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降解河豚毒素的提取液及其制備方法.pdf

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降解 河豚毒素 提取 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310135898.9

申請日:

2013.04.18

公開號:

CN103233043B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12P 1/04申請日:20130418|||公開
IPC分類號: C12P1/04; G01N33/577; C12Q1/68; A61K35/74; A61P39/02; C12R1/01(2006.01)N 主分類號: C12P1/04
申請人: 上海海洋大學
發明人: 鮑寶龍; 盧瑛; 馬廷龍; 趙靜; 劉靜; 張莉君
地址: 201306 上海市浦東新區臨港新城滬城環路999號
優先權:
專利代理機構: 上海三和萬國知識產權代理事務所(普通合伙) 31230 代理人: 侯佳猷
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310135898.9

授權公告號:

103233043B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.09.04|||2013.08.07

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種從產河豚毒素的細菌發酵液中制備降解河豚毒素的物質的方法和提取液的制備檢測方法,包括人工造成質粒丟失的方法、河豚毒素降解物質的提取方法、降解河豚毒素的檢驗方法。在本發明中,首次發現氣單胞菌Aeromonas?molluscorum中存在降解河豚毒素的物質,并建立了提取該物質的抽提方法,該方法有望用于降解河豚毒素物質的規模化生產。本發明涉及的細菌發酵液的抽提物具有降解河豚毒素的作用,可應用于制備用于治療河豚毒素中毒的藥物,可為科學研究、醫藥行業等相關領域提供原料。

權利要求書

權利要求書
1.   一種提取降解河豚毒素的物質的方法,其特征在于,包括如下步驟:
(1)將質粒丟失的產河豚毒素的細菌發酵培養至少48小時,離心收集細胞;
(2)用0.1%?1%乙酸溶解細胞,超聲波破碎細胞;
(3)95?105℃煮20?25min,冷卻后離心去除細胞碎片;
(4)過濾上清;
(5)對過濾液過活性碳柱,洗脫液的配方為:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80;
(6)洗脫液在40?50℃減壓濃縮,冷凍干燥;
(7)溶于無菌去離子水中;
(8)過Bio?Gel P2柱子;
(9)用0.02?0.05M乙酸洗脫,收集洗脫液;
(10)洗脫液再用C18Sep?Pak cartridges過柱;
(11)用5?20ml0.3%的乙酸洗脫,收集洗脫液;
(12)將洗脫液過濾;
(13)過濾液冷凍干燥后,溶解在無菌去離子水中,得到降解河豚毒素的物質的提取液。

2.   如權利要求1所述的提取降解河豚毒素的物質的方法,其特征在于,所述的質粒丟失的產河豚毒素細菌是軟體動物氣單胞菌,或是其它產河豚毒素的細菌。

3.   如權利要求1或2所述的提取降解河豚毒素的物質的方法,其特征在于,所述方法進一步包括以下檢測步驟:
將濾液作為待測樣本,調整pH值為6.5?7.4,用ELISA法檢測樣本中的河豚毒素。

4.   如權利要求1或2所述的提取降解河豚毒素的物質的方法,其特征在于,造成所述的產河豚毒素細菌丟失質粒的人工發酵培養方法,包括如下步驟:
(1)將所述的產河豚毒素細菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養基中;
(2)20?28℃下,200?450轉/分鐘,至少培養48小時。

5.   如權利要求4所述的提取降解河豚毒素的物質的方法,其特征在于,所述ORI液體培養基的組成為:0.05%精氨酸,0.2%胰蛋白胨,0.2%大豆蛋白胨,0.1%酵母抽提物,0.088%檸檬酸鐵,3%NaCl,余量為蒸餾水,pH7?8.5。

6.   如權利要4所述的提取降解河豚毒素的物質的方法,其特征在于,所述ORI液體培養基制備方法:在800ml去離子水中加入2g胰蛋白胨,2g大豆蛋白胨,1g酵母抽提物,30g氯化鈉和0.5g L?精氨酸,攪拌溶解后,再加入0.88g檸檬酸鐵,繼續攪拌,直到完全溶解后,加入去離子水定容至1000ml,并調節PH至7?8.5后封口滅菌。

7.   如權利要求3所述的提取降解河豚毒素的物質的方法,其特征在于,所述的檢測步驟中的ELISA法檢測包括如下步驟:
(1)在固定有抗原的酶標板上分別加入河豚毒素標準品,待測樣本和添加了河豚毒素標準品的待測樣本;
(2)在酶標板上加入河豚毒素的特異性抗體溶液;
(3)20?40℃孵育至反應完全,加入洗滌液洗滌酶標板3次;
(4)加入酶標二抗,20?40℃孵育至反應完全,加入洗滌液洗滌酶標板3次;
(5)加入顯色液,37℃孵育10?15min后,每孔加入終止液以終止反應;
(6)結果檢測:將酶標板插入酶標儀中,檢測450nm處的吸光值。

8.   如權利要求7所述的提取降解河豚毒素的物質的方法,其特征在于,所述ELISA法的步驟(1)中,添加了河豚毒素標準品的待測樣本,其河豚毒素標準品添加終濃度為25?200ng/mL。

9.   如權利要求7所述的提取降解河豚毒素的物質的方法,其特征在于,所述ELISA法的步驟(2)中的特異性抗體為河豚毒素的特異性單抗。

10.   如權利要求7所述的提取降解河豚毒素的物質的方法,其特征在于,所述ELISA法的步驟(3)中,孵育至反應完全所需時間為1.5h;所述ELISA法的步驟(4)中孵育至反應完全為1h。

11.   一種使產河豚毒素的細菌丟失質粒的人工發酵培養方法,其特征在于,包括如下步驟:
(1)將所述產河豚毒素的細菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養基中;
(2)23℃下,225轉/分鐘,至少培養48小時。

12.   如權利要求11所述造成產河豚毒素的細菌丟失質粒的人工發酵培養方法,其特征在于,所述產河豚毒素的細菌為產河豚毒素的氣單胞菌。

13.   如權利要求11或12所述造成產河豚毒素的細菌丟失質粒的人工發酵培養方法,其特征在于,所述ORI液體培養基的組成為:0.05%精氨酸,0.2%胰蛋白胨,0.2%大豆蛋白胨,0.1%酵母抽提物,0.088%檸檬酸鐵,3%NaCl,余量為蒸餾水,pH7?8.5。

14.   一種實時定量PCR檢測方法,其用于檢測如權利要求1?13任一項所述方法采用的細菌的質粒丟失,其特征在于,包括如下步驟:
(1)定量PCR標準曲線制作:將提取的Ne?1質粒用無菌水進行10倍系列稀釋,分別稀釋成6個梯度,作為模板,進行熒光定量PCR來建立標準曲線,按以下公式計算質粒拷貝數:
質粒拷貝數(copies·μL?1)=6.02×1023(copies·mol?1)×質粒濃度(g·μL?1)/質粒分子量(g·mol?1);
(2)實時定量PCR體系:將待測樣品和標準品分別做3個重復置于同一次實驗中進行反應,按下列組分配制PCR反應液:iQ SYBR Green Supermix12.5μl,PCR正向引物1μl,PCR反向引物1μl,質粒模板2μl,加入ddH2O補足至25μl,PCR正向引物序列5’?GACAAGGCTCGGAGACACGCA?3’,PCR反向引物序列5’?TCTCTTTCATGCTGCGGTTCAGC?3’,所述待測樣品為所述丟失質粒的細菌;
(3)實時定量PCR反應程序:95℃5min預變性質粒DNA模板,然后以95℃30s、59℃30s、72℃30s進行30個溫度變化循環,80℃1s、82℃1s進行1個循環,最后59℃至95℃延伸20s,最后,利用隨機軟件進行熔解曲線分析和CT值分析,確定質粒拷貝數;
(4)利用含精氨酸的ORI培養基培養至少48小時,質粒完全丟失。

15.   一種根據權利要求1?10中任一項所述的方法所提取制備得到的河豚毒素降解物質的提取液。

16.   如權利要求15所述的河豚毒素降解物質的提取液在制備用于治療河豚毒素中毒的藥物中的應用。

說明書

說明書降解河豚毒素的提取液及其制備方法
技術領域
本發明涉及生物技術領域,具體涉及藥用微生物開發和利用領域,更具體地涉及一種從細菌發酵液中制備可降解河豚毒素提取液的方法,以及由其提取得到的河豚毒素降解物質提取液。
背景技術
河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX),是一種氨基全羥基喹唑啉的生物堿,為一種毒性極強的神經毒素,通過特異性阻斷細胞膜上的電壓門控鈉離子通道,造成全身麻痹、最終死于呼吸和回流衰竭。TTX中毒潛伏期很短,短至10?30min,長至3?6h發病,發病急,如果搶救不及時,中毒后最快的10min內死亡,最遲4?6h死亡。臨床治療只能依賴于催吐、洗胃、導瀉等減少毒物的吸收的方法,以及使用腎上腺皮質激素,提高組織對毒素的耐受性。目前尚無有效的解毒劑。
目前已有通過制備河豚毒素抗體來阻斷河豚毒素與其受體鈉離子通道的研究報道,但還沒有發現存在直接降解河豚毒素的藥物。
發明內容
本發明發現,1株產TTX的細菌不但能合成河豚毒素,而且其發酵液中同時存在降解河豚毒素的物質。本發明的主要內容是:通過人工丟失產TTX細菌的質粒,使其失去產TTX的能力但卻可以保留生產降解TTX的物質,通過抽提失去質粒的細菌發酵液,可獲取降解河豚毒素的物質。本發明提供了人工造成質粒丟失的方法、質粒丟失的檢測方法、以及降解河豚毒素物質的制備方法。降解河豚毒素物質可用作河豚毒素中毒的解毒藥的開發和相關的科學研究。
本發明的一個目的在于提供一種提取降解河豚毒素的物質的方法,包括如下步驟:
(1)將質粒丟失的產河豚毒素的細菌發酵培養至少48小時(優選48?66小時,更優選67?96小時),離心收集細胞,優選在4℃下4000×g離心30min后收集細胞;
(2)用0.1%?1%乙酸(優選用1%的乙酸)溶解細胞,超聲波破碎細胞;
(3)95?105℃(優選100℃)煮20?25min,冷卻后離心去除細胞碎片;
(4)過濾上清;
(5)對過濾液過活性碳柱,洗脫液的配方為:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80;
(6)洗脫液在40?50℃(優選45℃)減壓濃縮,冷凍干燥;
(7)溶于無菌去離子水中;
(8)過Bio?Gel P2柱子;
(9)用0.02?0.05M(優選0.03M)乙酸洗脫,收集洗脫液;
(10)洗脫液再用C18Sep?Pak cartridges過柱;
(11)用5?20ml0.3%的乙酸洗脫,優選用10ml0.3%的乙酸洗脫,收集洗脫液;
(12)將洗脫液過濾;
(13)過濾液冷凍干燥后,溶解在無菌去離子水中,得到降解河豚毒素的物質的提取液。
在一實施方式中,本發明所述的方法進一步包括以下檢測步驟:將濾液作為待測樣本,調整pH值為6.5?7.4,用ELISA法檢測樣本中的河豚毒素。
在一實施方式中,本發明的提供一種提取降解河豚毒素的物質的方法,包括如下步驟:
(1)將質粒丟失的產河豚毒素的細菌發酵培養至少48小時,4℃下4000×g離心30min收集細胞;
(2)用0.1%乙酸溶解細胞,超聲波破碎細胞;
(3)100℃煮20?25min,冷卻后離心去除細胞碎片;
(4)過濾上清;
(5)對過濾液過活性碳柱,洗脫液的配方為:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80;
(6)洗脫液在45℃減壓濃縮,冷凍干燥;
(7)溶于2ml無菌去離子水中;
(8)過Bio?Gel P2柱子;
(9)用0.03M乙酸洗脫,從洗脫液流出開始收集,收集2ml;
(10)洗脫液再用C18Sep?Pak cartridges過柱;
(11)用10ml0.3%的乙酸洗脫,從第二個柱體積洗脫液流出開始收集,收集兩個柱體積的洗脫液;
(12)將洗脫液過濾;
(13)過濾液冷凍干燥后,溶解在1ml無菌去離子水中;
(14)將濾液作為待測樣本,調整pH值為6.5?7.4,用ELISA法檢測樣本中的河豚毒素。
在本發明的一實施方式中,所述氣單胞菌可以是軟體動物氣單胞菌(Aeromonas molluscorum),也可以是其它產河豚毒素的氣單胞菌,例如來自假單胞菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌(Shewanella)、交替單胞菌(Alteromonas)、芽孢桿菌(Bacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、產堿菌屬(Alcaligenes)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、微球菌屬(Micrococcus)、莫拉菌屬(Moraxella)、弧菌屬(Vibrio)、放線菌(Actinomycetes)、柄桿菌屬(Caulobacter)等類群的產TTX細菌。
在本發明的一實施方式中,造成所述的產河豚毒素的細菌丟失質粒的人工發酵培養方法,包括如下步驟:
(1)將所述的產河豚毒素細菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養基中;
(2)20?28℃(優選23℃)下,200?450轉/分鐘(優選225轉/分鐘),至少培養48小時。
在本發明的一實施方式中,所述ORI液體培養基的組成為:0.05%精氨酸,0.2%胰蛋白胨,0.2%大豆蛋白胨,0.1%酵母抽提物,0.088%檸檬酸鐵,3%NaCl,余量為蒸餾水,pH7?8.5(優選pH8.0)。
在本發明的一實施方式中,所述ORI液體培養基的制備方法(1000ml):在800ml去離子水中加入2g胰蛋白胨(OXOID公司),2g大豆蛋白胨(OXOID公司),1g酵母抽提物(OXOID公司),30g氯化鈉(宜興市第二化學試劑廠)和0.5g L?精氨酸(國藥集團化學試劑有限公司),攪拌溶解后,再加入0.88g檸檬酸鐵(國藥集團化學試劑有限公司),繼續攪拌,直到完全溶解后,加入去離子水定容至1000ml,并調節PH至7?8.5(優選PH8.0)后封口滅菌。
在本發明的一實施方式中,所述的檢測步驟中的ELISA法檢測包括如下步驟:
(1)在固定有抗原的酶標板上分別加入TTX標準品,待測樣本和添加了TTX標準品的待測樣本;
(2)在酶標板上加入TTX的特異性抗體溶液;
(3)20?40℃(優選室溫或37℃)孵育至反應完全,加入洗滌液洗滌酶標板3次;
(4)加入酶標二抗,20?40℃(優選室溫或37℃)孵育至反應完全,加入洗滌液洗滌酶標板3次;
(5)加入顯色液,37℃孵育10?15min后,每孔加入終止液以終止反應;
(6)結果檢測:將酶標板插入酶標儀中,檢測450nm處的吸光值。
在本發明的一實施方式中,所述ELISA法的步驟(1)中,添加了TTX標準品(Sigma?Aldrich公司,產品號:T8024?1MG)的待測樣本,其TTX標準品添加終濃度為25?200ng/mL。
在本發明的一實施方式中,所述ELISA法的步驟(2)中的特異性抗體為TTX的特異性單抗(北京中衛食品衛生科技公司,產品號:5561)。
在本發明的一實施方式中,所述ELISA法的步驟(3)中,孵育至反應完全所需時間為1.5h;所述ELISA法的步驟(4)中孵育至反應完全為1h。
本發明的另一目的在于提供一種造成產河豚毒素的氣單胞菌丟失質粒的人工發酵培養方法,包括如下步驟:
(1)將產河豚毒素的氣單胞菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養基中;
(2)23℃下,225轉/分鐘,至少培養48小時。
在本發明的一實施方式中,上述方法采用的所述ORI液體培養基的組成為:0.05%精氨酸,0.2%胰蛋白胨,0.2%大豆蛋白胨,0.1%酵母抽提物,0.088%檸檬酸鐵,3%NaCl,余量為蒸餾水,pH7?8.5(優選pH8.0)。
本發明的另一目的在于提供一種實時定量PCR檢測方法,其用于檢測上述任一方法采用的細菌或氣單胞菌的質粒丟失,包括如下步驟:
(1)定量PCR標準曲線制作:將提取的Ne?1質粒用無菌水進行10倍系列稀釋,分別稀釋成6個梯度,作為模板,進行熒光定量PCR來建立標準曲線,按以下公式計算質粒拷貝數:
質粒拷貝數(copies·μL?1)=6.02×1023(copies·mol?1)×質粒濃度(g·μL?1)/質粒分子量(g·mol?1);
(2)實時定量PCR體系:將待測樣品和標準品分別做3個重復置于同一次實驗中進行反應,按下列組分配制PCR反應液:iQ SYBR Green Supermix12.5μl,PCR正向引物(2μmol/L)1μl,PCR反向引物(2μmol/L)1μl,質粒模板2μl,加入ddH2O補足至25μl,PCR正向引物序列5’?GACAAGGCTCGGAGACACGCA?3’,PCR反向引物序列5’?TCTCTTTCATGCTGCGGTTCAGC?3’,所述待測樣品為所述丟失質粒的氣單胞菌或所述丟失質粒的細菌;
(3)實時定量PCR反應程序:95℃5min預變性質粒DNA模板,然后以95℃30s、59℃30s、72℃30s進行30個溫度變化循環,80℃1s、82℃1s進行1個循環,最后59℃至95℃延伸20s,最后,利用隨機軟件進行熔解曲線分析和CT值分析,確定質粒拷貝數;
(4)利用含精氨酸的ORI培養基培養至少48小時后,質粒完全丟失。
本發明的另一目的在于提供一種根據上述方法所提取制備得到的河豚毒素降解物質的提取液。
本發明的另一目的在于提供上述的河豚毒素降解物質的提取液在制備用于治療河豚毒素中毒的藥物中的應用。
本發明第一公開了通過改變培養基成分的方法,人工造成氣單胞菌Aeromonas molluscorum質粒丟失,使其失去原具備的合成TTX的能力,其特征在于,包括如下步驟:
(1)將細菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養基(0.05%精氨酸,0.2%胰蛋白胨,0.2%大豆蛋白胨,0.1%酵母抽提物,0.088%檸檬酸鐵,3%NaCl,余量為蒸餾水,pH8.0)中;23℃下,225轉/分鐘,培養48小時。
(2)定量PCR標準曲線制作:將提取的標準質粒用無菌水進行10倍系列稀釋,分別稀釋成6個梯度,作為模板(稀釋的時候用移液槍吹打20次,振蕩5s后離心,使溶液充分混勻),進行熒光定量PCR來建立標準曲線。按以下公式計算質粒拷貝數:質粒拷貝數(copies·μL?1)=6.02×1023(copies·mol?1)×質粒濃度(g·μL?1)/質粒分子量(g·mol?1)。
(3)實時定量PCR體系:將待測樣品和標準品分別做3個重復置于同一次實驗中進行反應,按下列組分配制PCR反應液:iQ SYBR Green Supermix12.5μl,PCR正向引物(2μmol/L)1μl,PCR反向引物(2μmol/L)1μl,質粒模板2μl,加入ddH2O補足至25μl。PCR正向引物序列5’?GACAAGGCTCGGAGACACGCA?3’;PCR反向引物序列5’?TCTCTTTCATGCTGCGGTTCAGC?3’。
(4)實時定量PCR反應程序:95℃5min預變性,然后以95℃30s、59℃30s、72℃30s進行30個循環,80℃1s、82℃1s1個循環,最后59℃至95℃延伸20s。最后,利用隨機軟件進行熔解曲線分析和CT值分析,確定質粒拷貝數。
(5)利用含精氨酸的ORI培養基培養至少48小時,氣單胞菌Aeromonas molluscorum48小時后質粒完全丟失。
本發明第二公開了所述產河豚毒素細菌發酵過程中降解河豚毒素的物質的提取方法,其特征在于,包括如下步驟:
(1)發酵培養66小時后,4℃下4000×g離心30min收集細胞;
(2)用0.1%乙酸溶解細胞,超聲波破碎細胞;
(3)100℃煮20?25min,冷卻后離心去除細胞碎片;
(4)上清用直徑0.25μm濾紙過濾;
(5)過濾液過活性碳柱,用洗脫液洗脫活性碳,洗脫液的配方為:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80;
(6)洗脫液45℃減壓至0.001?0.003M Pa濃縮,冷凍干燥;
(7)溶于2ml無菌去離子水中;
(8)過1×80cm的Bio?Gel P2柱子;
(9)用0.03M乙酸洗脫,從洗脫液流出開始收集,收集2ml;
(10)洗脫液再用C18Sep?Pak cartridges過柱;
(11)用10ml0.3%的乙酸洗脫,從第二個柱體積洗脫液流出開始收集,收集兩個柱體積的洗脫液;
(12)將洗脫液過濾;
(13)過濾液冷凍干燥后,溶解在1ml無菌去離子水中。
本發明第三公開了所述的提取樣本中河豚毒素的檢測方法,其特征在于,包括如下步驟:
(1)在固定有抗原的酶標板上分別加入TTX標準品,待測樣本和添加了TTX標準品的待測樣本;
(2)在酶標板上加入TTX的特異性抗體溶液;
(3)室溫或37℃孵育至反應完全,加入洗滌液洗滌酶標板3次;
(4)加入酶標二抗,室溫或37℃孵育至反應完全,加入洗滌液洗滌酶標板3次;
(5)加入顯色液,37℃孵育10?15min后,每孔加入終止液以終止反應;
(6)結果檢測:將酶標板插入酶標儀中,檢測450nm處的吸光值。
所述步驟(1)中,添加了TTX標準品的待測樣本,其TTX標準品添加終濃度為25?200ng/mL。
所述步驟(2)中的特異性抗體為TTX的特異性單抗。
所述步驟(3)中,孵育至反應完全所需時間為1.5h;所述步驟(4)中孵育至反應完全為1h。
本發明所述的“ORI液體培養基”的制備方法(1000ml):在800ml去離子水中加入2g胰蛋白胨(OXOID公司),2g大豆蛋白胨(英國OXOID公司),1g酵母提取物(英國OXOID公司),30g氯化鈉(宜興市第二化學試劑廠)和0.5g L?精氨酸(國藥集團化學試劑有限公司),攪拌溶解后,再加入0.88g檸檬酸鐵(國藥集團化學試劑有限公司),繼續攪拌,直到完全溶解后,加入去離子水定容至1000ml,并調節PH至8.0后封口滅菌。
本申請采用在已于2011年3月30日公開的中國專利申請號201010179363.8中記載的產河豚毒素的氣單胞菌(Aeromonas molluscorum),該菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號。保藏日期:2010年04月23日,保藏編號:CGMCC No.3760。
造成產河豚毒素細菌的質粒丟失的培養方法是可以重復再現的。將產河豚毒素的細菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養基中(ORI液體培養基的組成為:0.05%精氨酸,0.2%胰蛋白胨,0.2%大豆蛋白胨,0.1%酵母抽提物,0.088%檸檬酸鐵,3%NaCl,余量為蒸餾水,pH8.0),在23℃下,225轉/分鐘,至少培養48小時后,可造成產河豚毒素細菌的質粒丟失。
本發明所采用的試劑、樣品均為可通過商業途徑獲得的市售產品,大部分購自英國OXOID公司和國藥集團化學試劑有限公司。
本發明的有益效果:
1)本發明是通過從細菌發酵液中制備對河豚毒素具有降解效果的提取液,該提取液可作為今后臨床治療河豚毒素中毒的藥物。
2)本發明的河豚降解物質的提取方法可用作降解河豚毒素物質的規模化生產,可為科學研究、醫藥行業等相關領域提供原料。
附圖說明
以下結合附圖和具體實施方式來進一步說明本發明。
圖1為氣單胞菌Aeromonas molluscorum細菌質粒丟失時間序列。
圖2為ELISA檢測TTX的標準曲線。
具體實施方式
為了使本發明的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解,下面結合具體圖示,進一步闡述本發明。
實施例1
1、利用改進培養基造成氣單胞菌Aeromonas molluscorum質粒丟失的方法,可按照以下步驟操作:
(1)將細菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養基中,ORI液體培養基制備方法(1000ml)為:在800ml去離子水中加入2g胰蛋白胨(OXOID公司),2g大豆蛋白胨(OXOID公司),1g酵母提取物(OXOID公司),30g氯化鈉(宜興市第二化學試劑廠)和0.5g L?精氨酸(國藥集團化學試劑有限公司),攪拌溶解后,再加入0.88g檸檬酸鐵(國藥集團化學試劑有限公司),繼續攪拌,直到完全溶解后,加入去離子水定容至1000ml,并調節PH至8.0后封口滅菌。
(2)23℃下,225轉/分鐘,至少培養48小時。
2、利用實時定量PCR檢測細菌Aeromonas molluscorum質粒丟失的方法,可按照以下步驟操作:
(1)定量PCR標準曲線制作:將提取的標準質粒用無菌水進行10倍系列稀釋,分別稀釋成6個梯度,作為模板(稀釋的時候用移液槍吹打20次,振蕩5s后離心,使溶液充分混勻),進行熒光定量PCR來建立標準曲線。按以下公式計算質粒拷貝數:質粒拷貝數(copies·μL?1)=6·02×1023(copies·mol?1)×質粒濃度(g·μL?1)/質粒分子量(g·mol?1)。
(2)將細菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養基中,分別培養至18、24、48、72、96小時后,收集細菌,以堿法同時抽提各期細菌的質粒。
(3)實時定量PCR體系:將待測質粒樣品和標準品分別做3個重復置于同一次實驗中進行反應,按下列組分配制PCR反應液:iQ SYBR Green Supermix(Bio?Rad公司)12.5μl,PCR正向引物(2μmol/L)1μl,PCR反向引物(2μmol/L)1μl,質粒模板2μl,加入ddH2O補足至25μl。PCR正向引物序列5’?GACAAGGCTCGGAGACACGCA?3’;PCR反向引物序列5’?TCTCTTTCATGCTGCGGTTCAGC?3’。
(4)實時定量PCR反應程序:95℃5min預變性,然后以95℃30s、59℃30s、72℃30s進行30個循環,80℃1s、82℃1s1個循環,最后59℃至95℃延伸20s。最后,利用隨機軟件進行熔解曲線分析和CT值分析,確定質粒拷貝數。
3、降解河豚毒素的物質的提取方法,包括如下步驟:
(1)將丟失質粒的氣單胞菌發酵培養48小時后,4℃下4000×g離心30min收集細胞;
(2)用0.1%乙酸溶解細胞,超聲波破碎細胞;
(3)100℃煮20?25min,冷卻后離心去除細胞碎片;
(4)上清用直徑0.25μm濾紙過濾;
(5)過濾液過活性碳柱,用洗脫液洗脫活性碳,洗脫液的配方為:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80;
(6)洗脫液45℃減壓至0.001?0.003M Pa濃縮,冷凍干燥;
(7)溶于2ml無菌去離子水中;
(8)過1×80cm的Bio?Gel P2柱子(Bio?Rad Lab,Richmond,VA,USA);
(9)用0.03M乙酸洗脫,從洗脫液流出開始收集,收集2ml;
(10)洗脫液再用C18Sep?Pak cartridges過柱(Waters,Milford,MA);
(11)用10ml0.3%的乙酸洗脫,從第二個柱體積洗脫液流出開始收集,收集兩個柱體積的洗脫液;
(12)將洗脫液過濾;
(13)過濾液冷凍干燥后,溶解在1ml無菌去離子水中。
(14)將濾液作為待測樣本,調整pH值為6.5?7.4,用ELISA法檢測樣本中的河豚毒素。
4、發酵提取樣本中河豚毒素的檢測,包括如下步驟:
(1)采用市售的河豚毒素ELISA檢測試劑盒(北京中衛食品衛生科技公司,產品號:5561),在固定有抗原的酶標板上分別加入50μL TTX標準品(Sigma?Aldrich公司,產品號:T8024?1MG)(0、10、20、50、200ng/ml),待測樣本和添加了TTX標準品(終濃度為50ng/mL,100ng/mL)的待測樣本以及對照樣本(培養基);
(2)在酶標板上加入TTX的特異性抗體溶液(50μL/孔);
(3)37℃孵育1.5h,加入洗滌液洗滌酶標板3次;
(4)每孔加入100μL酶標二抗,37℃孵育1h,加入洗滌液洗滌酶標板3次;
(5)每孔加入100μL顯色液,37℃孵育12min,每孔加入終止液50μL;
(6)結果檢測:將酶標板插入酶標儀中,檢測450nm處的吸光值。
(7)以Ai/Ao的比值為縱坐標,TTX標準品濃度的對數值為橫坐標建立標準曲線,根據標準曲線求出樣本中河豚毒素的濃度。其中Ai為樣本的吸光值,Ao為標準品濃度為0ng/mL時的吸光值。結果如圖2所示,吸光度比值(Ai/Ao)與河豚毒素標準品濃度的對數值成正比關系,其擬合直線的方程式為y=?0.393x+1.2543,其中“y”為Ai/Ao值,“x”為河豚毒素濃度。根據此公式,可以依據檢測樣本所得吸光值計算出樣本中的河豚毒素濃度。
實施例2
本實施例的操作方法以及步驟同實施例1,不同之處在于將丟失質粒的氣單胞菌發酵培養時間為66小時。
實施例3
本實施例的操作方法以及步驟同實施例1,不同之處在于將丟失質粒的氣單胞菌發酵培養時間為96小時。
實施例4
本實施例的操作方法以及步驟如同實施例1,不同之處在于將添加精氨酸的ORI液體培養基改為添加河豚肝臟粗提液。ORI液體培養基制備方法(1000ml)為:在800ml去離子水中加入2g胰蛋白胨(OXOID公司),2g大豆蛋白胨(OXOID公司),1g酵母提取物(OXOID公司),30g氯化鈉(宜興市第二化學試劑廠),攪拌溶解后,再加入0.88g檸檬酸鐵(國藥集團化學試劑有限公司),繼續攪拌,直到完全溶解后,加入10ml河豚肝臟粗提液,再加入去離子水定容至1000ml,并調節PH至8.0后封口滅菌。
實施例5
本實施例的操作方法以及步驟如同實施例4,不同之處在于將丟失質粒的氣單胞菌發酵培養時間為66小時。
實施例6
本實施例的操作方法以及步驟如同實施例4,不同之處在于將丟失質粒的氣單胞菌發酵培養時間為96小時。
實施例7
本實施例的操作方法以及步驟如同實施例1,不同之處在于將添加精氨酸的ORI液體培養基改為添加河豚卵巢粗提液。ORI液體培養基制備方法(1000ml)為:在800ml去離子水中加入2g胰蛋白胨(OXOID公司),2g大豆蛋白胨(OXOID公司),1g酵母提取物(OXOID公司),30g氯化鈉(宜興市第二化學試劑廠),攪拌溶解后,再加入0.88g檸檬酸鐵(國藥集團化學試劑有限公司),繼續攪拌,直到完全溶解后,加入10ml河豚卵巢粗提液,再加入去離子水定容至1000ml,并調節PH至8.0后封口滅菌。
實施例8
本實施例的操作方法以及步驟如同實施例7,不同之處在于將丟失質粒的氣單胞菌發酵培養時間為66小時。
實施例9
本實施例的操作方法以及步驟如同實施例7,不同之處在于將丟失質粒的氣單胞菌發酵培養時間為96小時。
通過對比對照和各檢測樣本中的TTX的量的變化,可以得出提取液對TTX的降解效果。表1為對不同發酵時間提取液的TTX降解效果比較。
表1不同發酵時間提取液的TTX降解效果比較

由表1可知,相較于對照培養基(ORI)樣本,66h和96h培養液中的TTX含量都低于對照樣本;隨著TTX標準品添加量的增加,對照樣本、66h和96h培養液樣本中的TTX量也隨之增加,但是66h和96h培養液中的TTX含量依舊低于對照樣本,且96h發酵樣本中的TTX含量低于66h發酵樣本。上述結果顯示66h和96h發酵樣本中含有降解TTX的物質,采用本發明的提取方法和檢測方法可成功檢測河豚毒素降解物質提取液中的含量變化。
在本發明中,采用改變培養基成分的方法導致氣單胞菌Aeromonas molluscorum質粒丟失,利用實時定量PCR檢測質粒丟失情況,從質粒丟失的細菌中提取降解河豚毒素的物質,采用競爭性酶聯免疫法測定降解河豚毒素的能力。本發明所提取的降解河豚毒素的物質,可用于制備今后臨床治療河豚毒素中毒的藥物。
以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解,本發明不受上述實施例的限制,上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理,在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明還會有各種變化和改進,這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。   內容來自專利網www.wwszu.club轉載請標明出處

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