺乏支持評估治療效率的任何數據,以及重要地,利用更高級哺乳動物,如靈長類或人類的數據。
產生嵌合抗體的方法學可為本領域技術人員所用。例如,利用,例如單獨質粒中或單一(例如多順反子性)載體上的免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈,可以單獨地表達輕鏈和重鏈。然后可以對這些純化,并體外裝配為完整的抗體;描述了用于完成該裝配的方法學。見于,例如,Scharff,M.,Harvey Lectures69:125(1974)。還描述了用于形成來自減少的分離輕鏈和重鏈的IgG抗體的體外反應參數。見于,例如,Sears等,生物化學(Biochem.)16(9):2016?25(1977)。
在特別優選的實施方案中,本發明的嵌合ABM是人源化的抗體。人源化非人抗體的方法在本領域中已知。例如,可以按照下列文獻中的方法制備本發明的人源化ABM,所述文獻是:Winter的美國專利號5,225,539,Queen等的美國專利號6,180,370,或Adair等的美國專利號6,632,927,Foote的美國專利申請公開號2003/0039649;Sato等的美國專利申請公開號2004/0044187;或Leung等的美國專利申請公開號2005/0033028,將其每篇的全部內容引入本文作為參考。優選地,人源化抗體具有被引入其中的一個或多個由非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為“引進”殘基,其典型地取自“引進”可變結構域。按照Winter和其同事的方法,通過替換人抗體相應序列的高變區序列,可以基本實現人源化作用(Jones等,自然(Nature),321:522?525(1986);Riechmann等,自然(Nature),332:323?327(1988);Verhoeyen等,科學(Science),239:1534?1536(1988))。因此,所述“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567),其中基本小于完整人可變結構域的人可變結構域被來自非人物種的相應序列所替換。實際上,人源化抗體典型地是人抗體,其中一些高變區殘基和可能的一些FR殘基被來自嚙齒動物抗體類似位點的殘基所替換。所述人源化抗CD20抗體應該包括人免疫球蛋白的恒定區。
對用于制備人源化抗體的人可變結構域,輕鏈和重鏈二者的選擇,對減少抗原性非常重要。根據所謂的“最佳匹配”方法,針對完整的已知人可變結構域序列庫對嚙齒動物抗體可變結構域序列進行篩選。接著接受與嚙齒動物序列最相近的人序列作為人源化抗體的人構架區(FR)(Sims等,J. Immunol.(免疫學雜志),151:2296(1993);Chothia等,J. Mol.Biol.(分子生物學雜志),196:901(1987))。另一種選擇人構架序列的方法是將完整嚙齒動物構架的每個單獨亞區的序列(即,FR1,FR2,FR3,和FR4)或這些單獨亞區的一些組合(例如,FR1和FR2)與對應于該構架亞區的已知人可變區序列庫(例如,由Kabat編號決定的)進行比較,并對每個亞區或組合選擇最接近于嚙齒動物序列的人序列(Leung美國專利申請公開號2003/0040606A1,2003年2月27日公開)。另一種方法使用源自輕或重鏈的特定亞組的所有人抗體的共有序列的特定構架區域。可以將相同的構架用于一些不同的人源化抗體(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院會刊),89:4285(1992);Presta等,J. Immunol.(免疫學雜志),151:2623(1993))(特此將其每個的全部內容并入本文作為參考)。
抗體經人源化保持對所述抗原高親和性和其他有利生物特性也很重要。為實現該目的,根據一種優選的方法,通過利用母體和人源化序列的三維模型分析母體序列和多種概念上人源化的產物的方法制備人源化抗體。利用本領域技術人員所熟悉的計算機程序(例如,InsightII,accelrys inc (從前的MSI),或在由Schwede等,Nucleic Acids Res.(核酸研究)2003(13):3381?3385所描述的http://swissmodel.expasy.org/)能夠生成三維免疫球蛋白模型。這些模型的檢驗容許了對該殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能的作用進行分析,即,對影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能力的殘基的分析。以這種方法,能夠從受體和引進序列中選擇和組合FR殘基,以獲得所要求的抗體特征,如對靶抗原維持的親和性。通常,該高變區殘基直接地和最主要地涉及影響抗原結合。
在另一個實施方案中,將本發明的抗原結合分子改造為具有增強的結合親和性,這是根據,例如,Balint等在美國專利申請公開號2004/0132066中所公開的方法進行的,特此將其全部內容并入本文作為參考。
在一個優選的實施方案中,本發明涉及這樣的分離的多核苷酸,其包含編碼具有表3和/或5中所示氨基酸序列的多肽的序列,見下。本發明進一步涉及這樣的分離的核酸,其包含至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同于表2和/或4中所示核苷酸序列的序列,見下。在另一個實施方案中,本發明涉及這樣的分離的核酸,該核酸包含編碼這樣的多肽的序列,所述多肽具有與表3和/或5中氨基酸序列至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同的氨基酸序列,見下。本發明還涵蓋這樣的分離的核酸,該核酸包含編碼具有表3和/或5中任意構建體氨基酸序列的多肽的序列,所述多肽具有保守氨基酸替換。在某些實施方案中,可以將表2?5中的任意多核苷酸或多肽排除在外。因此,例如,在某些實施方案中,修飾的ABM,和/或編碼該修飾ABM的多核苷酸不包含任意或全部SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ IDNO:37,或SEQ ID NO:38。在另一個實施例中,在某些實施方案中,本發明修飾的ABM不包含任意或全部的SEQ ID NOs:55?62。
在另一個實施方案中,本發明涉及這樣的分離的多肽,其包含表3和/或5中所示的氨基酸序列,見下。本發明進一步涉及這樣的分離的多肽,其包含由表2和/或4中所示的核苷酸序列所編碼的序列,見下。在另一個實施方案中,本發明涉及這樣的分離的多肽,其包含至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同于表3和/或5中所示氨基酸序列的氨基酸序列,見下。本發明還涵蓋這樣的分離的多肽,其包含表3和/或5中任意構建體的氨基酸序列,所述多肽具有保守的氨基酸替換。在某些實施方案中,可以將表2?5中的任意多核苷酸或多肽排除在外。因此,例如,在某些實施方案中,多肽不包含與下列任意或全部序列對應的或由其編碼的氨基酸序列,所述序列是SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:35,SEQ IDNO:36,SEQ ID NO:37,或SEQ ID NO:38。在另一個實施例中,在某些實施方案中,本發明修飾的ABM不包含任意或全部的SEQ ID NOs:55?62。表2





表3




表4

表5

在另一個特別的實施方案中,本發明涉及這樣的分離的多核苷酸,該多核苷酸包含編碼具有這樣的氨基酸序列的多肽的序列,所述氨基酸序列源自圖1和表6中所示的母體序列,并且該多核苷酸在至少一個重鏈FR區域中包含至少一個氨基酸替換。在另一個實施方案中,本發明涉及這樣的分離的多肽,其包含源自圖1和表6中所示的母體序列的氨基酸序列,并且在至少一個重鏈FR區域中包含至少一個氨基酸替換。
表6


在一個方面,本發明修飾的ABM與母體ABM相比,可以包含完整構架區的替換。因此,例如,本發明進一步涉及這樣的分離的多核苷酸,其包含編碼這樣的多肽的序列,所述多肽具有至少一個源自人種系VH序列的重鏈FR。在優選的實施方案中,FR1區域中,或Kabat位置8?13處的人VH種系序列源自表7中所鑒定的任意一個序列,見下。可以從IMGT數據庫(http://imgt.cines.fr:8104/textes/IMGTrepertoire)獲得這些序列,并且將每個通過其登記號識別的序列的全部內容清楚地引入本文作為參考。
表7


在另一個實施方案中,本發明涉及這樣的分離的多核苷酸,其包含編碼這樣的多肽的序列,所述多肽包含按照下表8中所出現的任意一個序列,位于重鏈可變區Kabat位置8?13處的氨基酸序列,或其任何子集(例如,位置9?12,位置10?12,等)的氨基酸序列。在另一個實施方案中,本發明涉及這樣的分離的多肽,其包含按照下表8中所出現的任意一個序列,位于Kabat位置8?13處的氨基酸序列,或其子集(例如,位置9?12,位置10?12,等)的氨基酸序列。
表8
氨基酸序列SEQIDNOGAEVKK63GPTLVK64GPVLVK65GPALVK66GGGLVQ67GGGLVK68
氨基酸序列SEQ ID NOGGGLVE69GGGVVR70GGGVVQ71GGVVVQ72GGGLIQ73RGVLVQ74GPGLVK75GSGLVK76GAGLLK77GSELKK78GHEVKQ79GAELKK101GAEVVK102GGEVKK103GAGVKK104GGGVVK105
在另一個實施方案中,本發明涉及這樣的分離的多核苷酸,其包含編碼這樣的多肽的序列,所述多肽包含位于重鏈可變區Kabat位置108?113的氨基酸序列,或其子集(例如,位置110?112,位置110和112,等)的氨基酸序列。在特定的實施方案中,位于位置108?113的序列如下表9中所示。在另一個實施方案中,本發明涉及這樣的分離的多肽,其包含按照下表9中所出現的任意一個序列,位于Kabat位置108?113的氨基酸序列,或其子集(例如,位置110?112,位置110和112,等)的氨基酸序列。
表9
氨基酸序列SEQIDNOLVTVSS106LVIVSS107LVTVIS108LVIVIS109LVGVSS110LVTVGS111LVGVGS112LVAVSS113LVTVAS114LVAVAS115LVVVSS116
氨基酸序列SEQIDNOLVTVVS117LVVVVS118LVLVSS119LVTVLS120LVLVLS121LVSVSS122LVTVTS123
在另一個實施方案中,本發明涉及表達載體和/或宿主細胞,其包括一個或多個本發明的分離的多核苷酸。
一般而言,任何類型的培養的細胞系可以用于表達本發明的ABM。在一個優選的實施方案中,將CHO細胞,HEK293?EBNA細胞,BHK細胞,NS0細胞,SP2/0細胞,YO骨髓瘤細胞,P3X63小鼠骨髓瘤細胞,PER細胞,PER.C6細胞或雜交瘤細胞,其它哺乳動物細胞,酵母細胞,昆蟲細胞,或植物細胞用作背景細胞系以產生本發明的被改造的宿主細胞。
進一步包含Fc區域和Fc區域變體的修飾的ABM
在一個實施方案中,本發明的在重鏈V和/或CH1區域和/或輕鏈V和/或C區域中包含一個或多個氨基酸替換的ABM可以進一步包含人Fc區域。在特定的實施方案中,人恒定區是IgG1,如SEQ ID Nos80和81所示,并且顯示如下:
IgG1核苷酸序列(SEQ ID NO:80)
ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTC
TGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAAC
CGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACC
TTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTG
ACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAA
TCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCAAATCT
TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGG
GGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGA
TCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAA
GACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAA
TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG
GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTA
CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA
TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCC
CCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGT
CAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG
GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAG
CAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCA
CTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
IgG1氨基酸序列(SEQ ID NO:81)
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTIMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL
PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE
SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTQKSLSLSPGK
然而,該人Fc區域的變體和同種型也涵蓋于本發明中。例如,適合用于本發明的變體Fc區域能夠根據以下文獻所教導的方法產生,這些文獻包括Presta的美國專利號6,737,056(具有由于一個或多個氨基酸修飾所改變的效應子功能的Fc區域變體);或美國專利申請號60/439,498;60/456,041;60/514,549;或WO2004/063351(具有由于氨基酸修飾增加結合親和性的變體Fc區域);或美國專利申請號10/672,280或WO2004/099249(由于氨基酸修飾改變了對FcγR的結合的Fc變體),并將其每個的全部內容并入本文作為參考。
在本發明的另一個方面,在重鏈V和/或CH1區域和/或輕鏈V和/或C區域中包含一個或多個氨基酸替換的ABM可以進一步包含Fc區域變體。可以改造Fc區域,從而產生這樣的變體,其具有改變的對一種或多種FcRs結合的親和性。可以,例如,修飾Fc區域中的一個或多個氨基酸殘基,從而改變(例如,增強或減弱)與FcR的結合,如美國臨時專利申請號60/678,776所述,將其全部內容引入本文作為參考。通常,在通過影響FcR結合所鑒定的一個或多個Fc區域殘基處進行氨基酸的替換,從而產生所述Fc區域變體,在優選的實施方案,缺失或替換不超過1到約10個Fc區域殘基。本文中包含一個或多個氨基酸修飾(例如,替換)的Fc區域優選地保持至少約80%,優選地至少約90%,和最優選地至少約95%的母體Fc區域序列或天然序列人Fc區域。
還可制備氨基酸插入修飾的Fc區域,該變體具有改變的效應子功能。例如,可在鄰近一個或多個本文所確定影響FcR結合的Fc區域位置處引入至少一個氨基酸殘基(例如,一到兩個氨基酸殘基,且通常不超過10個殘基)。鄰近指在本文所鑒定的Fc區域殘基的一到兩個氨基酸殘基內。這樣的Fc區域變體可表現出增加的或減低的FcR結合和/或效應子功能。為了產生這樣的插入變體,可評估多肽的共晶體結構,從而合理地設計表現,例如提高的FcR結合能力的,修飾的Fc區域,所述多肽包含FcR結合區域(例如,目標FcR的細胞外結構域)和將氨基酸殘基插入其中的Fc區域(參見,例如,Sondermann等,自然(Nature)406:267(2000);Deisenhofer,生物化學(Biochemistry)20(9):2361?2370(1981);和Burmeister等,自然(Nature)3442:379?383,(1994),將其全部并入本文作為參考)。
通過在母體Fc區域中引入適合的氨基酸序列修飾,能夠產生變體Fc區域,該Fc區域(a)在人效應細胞存在下,或多或少有效地介導一種或多種效應子功能,和/或(b)與母體多肽相比,以更好的親和性與Fcγ受體(FcγR)或Fc新生兒受體(FcRn)結合。這些修飾的Fc區域通常會包含Fc區域中的至少一個氨基酸修飾。
在優選的實施方案中,母體多肽Fc區域是人Fc區域,例如,天然人Fc區域人IgG1(A和非A同種異型),IgG2,IgG3,IgG4,和在任意物種Fc區域中已知或已發現的所有同種異型。這些區域具有如美國臨時專利申請號60/678,776中所公開那些的序列,將其全部內容引入本文作為參考。
在某些實施方案中,為了產生這樣的ABM,母體多肽優選地具有預先存在的ADCC活性(例如,母體多肽包含人IgG1或人IgG3Fc區域),所述ABM在重鏈V和/或CH1區域和/或輕鏈V和/或C區域中包含一個或多個氨基酸替換,并且進一步包含具有改良的效應子功能(例如,ADCC)的修飾Fc區域。在一些實施方案中,具有改良ADCC的修飾Fc區域比具有天然序列IgG1或IgG3Fc區域的抗體,明顯更加有效地介導ADCC。
在特定的實施方案中,將氨基酸修飾引入到母體Fc區域的CH2結構域中。
可對本發明具有修飾的Fc區域的多肽進行一個或多個另外的修飾,這依賴于對該多肽所要求的或所意欲的用途。這些修飾可包括,例如,氨基酸序列的進一步改變(氨基酸殘基的替換、插入和/或缺失),與異源多肽的融合和/或共價修飾。這些進一步的修飾可在如上公開的導致Fc受體結合和/或效應子功能改變的氨基酸修飾之前、同時或之后進行。
備選地或另外地,氨基酸修飾與一個或多個改變Fc區域的Clq結合和/或補體依賴性細胞毒性功能的另外的氨基酸修飾的組合可以是有用的。本文中在這點上特別引起興趣的起始多肽是與Clq結合且顯示補體依賴性細胞毒性(CDC)的多肽。本文描述的氨基酸替換可用于改變該起始多肽結合Clq的能力和/或修飾其補體依賴性細胞毒性功能(例如,降低和優選地消除這些效應子功能)。然而,本文意欲這樣的多肽,該多肽包含在一個或多個已述位置的替換且具有提高的Clq結合和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)功能。例如,該起始多肽可能不能與Clq結合和/或介導CDC,且可根據本文所教導的內容對其進行修飾,從而使其獲得這些另外的效應子功能。此外,可對具有預先存在的Clq結合活性,任選地還具有介導CDC能力的多肽進行修飾,從而增強這兩種活性之一或全部。描述了改變Clq和/或修飾其補體依賴性細胞毒性功能的氨基酸修飾,例如,在WO00/42072中,特此將其并入本文作為參考。
如上所公開,能夠設計具有改變的效應子功能的Fc區域或其部分,例如,通過修飾Clq結合和/或FcR結合,并由此改變CDC活性和/或ADCC活性。例如,能夠產生具有提高的Clq結合和提高的FcγRIII結合的修飾的Fc區域(例如,具有提高的ADCC活性和提高的CDC活性)。或者,當要求降低或消除效應子功能時,可改造具有降低的CDC活性和/或降低的ADCC活性的修飾的Fc區域。在其他實施方案中,可僅增加這些活性中的一種,并任選地也降低其他活性,例如,為產生具有提高的ADCC活性但降低的CDC活性的修飾的Fc區域且反之亦然。
另一類型的氨基酸替換用于改變多肽的糖基化模式。這可以,例如,通過缺失一個或多個該多肽中存在的碳水化合物部分,和/或增加一個或多個該多肽中不存在的糖基化位點,來完成。多肽的糖基化典型地是N?連接的或O?連接的。N?連接的指碳水化合物部分與天冬酰胺殘基側鏈的連接。肽序列天冬酰胺?X?絲氨酸和天冬酰胺?X?蘇氨酸是碳水化合物部分與天冬酰胺側鏈酶促連接的識別序列,其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸。因而,多肽中這些肽序列任意之一的存在造成潛在的糖基化位點。O?連接糖基化指糖N?乙酰基半乳糖胺(N?aceylgalactosamine)、半乳糖或木糖中的一種與羥基氨基酸的連接,所述羥基氨基酸最常見的是絲氨酸或蘇氨酸,盡管也可使用5?羥脯氨酸或5?羥賴氨酸。
在一些實施方案中,本發明提供這樣的組合物,所述組合物包含具有Fc區域的母體多肽的修飾,其中該修飾的Fc區域包括至少一個表面殘基氨基酸修飾(參見,例如,Deisenhofer,生物化學(Biochemistry),28,20(9):2361?70,1981年4月,和WO00/42072,特此將其二者都并入本文作為參考)。在其他實施方案中,本發明提供這樣的組合物,其中所述組合物包含具有Fc區域的母體多肽的修飾,其中該修飾的Fc區域包括至少一個非表面殘基氨基酸修飾。在其它的實施方案中,本發明包括具有Fc區域的母體多肽的變體,其中所述變體包括至少一個表面氨基酸修飾和至少一個非表面氨基酸修飾。
本發明修飾的ABM的治療功效可以進一步通過它們在這樣的宿主細胞中的產生得以提高,所述宿主細胞經糖改造具有至少一種糖蛋白修飾的糖基轉移酶的改變的表達。在一個實施方案中,糖改造的宿主細胞進一步表達下列各項中的一項或多項:編碼具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸,編碼具有ManII活性的多肽的多核苷酸,或編碼具有GaIT活性的多肽的多核苷酸。在優選的實施方案中,宿主細胞表達編碼具有GnTIII活性或ManII活性的多肽的多核苷酸。在另一個優選的實施方案中,宿主細胞表達編碼具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸,以及編碼具有ManII活性多肽的多核苷酸。在再一個優選的實施方案中,具有GnTIII活性的多肽是融合多肽,其包含高爾基體定居多肽的高爾基體定位結構域。在另一個優選的實施方案中,本發明修飾的ABM在宿主細胞中的表達導致具有增加的Fc受體結合親和性以及增強的效應子功能的修飾ABM,其中所述宿主細胞表達編碼具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸。因此,在一個實施方案中,本發明涉及這樣的宿主細胞,所述宿主細胞包括(a)包括編碼具有GnTIII活性的多肽的序列的分離的核酸;和(b)編碼本發明的ABM的分離的多核苷酸,所述ABM諸如與人CD20結合的嵌合,靈長類化或人源化抗體。在優選的實施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包括GnTIII的催化結構域的融合多肽,并且該高爾基體定位結構域是甘露糖苷酶II的定位結構域。產生這樣的融合多肽的方法和使用它們產生具有增加的效應子功能的抗體的方法公開于美國臨時專利申請號60/495,142和美國專利申請公開號2004/0241817中,將其每個的全部內容特別并入本文作為參考。在另一個優選的實施方案中,嵌合的ABM是這樣的嵌合抗體或其片段,其具有鼠B?Ly1抗體的結合特異性。在特別優選的實施方案中,嵌合抗體包括人Fc。在另一個優選的實施方案中,該抗體被靈長類化或人源化。
在一個實施方案中,一個或多個編碼本發明的ABM的多核苷酸可以在組成型啟動子或備選地調節表達系統的控制下進行表達。適合的調節表達系統包括,但不限于,四環素調節的表達系統,可蛻皮素誘導的表達系統,lac?轉換表達系統,可糖皮質激素誘導的表達系統,可溫度誘導的啟動子系統,和金屬硫蛋白金屬可誘導表達系統。如果編碼本發明的ABM的一些不同核酸被包括在宿主細胞系統中,它們中的一些可以在組成型啟動子的控制下進行表達,而其它的可以在調節啟動子的控制下進行表達。認為最大表達水平是穩定的多肽表達的最高可能水平,其對細胞生長速率不具有顯著的不利影響,并且將使用常規實驗進行測定。表達水平通過本領域通常了解的方法進行確定,所述方法包括使用特異于ABM的抗體或特異于融合ABM的肽標簽的抗體進行的蛋白質印跡分析;和RNA印跡分析。在另外的備選中,多核苷酸可以操作性地連接于報道基因;基本具有與母體抗體相同結合特異性的修飾ABM的表達水平通過測量與報道基因的表達水平相關的信號來進行確定。報道基因可以與編碼所述融合多肽的核酸一起被轉錄為單個mRNA分子;它們各自的編碼序列可以通過內部核糖體進入位點(IRES)或通過不依賴帽的翻譯增強子(CITE)進行連接。該報道基因可以與至少一個編碼這樣的修飾ABM的核酸一起翻譯從而形成單一的多肽鏈,所述修飾的ABM基本具有與母體抗體相同的結合特異性。編碼本發明的ABMs的核酸可以在單一啟動子控制下操作性地連接于報道基因從而使編碼融合多肽的核酸和報道基因轉錄到RNA分子中,所述RNA分子交錯地被剪接成兩個單獨的信使RNA(mRNA)分子;得到的mRNAs之一翻譯成所述報道蛋白質,而另一個被翻譯成所述融合多肽。
修飾的ABM的表達
本領域那些技術人員眾所周知的方法可以用于構建表達載體,所述表達載體包含這樣的修飾ABM的編碼序列以及適合的轉錄/翻譯控制信號,所述修飾的ABM基本具有與母體抗體相同的結合特異性。這些方法包括體外重組DNA技術,合成技術和體內重組/遺傳重組。參見,例如,描述在Maniatis等,分子克隆實驗手冊(Molecular Cloning A Laboratory Manual),冷泉港實驗室,紐約(Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.)(1989)和Ausubel等,現代分子生物學手冊(Current Protocols in Molecular Biology),Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中的技術。
多種宿主表達載體系統可以用于表達本發明的ABMs的編碼序列。優選地,將哺乳動物細胞用作用重組質粒DNA或黏粒DNA表達載體轉染的宿主細胞系統,所述重組質粒DNA或黏粒DNA表達載體包含目標蛋白質的編碼序列和融合多肽的編碼序列。最優選地,將CHO細胞,HEK293?EBNA細胞,BHK細胞,NS0細胞,SP2/0細胞,YO骨髓瘤細胞,P3X63小鼠骨髓瘤細胞,PER細胞,PER.C6細胞或雜交瘤細胞,其它哺乳動物細胞,酵母細胞,昆蟲細胞,或植物細胞用作宿主細胞系統。表達系統和選擇方法的一些實例描述在下列參考文獻,及其引用的參考文獻中:Borth等,生物技術生物工程(Biotechnol.Bioen.)71(4):266?73(2000?2001),在Werner等,Arzneimittelforschung/Drug Res.48(8):870?80(1998)中,在Andersen和Krummen,現代生物技術觀點(Curr.Op.Biotechnol.)(13:117?123(2002)中,在Chadd和Chamow,現代生物技術觀點(Curr.Op.Biotechnol.)12:188?194(2001)中,和在Giddings,現代生物技術觀點(Curr.Op.Biotechnol.)12:450?454(2001)中。在備選的實施方案中,可以預期其它的真核生物宿主細胞系統,包括用重組酵母表達載體轉化的酵母細胞,所述表達載體包含本發明的ABM的編碼序列,如美國專利申請號60/344,169和WO03/056914(在非人真核宿主細胞中產生人樣糖蛋白的方法)中所教導的表達系統(將其每個的全部內容并入本文作為參考);用重組病毒表達載體(例如,桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統,所述病毒表達載體包含這樣的修飾ABM的編碼序列,所述修飾的ABM基本具有與母體抗體相同的結合特異性;用重組的病毒表達載體(例如,花椰菜花葉病毒,CaMV;煙草花葉病毒,TMV)感染的植物細胞系統或用包含本發明的ABM的編碼序列的重組質粒表達載體(例如,Ti質粒)轉化的植物細胞系統,包含但不限于美國專利號6,815,184(從經遺傳改造的浮萍(duckweed)表達和分泌生物學活性多肽的方法)中所教導的表達系統;WO2004/057002(通過引入糖基轉移酶基因在苔蘚類植物細胞中產生糖基化蛋白質)和WO2004/024927(在蘚類原生質體中產生胞外異源非植物蛋白質的方法)中所教導的表達系統;和美國專利申請號60/365,769,60/368,047,和WO2003/078614(在包含功能性哺乳動物GnTIII酶的轉基因植物中的糖蛋白加工)中所教導的表達系統(特此將其每個的全部內容并入本文作為參考);或用重組病毒表達載體(例如,腺病毒,痘苗病毒)感染的動物細胞系統,其包括被改造從而包含編碼這樣的修飾ABM的DNA的多個拷貝的細胞系,所述修飾的ABM基本具有與母體抗體相同的結合特異性,所述DNA的多個拷貝穩定擴增(CHO/dhfr)或在雙微染色體(例如,鼠細胞系)中不穩定擴增。在一個實施方案中,包含編碼本發明的ABM的多核苷酸的載體是多順反子的。此外,在一個實施方案中,上面討論的ABM是抗體或其片段。在一個優選的實施方案中,該ABM是人源化的抗體。
對于本發明的方法而言,穩定的表達通常優選進行瞬時表達,因為其典型地獲得更可再現的結果并且對于大規模生產也是更易于控制的。優于使用包含病毒的復制起點的表達載體,宿主細胞可以用受適合的表達控制元件(例如,啟動子,增強子,序列,轉錄終止子,聚腺苷酸化位點等)控制的各自的編碼核酸,和可選擇的標志物轉化。在引入外源DNA后,被改造的細胞可以容許在富集培養基中生長1?2天,并接著轉到選擇性培養基中。在重組質粒中的可選擇標志物賦予對于選擇的抗性并容許細胞的選擇,所述細胞將質粒穩定地整合到它們的染色體中并生長形成轉化灶,其又可以克隆和擴增到細胞系中。
可以使用許多選擇系統,包括,但不限于,單純皰疹病毒的胸苷激酶(Wigler等,細胞(Cell)11:223(1977)),次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska&Szybalski,美國國家科學院會刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:2026(1962)),和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等,細胞(Cell)22:817(1980))基因,它們分別可以用在tk?,hgprt?或aprt?細胞中。此外,抗代謝物抗性可以用作對于下列的選擇的基礎:賦予針對甲氨蝶呤的抗性的dhfr基因(Wigler等,美國國家科學院會刊(Natl.Acad.Sci.USA)77:3567(1989);O′Hare等,美國國家科學院會刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78:1527(1981));賦予針對霉酚酸的抗性的gpt基因(Mulligan&Berg,美國國家科學院會刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78:2072(1981));賦予針對氨基糖苷G?418的抗性的neo基因(Colberre?Garapin等,分子生物學雜志(J. Mol.Biol.)150:1(1981));和賦予針對潮霉素的抗性的hygro基因(Santerre等,基因(Gene)30:147(1984)。近期,已經描述了另外的可選擇基因,即容許細胞使用吲哚取代色氨酸的trpB基因;容許細胞使用組氨醇取代組氨酸的hisD基因(Hartman&Mulligan,美國國家科學院會刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:8047(1988));谷氨酰胺合成酶系統;和賦予針對鳥氨酸脫羧酶抑制劑,2?(二氟甲基)?DL?鳥氨酸,DFMO的抗性的ODC(鳥氨酸脫羧酶)(McConlogue,在分子生物學的當前交流(Current Communications in Molecular Biology),冷泉港實驗室版本(1987)中)。
表達包含具有改變的糖基化的Fc區域的修飾ABM
在另一個方面,本發明還涉及修飾由宿主細胞產生這樣的修飾ABMs的糖基化模式的方法,所述修飾的ABMs在V或CH1區域中包含至少一個氨基酸替換,所述方法包括在所述宿主細胞中表達編碼本發明修飾的ABM的核酸和編碼具有GnTIII活性的多肽的核酸或包括這些核酸的載體。優選地,修飾的多肽是IgG或其片段,所述IgG或其片段包含Fc區域。在特別優選的實施方案中,該ABM是人源化的抗體或其片段。在另一個實施方案中,改造該宿主細胞以使其共表達本發明的ABM,GnTIII和甘露糖苷酶II(ManII)。
由本發明的宿主細胞產生的被修飾的ABMs作為修飾的結果,顯示增加的Fc受體結合親和性和/或增加的效應子功能。在特別優選的實施方案中,該修飾的ABM是包含Fc區域的人源化的抗體或其片段。優選地,增加的Fc受體結合親和性是與Fcγ激活受體,諸如FcγRIIIa受體的增加的結合。增加的效應子功能優選地是下列的一個或多個的增加:增加的抗體依賴性細胞毒性,增加的抗體依賴性細胞的吞噬作用(ADCP),增加的細胞因子分泌,增加的免疫復合體介導的抗原呈遞細胞對抗原的吸收,增加的Fc?介導的細胞的細胞毒性,增加的與NK細胞的結合,增加的與巨噬細胞的結合,增加的與多形核細胞(PMNs)的結合,增加的與單核細胞的結合,增加的靶結合抗體的交聯,增加的定向信號傳導誘導的程序性細胞調亡,增加的樹突細胞成熟,和增加的T細胞引發。
效應子功能可以通過多種本領域技術人員已知的測定進行測量和/或確定。在美國申請公開號2004/0241817A1描述了多種用于測量效應子功能的測定,其包括Fc受體結合親和性和補體依賴性細胞毒性,將其全部內容引入本文作為參考。可以測量細胞因子的分泌,例如,利用夾心式ELISA,參見,例如,McRae等,免疫學雜志(J.Immunol.)164:23?28(2000)和可獲自www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols的細胞因子夾心式ELISA方案,或通過在Takahashi等,英國藥理學雜志(British J.Pharmacol.)137:315?322(2002)中描述的方法,將其每篇的全部內容引入本文作為參考。樹突細胞成熟,例如,可以利用Kalergis和Ravetch,試驗醫學雜志(J.Exp.Med.)195:1653?59(2002)中所述的測定對其進行確定,將其全部內容引入本文作為參考。吞噬作用和抗原吸收/呈遞測定的實例可以由Gresham等,試驗醫學雜志(J.Exp.Med.)191:515?28(2000);Krauss等,免疫學雜志(J.Immunol.)153:1769?77(1994);和Rafiq等,臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)110:71?79(2002),和Hamano等,免疫學雜志(J.Immunol.)164:6113?19(2000)提供,將其每篇的全部內容引入本文作為參考。可以測量細胞表面受體的下調,例如,通過Liao等,血液(Blood)83:2294?2304(1994)中所述的方法進行,將其全部內容引入本文作為參考。一般的方法,方案和測定,可參見細胞生物學:實驗室手冊(Cell Biology:A Laboratory Handbook),Celis,J.E.版本(第2版,1998),將其全部內容引入本文作為參考。使以上參考的方法,方案和測定適合于在本發明中使用在本領域技術人員的技術范圍中。
本發明還涉及在宿主細胞中產生具有修飾的寡糖的本發明的ABM的方法,所述方法包括(a)在容許按照本發明的ABM產生的條件下,培養經改造而表達至少一個編碼具有GnTIII活性的多肽的核酸的宿主細胞,其中具有GnTIII活性的所述多肽以一定量來進行表達,所述量足以修飾在由所述宿主細胞產生的所述ABM的Fc區域中的寡糖;和(b)分離所述ABM。在一個優選的實施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包括GnTIII的催化結構域的融合多肽。在特別優選的實施方案中,該融合多肽還包括高爾基體定居多肽的高爾基體定位結構域。
優選地,高爾基體定位結構域是甘露糖苷酶II或GnTI的定位結構域。或者,高爾基體定位結構域選自由下列各項組成的組:甘露糖苷酶I的定位結構域,GnTII的定位結構域,和α1?6核心巖藻糖基轉移酶的定位結構域。由本發明的方法產生的ABMs具有增加的Fc受體結合親和性和/或增加的效應子功能。優選地,增加的效應子功能是下列的一個或多個:增加的Fc?介導的細胞毒性(包括增加的抗體依賴性細胞毒性),增加的抗體依賴性細胞的吞噬作用(ADCP),增加的細胞因子分泌,增加的免疫復合體介導的抗原呈遞細胞對抗原的吸收,增加的與NK細胞的結合,增加的與巨噬細胞的結合,增加的與單核細胞的結合,增加的與多形核細胞的結合,增加的定向信號傳導誘導的程序性細胞死亡,增加的靶結合抗體的交聯,增加的樹突細胞成熟,或增加的T細胞引發。優選地,增加的Fc受體結合親和性是增加的與Fc激活受體,諸如FcγRIIIa的結合。在特別優選的實施方案中,該ABM是人源化抗體或其片段。
在另一個實施方案中,本發明涉及由本發明方法所產生的基本具有與母體抗體相同結合特異性的修飾ABM,其在所述多肽的Fc區域中具有增加比例的等分寡糖。意欲這樣的ABM涵蓋包括Fc區域的抗體和其片段。在優選的實施方案中,該ABM是人源化抗體。在一個實施方案中,在ABM的Fc區域中的等分的寡糖的百分比是總寡糖的至少50%,更優選地,至少60%,至少70%,至少80%,或至少90%,并且最優選地是至少90?95%。在另一個實施方案中,通過本發明的方法產生的ABM作為其通過本發明的方法修飾其寡糖的結果在Fc區域中具有增加比例的非巖藻糖基化寡糖。在一個實施方案中,非巖藻糖基化寡糖的百分比是至少50%,優選地,至少60%到70%,最優選地至少75%。非巖藻糖基化的寡糖可以是雜合的或復合的類型。在特別優選的實施方案中,由宿主細胞和本發明的方法產生的ABM在Fc區域中具有增加比例的等分的,非巖藻糖基化的寡糖。該等分的,非巖藻糖基化的寡糖可以是雜合的或復合的。具體而言,本發明的方法可以用于產生ABMs,其中在ABM的Fc區域中的至少15%,更優選地至少20%,更優選地至少25%,更優選地至少30%,更優選地至少35%的寡糖是等分的,非巖藻糖基化的。本發明的方法還可以用于產生多肽,其中在多肽的Fc區域中的至少15%,更優選地至少20%,更優選地至少25%,更優選地至少30%,更優選地至少35%的寡糖是等分的雜合非巖藻糖基化的。
在另一個實施方案中,本發明涉及通過本發明的方法所產生的基本具有與母體抗體相同結合特異性的修飾ABM,其經改造而具有增加的效應子功能和/或增加的Fc受體結合親和性。優選地,增加的效應子功能是下列的一個或多個:增加的Fc?介導的細胞的細胞毒性(包括增加的抗體依賴性細胞毒性),增加的抗體依賴性細胞的吞噬作用(ADCP),增加的細胞因子分泌,增加的免疫復合體介導的抗原呈遞細胞對抗原的吸收,增加的與NK細胞的結合,增加的與巨噬細胞的結合,增加的與單核細胞的結合,增加的與多形核細胞的結合,增加的定向信號傳導誘導的程序性細胞死亡,增加的靶結合抗體的交聯,增加的樹突細胞成熟,或增加的T細胞引發。在優選的實施方案中,增加的Fc受體結合親和性是與Fc激活受體,最優選地,FcγRIIIa的增加的結合。在一個實施方案中,該修飾的ABM是包含Fc區域的抗體,抗體片段,或包括等價于免疫球蛋白的Fc區域的區域的融合蛋白。在特別優選的實施方案中,該ABM是人源化抗體。
包含修飾的ABM的藥物組合物
本發明還涉及藥物組合物,其包括本發明的修飾的ABMs和藥用載體。
可以使用任何常規載體材料。該載體材料可以是適合eteral、經皮或胃腸外施藥的有機或無機材料。適合的載體包括水、明膠、阿拉伯樹膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石、植物油、聚亞烷基二醇、礦脂等。此外,該藥物制劑可含有其他藥物活性劑。可依照藥物配方可接受慣例加入額外的添加劑,如增香劑、穩定劑、乳化劑、緩沖劑等。
本文所使用的術語“藥用”指那些化合物、物質、組合物和/或劑型,它們在可靠的醫學判斷范圍內,適合用于與人和動物的組織相接觸,而不具過量毒性、刺激、變應性反應或其他問題或并發癥,并與合理的益處/危險性比率相匹配。
本發明還涉及這些用于治療或預防癌癥的藥物組合物。本發明還涉及用于治療或預防癌癥的方法,所述方法包括施用治療有效量的本發明藥物組合物。
優選地,所述癌選自由乳腺癌,膀胱癌,頭和頸部癌,皮膚癌,胰腺癌,肺癌,卵巢癌,結腸癌,前列腺癌,腎癌,和腦癌組成的組。
本發明還涉及這些用于治療或預防癌癥前期病癥或病灶的藥物組合物。本發明還涉及用于治療或預防癌癥前期病癥或病灶的方法,所述方法包括施用治療有效量的本發明藥物組合物。
優選地,所述癌癥前期病癥或病灶選自由口腔粘膜白斑病,光化性角化病(日光性角化病),結腸或直腸癌癥前期息肉,胃上皮發育不良,腺瘤發育不良,遺傳性非息肉性結腸癌綜合征(HNPCC),巴雷特食道,膀胱發育不良,和癌癥前期宮頸病癥組成的組。
本發明還提供產生和使用宿主細胞系統用于產生本發明的修飾ABMs的糖形的方法,所述修飾的ABM具有增加的Fc受體結合親和性,優選地增加的與Fc激活受體的結合,和/或具有增加的效應子功能,所述效應子功能包括抗體依賴性細胞毒性。可以用于本發明的修飾ABMs的糖改造方法詳細描述于美國專利號6,602,684,和臨時美國專利申請號60/441,307和WO2004/065540中,將其每個的全部內容并入本文作為參考。或者,本發明的修飾的ABMs可以進行糖改造從而在Fc區域中具有減少的巖藻糖殘基,所述糖改造按照公布于EP1176195A1中的技術進行,將其全部內容并入本文作為參考。
產生用于制備具有改變的糖基化模式的修飾ABM的細胞系
本發明提供宿主細胞表達系統,其用于產生具有修飾的Fc糖基化模式的本發明修飾的ABMs。特別地,本發明提供宿主細胞系統,其用于產生具有提高的治療價值的本發明修飾的ABMs的糖形。因此,本發明提供被選擇或被改造以用于表達具有GnTIII活性的多肽的宿主細胞表達系統。在一個實施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包括異源高爾基體定居多肽的高爾基體定位結構域的融合多肽。具體而言,這樣的宿主細胞表達系統可以進行改造從而包括編碼具有GnTIII的多肽的重組核酸分子,其操作性地連接于組成型或調節性啟動子系統。
在一個具體實施方案中,本發明提供宿主細胞,其已經改造而表達至少一個編碼融合多肽的核酸,所述融合多肽具有GnTIII活性并包括異源高爾基體定居多肽的高爾基體定位結構域。在一個方面,宿主細胞經改造具有核酸分子,所述核酸分子包括至少一個編碼融合多肽的基因,所述融合多肽具有GnTIII活性并包括異源高爾基體定居多肽的高爾基體定位結構域。
一般而言,任何類型的培養的細胞系,包括上述討論的細胞系,可以用作背景來改造本發明的宿主細胞系。在一個優選的實施方案中,將CHO細胞,BHK細胞,NS0細胞,SP2/0細胞,YO骨髓瘤細胞,P3X63小鼠骨髓瘤細胞,PER細胞,PER.C6細胞或雜交瘤細胞,其它哺乳動物細胞,酵母細胞,昆蟲細胞,或植物細胞用作背景細胞系以產生本發明的改造的宿主細胞。
本發明意欲涵蓋任何改造的宿主細胞,其表達具有GnTIII活性的多肽,包括包含如本文定義的異源高爾基體定居多肽的高爾基體定位結構域的融合多肽。
一個或數個編碼具有GnTIII活性的多肽的核酸可以在組成型啟動子,或備選地,調節性表達系統控制下進行表達。這些系統是本領域眾所周知的,并且包括上面討論的系統。如果編碼具有GnTIII活性并包括異源高爾基體定居多肽的高爾基體定位結構域的融合多肽的幾種不同核酸被包括在宿主細胞系統中,它們中的一些可以在組成型啟動子的控制下進行表達,而其它的在調節性啟動子的控制下進行表達。具有GnTIII活性的融合多肽的表達水平由本領域通常了解的方法所確定,所述方法包括蛋白質印跡分析,RNA印跡分析,報道基因表達分析或GnTIII活性測量。或者,可以使用結合GnTIII的生物合成產物的凝集素,例如,E4?PHA凝集素。或者,可以使用功能性測定,其測量由這樣的細胞產生的抗體介導的增加的Fc受體結合或增加的效應子功能,所述細胞用編碼具有GnTIII活性的多肽的核酸進行改造。
表達具有修飾的糖基化模式的蛋白質的轉染子或轉化體的鑒定
包含本發明修飾的ABM的編碼序列并表達生物學活性基因產物的宿主細胞可以通過至少下列四個常規方法進行鑒定;(a)DNA?DNA或DNA?RNA雜交;(b)“標志物”基因功能的存在或缺乏;(c)如通過各個mRNA轉錄物在宿主細胞中表達所測量的評估轉錄的水平;和(d)如通過免疫測定或通過其生物學活性所測量的來檢測基因產物。
在第一個方法中,本發明修飾的ABM的編碼序列和具有GnTIII活性的多肽的編碼序列的存在可以使用包含核苷酸序列的探針,通過DNA?DNA或DNA?RNA雜交來進行檢測,所述核苷酸序列與各個編碼序列,或其部分或衍生物分別具有同源性。
在第二個方法中,重組表達載體/宿主系統可以基于某些“標志物”基因功能(例如,胸苷激酶活性,對抗生素的抗性,對甲氨蝶呤的抗性,轉化表型,在桿狀病毒中的包含體形成等)的存在或缺乏來進行鑒定和選擇。例如,如果將本發明修飾的ABM的編碼序列,或其片段,和具有GnTIII活性的多肽的編碼序列插入載體的標志物基因序列中,包含各個編碼序列的重組體能夠通過標志物基因功能的缺乏而進行鑒定。或者,標志物基因可以在用于控制編碼序列的表達的相同或不同啟動子控制下與編碼序列一起串聯排列。響應于誘導或選擇的標志物的表達顯示本發明修飾的ABM的編碼序列和具有GnTIII活性的多肽的編碼序列的表達。
在第三個方法中,本發明修飾的ABM的編碼區,或其片段,和具有GnTIII活性的多肽的編碼序列的轉錄活性能夠通過雜交測定進行評估。例如,RNA可以使用探針通過RNA印跡來進行分離和分析,所述探針與本發明修飾的ABM的編碼序列,或其片段,和具有GnTIII活性的多肽的編碼序列,或其特定部分具有同源性。或者,可以對宿主細胞的總核酸進行抽提并測定與這些探針的雜交。
在第四個方法中,蛋白質產物的表達可以,例如通過蛋白質印跡法,免疫測定諸如放射免疫沉淀法,酶聯免疫測定等來進行免疫學評估。然而,表達系統成功的最終測試包括檢測生物學活性的基因產物。
產生和使用具有增加的效應子功能的修飾的ABMs,所述效應子功能包括抗體依賴性細胞毒性
在優選的實施方案中,本發明提供嵌合的修飾ABMs的糖形,所述嵌合的修飾ABMs基本具有與鼠B?Ly1抗體相同的結合特異性并具有增加的效應子功能,所述效應子功能包括抗體依賴性細胞毒性。已經在前面描述了抗體的糖基化改造。參見,例如美國專利號6,602,684,將其全部內容并入本文作為參考。
將未綴合的單克隆抗體(mAbs)用于治療一些類型的癌癥的臨床試驗最近已經產生了令人鼓舞的結果。Dillman,癌癥的生物療法和放射性藥物(Cancer Biother.&Radiopharm.)12:223?25(1997);Deo等,今日免疫(Immunology Today)18:127(1997)。一種嵌合的,未綴合的IgG1已經獲批準用于低級或濾泡性的B?細胞非霍奇金淋巴瘤。Dillman,癌癥的生物療法和放射性藥物(Cancer Biother.&Radiopharm.)12:223?25(1997),而另一種未綴合的mAb,靶向實體乳腺腫瘤的人源化IgG1已經顯示了在III期臨床試驗中的有前景的結果。Deo等,今日免疫(Immunology Today)18:127(1997)。這兩種mAbs的抗原在它們各自的腫瘤細胞中高度表達并且抗體在體外和體內通過效應細胞介導有效的腫瘤破壞。與此相對,許多其它的具有優良腫瘤特異性的未綴合mAbs不能引發在臨床上有用的足夠潛能的效應子功能。Frost等,癌癥(Cancer)80:317?33(1997);Surfus等,免疫療法雜志(J. Immunother.)19:184?91(1996)。對于這些弱mAbs中的一些而言,目前測試了輔助的細胞因子療法。細胞因子的加入可以通過增加循環淋巴細胞的活性和數量而刺激抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。Frost等,癌癥(Cancer)80:317?33(1997);Surfus等,免疫療法雜志(J. Immunother.)19:184?91(1996)。ADCC,一種對抗體靶向的細胞的溶胞攻擊,在白細胞受體與抗體的恒定區(Fc)結合后得以引發。Deo等,今日免疫(Immunology Today)18:127(1997)。
一種增加未綴合的IgGls的ADCC活性的不同的,但是補充性的方法是改造抗體的Fc區域。蛋白質改造研究已經顯示FcγRs與IgG CH2結構域較低的鉸鏈區相互作用。Lund等,免疫學雜志(J. Immunol.)157:4963?69(1996)。然而,FcγR結合也需要在CH2區域中的保守Asn297處共價連接的寡糖的存在。Lund等,免疫學雜志(J. Immunol.)157:4963?69(1996);Wright和Morrison,生物技術趨勢(Trends Biotech.)15:26?31(1997),提示寡糖和多肽都直接有利于相互作用的位點或需要寡糖來維持活性CH2多肽構象。因此能夠開發對寡糖結構的修飾用作增加相互作用親和性的方式。
IgG分子在其Fc區域中攜帶兩個N連接的寡糖,每個在各自的重鏈上。如任何糖蛋白,抗體作為糖形的群產生,其共享相同的多肽主鏈但是具有不同的連接于糖基化位點的寡糖。通常見于血清IgG的Fc區域中的寡糖是復合的雙觸角的類型(Wormald等,生物化學(Biochemistry)36:130?38(1997),其具有低水平的末端唾液酸和等分的N?乙酰葡糖胺(GlcNAc),和不同程度的末端半乳糖基化和核心巖藻糖基化。一些研究顯示FcγR結合所需要的最小碳水化合物結構位于寡糖核心中。Lund等,免疫學雜志(J.Immunol.)157:4963?69(1996)。
用于產生未綴合的治療性mAbs的用在工業和研究中的小鼠或倉鼠來源的細胞系通常將所需的寡糖決定子連接于Fc位點。然而,在這些細胞系中表達的IgGs,缺乏以低量見于血清IgGs的等分GlcNAc。Lifely等,糖生物學(Glycobiology)318:813?22(1995)。與此相對,最近觀察到大鼠的骨髓瘤產生的,人源化IgG1(CAMPATH?1H)在其糖形的一些中攜帶等分的GlcNAc。Lifely等,糖生物學(Glycobiology)318:813?22(1995)。大鼠的細胞衍生的抗體與由標準的細胞系產生的CAMPATH?1H抗體相比,達到了相似的最大體外ADCC活性,但是其以顯著更低的抗體濃度存在。
CAMPATH抗原通常以高水平存在于淋巴瘤細胞上,并且這種嵌合的mAb在缺乏等分的GlcNAc時具有高ADCC活性。Lifely等,糖生物學(Glycobiology)引8:813?22(1995)。在N?連接的糖基化途徑中,等分的GlcNAc通過GnT?III加入。Schachter,生物化學細胞生物學(Biochem.Cell Biol.)64:163?81(1986)。
以前的研究使用單一的抗體產生CHO細胞系,其經預先改造從而以外部調節的方式,表達不同水平的克隆的GnTIII基因酶(Umana,P.,等,自然生物技術(Nature Biotechnol.)17:176?180(1999))。這種方法首次在修飾抗體的GnTIII的表達和ADCC活性之間建立嚴格的關聯。因此,本發明預期這樣的重組,嵌合抗體或其具有鼠B?Ly1抗體結合特異性的片段,其具有由增加的GnTIII活性所導致的改變的糖基化。增加的GnTIII活性導致在修飾的ABM的Fc區域中,等分的寡糖的百分比的增加,以及巖藻糖殘基的百分比的減少。這種抗體,或其片段,具有增加的Fc受體結合親和性和增加的效應子功能。此外,本發明涉及抗體片段和融合蛋白,它們包括等價于免疫球蛋白的Fc區域的區域。
按照本發明方法的修飾ABMs的治療性應用
在最廣泛的意義上,本發明修飾的ABMs可以用于體內或體外靶向表達靶抗原的細胞,特別是當所述靶抗原在細胞表面上表達時。可以靶向表達靶抗原的細胞,以用于診斷或治療的目的。在一個方面中,本發明修飾的ABMs可以用于改變表達靶抗原的細胞中的細胞信號傳導活性。在另一個方面中,本發明修飾的ABMs可以用于改變一個或多個靶抗原的交聯和/或低聚作用。用于本發明修飾的ABM的靶抗原可以是細胞表面受體,其包括,但不限于CD20,CD21,CD22,CD19,CD47,CD99,CD2,CD45,Her1(EGFR),Her2/neu,Her3,Her4,TRAIL受體(例如,TRAILR1,TRAILR2),TNFR,FGF受體(例如,FGFR1),IGF受體,PDGF受體,VEGF受體,和其他細胞表面結合受體。在特定的實施方案中,靶抗原是CD20。本發明修飾的ABM還用于抑制細胞周期,導致靶細胞(例如,腫瘤細胞)的程序性細胞死亡,抑制血管發生和/或導致靶細胞的分化。
在另一個方面,本發明涉及用于治療這樣的疾病的方法,所述疾病可以通過靶抗原改變的細胞信號傳導活性和/或改變的介導一個或多個靶抗原交聯能力,得以治療,所述方法包括將治療有效量的本發明修飾的ABM施用于需要其的受試者。在具體的實施方案中,所述修飾的ABM是抗體。在更特定的實施方案中,所述抗體是人源化的。可以對其施用修飾的ABM的疾病的實例包括,但不限于,細胞增殖疾病或病癥,自體免疫疾病或病癥,和與細菌或病毒感染相關的疾病或病癥。
在一個實施方案中,所述疾病或病癥是細胞增殖病癥。可以通過本發明的ABM治療的細胞增殖病癥的實例包括,但不限于,位于腹部、骨骼、乳腺、消化系統、肝臟、胰腺、腹膜、內分泌腺(腎上腺、甲狀旁腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼睛、頭和頸部、神經系統(中樞和外周)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸區和泌尿生殖系統中的瘤,癌癥,惡性腫瘤和/或腫瘤。可以用本發明的ABM治療的具體的瘤,癌癥,惡性腫瘤和/或腫瘤包括,但不限于,表皮和鱗狀細胞癌,神經膠質瘤,胰腺癌,卵巢癌,前列腺癌,乳腺癌,膀胱癌,頭和頸部癌癥,腎細胞癌,結腸癌,結腸直腸癌,肺癌,腦腫瘤,惡性黑素瘤,白血病,淋巴瘤,T細胞淋巴瘤,多發性骨髓瘤,胃癌,宮頸癌,子宮內膜癌,食道癌,肝癌,皮膚癌,尿道癌,絨毛膜癌,咽癌,喉癌,泡膜細胞增生癥,塞爾托利細胞瘤,子宮內膜增生,子宮內膜異位,胚組織瘤,纖維肉瘤,卡波西肉瘤,血管瘤,海綿狀血管瘤,成血管細胞瘤,視網膜神經膠質瘤,星形細胞瘤,神經纖維瘤,少突神經膠質細胞瘤,成神經管細胞瘤,成神經節細胞瘤,神經膠質瘤,橫紋肌肉瘤,錯構胚細胞瘤,骨源性肉瘤,平滑肌肉瘤,甲狀腺肉瘤,尤因肉瘤,和維爾姆斯瘤。
類似地,也可以用本發明修飾的ABMs治療其它細胞增殖性病癥。這些細胞增殖性病癥的實例包括,但不限于:高丙種球蛋白血病,淋巴增生性疾病,副球蛋白血癥,紫癜,結節病,塞澤里綜合征,瓦爾登斯特倫巨球細胞血癥,戈謝病,組織細胞增多癥和位于上面列出的器官系統中除了腫瘤之外的任何其它細胞增殖性病癥。
自體免疫疾病或病癥的實例包括,但不限于,免疫介導的血小板減少癥,諸如急性特發性血小板減少性紫癜和慢性特發性血小板減少紫癜,皮肌炎,小舞蹈病,狼瘡性腎炎,風濕熱,多腺綜合征,亨諾赫?舍恩萊因紫癜,鏈球菌感染后腎炎,結節紅斑,Takayasu′s動脈炎,愛迪生氏病,多形紅斑,結節性多動脈炎,關節強直性脊椎炎,古德帕斯徹綜合征,閉塞性血栓血管炎,原發性膽硬化,橋本甲狀腺炎,甲狀腺毒癥,慢性活性肝炎,多肌炎/皮肌炎,多軟骨炎,pamphigus vulgaris,韋格納肉芽腫病,膜性腎病,肌萎縮性脊髓側索硬化,脊髓癆,多肌痛(polymyalgia),惡性貧血,快速進行性血管球性腎炎和成纖維齒槽炎,炎癥響應,諸如炎性皮膚疾病,其包括牛皮癬和皮炎(例如,特異性皮炎);系統硬皮病和硬化癥;與炎性腸疾病相關的響應(諸如局限性回腸炎和潰瘍性結腸炎);呼吸窘迫綜合征(包括成人呼吸窘迫綜合征;ARDS);皮炎;腦膜炎;腦炎;眼色素層炎;結腸炎;腎小球腎炎;變應性疾病,諸如濕疹和哮喘,以及涉及T細胞浸潤和慢性炎性響應的其他病癥;動脈粥樣硬化;白細胞粘附缺陷;類風濕性關節炎;系統性紅斑狼瘡(SLE);糖尿病(例如,1型糖尿病或胰島素依賴性糖尿病);多發性硬化;雷諾綜合征(Reynaud′s syndrome);自體免疫甲狀腺炎;變應性腦脊髓炎;斯耶格倫綜合征(Sjorgen′s syndrome);青少年發作糖尿病;和與由細胞因子和T?淋巴細胞介導的急性和遲發超敏性相關的免疫響應,所述細胞因子和T?淋巴細胞典型地見于結核,肉樣瘤病,多肌炎,肉芽腫病和脈管炎中;惡性貧血(艾迪生氏病);涉及白細胞血細胞滲出的疾病;中樞神經系統(CNS)炎性病癥;多器官損傷綜合征;溶血性貧血(包括,但不限于冷球蛋白血癥或庫姆斯陽性貧血癥);重癥肌無力;抗原?抗體復合物介導的疾病;抗小球基膜疾病;抗磷脂綜合征;變應性神經炎;格雷夫斯病(Graves′disease);蘭?伊(Lambert?Eaton)肌無力綜合征;大皰性類天皰瘡;天皰瘡;自體免疫多內分泌腺病;賴特病(Reiter′s disease);僵直人綜合征(stiff?man syndrome);貝赫切特疾病(Behcet disease);巨細胞性動脈炎;免疫復合物腎炎;IgA腎病;IgM多神經病;免疫血小板減少性紫癜(ITP)或自體免疫血小板減少癥等。
本發明修飾的ABM可以單獨或與其他治療法或治療試劑組合使用,從而治療可以通過增高或降低細胞信號傳導活性和/或一個或多個靶抗原交聯治療的疾病。在一個實施方案中,本發明修飾的ABMs可以單獨用于體內靶向和殺傷腫瘤細胞。修飾的ABMs還可以與適合的治療劑組合使用以治療人癌癥。例如,該修飾的ABMs可以與標準或常規治療方法諸如化學療法,放射治療組合使用或可以綴合或連接于治療性藥物,或毒素,以及淋巴因子或腫瘤抑制生長因子,以將治療劑遞送到癌癥位點。在特定的實施方案中,本發明修飾的ABMs的綴合物包括(1)免疫毒素(修飾的ABM和細胞毒性部分的綴合物)和(2)標記的(例如,放射性標記的,酶標記的或熒光染料標記的)修飾ABMs,其中該標記提供鑒定包含標記的ABM的免疫復合體的方法。該修飾的ABM還可以用于通過天然補體方法來誘導裂解,并且與正常存在的抗體依賴性細胞毒性細胞相互作用。
免疫毒素的細胞毒性部分可以是細胞毒性藥物或細菌或植物起源的酶促活性毒素,或這樣的毒素的酶促活性片段(“A鏈”)。所用的酶促活性毒素及其片段是白喉A鏈,白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相似豆毒蛋白A鏈、塑蓮根毒蛋白IIA鏈、α?帚曲霉素、光桐蛋白、香石竹毒蛋白、垂序登陸蛋白(PAPI,PAPII,和PAP?S)、苦瓜蛋白(momordica charantia)抑制劑、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白,sapaonaria officinalis抑制劑、多花白樹毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素,和伊諾毒素。在另一個實施方案中,該修飾的ABMs與小分子抗癌藥物綴合。修飾的ABM和這些細胞毒性部分的綴合物使用多種雙功能蛋白偶聯劑進行制備。這些試劑的實例是SPDP,IT,亞氨酸酯的雙功能衍生物諸如二甲基adipimidate鹽酸,活性酯諸如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯,醛諸如戊二醛,二疊氮化合物諸如二?(p?疊氮苯甲酰基)已二胺,二重氮化衍生物諸如二?(p?重氮苯甲酰基)?乙二胺,二異氰酸酯諸如甲苯基2,6?二異氰酸酯,和雙活性氟化合物諸如1,5?二氟?2,4?二硝基苯。毒素的溶解部分可以連接于修飾的ABMs的Fab片段。本領域已知另外的適合毒素,如在例如公開的美國專利申請號2002/0128448中顯示的,將其全部內容并入本文作為參考。
在一個實施方案中,將本發明的抗原結合分子綴合于另外的部分,如放射性標記或毒素。該綴合的修飾ABMs能通過本領域眾所周知的大量方法產生。
多種放射性核素適用于本發明,且認為本領域的技術人員具有容易地在多種情形下確定哪種放射性核素是最適合的能力。例如,131碘是熟知的用于靶向免疫療法的放射性核素。然而,131碘的臨床有效性可被若干因素所限制,包括:8天物理半衰期;血液中和腫瘤位點處碘化抗體的脫鹵作用;和對腫瘤中局部劑量沉積可以是非最適性的發射特征(例如,大γ成分)。隨著優秀螯合劑的出現,將金屬螯合基團連接到蛋白質上的機會增加了利用其他放射性核素如111銦和90釔的機會。90釔為用于放射免疫療法應用提供若干益處;90釔的64小時半衰期足夠長,從而容許腫瘤的抗體積累,且不同于例如131碘,90釔是在其衰變中不伴隨γ照射的,在組織中具有100?1000個細胞直徑范圍的高能量純β放射體。此外,貫穿輻射的最少量容許給門診病人施用90釔標記的抗體。另外,細胞殺傷對標記抗體的內化沒有要求,且電離輻射的局部發射應該對缺乏該靶抗原的相鄰腫瘤細胞是致死因子。
90釔標記的本發明修飾的ABM的有效單次治療劑量(即,治療有效量)在約5?約75mCi的范圍內,更優選地,約10?約40mCi的范圍內。131碘標記的本發明ABM的有效單次治療非骨髓可消融劑量在約5?約70mCi的范圍內,更優選地,約5?約40mCi。131碘標記的本發明抗體的有效單次治療可消融劑量(即,可以需要自體同源骨髓移植)在約30?約600mCi的范圍內,更優選地,約50?低于約500mCi。在與按照本發明的嵌合抗體的綴合物中,由于比鼠抗體更長的循環半衰期,131碘標記的嵌合抗體的有效單次治療非骨髓可消融劑量在約5?約40mCi的范圍內,更優選地,低于約30mCi。對于,例如111銦標記的成像標準,典型地低于約5mCi。
關于本發明的放射性標記抗體,以其進行的療法還能利用單獨療法治療或利用多重治療發生。由于該放射性核素成分,優選在治療前,“收獲”外周干細胞(“PSC”)或骨髓(“BM”)用于經歷了由放射所導致的潛在致命骨髓毒性的患者。利用標準技術收獲BM和/或PSC,并且接著進行清洗和冷凍用于可能的再輸注。另外,最優選地,在治療前,對患者進行利用診斷標記抗體(例如,使用111銦)的診斷劑量學研究,其目的是確保治療性標記抗體(例如,使用90釔)不會在任何正常器官或組織中非必要地“濃縮”。
在一個實施方案中,本發明的嵌合的糖基改造的修飾ABM綴合于蓖麻毒蛋白A鏈。最有利地,蓖麻毒蛋白A鏈是去糖基化并通過重組方式產生的。制備該蓖麻毒蛋白的免疫毒素的有利方法描述于Vitetta等,Science(科學)238:1098(1987),特此將其并入作為參考。
當出于診斷目的,用于體外殺傷人癌細胞時,該綴合物將典型地以至少約10nM的濃度加入細胞培養基中。配制和進行體外應用的施用方式不是關鍵性的。將通常使用與培養物或灌注介質相容的水性制劑。可以通過常規技術來讀出細胞毒性以確定癌癥的存在或程度。
如上討論的,可以通過將放射性同位素(例如,I,Y,Pr)綴合于本發明嵌合的,糖基改造的和/或修飾的ABM而制備細胞毒性的放射性藥物以治療癌癥。用于本文時,術語“細胞毒性部分”傾向于包括這些同位素。
在另一個實施方案中,用細胞毒性藥物填充脂質體并用本發明的ABMs包被脂質體。因為許多本發明修飾的ABM的靶分子在細胞表面上(例如,在惡性B細胞表面上存在許多CD20分子)表達,該方法允許將大量藥物遞送到正確的細胞類型。
將這些治療劑綴合于抗體的技術是眾所周知的(見,例如Arnon等,“在癌癥治療中使用的藥物的免疫靶標的單克隆抗體”(″Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy″),在單克隆抗體和癌癥治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy),Reisfeld等(eds.),243?56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)中;Hellstrom等,“藥物遞送的抗體”(″Antibodies For Drug Delivery″),在控制藥物遞送(Controlled DrugDelivery)(第2版)中,Robinson等(eds.),623?53頁(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe,“在癌癥治療中的細胞毒性劑的抗體載體:綜述”(″AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review″),在單克隆抗體′84:生物和臨床應用(Monoclonal Antibodies′84:Biological And Clinical Applications),Pinchera等(eds.),475?506頁(1985)中;和Thorpe等,“抗體毒素綴合物的制備和細胞毒性性質”(″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody Toxin Conjugates″),免疫綜述(Immunol. Rev.),62:119?58(1982)(將其每篇全部內容引入本文作為參考)。
另外,本發明的ABMs的其它治療性應用包括,例如通過重組DNA技術綴合或連接于能夠將前藥轉化成細胞毒性藥物的酶,和將抗體?酶綴合物與前藥組合使用從而在腫瘤位點將前藥轉化成細胞毒性劑(見,例如Senter等,“抗體?堿性磷酸酶的抗腫瘤作用”(″Anti?Tumor Effects of Antibody?alkaline Phosphatase″)美國國家科學院會刊(proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:4842?46(1988);“由單克隆抗體?堿性磷酸酶綴合物引起的磷酸化Mitocycin C和依托泊苷衍生物的體外和體內抗腫瘤活性的增強”(″Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody?Alkaline Phosphatase Conjugates″),癌癥研究(Cancer Research)49:5789?5792(1989);和Senter,“由抗體?酶綴合物引起的前體藥物的活化:癌癥治療的新方法”(″Activation of Prodrugs by Antibody?Enzyme Conjugates:A New Approach to Cancer Therapy″),FASEB J.4:188?193(1990))。
此外,本發明的ABMs的另外的治療性應用,包括,在存在補體的情況下使用未綴合的,或作為抗體?藥物或抗體?毒素綴合物的部分從而從癌癥患者的骨髓中去除腫瘤細胞。按照該方法,可以通過用抗體處理對自體骨髓進行離體(ex vivo)清洗,并將骨髓輸注回患者(見,例如Ramsay等,“利用單克隆抗體進行的骨髓清洗”(″Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies″)臨床免疫學雜志(J.Clin.Immunol.),8(2):81?88(1988))。
此外,預期本發明包括包含抗原結合結構域的單鏈免疫毒素,所述單鏈免疫毒素基本容許與母體抗體相同的結合特異性(例如,包含母體抗體CDRs的多肽),并且所述單鏈免疫毒素還包含毒素多肽。本發明的單鏈免疫毒素可以用于體內治療人癌癥。
類似地,可以將融合蛋白用于體內治療人癌癥,所述融合蛋白包括至少本發明ABM的抗原結合區,和與之連接的至少第二蛋白的功能活性部分,所述第二蛋白具有抗腫瘤活性,例如淋巴因子或制癌蛋白。
本發明提供用于選擇性殺傷表達細胞表面受體的腫瘤細胞的方法,所述細胞表面受體包括,但不限于CD20,Her1(EGFR),Her2/neu,Her3,Her4,TRAIL受體(例如,TRAILR1,TRAILR2),TNFR,FGF受體(例如,FGFR1),IGF受體,PDGF受體,VEGF受體,以及其他細胞表面結合受體。該方法包括將本發明修飾的ABM(綴合的,例如,作為免疫毒素,或未綴合的)與所述腫瘤細胞反應。這些腫瘤細胞可以來自人癌癥。
此外,本發明提供體內治療癌癥(例如,人癌癥)的方法。該方法包括將藥用有效量的組合物施用于受試者,所述組合物包括至少一種本發明修飾的ABM(綴合的,例如,作為免疫毒素,或未綴合的)。
在進一步的方面,本發明涉及用于治療B細胞增殖病癥,包括B細胞淋巴瘤,以及完全或部分地由致病自體抗體基于B細胞的損耗而產生的自體免疫疾病的改善的方法,所述方法包括將治療有效量的本發明的ABM施用于需要其的人類受試者。在優選的實施方案中,ABM是糖改造的抗CD20抗體,其具有與鼠B?Ly1抗體基本相同的結合特異性。在另一個優選的實施方案中,所述抗體是人源化的。在本發明的這個方面,本發明的ABM用于在延長的期限內損耗正常B細胞的血液。
按照本發明的實踐,受試者可以是人,馬,豬,牛,鼠,犬,貓,和.鳥受試者。此外本發明還包括其它的溫血動物。
本發明還提供抑制人腫瘤細胞生長,治療受試者中腫瘤,和治療受試者中增殖型疾病的方法。這些方法包含向所述受試者施用有效量的本發明的組合物。
在一個實施方案中,本發明涉及這樣的按照本發明的ABM,其用于治療或預防癌癥,癌癥前期病癥或病灶,或自體免疫病癥。在另一個實施方案中,本發明涉及用作藥物的按照本發明的ABM,所述藥物用于治療或預防癌癥,癌癥前期病癥或病灶,或自體免疫病癥。所述癌癥可以是,例如B細胞淋巴瘤,肺癌,非小細胞肺(NSCL)癌,細支氣管肺泡細胞肺癌,骨癌,胰腺癌,皮膚癌,頭或頸部癌癥,皮膚或眼內黑素瘤,子宮癌,卵巢癌,直腸癌,肛門區癌,胃癌,胃癌,結腸癌,乳腺癌,子宮癌,輸卵管癌,子宮內膜癌,子宮頸癌,陰道癌,外陰癌,霍奇金病,食道癌,小腸癌,內分泌系統癌,甲狀腺癌,甲狀旁腺癌,腎上腺癌,軟組織肉瘤,尿道癌,陰莖癌,前列腺癌,膀胱癌,腎癌或輸尿管癌,腎細胞癌,腎盂癌,間皮瘤,肝細胞癌,膽管癌,慢性或急性白血病,淋巴細胞淋巴瘤,中樞神經系統(CNS)腫瘤,脊柱軸腫瘤,腦干神經膠質瘤,多形性成膠質細胞瘤,星形細胞瘤,神經鞘瘤,室管膜瘤,成神經管細胞瘤,腦脊膜瘤,鱗狀細胞癌,垂體腺瘤,包括上述癌癥任一種的頑固形式,或一種或多種上述癌的組合。癌癥前期病癥或病灶包括,例如由口腔粘膜白斑病,光化性角化病(日光性角化病),結腸或直腸癌癥前期息肉,胃上皮發育不良,腺瘤發育不良,遺傳性非息肉性結腸癌綜合征(HNPCC),巴雷特食道,膀胱發育不良,和癌癥前期宮頸病癥組成的組。
優選地,所述癌選自由下列各項組成的組:B細胞淋巴瘤,乳腺癌,膀胱癌,頭和頸部癌,皮膚癌,胰腺癌,肺癌,卵巢癌,結腸癌,前列腺癌,腎癌,和腦癌。提供了自體免疫病癥的實例,如上。
另一個實施方案是將按照本發明的ABM用于制備治療或預防癌癥或治療或預防癌癥前期病癥或病灶的藥物的應用。癌癥和癌癥前期的病癥或病灶如上定義。
因此,顯而易見的是,本發明涵蓋用于治療人癌癥的藥物組合物,組合,應用和方法。例如,本發明包括用在治療人癌癥中的藥物組合物,其包括藥用有效量的本發明的抗體和藥用載體。
本發明的ABM組合物可以使用常規施用方式進行施用,所述方式包括,但不限于,靜脈內、腹膜內、口服、淋巴內或直接施用于腫瘤中。靜脈內施用是優選的。
在本發明的一個方面,以凍干制劑或水溶液形式存在的包含本發明的ABMs的治療性制劑通過將具有所需純度的抗體與任選的藥用載體、賦形劑或穩定劑(雷明頓制藥科學(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第十六版,Osol,A.Ed.(1980))混和來進行制備以用于貯存。可以接受的載體,賦形劑,或穩定劑在所用的劑量和濃度上對于受者是無毒的,并且包括緩沖劑諸如磷酸鹽,檸檬酸鹽和其它有機酸;抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸;防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨;六甲氯銨;苯扎氯銨;芐索氯銨;苯酚,丁醇或芐醇;對羥基苯甲酸烷基酯諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯;鄰苯二酚;間苯二酚;環已醇;3?戊醇;和間甲酚);低分子量(少于約10個殘基)多肽;蛋白質,諸如血清白蛋白,明膠,或免疫球蛋白;親水性聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸諸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,組氨酸,精氨酸,或賴氨酸;單糖,二糖,和其它的碳水化合物包括葡萄糖,甘露糖,或糊精;鰲合劑諸如EDTA;糖諸如蔗糖,甘露糖醇,海藻糖或山梨糖醇;成鹽平衡離子諸如鈉;金屬復合體(例如,鋅?蛋白復合體);和/或非離子表面活性劑諸如TWEENTM,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在WO98/56418中描述了示范的抗CD20ABM制劑,將其明確地引入本文作為參考。該公開文獻描述了包含40mg/mL利妥昔單抗,25mM乙酸鹽,150mM海藻糖,0.9%苯甲醇,0.02%聚山梨酯20的pH5.0的液體多劑量制劑,其在2?8℃儲存時,具有最短貯存期2年。另一種目標抗CD20制劑包含處于9.0mg/mL氯化鈉中的10mg/mL利妥昔單抗,7.35mg/mL二水合檸檬酸鈉,0.7mg/mL聚山梨醇80,和用于注射的無菌水,pH6.5。在本發明中,用本發明修飾的ABM替換利妥昔單抗。
將適合于皮下施用的凍干制劑描述在WO97/04801中。這些凍干制劑可以用適合的稀釋劑重構到高蛋白質濃度并且可以將該重構的制劑皮下施用給本文的待治療的哺乳動物。
根據被治療的具體適應癥的需要,本文的制劑也可以含有多于一種的活性化合物,優選具有互補活性而不彼此不利影響的那些。例如,可能理想的是另外提供細胞毒劑,化學治療劑,細胞因子或免疫抑制劑(例如作用于T細胞的一種,如環孢菌素或結合T細胞的抗體,例如結合LFA?1的一種)。這些其它試劑的有效量取決于制劑中存在的拮抗劑的量,疾病或病癥或治療的類型,和以上討論的其它因素。這些通常以相同劑量和以上文所用的給藥途徑使用或以迄今使用的劑量的約1至99%使用。
活性成分還可以被包裹在,例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊中,例如,分別在膠體藥物遞送系統(例如,脂質體,白蛋白微球體,微乳,納米顆粒和納米膠囊)或在粗乳狀液中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚?(甲基丙烯酸甲酯(methylmethacylate))微膠囊。這些技術公開在雷明頓制藥科學(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第16版,Osol,A.版本(1980)中。
可以制備持續釋放的制劑。持續釋放的制劑的適合的實例包括包含拮抗劑的固體疏水聚合物的半透性基質,所述基質以成形制品,例如薄膜,或微膠囊的形式存在。持續釋放的基質的實例包括聚酯,水凝膠(例如,聚(2?羥乙基?甲基丙烯酸酯),或聚(乙烯醇)),聚丙交酯(美國專利號3,773,919),L?谷氨酸和γ乙基?L?谷氨酸鹽的共聚物,不可降解的乙烯乙酸乙烯酯,可降解的乳酸?羥基乙酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸?羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙立德組成的可注射微球體),和聚?D?(?)?3?羥基丁酸。
用于體內施用的制劑必須是無菌的。這可以通過以無菌過濾膜過濾來容易地實現。
本發明的組合物可以以多種劑型存在,所述劑型包括,但不限于,液體溶液或混懸液,片劑,丸劑,散劑,栓劑,聚合物微膠囊或微泡,脂質體,和可注射的或可輸注的溶液劑。優選的形式取決于施用和治療應用的方式。
本發明的組合物還優選地包括本領域已知的常規藥用載體和佐劑諸如人血清白蛋白,離子交換劑,釩土,卵磷脂,緩沖物質諸如磷酸鹽,甘氨酸,抗壞血酸,山梨酸鉀,和鹽或電解質諸如硫酸魚精蛋白。
用于本發明的藥物組合物的最有效施用方式和劑量方案取決于疾病的嚴重性和進程,患者的健康和對治療的反應,以及治療的醫師的判斷。因此,對個體患者應該對該組合物的劑量進行滴定。然而,本發明的組合物的有效劑量將通常在約0.01到約2000mg/kg的范圍內。
本文所述的分子可以以多種劑型存在,所述劑型包括,但不限于,液體溶液劑或混懸液,片劑,丸劑,散劑,栓劑,聚合物微膠囊或微泡,脂質體,和可注射的或可輸注的溶液。優選的形式取決于施用和治療應用的方式。
在一些情形中,可以通過使用預測性生物標記確定本發明的劑量。預測性生物標記是分子標記,其用于確定(即,觀察和/或量化)腫瘤相關基因或蛋白質表達和/或活化的模式,或腫瘤相關信號傳導途徑的細胞成分。闡明腫瘤組織中靶治療的生物作用,并將這些作用與臨床響應相互聯系,幫助識別腫瘤中有效的主要生長和生存途徑,從而建立可能的響應器模式,并且相反地,為設計克服治療抗性的策略提供基本原理。例如,當修飾的ABM是特異于EGFR的抗體時,抗EGFR治療的生物標記可以包含一個或多個這樣的分子,所述分子處于導致細胞增殖病癥的EGFR下游信號傳導途徑中,所述分子包括,但不限于,Akt,RAS,RAF,MAPK,ERK1,ERK2,PKC,STAT3,STAT5(Mitchell,自然生物工程(Nature Biotech.)22:363?364(2004);Becker,自然生物工程(Nature Biotech.)22:15?18(2004);Tsao和Herbst,信號(Signal)4:4?9(2003))。用于抗EGFR治療的生物標記還可以包含生長因子受體,如EGFR,ErbB?2(HER2/neu),和ErbB?3(HER3),并且可以是患者對于抗EGFR治療響應陽性或陰性的預測物。例如,生長因子受體ErbB?3(HER3)被確定為抗EGFR抗體ABX?EGF的陰性預測生物標記(美國專利申請公開號2004/0132097A1)。
預測性生物標記可以通過本領域熟知的細胞測定法進行測量,其包括,但不限于免疫組化,流式細胞術,免疫熒光,捕獲?和?檢測測定,和反相測定,和/或美國專利申請公開號2004/0132097A1中所述的測定,將其全部內容引入本文作為參考。抗EGFR治療的預測性生物標記自身可以通過按照美國專利申請公開號2003/0190689A1中所述的技術來進行鑒定,將其全部內容引入本文作為參考。
因此,在一個方面,本發明提供用于治療這樣的病癥的方法,所述病癥與由靶抗原引起的改變的或調節異常的細胞信號傳導和/或改變的介導一個或多個靶抗原交聯和/或低聚作用的能力相關,所述方法包括:通過測定來自接受一種或多種試劑治療前的人類受試者的樣品,在需要該治療的人類受試者體內,預測其對于利用修飾的ABM的治療的響應,所述一種或多種試劑檢測對于這樣病癥的預測性生物標記的表達和/或活化作用,所述病癥與由靶抗原引起的改變的或調節異常的細胞信號傳導和/或改變的介導一個或多個靶抗原交聯和/或低聚作用的能力相關(如癌癥);確定一種或多種預測性生物標記表達和/或活化的模式,其中所述模式預測人類受試者對修飾的ABM治療的響應;和向被預測為對修飾的ABM治療產生陽性響應的人類受試者施用治療有效量的組合物,所述組合物包含本發明修飾的ABM。用于本文時,被預測為對修飾的ABM治療產生陽性響應的人類受試者是這樣的人,對于他們,修飾的ABM應該對這樣的疾病或病癥具有可測量的作用,所述疾病或病癥與由靶抗原引起的改變的或調節異常的細胞信號傳導和/或改變的介導一個或多個靶抗原交聯和/或低聚作用的能力相關(例如,腫瘤退化/收縮),并且對于他們,修飾的ABM治療的副作用(例如,毒性)不超過其益處。用于本文時,樣品意指來自生物體,特別是人的任何生物樣品,其包括一個或多個細胞,包括任意起源、組織或活組織檢查樣品的單細胞,所述任意起源、組織或活組織檢查的樣品取自器官,如胸,肺,胃腸道,皮膚,子宮頸,卵巢,前列腺,腎,腦,頭和頸部,或身體的任意其他器官或組織,以及其他身體樣品,包括,但不限于,涂片,唾液,分泌物,腦脊髓液,膽汁,血液,淋巴液,尿和糞。
包括本發明的修飾的ABM的組合物將以與良好的醫療實踐保持一致的方式來進行配制,給藥和施用。在該情形中考慮的因素包括被治療的具體疾病或病癥,被治療的具體哺乳動物,個體患者的臨床條件,疾病或病癥的起因,遞送該試劑的位點,施用的方法,施用的時間表,和執業醫生已知的其它因素。待施用的拮抗劑的治療有效量將由這些考慮所支配。
作為一般的建議,每劑量中腸胃外施用的抗體的治療有效量將在約0.1到20mg/kg患者體重/日范圍內,其中所用的拮抗劑的典型起始范圍在約2到10mg/kg的范圍內。
此外優選地,所述修飾的ABM以約1.0mg/kg到約15mg/kg的治療有效量使用。
此外更優選地,所述修飾的ABM以約1.5mg/kg到約12mg/kg的治療有效量使用。
此外更優選地,所述修飾的ABM以從約1.5mg/kg到約4.5mg/kg的治療有效量使用。
此外更優選地,所述修飾的ABM以從約4.5mg/kg到約12mg/kg的治療有效量使用。
最優選地,所述修飾的ABM以約1.5mg/kg的治療有效量使用。
此外最優選地,所述修飾的ABM以約4.5mg/kg的治療有效量使用。
此外最優選地,所述修飾的ABM以約12mg/kg的治療有效量使用。
在一個優選的實施方案中,該修飾的ABM是抗體,優選地是人源化的抗體。這種未綴合的抗體的適合的劑量在,例如,約20mg/m2到約1000mg/m2的范圍內。在一個實施方案中,抗體的劑量與目前為利妥昔單抗所推薦的劑量不同。例如,可以向患者施用一次或多次基本少于375mg/m2的抗體的劑量,例如其中該劑量在約20mg/m2到約250mg/m2的范圍內,例如從約50mg/m2到約200mg/m2的范圍內。
而且,可以施用一次或多次起始劑量的抗體,隨后施用一次或多次隨后的劑量,其中在隨后的劑量中的抗體的mg/m2劑量的量超過在起始劑量中的抗體的mg/m2劑量的量。例如,起始劑量可以在約20mg/m2到約250mg/m2(例如,從約50mg/m2到約200mg/m2)的范圍內,并且隨后的劑量可以在約250mg/m2到約1000mg/m2的范圍內。
然而,如上指出,修飾的ABM的這些提示量要進行大量的治療性判斷。在選擇適當的劑量和時間表中的關鍵因素是如上所示的獲得的結果。例如,起初可能需要相對更高的劑量用于進行中的和急性疾病的治療。為了獲得最有效的結果,取決于疾病或病癥,將拮抗劑在盡可能接近于疾病或病癥的首次癥狀,診斷,征兆或發生的時候施用或在疾病或病癥減輕的時候進行施用。
通過任何適合的方式來施用本發明修飾的ABM,所述方式包括腸胃外,皮下,腹膜內,intrapulinonary,和鼻內,和如果需要用于局部免疫抑制性治療,包括病灶內施用。腸胃外輸注包括肌內,靜脈內,動脈內,腹膜內,或皮下施用。此外,拮抗劑可以通過脈沖輸注,例如以下降劑量的拮抗劑來適當地施用。部分取決于施用是短暫的還是長期的,優選地,將給藥通過注射,最優選地靜脈內或皮下注射進行。
可以與本文的拮抗劑一起,施用其它的化合物,諸如細胞毒性劑,化學治療劑,免疫抑制劑和/或細胞因子。組合的施用包括使用單獨的制劑或單一的藥物制劑的共同施用,和以任一順序的連續施用,其中優選地,在兩種(或所有的)活性劑同時發揮它們的生物學活性的時候,存在時間周期。
將清楚的是實現治愈所需要的本發明的組合物的劑量可以隨時間表優化進一步地減少。
按照本發明的實踐,藥用載體可以是脂質載體。該脂質載體可以是磷脂。此外,脂質載體可以是脂肪酸。此外,脂質載體可以是去污劑。用于本文時,去污劑是改變液體的表面張力,通常是降低其的任何物質。
在本發明的一個實例中,所述去污劑可以是非離子型去污劑。非離子型去污劑的實例包括,但不限于,聚山梨酯80(也稱為吐溫80或(聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯),Brij,和Triton(例如Triton WR1339和TritonA?20)。
或者,所述去污劑可以是離子型去污劑。離子型去污劑的實例包括,但不限于,烷基三甲基溴化銨。
另外,根據本發明,所述脂質載體可以是脂質體。如本申請中所用的,“脂質體”是任何膜束縛的囊泡,其包含本發明的任何分子或其組合。
下面的實施例更加詳細地解釋本發明。給出下列制備和實施例,從而使本領域技術人員能夠更加清楚地理解并實施本發明。不過,本發明的范圍并不受例示的實施方案的限制,所述實施方案只是意在作為發明單一方面的舉例說明,并且功能上等同的方法在本發明的范圍之內。事實上,由前述描述和附圖,對于本領域技術人員來說,除了本文所述那些之外,本發明的各種改進將是顯而易見的。這些改進將會落入后附的權利要求書的范圍之內。
實施例
除非另外指定,在下列實施例中的特定氨基酸殘基位置的編號的參考是按照Kabat編號系統進行的。
實施例1
材料和方法
重組抗體B?Ly1的克隆和表達
在含有10%FBS和4mML?谷氨酰胺的RPMI中生長表達B?Ly1的雜交瘤細胞(見,例如Poppema,S.,等,1987,第9屆生物測試座談會會刊(Proceedings of the9thBiotest Symposium),教育學會(Institute of Education),倫敦,(Sonneborn,H.H.和Tills,D,Eds.);Ling,N.R,等,1987,在白細胞測型會議III:白細胞分化抗原(Leucocyte Typing Conference III:White cell differentiation antigens)中,302?355,牛津大學出版社(Oxford University Press),牛津.(A.J.McMichael,Ed.);Knapp,W.1990.白細胞測型會議IV會刊(Leukocyte Typing Conference IVProceedings),牛津大學出版社(Oxford University Press),牛津)。收獲了具有>90%生存力的6x106個細胞,并利用Qiagen RNAeasy midi試劑盒分離總RNA。通過RT?PCR擴增了編碼B?Ly1可變輕鏈和重鏈的cDNA。RT?PCR反應在下列條件下進行:在50℃保持30分鐘,以進行第一條鏈cDNA的合成;在95℃保持15分鐘,以進行最初的變性;94℃保持1分鐘,45℃保持1分鐘,72℃保持1.5分鐘為一個周期,并進行30個周期;以及在72℃保持10分鐘的最終延伸步驟。通過凝膠電泳證實所預期的PCR產物尺寸。將PCR產物克隆到適合的大腸桿菌載體中,且DNA測序證實編碼可變輕鏈和重鏈的基因被分離了。
為了構建嵌合B?Ly1表達載體,通過另外的PCR反應,將合成的信號序列和適當的限制性位點與可變鏈融合。在正確的可變鏈DNA序列最終證實后,將它們與相應的人IgG1恒定區組合。一旦構建了所述基因,在MPSV啟動子和合成的聚腺苷酸位點上游的控制下,利用兩種不同的載體,每條鏈一種,對它們進行克隆,從而導致形成質粒pETR1808(重鏈表達載體)和pETR1813(輕鏈表達載體)。每種載體均攜帶EBV OriP序列。
通過利用磷酸鈣?轉染方法用載體pETR1808和pETR1813共轉染HEK293?EBNA細胞,而產生嵌合B?Ly1。通過磷酸鈣方法轉染指數增長的HEK293?EBNA細胞。利用增補了10%FCS的DMEM培養基,使細胞在T瓶中生長為貼壁單層培養物,并且當它們鋪滿50?80%匯合時,對其進行轉染。對于T75瓶的轉染,在轉染前24小時,將8百萬個細胞接種到增補了FCS(最終為10%V/V)和250μg/ml新霉素的14ml DMEM培養基中,并且將細胞置于37℃,含有5%CO2的空氣的培養箱中,過夜。對于每個待轉染的T75瓶,通過混合等分為輕鏈和重鏈表達載體的47μg總質粒載體DNA,235μl的1M CaCl2溶液,并加水至最終體積469μl,來制備DNA,CaCl2和水的溶液。向該溶液中,加入469μl的50mM HEPES,280mM NaCl,1.5mM Na2HPO4溶液,pH7.05,立即混合10秒鐘,并且在室溫下靜置20秒。用12ml增補了2%FCS的DMEM稀釋該混懸液,并將其加入到T75中,從而替換現有的培養基。在37℃,5%CO2下,培養該細胞約17?20小時,然后再用12ml DMEM,10%FCS替換培養基。為了產生未修飾的抗體“chB?Ly1”,僅用1∶1比例的抗體表達載體pETR1808和pETR1813轉染該細胞。為了產生糖改造的抗體“chB?Ly1?ge”,用4種質粒共轉染該細胞,所述4種質粒分別地處于4∶4∶1∶1的比例,兩種用于抗體表達(pETR1808和pETR1813),一種用于融合GnTIII多肽表達(pETR1519),和一種用于甘露糖苷酶II表達(pCLF9)。轉染后第5天,收集上清液,在1200rpm離心5分鐘,隨后在4000rpm第二次離心10分鐘,并保存在4℃。
利用三個順序的層析步驟,即Superdex200柱(阿莫仙藥業(Amersham Pharmacia))上的蛋白質A層析,陽離子交換層析,和尺寸排阻層析步驟,從培養上清液中純化chB?Ly1和chB?Ly1?ge,其中將緩沖液換為磷酸緩沖鹽溶液,并且從該最終步驟中收集單體抗體峰。利用分光光度計,由280nm處的吸光率估算抗體濃度。
寡糖分析
通過PNGaseF消化,從抗體中酶促釋放寡糖,其中所述抗體固定在PVDF膜上或溶液中。
直接制備由此產生的含有被釋放的寡糖的消化溶液,從而進行MALDI/TOF?MS分析,或者在樣品制備前,進一步用EndoH糖苷酶進行消化,從而進行MALDI/TOF?MS分析。
用于PVDG膜固定的抗體的寡糖釋放方法
用100μl甲醇濕潤具有PVDF(ImmobilonP,密斯博(Millipore),Bedford,馬薩諸塞州(Massachusetts))膜的96孔板的孔,并且利用應用于多篩真空抽吸裝置(密斯博(Millipore),Bedford,馬薩諸塞州(Massachusetts))的真空,經過PVDF膜吸出該液體。用300μl的水洗滌該PVDF膜三次。再用50μl RCM緩沖液(8M尿素,360mM Tris,3.2mM EDTA,pH8.6)洗滌孔。將30?40μg抗體裝入容納10μl RCM緩沖液的孔中。通過應用真空,將孔中的液體經過所述膜吸出,并且隨后用50μl RCM緩沖液洗滌該膜2次。通過在RCM中添加50μl的0.1M二硫蘇糖醇和在37℃培養1小時,還原二硫鍵。
還原之后,使用真空從孔中去除二硫蘇糖醇溶液。在通過向RCM緩沖液中添加50μl的0.1M碘乙酸,并在黑暗中室溫溫育30分鐘,進行半胱氨酸殘基羧甲基化作用前,用300μl水洗滌所述孔三次。
羧甲基化作用后,用真空對所述孔進行吸取,并隨后用300μl水洗滌三次。然后通過在室溫溫育100μl的1%聚乙烯吡咯烷酮360水性溶液1小時,封閉PVDF膜,從而防止內切糖苷酶的吸收。再通過溫和的抽真空作用去除封閉試劑,隨后用300μl水洗滌三次。
在最終體積為25μl的20mM NaHCO3,pH7.0中,通過添加2.5mU肽?N?糖基化酶(glycosydase)F(重組N?聚糖酶,GLYKO,Novato,CA)和0.1mU唾液酸酶(GLYKO,Novato,CA),從而去除任何潛在的帶電單糖殘基以釋放N?連接的寡糖。在37℃,進行消化3小時。
用于溶液中抗體的寡糖釋放方法
將40?50μg抗體與2mM Tris,pH7.0中的2.5mU PNGaseF(Glyko,U.S.A.),混合,所述混合物處于25μl的最終體積,并且將該混合物在37℃溫育3小時。
PNGaseF釋放的寡糖的內切糖苷酶H消化對于向MALDI/TOF?MS中性寡糖峰分配雜交等分寡糖結構的應用
隨后用內切糖苷酶H(EC3.2.1.96)消化PNGaseF釋放的寡糖。對于EndoH消化,將15mU EndoH(Roche,瑞士)加入到PNGaseF消化物中(上述抗體在溶液中的方法),從而提供最終體積30μl,并在37℃下培養該混合物3小時。EndoH使N?連接寡糖的幾丁二糖核心的N?乙酰葡糖胺殘基間斷裂。該酶僅能消化寡甘露糖和大多數雜交類型聚糖,而復合類型寡糖是不水解的。
用于MALDI/TOF?MS的樣品制備
在添加乙酸至最終濃度150mM后,進一步室溫溫育含有釋放的寡糖的酶消化物3小時,并且隨后通過裝在微?生物?旋轉(micro?bio?spin)層析柱(BioRad,瑞士)中的0.6ml的陽離子交換樹脂(AG50W?X8樹脂,氫形式,100?200網眼,BioRad,瑞士),去除陽離子和蛋白質。對不銹鋼靶板應用1微升由此生成的樣品,并在該板上與1μl sDHB基質混合。通過將2mg的2,5?二羥基苯甲酸和0.1mg的5?甲氧基水楊酸溶解在1ml乙醇/10mM水性氯化鈉1∶1(v/v)中,制備sDHB基質。空氣干燥所述樣品,應用0.2μl乙醇,并且最終容許所述樣品在空氣中再結晶。
MALDI/TOF?MS
用于獲得質譜的MALDI?TOF質譜儀是Voyager Elite(遠景生物系統(Perspective Biosystems))。以線性配置操作該儀器,其具有20kV的加速度和80ns的延時。為了離子的質量分配,使用了利用寡糖標準的外部校準。總結了來自200個激光點的光譜,從而獲得最終光譜。
全血B細胞的損耗
將來自健康供體的495μl肝素化血液等分到5ml的聚苯乙烯管中,加入5ul濃縮了100倍的抗體樣品(最終濃度1?1000ng/ml)或單獨的PBS,在37℃溫育所述管。24小時后,將50μl血液轉移到新的管中,并在黑暗中,用抗CD3?FITC,抗CD19?PE和抗CD45?CyChrome(百克頓?迪克森(Becton?Dickinson))室溫染色15分鐘。分析前,向所述管中加入500μlFACS緩沖液(含有2%FCS和5mM EDTA的PBS)。通過在CD45?CyChrome上設定閾值,通過流式細胞計數分析血液樣品的CD3?FITC和CD19?PE熒光。通過繪圖CD19+B細胞與CD3+T細胞的比例,確定B細胞的損耗。
抗CD20抗體與Raji細胞的結合
將180μl FACS緩沖液(含有2%FCS和5mM EDTA的PBS)中的200,000個細胞轉移到5ml的聚苯乙烯管中。下一步,加入20μl濃縮了10倍的抗CD20抗體樣品(最終濃度1?5000ng/ml)或單獨的PBS,并在4℃溫育管30分鐘。隨后,用FACS緩沖液洗滌樣品2次,并在300xg沉淀3分鐘。吸出上清液,并且使細胞吸收于高達100μl的FACS緩沖液中。下一步,加入1μl抗Fc特異性F(ab’)2?FITC片段(杰克遜免疫研究實驗室(Jackson Immuno Research Laboratories),美國),并在4℃溫育所述管30分鐘。用FACS緩沖液洗滌樣品2次,并使其吸收于500μl含有0.5μg/ml PI的FACS緩沖液中,從而利用流式細胞術進行分析。通過針對抗體濃度的幾何平均熒光繪圖確定結合。
實施例2
高度同源受體方法
通過將小鼠B?ly1蛋白質序列與人種系序列集合對比,并選擇顯示出最高序列同一性的人序列,來進行高度同源抗體受體構架研究。在此,將來自VBase數據庫的序列VH1_10(基因座1?e,Acc.No.DP?88)選為重鏈的構架受體序列,并且將來自IMGT數據庫的IGKV2?40(Acc.No X59314)序列選為輕鏈的構架受體。向這兩種受體構架上,結合小鼠重鏈和輕鏈可變結構域的三個互補決定區(CDRs)。由于構架4區域不是種系V基因可變區域的一部分,所以單獨地針對該位置進行對比。為重鏈選擇了JH4區域,并且為輕鏈選擇了JK4區域。所設計的免疫球蛋白結構域的分子模型顯示一個這樣的部位,其在CDR外,潛在地需要鼠氨基酸殘基,取代人氨基酸殘基。向人構架中再引入鼠氨基酸殘基將產生所謂的回復突變。例如,位于Kabat位置27處的人受體氨基酸殘基被回復突變為酪氨酸殘基。將人源化抗體變體設計為包括或省略該回復突變。人源化抗體輕鏈不需要任何的回復突變。設計了蛋白質序列后,如下所述合成了編碼這些蛋白質的DNA序列。
混合的構架方法
為了避免在人受體構架的關鍵氨基酸殘基位置(對保持良好的抗原結合親和性或抗體功能關鍵的)引入回復突變,研究在位于天然人種系序列的那些重要位置處,是完整構架區1(FR1),還是構架區1(FR1)和2(FR2)一起,可以被已經具有供體殘基的人抗體序列或其功能等價序列取代。為了這個目的,分別地將小鼠B?ly1序列的VH構架1和2與人種系序列進行對比。在此,最高序列同一性對于選擇受體構架不重要,并且不被使用,但是代替地,假定若干關鍵殘基的匹配是更重要的。那些關鍵的殘基包括殘基24,71,和94(Kabat編號),和還有那些位于位置27,28,和30(Kabat編號)的殘基,所述殘基位于由Kabat形成的CDR1定義外,但是通常在抗原結合中有所涉及。選擇IMGT序列IGHV3?15(Acc NoX92216)為適合的序列。設計了蛋白質序列后,如下所述合成了編碼這些蛋白質的DNA序列。利用該方法,為了保持抗原結合的良好水平,輕鏈或重鏈都不需要回復突變。
抗體基因的合成
設計了人源化抗體V區域的氨基酸序列后,必須產生DNA序列。個體構架區的DNA序列數據見于人種系序列的數據庫。CDR區域的DNA序列取自相應的鼠cDNA數據。用這些序列,實質上裝配了完整DNA序列。持有該DNA序列數據,通過引入沉默突變,將診斷限制性位點引入到實質序列中,從而產生限制性核酸內切酶的識別位點。為了獲得物質的DNA鏈,進行了基因合成(例如,Wheeler等,1995)。在該方法中,由目的基因設計寡核苷酸,從而使一個寡核苷酸系列源自編碼鏈,并且一個其他的系列來自非編碼鏈。每個寡核苷酸的3’和5’末端(除了該行中的最開始和末尾)通常顯示出與兩個源自對等鏈的引物互補的序列。當將這些寡核苷酸放入對任何熱穩定聚合酶合適的反應緩沖液中,并加入Mg2+,dNTPs和DNA聚合酶時,每個寡核苷酸從其3’末端開始延長。一個引物新形成的3’末端再與對等鏈的下一個引物退火,并進一步在適合模板依賴性DNA鏈延長的條件下,延伸其序列。將最終產物克隆到大腸桿菌中用于增殖的常規載體中。
抗體產生
利用標準分子生物技術,將人重鏈和輕鏈前導序列(用于分泌)添加到上述可變區序列的上游,并且然后將這些分別連接于人IgG1κ恒定重鏈和輕鏈序列的上游。將由此產生的完整抗體重鏈和輕鏈DNA序列,在MPSV啟動子和合成多腺苷酸位點上游的控制下,亞克隆到哺乳動物表達載體中(一個對于輕鏈,一個對于重鏈),其中每種載體均攜帶EBV OriP序列,如以上實施例1中所述。如以上實施例1中所述,即通過下列步驟生產抗體,所述步驟是:用哺乳動物抗體重鏈和輕鏈表達載體共轉染HEK293?EBNA,轉染后5?7天收獲條件培養基,并通過蛋白質A親合層析純化分泌的抗體,隨后進行陽離子交換層析和最終的尺寸排阻層析步驟,從而分離純單體IgG1抗體。將抗體配制在25mM磷酸鉀,125mM氯化鈉,100mM pH6.7的甘氨酸溶液中。如以上實施例1中對于嵌合抗體所述的,通過與GnT?III糖基轉移酶表達載體一起,或與GnT?III表達載體和高爾基體甘露糖苷酶II表達載體一起,共轉染所述抗體表達載體,來產生人源化抗體變體的糖改造變體。如以上對于非糖改造抗體所述,純化并配制糖改造的抗體。如下述,利用MALDI/TOF?MS分析了連接在抗體Fc區域的寡糖。
寡糖分析
用于溶液中抗體的寡糖釋放方法。將40?50μg的抗體與2.5mUPNGaseF(Glyko,U.S.A.)混合于最終體積為25微升的2mM Tris,pH7.0中,并且將該混合物在37℃溫育3小時。
用于MALDI/TOF?MS的樣品制備
在添加乙酸至最終濃度150mM后,進一步室溫溫育含有釋放的寡糖的酶消化物3小時,并且隨后通過裝在微?生物?旋轉(micro?bio?spin)層析柱(BioRad,瑞士)中的0.6ml的陽離子交換樹脂(AG50W?X8樹脂,氫形式,100?200網眼,BioRad,瑞士),以去除陽離子和蛋白質。對不銹鋼靶板應用1微升的由此生成的樣品,并在該板上與1μl sDHB基質混合。通過將2mg的2,5?二羥基苯甲酸和0.1mg的5?甲氧基水楊酸溶解在1ml乙醇/10mM水性氯化鈉1∶1(v/v)中,制備sDHB基質。空氣干燥所述樣品,應用0.2μl乙醇,并且最終容許所述樣品在空氣中再結晶。
MALDI/TOF?MS
用于獲得質譜的MALDI?TOF質譜分光計是Voyager Elite(遠景生物系統(Perspective Biosystems))。以線性配置操作該儀器,其具有20kV的加速度和80ns的延時。為了離子的質量分配,使用了利用寡糖標準的外部校準。總結了來自200個激光點的光譜,從而獲得最終光譜。
抗原結合測定
利用基于流式細胞術的測定,測試了純化的,單體人源化抗體變體與Raji B細胞淋巴瘤靶細胞上的人CD20的結合,正如以上實施例1中對于嵌合B?ly1抗體所描述的。
單體IgG1糖變體與NK細胞和表達FcγRIIIA的CHO細胞系的結合
應用富含CD16?和CD56?陽性細胞的陰性選擇,從新近分離的外周血單核細胞(PBMC)中分離人NK細胞(MACS系統,Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach/德國)。由CD56表達所確定的純度是88?95%。在37℃,將新近分離的NK細胞在不含鈣和鎂離子的PBS(3x105細胞/ml)中溫育20分鐘,從而去除NK細胞結合的IgG。以106細胞/ml的密度,將細胞溫育在含有不同濃度的抗CD20抗體(0,0.1,0.3,1,3,10μg/ml)的PBS,0.1%BSA中。多次洗滌后,通過利用1∶200FITC?綴合的F(ab’)2山羊抗人,F(ab’)2特異性IgG(杰克遜免疫研究(Jackson ImmunoReasearch),West Grove,PA/USA)和抗人CD56?PE(BD生物科技(BD Biosciences),Allschwil/瑞士)的培養檢測抗體結合。以10μg/ml的濃度加入抗FcγRIIIA3G8F(ab’)2片段(Ancell,Bayport,MN/USA),從而競爭抗體糖變體(3μg/ml)的結合。在FACSCalibur(BD生物科技,Allschwil/瑞士)上,對CD56陽性細胞確定指示結合的抗體變體的熒光強度。通過用編碼FcγRIIIA Val158α?鏈和γ?鏈的表達載體的電穿孔(280V,950μF,0.4cm),轉染CHO細胞。通過添加6μg/ml嘌呤霉素選擇轉染子,并利用10μl FITC?綴合的?抗?FcγRIII3G8單克隆抗體(BD生物科技,Allschwil/瑞士),通過FACS分析了對于106個細胞的穩定克隆。與上述NK細胞結合相似地進行了IgG1與表達FcγRIIIA?Val158的CHO細胞結合。
ADCC測定
人外周血單核細胞(PBMC)用作效應細胞,并且利用Histopaque?1077(希格瑪診斷公司(Sigma Diagnostics Inc.),St.Louis,MO63178USA)并基本按照制造商的說明對其進行制備。簡要地,利用肝素化的注射器,從志愿者體內取得靜脈血。用PBS(不含Ca++或Mg++)稀釋該血液為1∶0.75?1.3,并且將其層鋪在Histopaque?1077上。將該梯度在室溫下(RT),以400x g,無間斷地離心30分鐘。收集含有PBMC的界面,并用PBS(50ml/來自兩種梯度的細胞)對其進行洗滌,再通過在300xg,室溫離心10分鐘對其進行收獲。用PBS重新懸浮該沉淀后,計數PBMC,并通過在200xg室溫離心10分鐘對其進行洗滌第二次。然后將細胞重新懸浮在適當的培養基中,以進行后繼的步驟。
用于ADCC測定的效應子與靶標的比例對于PBMC和NK細胞分別是25∶1和10∶1。在適當濃度的AIM?V培養基中制備效應細胞,以加入50μl/圓底96孔板的孔。靶細胞是在含有10%FCS的DMEM中生長的人B淋巴瘤細胞(例如,Raji細胞)。在PBS中洗滌靶細胞,在AIM?V中,計數,以0.3百萬/ml并重新混懸靶細胞,從而加入100μl中的30,000個細胞/微孔。在AIM?V中稀釋抗體,將50μl加入到預涂布的靶細胞中,并容許其在室溫下與靶標結合10分鐘。然后,加入效應細胞,并在37℃,含有5%CO2的潮濕空氣中溫育該板4小時。通過利用細胞毒性檢測試劑盒(羅氏診斷(Roche Diagnostics),Rotkreuz,瑞士)測量來自損傷細胞的乳酸脫氫酶(LDH)釋放量,評估靶細胞的殺傷。溫育4小時后,以800xg離心該板。將100μl來自每個孔的上清液轉移到新的透明平底96孔板中。將100μl來自該試劑盒的顏料底物緩沖液加入到每個孔中。利用SOFTmaxPRO軟件(分子裝置(Molecular Devices),Sunnyvale,CA94089,USA),在ELISA計數器中,在490nm至少10分鐘,以確定顏色反應的Vmax值。從僅含有靶標和效應細胞,而無抗體的孔中,測量同時的LDH釋放量。從僅含有靶細胞和1%Triton X?100的孔中確定最大釋放量。如下計算由特異性抗體介導的殺傷百分比:((x?SR)/(MR?SR)*100,其中x是在特定抗體濃度時Vmax的平均值,SR是同時釋放量的Vmax的平均值,并且MR是最大釋放量Vmax的平均值。
補體依賴性細胞毒性測定
計數靶細胞,用PBS對其進行洗滌,并在AIM?V(Invitrogen)中重新混懸細胞為1百萬個細胞/ml。將50μl細胞/孔涂布在平底96孔板中。在AIM?V中制備抗體稀釋液,并加入50μl到細胞中。容許抗體與細胞在室溫下結合10分鐘。新鮮凍融人血清補體(Quidel),用AIM?V稀釋3倍,并向孔中加入50μl。如制造商所述制備兔補體(Cedarlane實驗室),用AIM?V稀釋3倍,并將50μl加入到孔中。作為對照,在加入到該測定之前,將補體來源在56℃加熱30分鐘。
在37℃溫育該測定板2小時。通過測量LDH釋放量確定細胞的殺傷。簡要地,以300xg離心該板3分鐘。將50μl上清液/孔轉移到新的96孔板中,并加入50μl來自細胞毒性試劑盒(羅氏(Roche))的測試劑。利用ELISA計數器的動力學測量確定了上清液中對應于LDH濃度的Vmax。通過在1%Trition X?100的存在下培養該細胞來確定最大釋放量。
全血B細胞損耗測定
如上實施例1中所述實現由抗CD20抗體引起的全血中正常B細胞的損耗。
程序性細胞死亡測定
通過過夜(16?24小時)溫育10μg/ml(就抗原結合而言的飽和條件)的抗體和靶細胞(處于靶細胞濃度5x105細胞/ml),評估抗體的程序性細胞死亡潛力。用AnnV?FITC染色樣品,并利用FACS對其進行分析。測定一式三份地進行。
通過根據程序性細胞死亡標記,如膜聯蛋白V和磷脂酰絲氨酸,的表觀,利用流式細胞術進行檢測。陰性對照(無誘導的程序性細胞死亡)不含任何抗體,而僅含磷酸緩沖鹽溶液。陽性對照(最大程序性細胞死亡)含有5微摩爾的強程序性細胞死亡誘導劑喜樹堿(CPT)。
結果和討論
抗體變體B?HH1,B?HH2,B?HH3,和母體嵌合抗體chB?ly1(以上實施例1中所述)的人CD20抗原結合的比較顯示所有抗體都具有相似的EC50值,但是B?HH1構建體與變體B?HH2和B?HH3相比,以較低的強度/化學計量結合(圖11),其中所述抗體變體B?HH1,B?HH2,B?HH3是與人源化B?ly1輕鏈(BKV1)復合的。B?HH1可以通過其部分的人CDR1和CDR2區域(Kabat定義),以及位置28(Kabat編號)處的Ala/Thr的多態性,與B?HH2和B?HH3區分開。這說明位置28,完整CDR1,和/或完整CDR2對于抗體/抗原相互作用都很重要。
B?HL1,B?HH1和嵌合chB?ly1母體抗體的比較顯示了B?HL1構建體中任何結合活性的缺乏,以及B?HH1與B?ly1相比大約一半的結合強度/化學計量(圖12)。B?HL1和B?HH1均是基于源自人VH1種類的受體構架而設計的。在其他區別中,B?HL1構建體的位置71(Kabat編號)驚人的不同,這說明其對于抗原結合推定的重要性。位置71處的氨基酸是確定重鏈CDR2的規范環結構的殘基之一。在此,丙氨酸或其功能等價物(例如,亮氨酸,纈氨酸,或蘇氨酸(見于,例如,Morea等,方法(Methods)20:267?279(2000))似乎對于抗原結合很重要,而精氨酸對于抗原結合似乎是不利的。
當比較圖2和9?13的抗原結合數據時,在所測試的不同人源化抗體變體中,BHH2?BKV1,BHL8?BKV1,和BHL11?BKV1變體顯示出與人細胞表面上的人CD20良好的結合親和性。盡管抗原結合的相似EC50值,這些變體在它們誘導CD20陽性靶細胞中的程序性細胞死亡中,嚴重不同(見圖4?6,14,15)。由于原始B?ly1抗體顯示了低的程序性細胞死亡誘導,本發明確定了母體B?ly1抗體構建體和B?HL8和B?HH2構建體之間的區別。在B?HH2重鏈中鑒定了7個不存在于B?HL8或母體B?ly1重鏈中的殘基:Gln1,Ala9,Val11,Lys12,Ser16,Val20,和Met48。全部7個這些殘基位于VH結構域的構架區中。除對于Gln1外,直接抗原接觸的可能性是不可能的。為了確定這些殘基中單獨一個是否是形成新產生的程序性細胞死亡誘導特性的原因,產生了B?HL8重鏈的7種變體,所述變體潛在地可以恢復B?HH2構建體的程序性細胞死亡行為,它們是:B?HL11(具有突變E1Q),B?HL12(G9A,V48M),B?HL13(L11V,V48M),B?HL14(V12K,V48M),B?HL15(G16S,V48M),B?HL16(L20V,V48M),和B?HL17(V48M)。見于SEQ ID NOs:32,34,36,38,40,42,和44(存在于序列表中時,這些不是按照Kabat編號的,但是它們的Kabat編號可以容易地由普通技術人員確定)。這些變體的抗原結合特性,就EC50值和化學計量而言,并不徹底不同(見圖2)。然而,可以在它們誘導程序性細胞死亡的能力上發現明顯的區別(圖4?6,14,15,和24)。具有L11V,V48M修飾的構建體,即B?HL13,顯著增高了誘導程序性細胞死亡的能力(見圖24)。然而,V48M修飾,單獨地,沒有明顯的作用(見圖5)。因此,位于Kabat位置11和12的殘基最大范圍地影響程序性細胞死亡行為。這些殘基不直接影響抗原的結合,而是影響VH和CH1結構域之間的界面,并由此通過肘角度的修飾發生作用。
B?HL4構建體通過用人種系序列IGHV1?45(Acc No X92209)的FR1取代B?HH2的FR1,來源于B?HH2抗體。該構建體盡管僅在FR1中的4個位置具有不同的氨基酸,卻顯示出極大降低的抗原結合能力。這些殘基位于位置2,14,28和30(Kabat編號)。在這些中,位置28和30可能是有影響的位置,其原因在于它是CDR1的Chothia定義的一部分。在變體B?HH8和9(均具有BKV1輕鏈)中,位置28和30與母體B?ly1序列相比是被修飾的。如圖22所示,如果蘇氨酸28或蘇氨酸30存在,則結合特性不會受到顯著的損害(圖22)。在人源化輕鏈中沒有引入回復突變,所述輕鏈具有結合的完整Kabat CDR1,CDR2和CDR3。在程序性細胞死亡的誘導中(見圖14,15和21),最有效的變體是人源化B?ly1變體BHH2?BKV1(甚至比原始chB?ly1更有效,并且比具有與利妥昔單抗相同的序列的抗體,C2B8有效得多)。其他可以恢復增加的程序性細胞死亡的人源化變體是:B?HL13和B?HL14(BHL8的衍生物),BHH8(“混合的構架”),BHH9(具有一個回復突變從而檢查S30T的作用的“混合的構架”),和B?HH6(B?HH2的M34I衍生物)。變體BHH4是另一種未引入另外的非人序列的人源化B?ly1變體。變體B?HH5,B?HH6和B?HH7是B?HH2構建體的衍生物,其具有部分人源化的Kabat CDR1區域。
人源化B?ly1抗體的重要特性是:它是如Cragg,M.S.和Glennie,M.J.,血液(Blood)103(7):2738?2743(2004年4月)中所定義的II型抗CD20抗體。因此,利用Polyak,M.J.和Deans,J.P.,血液(Blood)99(9):3256?3262(2002)中所述的用于該目的的測定,它在與CD20的結合后,不誘導任何顯著的對CD20的非離子型去污劑提取物的抗性,所述CD20的非離子型去污劑提取物來自CD20+人細胞的表面。它與C2B8抗體(另一種抗CD20抗體,其具有與利妥昔單抗相同的序列(見,Reff的美國專利公開號20030003097))相比,誘導對CD20的非離子型去污劑提取物明顯更低的抗性。如對II型抗CD20抗體的預測,人源化B?ly1不具有任何顯著的補體介導的溶胞活性,并且表現出比抗CD20抗體C2B8(具有與利妥昔單抗相同序列的嵌合IgG1)低得多的補體介導的溶胞活性。人源化B?ly1抗體(變體B?HH2B?KV1)的另一個重要特性是:它在同型聚集測定中非常有效。在該測定中,如在Deans等中所詳述地,在哺乳動物細胞培養箱中,以37℃,5%CO2空氣,在細胞培養基中培養CD20陽性人細胞,即Daudi細胞和濃度為1微克/ml的抗體,以及平行地濃度為5微克/ml的抗體,長達24小時。作為比較,在與使用抗CD20抗體,即C2B8相同的條件下,進行細胞的平行對照培養。在不同的時間點,包括8小時和24小時培養,利用顯微鏡視覺檢查該細胞。發現人源化B?ly1抗體導致強烈的同型聚集,其聚集顯著地大于由添加C2B8對照抗體所誘導的那些。另外,且與作為抗CD20類型II的抗體相一致,當用人源化B?ly1抗體培養CD20陽性人細胞時,與利用具有與利妥昔單抗相同序列的C2B8嵌合IgG1抗體相同的條件下的對照相比,它誘導更高水平的程序性細胞死亡。
通過在哺乳動物細胞中共表達GnTIII糖基轉移酶和抗體基因產生人源化抗體的糖改造變體。這導致附著于抗體Fc區域的非巖藻糖基化寡糖片段的增加,其包括等分的非巖藻糖基化寡糖,正如WO2004/065540中所述(圖17?19)。糖改造的抗體,與非糖改造抗體和C2B8抗體相比,具有顯著更高水平的與人FcγRIII受體的結合(圖20),以及更高的ADCC活性(圖16)。人源化B?ly1抗體在全血測定中,還比對照C2B8抗體更加有效地誘導人B細胞損耗(圖16)。這對于非糖改造的B?ly1抗體和其糖改造形式都是正確的。糖改造抗體在全血測定中損耗B細胞的方面,比C2B8對照抗CD20抗體更有效大約1000倍。該比較對于非糖改造的和糖改造的B?ly1抗體的人源化形式都很重要,原因在于其顯示在組合的Fc受體依賴性活性,如ADCC,和補體介導的溶胞,和程序性細胞死亡誘導的測定中,B?ly1的兩種形式都比C2B8顯著更有效,盡管B?ly1的兩種形式都具有明顯更低的補體介導的溶胞活性。ADCC,Fc受體依賴性細胞殺傷活性和程序性細胞死亡誘導存在于人源化B?ly1抗體變體的這一優越的活性中。此外,在程序性細胞死亡測定中,該類型II抗CD20抗體的糖改造和非糖改造形式都是有效的,其中具有增加的與Fcγ受體結合親和性的Fc改造變體在程序性細胞死亡的誘導中比非Fc改造變體甚至更加有效,并且其中所有變體都比對照抗體C2B8顯著地更加有效。由類型II抗CD20抗體介導的增強的同型聚集和程序性細胞死亡誘導的精確機制是未知的,并且伴隨結合于CD20陽性細胞表面上其他分子,如Fcγ受體可以影響該重要特性。因此,證明這樣的II型抗CD20抗體仍然能夠誘導甚至高于非Fc改造的強程序性細胞死亡作用和同型聚集是很重要的,其中已經在所述II型抗CD20抗體的Fc區域中進行了改造,從而獲得與Fcγ受體,包括FcγRIII增高的結合親和性和相關的ADCC活性的增高,。程序性細胞死亡的誘導是重要的,因為,在體內,身體中存在著這樣的位置,在所述位置可以發現靶CD20陽性細胞,但與FcγRIII陽性細胞的接近比在血液中更難(例如,淋巴結)。在那些位置,由抗CD20抗體自身引起的程序性細胞死亡的誘導對于人類中抗CD20抗體治療的良好功效可以是關鍵的,所述抗CD20抗體治療是對血液惡性腫瘤,如非霍奇金淋巴瘤和B細胞慢性淋巴細胞白血病的治療,和對自體免疫疾病,如類風濕性關節炎和由B細胞損耗方法引起的狼瘡的治療。人源化Fc改造的II型抗CD20抗體與FcγRIII增高的結合親和性以及較高的ADCC也可以是對該治療非常重要的性質。最后,該II型抗CD20抗體,包括人源化和Fc改造變體的降低或可忽略不計的補體介導的溶胞活性也可以是重要的,其原因在于已將由抗CD20抗體引起的較高的補體活化與增高的,不需要的副作用聯系起來了。
實施例3
為了進一步檢查影響程序性細胞死亡活性的殘基,產生了BHH2重鏈的6種變體:BHH2?A(V11L)(SEQ ID NO:124),BHH2?B(K12V)(SEQ IDNO:125),BHH2?C(A9G)(SEQ ID NO:126),BHH2?D(E10G)(SEQ ID NO:127),BHH2?E(T110I)(SEQ ID NO:128),和BHH2?F(S112I)(SEQ ID NO:129)。通過上文所述的方法,測試了這些變體構建體與靶抗原(CD20)的結合。6種變體構建體全保持了結合活性。
通過上文所述的方法,還測試了這些重鏈變體構建體的程序性細胞死亡作用,其中5種構建體,即BHH2?B,BHH2?C,BHH2?D,BHH?2E,和BHH?2F具有與BHH2母體構建體相同的程序性細胞死亡潛力。然而,BHH2?A(V11L)誘導程序性細胞死亡的能力與BHH2相比,顯著降低了(見圖23)。
還通過產生5種變體檢查了人源化B?ly1輕鏈(BKV1)中單一氨基酸替換的程序性細胞死亡作用,所述5種變體是:BKV?10(P40A)(SEQ IDNO:130),BKV?11(A80P)(SEQ ID NO:131),BKV?12(V83F)(SEQ IDNO:132),BKV?13(E105A)(SEQ ID NO:133),和BKV?14(I106A)(SEQ IDNO:134)。通過上文所述的方法測試了構建體BKV?11,BKV?12,BKV?13,和BKV?14與靶抗原(CD20)的結合,并且確定全部4種變體都保持了結合活性。還通過上文中所述的方法測試了這4種輕鏈變體構建體的程序性細胞死亡作用。BKV?11,BKV?12,和BKV?13的程序性細胞死亡潛力不由它們各自的替換而改變。然而,BKV?14證明了與BKV1相比降低的誘導程序性細胞死亡的能力(見,例如,圖25)。
將本說明書中提及的所有公開文獻,如教科書,雜志文章,GenBank的條目,以及公開的申請和專利申請以這樣的程度引入本文作為參考,所述程度如同明確和分別地顯示將每篇單獨的公開文獻或專利申請引入作為參考。   內容來自專利網www.wwszu.club轉載請標明出處

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