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銀杏內酯注射液及含量測定方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310172831.2

申請日:

2012.04.23

公開號:

CN103239487B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 專利權的轉移號牌文件類型代碼:1602號牌文件序號:101726993035IPC(主分類):C07D 493/22專利號:ZL2013101728312登記生效日:20160105變更事項:專利權人變更前權利人:成都百裕科技制藥有限公司變更后權利人:成都百裕金閣萊藥業有限公司變更事項:地址變更前權利人:611130 四川省成都市溫江區成都海峽兩岸科技產業開發園柳臺大道西段433號變更后權利人:610000 四川省成都市高新區科園南路88號11棟1002號|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 36/16申請日:20120423|||公開
IPC分類號: C07D493/22; A61K36/16; A61K9/08; G01N30/36; A61K127/00(2006.01)N 主分類號: C07D493/22
申請人: 成都百裕科技制藥有限公司
發明人: 孫毅; 朱永紅; 童正兵; 王婕
地址: 611130 四川省成都市溫江區成都海峽兩岸科技產業開發園柳臺大道西段433號
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310172831.2

授權公告號:

|||103239487B||||||

法律狀態公告日:

2016.01.27|||2014.12.10|||2013.09.11|||2013.08.14

法律狀態類型:

專利申請權、專利權的轉移|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及植物提取領域,具體涉及一種治療心腦血管疾病的銀杏內酯注射液的檢測方法和其中有效成分含量的測定方法,所測定的銀杏內酯注射液每1ml含銀杏萜類內酯以白果內酯(C15H18O8)、銀杏內酯A(C20H24O9)、銀杏內酯B(C20H24O10)和銀杏內酯C(C20H24O11)的總量計,含量為1-10mg/ml,優選4.25~5.75mg。

權利要求書

權利要求書
1.   銀杏內酯注射液的檢測方法,其特征在于檢測的項目和方法如下:
(1)蛋白質:取銀杏內酯注射液2ml,加水制成50ml,作為供試品溶液,稱取考馬斯亮藍G?250約50mg,溶于25ml乙醇中,再加入85%(w/v)的磷酸50ml,加水稀釋至500ml,搖勻,過濾,精密量取濾液5ml置試管中,再加入1ml供試品溶液,搖勻,放置3min,同法做空白,于595nm波長下,測定吸光度,供試品溶液吸光度小于0.05;
(2)鞣質:取蛋白質檢查項供試品溶液1ml加入稀醋酸1滴,再加明膠氯化鈉試液5滴,搖勻,放置10分鐘,未出現渾濁或沉淀;
(3)樹脂:取蛋白質檢查項供試品溶液5ml,加鹽酸1滴,放置30分鐘,無樹脂狀物質析出;
(4)草酸鹽:取蛋白質檢查項供試品溶液2ml,用稀鹽酸調節pH值至1~2,濾過,濾液用氨水調節pH值為5~6,加3%氯化鈣溶液3滴,放置10分鐘,未出現渾濁或沉淀;
(5)鉀離子:取蛋白質檢查項供試品溶液2ml,置10ml納氏比色管中,加堿性甲醛溶液0.6ml、3%EDTA溶液2滴、3%四苯硼鈉溶液0.5ml,加水稀釋至10ml,另取標準氯化鉀溶液0.8ml,同法試驗,濁度低于對照溶液。

2.   銀杏內酯注射液中有效成分含量的測定方法,其特征在于:
色譜條件與系統適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以25∶10∶65甲醇?四氫呋喃?水為流動相;用蒸發光散射檢測器,漂移管溫度:105℃;載氣流速:3.00L/min;柱溫:40℃;理論板數按白果內酯峰計算應不低于2500,白果內酯峰與銀杏內酯C峰的分離度應大于1.5;
對照品溶液的制備:分別精密稱取白果內酯對照品、銀杏內酯A對照品、銀杏內酯B對照品、銀杏內酯C對照品適量,加甲醇制成每1ml分別含0.15mg、0.12mg、0.1mg、0.1mg的混合溶液,搖勻,作為對照品溶液;
供試品溶液的制備:精密量取銀杏內酯注射液1ml,加磷酸鹽緩沖溶液14ml,搖勻,上Extrelut?20柱,吸附15分鐘,用乙酸乙酯100ml洗脫,收集洗脫液,于水浴上蒸干,殘渣用流動相溶解并轉移至10ml量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過,作為供試品溶液;
測定法:分別精密吸取對照品溶液10μl、20μl和供試品溶液15μl,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,用外標兩點法對數方程分別計算白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B和銀杏內酯C的含量。

3.   根據權利要求2的銀杏內酯注射液中有效成分含量的測定方法,其中供試品溶液的制備步驟中所加的磷酸鹽緩沖溶液的pH為6.5。

4.   根據權利要求3的銀杏內酯注射液中有效成分含量的測定方法,其中所測定的銀杏內酯注射液每1ml含銀杏萜類內酯以白果內酯(C15H18O8)、銀杏內酯A(C20H24O9)、銀杏內酯B(C20H24O10)和銀杏內酯C(C20H24O11)的總量計,含量為1?10mg/ml,優選4.25~5.75mg。

說明書

說明書銀杏內酯注射液及含量測定方法
技術領域
本發明涉及植物提取領域,具體涉及一種治療心腦血管疾病的銀杏內酯注射液的檢測方法和含量測定方法。
背景技術
自上世紀60年代開始,許多國家采用現代分離技術對銀杏葉的化學成分進行研究,經藥理實驗和臨床驗證,發現銀杏葉的多方面生物活性與其所含特定化學成分有關。德國Dr.Willar Schwabe首次注冊了銀杏葉的一種簡單提取物,于1972年申請了專利(W Schwabe DE176708和DE2117429),定名為EGb761,用于治療心腦血管疾病和神經系統疾病,具有顯著療效,且無毒副作用,銀杏內酯類化合物(ginkgolids)具有強血小板活化因子(PAF)拮抗作用。銀杏制劑被列為治療藥物的國家有德國、法國和中國,其他國家均用為保健食品或非處方用藥,美國開發出的銀杏保健食品已經獲得FDA批準。
銀杏內酯屬于萜類化合物,稱為萜類內酯,由倍半萜內酯和二萜內酯組成,是銀杏葉中一類重要的活性成分。白果內酯(bilobalide)屬倍半萜內酯,由R.T.Major于1967年和K.Weinges于1969年分離得到,目前從銀杏葉中發現的唯一的一個倍半萜內酯化合物,銀杏內酯A、B、C、M、J(ginkgolidA、B、C、M、J)為二萜內酯化合物,于1932年由S.Furukawa首次從銀杏葉中分離出來,1967年才由K.Nakanish、M.Maruyama和K.Okabe等人進一步分離和確定其化學結構。從結構上看,白果內酯類分子骨架由15個碳原子組成,具有互相稠合在一起的4個五元環,其中有1個五元碳環,3個五元內酯碳環,五元環上連有1個天然產物中罕見的叔丁基。白果內酯有很強的生物活性,具有促進神經生長的作用,可防止腦細胞線粒體氧化應激引起的功能改變,改善老年記憶功能,防止老年癡呆的發生,以及防止腦、脊髓神經脫髓鞘作用,其神經營養、神經保護作用比銀杏內酯強。銀杏內酯B有抗炎、抗休克、保護心腦血管、治療急性胰腺炎等作用。而銀杏內酯類化合物的分子骨架由20個碳原子組成,具有6個五元環,其中有2個五元碳環,3個五元內酯環,1個四氫呋喃環,兩個五元碳環以螺環的形式連接在一起,其余的環以稠合的方式連接,形成一個剛性蘢狀的特殊立體化學結構。銀杏內酯分子中均具有天然產物中罕見的叔丁基。銀杏內酯包括二萜類和倍半萜類內酯,二萜類內酯主要有銀杏內酯A、B、C、J、M等,半萜類內酯有白果內酯。
自20世紀70年代初發現了PAF后,藥理學家對銀杏內酯進行了研究,明確銀杏萜內酯是強血小板活化因子拮抗劑,免疫系統、中樞神經系統、缺血損傷有保護作用,并有抗休克、抗過敏及抗炎作用。銀杏內酯A、B、C、M、J結構差別在于含有的羥基數目和羥基連接的位置不同。銀杏內酯均為強血小板活化因子拮抗劑,是銀杏葉中特殊生理活性的關鍵成分。

銀杏內酯A結構式              銀杏內酯B結構式
分子式:C20H24O9分子量:408.4       分子式:C20H24O10分子量:424.4

銀杏內酯C結構式                白果內酯結構式
分子式:C20H24O11分子量:440.4          分子式:C15H18O8分子量:326.3
銀杏內酯對血小板活化因子PAF受體有強大的特異性抑制作用,其中銀杏內酯的抗PAF活性最高。PAF是血小板和多種炎癥組織分泌產生的一種內源性磷脂,是迄今發現的最有效的血小板聚集誘導劑,它與許多疾病的產生、發展密切相關。而銀杏內酯目前被認為是最有臨床應用前景的天然PAF受體拮抗劑,其拮抗作用活性與化學結構密切相關。當內酯結構中R3為羥基或羥基數目增多時,對PAF的拮抗活性減弱,而當R2為羥基且R3為H時,則活性顯著增強,其中以銀杏內酯B對PAF產生的拮抗作用最強。
銀杏內酯的提取及純化方法較多,主要有:溶劑萃取法、柱提取法、溶劑萃取?柱提取法、超臨界提取法及色譜或柱層析純化法等。這些方法都不能有效地分離出高含量的銀杏內酯,且銀杏內酯各組成比例不確定,因此,在臨床使用上藥效各不相同,由于其含量不高,也存在一定的安全風險,無完整的藥理毒理及臨床試驗數據,因此,上述方法均處于試驗階段,未實施于藥品生產過程,在中國雖有銀杏內酯注射液相關專利,但其組成均與本發明不同,經ICH成員國多家官方網站檢索,迄今尚無其它銀杏內酯注射劑產品上市。銀杏內酯類成分的測定目前多采用HPLC?UV法、HPLC?MS和HPLC?ELSD法,這些方法僅能對銀杏內酯各成分的含量進行測定,由于缺乏對其產品中不良反應物質的嚴格控制,并不能真實的反映出藥品的質量特性,不形成一個完善的藥品質量控制體系,盡管銀杏內酯的發明專利很多,由于控制方法過于簡單,銀杏內酯組成比例不定,都無法制成中藥注射劑,不能保證臨床療效和應用的安全性。
盡管在中國、德國等國家有諸多關于銀杏內酯的專利和報道,但本發明的工藝過程、質量控制技術和臨床適應癥與其它發明專利有截然不同之處,尤其是不同的分離純化工藝得到的萜類內酯的成分各不相同,迄今為止,尚無4種組分(銀杏內酯A、B、C和白果內酯)比例固定的提取銀杏內酯有效部位組合物的工藝報道,也沒有對銀杏內酯中4種組分指紋圖譜控制技術及可能殘留的大分子、蛋白質檢查方法的報道。本發明制備的銀杏內酯注射液已獲得國家食品藥品監督管理局批準文號,國藥準字:Z20110035,是目前國際上第一個銀杏有效部位注射劑,產品結構清晰、明確。
發明內容
本發明所解決的技術問題是提供一種銀杏內酯的提取分離方法,該提取分離方法可得到組分固定的銀杏內酯。該方法步驟如下:
A、提取:粉碎銀杏葉,加有機溶劑提取,濃縮提取液中加抗氧化保護劑,用pH調節劑調pH值至4~5,濃縮、冷藏。
其中,提取有機溶劑為乙醇、丙酮或乙酸乙酯,濃度為50~80%v/v,用量為5~12倍量,最佳用量6~10倍;
提取方法為:回流提取或煎煮提取。
1)回流提取:
50~80%v/v乙醇:提取溫度75~85℃,提取次數2~3次,時間每次1~2小時;
50~80%v/v丙酮:提取溫度45~55℃,提取次數2~3次,時間每次1~2小時;
50~80%v/v乙酸乙酯:提取溫度55~65℃,提取次數2~3次,時間每次1~2小時;
真空度:?0.02~0.08MPa
優選提取條件為:提取3次,每次1.5小時;乙醇濃度宜選擇65%v/v;丙酮濃度宜選擇50%v/v;乙酸乙酯濃度宜選擇60%v/v。
2)煎煮提取:
50~80%v/v乙醇:提取溫度80~90℃,提取次數2~3次,時間每次1~2小時;
50~80%v/v丙酮:提取溫度50~60℃,提取次數2~3次,時間每次1~2小時;
50~80%v/v乙酸乙酯:提取溫度60~65℃,提取次數2~3次,時間每次1~2小時;
優選提取條件為:提取3次,每次1.5小時;乙醇濃度宜選擇65%v/v;丙酮濃度宜選擇50%v/v;乙酸乙酯濃度宜選擇60%v/v。
提取液在濃縮過程中受熱后銀杏內酯易分解,需加入保護劑和pH調節劑。加入保護劑是為了防止銀杏內酯受熱氧化分解,可用的抗氧化保護劑主要有中性氨基酸,包括:絲氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸中至少一種,優選蛋氨酸。
pH調節劑主要是有機弱酸,包括:枸櫞酸、蘋果酸、山梨酸中至少一種,優選枸櫞酸用于調pH值,是利用其弱酸性作為穩定劑,防止銀杏內酯在堿性條件下開環。原因是銀杏內酯結構為5元環,在弱酸性條件下穩定,枸櫞酸為弱酸,可以防止銀杏內酯在堿性條件下開環。
步驟A冷藏的目的是為了使油水分離,以除去水中脂溶性雜質。
B、萃取:將濃縮液先用正己烷或石油醚萃取2~3次(優選等體積的正己烷或石油醚萃取),水相用脂溶性溶劑萃取4~5次(優選等體積的乙酸乙酯萃取),再用水飽和仲丁醇(正丁醇)?乙酸乙酯混合溶劑萃取4~5次(優選等體積水飽和仲丁醇?乙酸乙酯混合溶劑萃取),合并有機相萃取液,減壓濃縮。
其中,先用正己烷或石油醚萃取是為了除去葉綠素、銀杏酚酸等雜質。
再用脂溶性溶劑萃取銀杏內酯,可用的脂溶性溶劑有乙酸乙酯、甲酸乙酯、丙酮、丁酮中的至少一種。
銀杏萜類內酯易溶于乙酸乙酯,銀杏黃酮在乙酸乙酯中溶解性相對較低,在熱水中和含水醇中溶解度較大,故可用乙酸乙酯萃取銀杏內酯,將其與銀杏黃酮類化合物分離,分離得的銀杏內酯粗品可進一步用活性炭、硅膠或樹脂柱吸附層析,進一步除去雜質,然后在含水醇中結晶即可得到比較純的銀杏內酯。
C、過柱:萃取液過聚酰胺(30~60目)樹脂柱,依次用1~5BV水、3~5BV20%~40%v/v乙醇、2~3BV60%~90%v/v乙醇洗脫,控制洗脫液流速為2~3BV/h;合并洗脫液,減壓濃縮,干燥;
D、析晶:將過柱后的干燥物加入沸水中,攪拌溶解,冷卻,上清液用等體積乙酸乙酯、甲酸乙酯或丙酮萃取4~5次,合并萃取液,減壓濃縮,蒸干,加5~8倍量30%~50%v/v乙醇加熱攪拌溶解,過濾,冷藏,析出晶體,濾過,濾液I備用,晶體用30%~50%v/v乙醇洗滌,減壓干燥,得到晶體I。
濾液I濃縮至含醇量為10%~30%v/v,冷藏,析出晶體,濾過,濾液II備用;用30%~50%v/v乙醇洗滌,減壓干燥,得晶體II。
濃縮濾液II,加0.1~0.5%(g/L)活性炭吸附,過濾,濾液濃縮至含醇量為10~30%v/v,冷藏,析出晶體,濾過,濾液III備用;晶體用30%~50%v/v乙醇洗滌,減壓干燥,得晶體III。
濾液III濃縮,過活性炭?硅膠(體積比1∶1~1∶3)柱,先用30%~50%v/v乙醇洗脫,再用70%~90%v/v乙醇洗脫,收集洗脫液濃縮至含醇量為10%~30%v/v,冷藏析晶,濾出晶體,濾液IV備用;晶體用30%乙醇洗滌,減壓干燥,得晶體IV。
濃縮濾液IV,冷藏,析出晶體,濾過,晶體用30%v/v乙醇洗滌,減壓干燥,得晶體V。
根據HPLC對母液中殘余銀杏內酯的檢測結果,考慮是否對濾液IV進行結晶。
E、混晶:將晶體I、II、III、IV、V混合均勻,粉碎,得到類白色晶體組合物,該晶體組合物有效部位(白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C之和)的HPLC含量大于95%。
采用本發明取分離方法得到的銀杏內酯的參數如下:
a)性狀:類白色或微黃色結晶性粉末。在乙酸乙酯中易溶,在甲醇、乙醇中溶解,在水中幾乎不溶。
b)水分:小于5.0%。
c)蛋白質:在595nm波長處吸光度小于0.05。
d)鞣質、樹脂、草酸鹽、鉀離子:不得檢出。
e)殘留溶劑:乙醇和乙酸乙酯均小于0.5%,正己烷小于0.029%,己內酰胺小于0.0015%。
f)總銀杏酸:HPLC法測定總銀杏酸含量小于5ppm。
g)大分子和聚合物:凝膠色譜法測定無殘留大分子和聚合物。LC?MS法測定無分子量大于1000的大分子物質和聚合物。
h)重金屬:小于10ppm。
i)砷鹽:小于2ppm。
k)異常毒性:制成每1ml中含0.2mg的溶液,符合靜脈注射法給藥。
1)指紋圖譜:HPLC法測定,以白果內酯對照品、銀杏內酯A對照品、銀杏內酯B對照品、銀杏內酯C對照品為參照物,按中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統,四個共有峰相似度大于0.95。
m)含量:HPLC法測定,按干燥品計算,含白果內酯(C15H18O8)25.0%~50.0%、銀杏內酯A(C20H24O9)20.0%~45.0%、銀杏內酯B(C20H24O10)10.0%~30.0%、銀杏內酯C(C20H24O11)5.0%~15.0%,且白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C總量大于95%。
附圖說明
圖1洗脫體積對洗脫率的影響。
圖2乙醇流速對洗脫率的影響。
圖3銀杏內酯LC?MS圖譜(分子量400~1000)。
圖4銀杏內酯LC?MS圖譜(分子量400~3000)。
圖5銀杏內酯對照指紋圖譜;
共有峰中峰2:銀杏內酯C,峰3:白果內酯,峰4:銀杏內酯A,峰5:銀杏內酯B。
具體實施方式
以下為本發明銀杏內酯制備方法中的關鍵條件篩選試驗。
一、萃取方案篩選試驗
方法一:將濃縮液先用等體積的正己烷萃取2~3次,水相用8倍量的丁酮?丙酮(4∶6)在溫熱下提取5次,合并萃取液,減壓濃縮。
方法二:將濃縮液先用等體積的正己烷萃取2~3次,水相再用等體積乙酸乙酯萃取4~5次,用等量水飽和的仲丁醇?乙酸乙酯(7∶3)萃取4~5次,合并萃取液,減壓濃縮,干燥。
以上兩種萃取分離純化方法篩選試驗,用HPLC?ELSD法分別測定兩種試驗中銀杏內酯的總量,試驗結果見表1。
表1  萃取方案篩選試驗結果
考察項目方法一方法二外觀性狀棕色粉末棕色粉末總內酯含量(%)14.110.8
方法二所得總內酯含量均較高,乙酸乙酯和仲丁醇為安全性極高的溶劑,因此,選用方法二作為萃取離純化工藝。
二、層析條件篩選試驗
由于萃取液中尚含有大量銀杏黃酮類物質及其它雜質,要得到純度極高銀杏內酯,必須將黃酮與銀杏內酯有效的分離,目前普遍采用的分離方法包括聚酰胺樹脂柱分離法、氧化鋁柱層析法和硅膠柱層析法,發明人對比研究過程及結果如下:
方法一:將萃取液過聚酰胺樹脂柱,先用2~3倍量的30%乙醇洗脫,繼用70%乙醇洗脫,洗脫速度為2BV/h,濃縮洗脫液,蒸干。
方法二:將萃取液過酸性氧化鋁柱,將萃取液與等量氧化鋁混合,烘干,干法上柱,用4~6倍量的乙酸乙酯洗脫,洗脫速度為2BV/h,濃縮洗脫液,蒸干。
方法三:將萃取液過硅膠柱,將萃取液與等量柱層析硅膠混合,烘干,干法上柱,先用用4~6倍量的石油醚?乙酸乙酯(2∶1)洗脫,洗脫速度為2BV/h,再用正己烷?乙酸乙酯(5∶1)洗脫,洗脫速度為2BV/h,濃縮洗脫液,蒸干。
用HPLC?ELSD法分別對三種試驗中銀杏內酯的總量進行測定,試驗結果見表2。
表2  柱層析試驗結果
考察項目方法一方法二方法三外觀性狀黃色粉末黃色粉末黃色粉末總內酯含量(%)47.835.538.2
由上可見,采用聚酰胺樹脂柱得到的銀杏內酯含量較高,分離效果較好。
聚酰胺樹脂對黃酮有較好的吸附作用,因此,可以有效地將銀杏內酯和銀杏黃酮進行有效地分離,對過柱洗脫工藝參數考察。
1、水洗體積的選擇:蒸餾水洗滌樹脂柱能起到很好的除雜作用,用5BV的水洗滌樹脂柱,流速1~2BV/h,流出的顏色由深變淺,收集水洗液5BV,流出液清亮,檢測結果顯示,水體積達到3BV時,柱中的水溶性雜質已經基本干凈,檢測不出銀杏內酯,所以選用3BV的水洗體積。洗脫體積對洗脫率的影響見圖1。
2、乙醇洗脫濃度對洗脫效果的影響:將萃取物分別上不同聚酰胺柱,吸附30min,先用3BV水洗,再分別使用10%、30%、40%、50%、70%、90%乙醇洗脫,流速1BV/h,分別收集乙醇洗脫液,測定各濃度洗脫液中銀杏內酯的量,隨著乙醇濃度的升高,洗脫量和洗脫率都隨之上升,但是至40%的乙醇時洗脫量提升緩慢,至90%的乙醇時洗脫量差別不大,30%的乙醇洗脫基本上達到最佳洗脫率,因此,采用30%乙醇作為最佳洗脫濃度。
3、乙醇解析流速的洗脫效果影響:將萃取物分別上不同聚酰胺柱,吸附30min,先用3BV水洗,再用40%乙醇洗脫,流速1BV/h。為選取較優的乙醇解析流速,分別以1、2、3、4、5BV/h的流速過柱,洗脫并收集3BV洗脫液,測定銀杏內酯量。洗脫流速與解析率有很大的關聯性,隨著流速提高,解析率增加,但到3BV/h時反而下降,這是速度加快導致乙醇洗脫液不能很好的與吸附的銀杏內酯交換,因而不能達到很好的洗脫效果。最佳流速2~3BV/h。乙醇流速對洗脫率的影響見圖2。
三、析晶條件篩選試驗:
雖然過柱、萃取后提取物中銀杏內酯的含量有所增加,黃酮類物質也得到有效分離,但銀杏內酯的含量尚不能達到注射劑要求,需進一步結晶純化。銀杏內酯在乙醇、乙酸乙酯等溶劑中易溶,而在水、正己烷等溶劑中不溶,因此只有選用極性合適混合溶劑作為結晶溶劑。
(1)30%v/v乙醇溶劑:取待析晶提取物10g,分別加4、6、8、10倍量30%乙醇,加熱溶解,低溫(0~6℃)靜置,濾過,減壓干燥,分別測定晶體重量,試驗結果見表3。
表3  30%乙醇結晶試驗結果
溶劑加入量(倍)46810加熱溶解情況未溶完溶解完全溶解完全溶解完全晶體量(g)3.84.54.22.4
析晶時加5~8倍量30%乙醇比較合適,析出的晶體相對較多。
(2)正己烷?乙酸乙酯(8∶1)溶劑:取待析晶提取物10g,分別加4、6、8、10倍量正己烷?乙酸乙酯(8∶1)混合溶劑,加熱溶解,低溫(0~6℃)靜置,濾過,減壓干燥,分別測定晶體重量,試驗結果見表4。
表4  正己烷?乙酸乙酯混合溶劑結晶試驗結果
溶劑加入量(倍)46810加熱溶解情況溶解完全溶解完全溶解完全溶解完全晶體量(g)2.33.53.83.2
正己烷?乙酸乙酯混合溶劑析晶量少于30%乙醇溶劑析出晶體量。
(3)10%v/v乙酸乙酯溶劑:取待析晶提取物10g,分別加4、6、8、10倍量10%乙酸乙酯加熱溶解,低溫(0~6℃)靜置,濾過,減壓干燥,分別測定晶體重量,試驗結果見表5。
表5  10%乙酸乙酯結晶試驗結果
溶劑加入量(倍)46810加熱溶解情況未溶完溶解完全溶解完全溶解完全晶體量(g)2.33.53.32.2
10%乙酸乙酯溶劑析晶量少于30%乙醇溶劑析出晶體量。
根據實驗結果,結晶溶劑選用5~8倍量30%乙醇比較合適。
以下為采用本發明方法制備銀杏內酯的實例。
實施例1
銀杏葉粗粉50kg,加65%乙醇加熱回流提取3次(10、8、6倍量),每次1.5小時,合并提取液,濾過,減壓濃縮,加0.05%蛋氨酸攪拌溶解,用枸櫞酸溶液調節pH值至4~5,繼續濃縮,低溫放置,過濾。先用等量正己烷萃取,再用等量乙酸乙酯萃取,最后用水飽和仲丁醇?乙酸乙酯混合溶劑萃取,過聚酰胺(30~60目)樹脂柱,先用水洗脫,繼用30%乙醇洗脫,再用70%乙醇洗脫,合并洗脫液,減壓濃縮。加入2~3倍量沸水中,攪拌溶解,靜置,放冷,用乙酸乙酯萃取,減壓濃縮,加乙醇加熱攪拌溶解,過濾,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體I(主要為白果內酯和銀杏內酯B);濾液繼續濃縮,加乙醇至30%,靜置,析出晶體,濾過,干燥,得晶體II(主要為銀杏內酯A、B、C);濾液加入藥用炭,攪拌吸附,過濾,濃縮,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體III(主要為銀杏內酯A和B);將濾液濃縮,過藥用炭?硅膠(1∶1)柱,先用2倍量30%乙醇洗脫,再用4倍量70%乙醇洗脫,收集洗脫液,濃縮,加乙醇至30%,放冷,靜置,析出晶體,濾過,干燥,得晶體IV;濾液濃縮,加乙醇至30%,放冷,靜置,析出晶體,濾過,干燥,得晶體V。將晶體混合均勻,得銀杏內酯91.6g,HPLC含量97.2%,其中白果內酯(C15H18O8)為42.5%、銀杏內酯A(C20H24O9)為25.4%、銀杏內酯B(C20H24O10)為18.7%、銀杏內酯C(C20H24O11)為10.6%。
實施例2
銀杏葉粗粉200kg,加6倍量80%乙醇加熱回流提取3次,每次1.5小時,合并提取液,濾過,濾液減壓回收乙醇至無醇味,加0.05%蛋氨酸攪拌溶解,用枸櫞酸溶液調節pH值至4~5,繼續濃縮,低溫放置,過濾。先用正己烷萃取,再用乙酸乙酯萃取,最后用水飽和仲丁醇?乙酸乙酯混合溶劑萃取,過聚酰胺(30~60目)樹脂柱,先用30%乙醇洗脫,繼用70%乙醇洗脫,合并洗脫液,減壓濃縮。加入沸水中,攪拌溶解,靜置放冷,用乙酸乙酯萃取,減壓濃縮,加乙醇加熱攪拌溶解,過濾,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體I(主要為白果內酯和銀杏內酯B);濾液繼續濃縮,加乙醇,靜置析出晶體,濾過,干燥,得晶體II(主要為銀杏內酯A、B、C);濾液加入藥用炭,攪拌吸附,過濾,濃縮,加乙醇,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體III(主要為銀杏內酯A和B);將濾液濃縮,過藥用炭?硅膠(1∶1)柱,先用2倍量30%乙醇洗脫,再用4倍量70%乙醇洗脫,收集洗脫液,濃縮,加乙醇至30%,放冷,靜置,析出晶體,濾過,干燥,得晶體IV;濾液濃縮,加乙醇至30%,放冷,靜置,析出晶體,濾過,干燥,得晶體V。將晶體混合均勻,得銀杏內酯362.8g,HPLC含量96.8%,其中白果內酯(C15H18O8)為31.2%、銀杏內酯A(C20H24O9)為28.8%、銀杏內酯B(C20H24O10)為28.2%、銀杏內酯C(C20H24O11)為8.6%。
實施例3
銀杏葉粗粉200kg,加8倍量75%乙醇加熱回流提取3次,每次1.5小時,合并提取液,濾過,濾液減壓回收乙醇至無醇味,加0.05%蛋氨酸攪拌溶解,用枸櫞酸溶液調節pH值至4~5,繼續濃縮,低溫放置,過濾。先用正己烷萃取,再用乙酸乙酯萃取,最后用水飽和仲丁醇?乙酸乙酯混合溶劑萃取,過聚酰胺(30~60目)樹脂柱,先用30%乙醇洗脫,繼用75%乙醇洗脫,合并洗脫液,減壓濃縮。加入沸水中,攪拌溶解,靜置放冷,用乙酸乙酯萃取,減壓濃縮,加乙醇加熱攪拌溶解,過濾,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體I(主要為白果內酯和銀杏內酯B);濾液繼續濃縮,加乙醇,靜置析出晶體,濾過,干燥,得晶體II(主要為銀杏內酯A、B、C);濾液加入藥用炭,攪拌吸附,過濾,濃縮,加乙醇,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體III(主要為銀杏內酯A和B);濾液濃縮,上藥用炭?硅膠(1∶1)柱,用60%乙醇洗脫,收集洗脫液,濃縮,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體IV;將晶體混合均勻,得銀杏內酯375.5g,HPLC含量97.1%,其中白果內酯(C15H18O8)為35.8%、銀杏內酯A(C20H24O9)為28.5%、銀杏內酯B(C20H24O10)為26.2%、銀杏內酯C(C20H24O11)為6.6%。
實施例4
取銀杏葉粗粉200kg,加10倍量75%乙醇加熱回流提取3次,每次1.5小時,合并提取液,濾過,濾液減壓回收乙醇至無醇味,加0.05%蛋氨酸攪拌溶解,用枸櫞酸溶液調節pH值至4~5,繼續濃縮,低溫放置,過濾。先用正己烷萃取,再用乙酸乙酯萃取,最后用水飽和仲丁醇?乙酸乙酯混合溶劑萃取,過聚酰胺(30~60目)樹脂柱,先用25%乙醇洗脫,繼用65%乙醇洗脫,合并洗脫液,減壓濃縮。加入沸水中,攪拌溶解,靜置放冷,用乙酸乙酯萃取,減壓濃縮,加50%乙醇加熱攪拌溶解,過濾,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體I(主要為白果內酯和銀杏內酯B);濾液繼續濃縮,加乙醇,靜置析出晶體,濾過,干燥,得晶體II(主要為銀杏內酯A、B、C);濾液加入藥用炭,攪拌吸附,過濾,濃縮,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體III(主要為銀杏內酯A和B);濾液濃縮,上藥用炭?硅膠(1∶1)柱,用60%乙醇洗脫,收集洗脫液,濃縮,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體IV;濾液濃縮,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體V;將晶體混合均勻,得銀杏內酯362.2g,HPLC含量96.5%,其中白果內酯(C15H18O8)為35.5%、銀杏內酯A(C20H24O9)為26.0%、銀杏內酯B(C20H24O10)為26.2%、銀杏內酯C(C20H24O11)為8.8%。
實施例5
銀杏葉粗粉200kg,加8倍量60%乙酸乙酯加熱回流提取3次,每次1.5小時,合并提取液,濾過,濾液減壓回收乙酸乙酯,加0.05%蛋氨酸攪拌溶解,用枸櫞酸溶液調節pH值至4~5,繼續濃縮,低溫放置,過濾。先用石油醚萃取,水相再用乙酸乙酯萃取,最后用水飽和仲丁醇?乙酸乙酯混合溶劑萃取,過聚酰胺(30~60目)樹脂柱,先用30%乙醇洗脫,繼用75%乙醇洗脫,合并洗脫液,減壓濃縮。加入沸水中,攪拌溶解,靜置放冷,用丙酮萃取,減壓濃縮至干,加50%乙醇加熱攪拌溶解,過濾,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體I(主要為白果內酯和銀杏內酯B);濾液繼續濃縮,加乙醇,靜置析出晶體,濾過,干燥,得晶體II(主要為銀杏內酯A、B、C);濾液加入藥用炭,攪拌吸附,過濾,濃縮,加乙醇,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體III(主要為銀杏內酯A和B);濾液濃縮,上藥用炭?硅膠(1∶1)柱,用60%乙醇洗脫,收集洗脫液,濃縮,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體IV;將晶體混合均勻,得銀杏內酯350.6g,HPLC含量97.4%,其中白果內酯(C15H18O8)為40.0%、銀杏內酯A(C20H24O9)為22.5%、銀杏內酯B(C20H24O10)為27.2%、銀杏內酯C(C20H24O11)為10.3%。
實施例6
銀杏葉粗粉200kg,加8倍量50%丙酮加熱回流提取3次,每次1.5小時,合并提取液,濾過,濾液減壓回收丙酮,加0.05%蛋氨酸攪拌溶解,用枸櫞酸溶液調節pH值至4~5,繼續濃縮,低溫放置,過濾。先用石油醚萃取,水相再用乙酸乙酯萃取,最后用水飽和仲丁醇?乙酸乙酯混合溶劑萃取,過聚酰胺(30~60目)樹脂柱,先用30%乙醇洗脫,繼用70%乙醇洗脫,合并洗脫液,減壓濃縮。加入沸水中,攪拌溶解,靜置放冷,用乙酸乙酯萃取,減壓濃縮至干,加30%乙醇加熱攪拌溶解,過濾,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體I(主要為白果內酯和銀杏內酯B);濾液繼續濃縮,加乙醇,靜置析出晶體,濾過,干燥,得晶體II(主要為銀杏內酯A、B、C);濾液加入藥用炭,攪拌吸附,過濾,濃縮,加乙醇,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體III(主要為銀杏內酯A和B);濾液濃縮,上藥用炭?硅膠(1∶1)柱,用60%乙醇洗脫,收集洗脫液,濃縮,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體IV;濾液濃縮,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體V;將晶體混合均勻,得銀杏內酯343.5g,HPLC含量96.2%,其中白果內酯(C15H18O8)為38.2%、銀杏內酯A(C20H24O9)為28.3%、銀杏內酯B(C20H24O10)為24.2%、銀杏內酯C(C20H24O11)為9.3%。
實施例7
銀杏葉粗粉200kg,加8倍量70%乙醇加熱至微沸煎煮提取3次,每次1.5小時,合并提取液,濾過,濾液減壓回收丙酮,加0.05%蛋氨酸攪拌溶解,用枸櫞酸溶液調節pH值至4~5,繼續濃縮,低溫放置,過濾。先用石油醚萃取,水相再用乙酸乙酯萃取,最后用水飽和仲丁醇?乙酸乙酯混合溶劑萃取,過聚酰胺(30~60目)樹脂柱,先用30%乙醇洗脫,繼用70%乙醇洗脫,合并洗脫液,減壓濃縮。加入沸水中,攪拌溶解,靜置放冷,用乙酸乙酯萃取,減壓濃縮至干,加30%乙醇加熱攪拌溶解,過濾,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體I(主要為白果內酯和銀杏內酯B);濾液繼續濃縮,加乙醇,靜置析出晶體,濾過,干燥,得晶體II(主要為白果內酯和銀杏內酯A、B);濾液加入藥用炭,攪拌吸附,過濾,濃縮,加乙醇,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體III(主要為銀杏內酯A和C);濾液濃縮,上藥用炭?硅膠(1∶1)柱,用60%乙醇洗脫,收集洗脫液,濃縮,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體IV;濾液濃縮,放冷,析出晶體,濾過,干燥,得晶體V;將晶體混合均勻,得銀杏內酯362.6g,HPLC含量97.4%,其中白果內酯(C15H18O8)為36.5%、銀杏內酯A(C20H24O9)為25.3%、銀杏內酯B(C20H24O10)為28.2%、銀杏內酯C(C20H24O11)為7.4%。
綜上,采用本發明所使用的提取分離純化方法可得到純度較高組分相對固定的銀杏內酯,其中,含白果內酯(C15H18O8)25.0%~50.0%、銀杏內酯A(C20H24O9)20.0%~45.0%、銀杏內酯B(C20H24O10)10.0%~30.0%、銀杏內酯C(C20H24O11)5.0%~15.0%,且白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C總量大于95%。
本發明銀杏內酯的分項檢測方法及檢測結果如下:
a)性狀:類白色或微黃色結晶性粉末。
在乙酸乙酯中易溶,在甲醇、乙醇中溶解,在水中幾乎不溶。
b)水分:60℃減壓干燥減失重量小于5.0%。
c)蛋白質:在595nm波長處吸光度小于0.05。
取本發明銀杏內酯約24mg,加乙醇2ml溶解后,加水稀釋至50ml,作為供試品溶液。照考馬斯亮藍法(Bradford法)測定,以相應的試劑為空白,在595nm波長處吸光度小于0.05。
d)鞣質、樹脂、草酸鹽、鉀離子
可采用的檢測方法有:
鞣質:取蛋白質檢查項供試品溶液1ml,加入稀醋酸1滴,再加明膠氯化鈉試液5滴,搖勻,放置10分鐘,未出現渾濁或沉淀。
樹脂:取蛋白質檢查項供試品溶液5ml,加鹽酸1滴,放置30分鐘,無樹脂狀物質析出。
草酸鹽:取蛋白質檢查項供試品溶液2ml,用稀鹽酸調節pH值至1~2,濾過,濾液用氨水調節pH值為5~6,加3%氯化鈣溶液3滴,放置10分鐘,未出現渾濁或沉淀。
鉀離子:取蛋白質檢查項供試品溶液2ml,置10ml納氏比色管中,加堿性甲醛溶液0.6ml、3%EDTA溶液2滴、3%四苯硼鈉溶液0.5ml,加水稀釋至10ml,另取標準氯化鉀溶液0.8ml,同法試驗,供試品溶液的濁度不高于對照溶液。
結果:未檢出鞣質、樹脂、草酸鹽、鉀離子。
e)殘留溶劑
(1)乙醇、乙酸乙酯和正己烷:含乙醇和乙酸乙酯均小于0.5%,正己烷小于0.029%。
(2)樹脂殘留量:含己內酰胺小于0.0015%。
f)總銀杏酸:含總銀杏酸小于5ppm。
g)大分子和聚合物:凝膠色譜法測定無殘留大分子和聚合物。LC?MS法測定,結果無分子量大于1000的大分子和聚合物。
測定方法:
(1)凝膠色譜法色譜柱:Phenomenex BioSep?SEC?S2000,300×7.8mm,5um,流動相:0.71%(內含0.02%的疊氮化鈉)硫酸鈉溶液,柱溫:35℃,檢測器溫度:35℃,流速:0.5ml/min。結果:無殘留大分子和聚合物。
(2)HPLC?MS聯用法流動相:甲醇?水(90∶10)、色譜柱:Agilent RX?C18(2.1×50mm)柱溫:25℃,流速:0.3ml/min。結果:結果無分子量大于1000的大分子和聚合物。
h)重金屬:小于10ppm。
i)砷鹽:小于2ppm。
k)異常毒性:制成每1ml中含0.2mg的溶液,符合靜脈注射法給藥。
供試品溶液的制備:取本發明銀杏內酯約25mg,用乙醇2ml溶解后加氯化鈉注射液制成每1ml中含0.2mg的溶液。
檢查法:取體重17~20g小鼠5只,注入小鼠尾靜脈供試品溶液0.5ml,48小時無死亡。
l)指紋圖譜:HPLC法測定,記錄60分鐘的色譜圖。按中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統,四個共有峰相似度大于0.95。
m)含量:HPLC法測定,按干燥品計算,含白果內酯(C15H18O8)應為25.0%~50.0%、銀杏內酯A(C20H24O9)應為20.0%~45.0%、銀杏內酯B(C20H24O10)應為10.0%~30.0%、銀杏內酯C(C20H24O11)應為5.0%~15.0%,且白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C總量大于95%。
l)指紋圖譜和m)含量測定采用的檢測方法相同,條件如下:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇?四氫呋喃?水(25∶10∶65)為流動相;用蒸發光散射檢測器,漂移管溫度:105℃;載氣流速:3.00L/min;柱溫:40℃;理論板數按白果內酯峰計算應不低于2500。白果內酯峰與銀杏內酯C峰的分離度應大于1.5。
n)熱原檢查:體溫升高低于0.6℃。
供試品溶液的制備:精密稱取本發明銀杏內酯20mg,加入2ml乙醇使溶解,再加入0.9%氯化鈉注射液100ml中。
檢查法:取家兔3只,測定其正常體溫后15分鐘內,按家兔體重每1kg注射5ml自耳靜脈緩緩注入供試品溶液,每隔30分鐘測定體溫1次,共測6次,體溫升高均應低于0.6℃,并且3只家兔體溫升高總和低于1.3℃。
發明人對上述發明內容進行了大分子及聚合物測定研究與說明,用于證明本發明的技術效果。下述試驗用于進一步說明與解釋本發明,但不限制本發明。
(1)試驗儀器及試劑
Agilent1200型高效液相色譜儀,紫外檢測器,示差折光檢測器。
Phenomenex BioSep?SEC?S2000凝膠色譜柱。
右旋糖酐對照品D2000(藍色葡聚糖2000),中檢所,批號140646?2000?01
葡萄糖對照品(D0),含量:99.5%,批號086K0166,SIGMA。
超純水用Millipore?Q超純水系統制得。
其余試劑為分析純。
(2)流動相的選擇
選取0.71%(內含0.02%的疊氮化鈉)硫酸鈉溶液作為流動相。
(3)檢測器的選擇
選用通用型檢測器示差折光檢測器,該檢測器對于存在折光系數差異的物質均有良好的響應。
(4)擬確定的色譜條件
色譜柱:Phenomenex BioSep?SEC?S2000,300×7.8mm,5μm
流動相:0.71%(內含0.02%的疊氮化鈉)硫酸鈉溶液
柱溫:35℃,檢測器溫度:35℃,流速:0.5ml/min
(5)銀杏內酯各成分的分子量
銀杏內酯銀杏內酯A銀杏內酯B銀杏內酯C白果內酯銀杏內酯J分子式C20H24O9C20H24O10C20H24O11C15H18O8C20H24O10分子量408.4424.4440.4326.3424.4
(6)方法學研究
①將右旋糖酐和葡萄糖對照品分別加流動相制成10mg/ml的溶液,分別精密吸取對照品溶液各20μl,注入色譜儀,記錄色譜圖,結果右旋糖酐在保留時間9.816′出峰,葡萄糖在保留時間18.712′出峰,表明采用凝膠色譜法,分子量大的物質先出峰,分子量小的物質后出峰。
②取本發明銀杏內酯約10mg,加乙醇2ml溶解,加入右旋糖酐對照品溶液(10mg/ml)1ml,混勻,精密吸取10μl,注入色譜儀,記錄色譜圖,結果在保留時間9.698′檢出右旋糖酐,銀杏內酯注射液成分峰均在18min以后出峰,表明分子量在180~450出峰時間在18min左右,分子量5000~2000000出峰時間在9min左右,采用凝膠色譜法來檢測大分子物質是可行的。
為了再一次驗證本品中不含大分子及聚合物,故又進行了LC?MS試驗。
色譜條件:甲醇?水(90∶10)為流動相、Agilent RX?C18(2.1×50mm)色譜柱,柱溫25℃流速0.3ml/min。
供試品溶液的制備:精密稱取本發明銀杏內酯10mg置10ml量瓶中,加適量1%乙酸使溶解,加流動相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。
LC?MS聯用測試:根據確定的試驗方法,分別取供試品溶液各10μl,在400~1000和400?3000分子量范圍內分別測試,記錄色譜圖。試驗結果見表6。
表6  LC?MS聯用分子量測定結果
[M+Na]+M419.1、431.5、447.4、463.3、475.7、532.2、588.8、701.8396.1、408.5、424.4、440.3、452.7、509.2、678.8
從LC?MS聯用分子量測定結果來看,分別檢出銀杏內酯A(分子量408.5)、銀杏內酯B(分子量424.4)、銀杏內酯C(分子量440.4),與本發明銀杏內酯的有效成份完全一致,由于測試分子量范圍在400?3000之間,未對白果內酯進行測試,本發明銀杏內酯中未檢出分子量大于700以上的物質,其它不同分子量的物質可能是其它雜質的存在,經LC?MS對銀杏內酯中不同成份的分子量測試,說明本品中不含大分子或聚合物。銀杏內酯LC?MS圖譜見圖3~4。
實施例8
銀杏內酯質量控制——總銀杏酸檢查
色譜條件與系統適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇?1%冰醋酸(90∶10)為流動相;流速1.0ml/min;檢測波長為310nm。理論板數按白果新酸峰計應不低于4000。
對照品溶液的制備:取白果新酸對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1ml含5μg的溶液作為對照品溶液;另取總銀杏酸對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1ml含100μg的溶液,作為定位用對照溶液。
供試品溶液的制備:取本發明銀杏內酯5g,精密稱定,置燒瓶中,加正己烷50ml,加熱回流2小時,取出,放冷,濾過,殘渣再用少量正己烷洗滌,合并濾液與洗滌液,置水浴上蒸干,殘渣加甲醇溶解并稀釋至2ml,搖勻,作為供試品溶液。
測定法:精密吸取供試品溶液、對照品溶液及定位用對照溶液各20μl,注入液相色譜儀,計算供試品溶液中與總銀杏酸對照品相應色譜峰的總峰面積,以白果新酸對照品外標法計算總銀杏酸含量,總銀杏酸小于5ppm。
發明人對上述發明內容進行了研究與說明,用于證明本發明的技術效果。下述試驗用于進一步說明與解釋本發明,但不限制本發明。
a、方法一
供試品溶液的制備:取本發明銀杏內酯5g,精密稱定,置燒瓶中,精密加入石油醚(60~90℃)50ml,回流2小時,取出,放冷,濾過,殘渣再用少量石油醚洗滌1次,合并濾液與洗滌液,置水浴上蒸干,殘渣加甲醇溶解并稀釋至2ml,搖勻,作為供試品溶液(1)。
空白樣品溶液的制備:取石油醚(60~90℃)50ml,置錐形瓶中,回流2小時,置水浴上蒸干,殘渣加甲醇溶解并稀釋至2ml,搖勻,作為空白溶液(1)。
b、方法二(正己烷替換石油醚)
供試品溶液的制備:取本發明銀杏內酯5g,精密稱定,置燒瓶中,精密加入正己烷50ml,回流2小時,取出,放冷,濾過,殘渣再用少量正己烷洗滌1次,合并濾液與洗滌液,置水浴上蒸干,殘渣加甲醇溶解并稀釋至2ml,搖勻,作為供試品溶液(2)。
空白樣品溶液的制備:取正己烷50ml,置燒瓶中,回流2小時,置水浴上蒸干,殘渣加甲醇溶解并稀釋至2ml,搖勻,作為空白溶液(2)。
測定法:精密吸取供試品溶液和空白溶液各20μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。試驗結果見表7。
表7  兩種方法檢測結果表

試驗結果表明:采用方法一(石油醚)制備樣品,空白溶液中檢出色譜峰,其峰面積與供試品溶液檢出的色譜峰面積基本一致,說明空白試驗有干擾;而采用方法二(正己烷)制備樣品,空白溶液與供試品溶液均未檢出色譜峰,故發明人擬采用方法二來做加樣回收試驗,以此來驗證方法二的可行性。
c、總銀杏酚酸的加樣回收試驗
供試品溶液的制備:取本發明銀杏內酯5g,精密稱定,置燒瓶中,精密加入濃度為1.032mg/ml的總銀杏酸對照品溶液0.2ml,再精密加入正己烷50ml,回流2小時,放冷,濾過,殘渣再用少量正己烷洗滌,合并濾液與洗滌液,置水浴蒸干,殘渣加甲醇溶解并稀釋至2ml,搖勻,作為供試品溶液。
對照品溶液的制備:精密量取濃度為1.032mg/ml的總銀杏酸對照品溶液0.2ml,置2ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液。
測定法:精密吸取供試品溶液和對照品溶液各20μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。
結果:供試品溶液在與總銀杏酸對照品色譜相應的位置上能檢出總銀杏酸色譜峰,從峰面積來看,供試品溶液與對照品溶液峰面積一致,說明回收率較好。試驗結果見表8。
表8  加樣回收率試驗結果

d、重現性試驗
對照品溶液的制備:取白果新酸對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1ml含5μg的溶液作為對照品溶液。另取總銀杏酸對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1ml含100μg的溶液,作為定位用對照溶液。
供試品溶液制備:取本發明銀杏內酯5g,精密稱定,共稱取6份,分別置燒瓶中,加正己烷50ml,回流2小時,放冷,濾過,殘渣用少量正己烷洗滌,合并濾液與洗滌液,置水浴上蒸干,殘渣加甲醇溶解并稀釋至2ml,搖勻,作為供試品溶液。
測定法:精密吸取供試品溶液、對照品溶液及定位用對照溶液各20μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。試驗結果見表9。
表9  重現性試驗結果
編號1#2#3#4#5#6#總銀杏酸檢查結果未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出未檢出
試驗結果表明,本發明銀杏內酯中無銀杏酚酸。
e、回收率試驗
供試品溶液制備:取本發明銀杏內酯5g,精密稱定,共稱取3份,分別置燒瓶中,分別加入濃度為3.04μg/ml白果新酸對照品溶液1.6ml、2.0ml、2.4ml,再分別加正己烷50ml,回流2小時,放冷,濾過,殘渣用少量正己烷洗滌,合并濾液與洗滌液,置水浴上蒸干,殘渣加甲醇溶解并稀釋至2ml,搖勻,作為供試品溶液。
對照品溶液的制備:同重現性試驗項。
測定法:精密吸取供試品溶液、對照品溶液各20μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。每個濃度測定三次,共9次。計算回收率、RSD值。試驗結果見表10。
表10  回收率試驗結果表

試驗結果表明,回收率較好。
實施例9
銀杏內酯質量控制——指紋圖譜檢查
色譜條件與系統適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇?四氫呋喃?水(25∶10∶65)為流動相;用蒸發光散射檢測器,漂移管溫度:105℃;載氣流速:3.00L/min;柱溫:40℃;理論板數按白果內酯峰計算應不低于2500。白果內酯峰與銀杏內酯C峰的分離度應大于1.5。
參照物溶液的制備:分別精密稱取白果內酯對照品、銀杏內酯A對照品、銀杏內酯B對照品、銀杏內酯C對照品適量,加甲醇制成每1ml分別含0.15mg、0.12mg、0.1mg、0.1mg的混合溶液,搖勻,作為參照物溶液。
試品溶液的制備:取本發明銀杏內酯6mg,精密稱定,置10ml量瓶中加甲醇1ml溶解,加流動相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。
測定法:分別精密吸取參照物溶液和供試品溶液各20μl,注入液相色譜儀,記錄60分鐘的色譜圖。
按中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統,供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度大于0.95。
發明人對上述發明內容進行了研究與說明,用于證明本發明的技術效果。下述試驗用于進一步說明與解釋本發明,但不限制本發明。
在銀杏內酯指紋圖譜中,其中峰2為銀杏內酯C、峰3為白果內酯、峰4為銀杏內酯A、峰5為銀杏內酯B,本品中有效部位4個特征峰在指紋圖譜中均能一一對應。銀杏內酯對照指紋圖譜見圖5。
首先采用國家藥典委員會2004年指紋圖譜指定軟件——中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版分別對10批銀杏內酯生成對照指紋圖譜,將不同批次的供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜用相似度軟件進行計算相似度。試驗結果見表11。
表11  10批銀杏內酯相似度結果
批號100401100402100403100404110101相似度0.9920.9970.9910.9960.982批號110102110103110601110602110603相似度0.9990.9970.9920.9930.989
10批銀杏內酯指紋圖譜的相似度均大于0.95。
實施例10
銀杏內酯質量控制——殘留溶劑測定
(1)乙醇、乙酸乙酯和正己烷
供試品溶液的制備:取本發明銀杏內酯約0.1g,精密稱定,置頂空瓶中,精密加入N,N?二甲基甲酰胺5ml使溶解,密封,作為供試品溶液。
對照品溶液的制備:取乙醇、乙酸乙酯和正己烷適量,精密稱定,用N,N?二甲基甲酰胺定量稀釋制成每1ml中各約含30μg的溶液,精密量取5ml,置頂空瓶中,密封,作為對照品溶液。
測定法:以6%氰丙基苯基?94%二甲基聚硅氧烷(或極性相近)為固定液,起始溫度為50℃,維持3分鐘,以每分鐘40℃的速率升溫至160℃,維持3分鐘;進樣口溫度200℃;檢測器溫度為250℃;頂空瓶平衡溫度為80℃,平衡時間為30分鐘。取對照品溶液頂空進樣,各成分峰之間的分離度應符合要求;再取供試品溶液與對照品溶液分別頂空進樣,記錄色譜圖,按外標法以峰面積計算。
含乙醇和乙酸乙酯均小于0.5%,正己烷小于0.029%。
(2)樹脂殘留量
對照品溶液的制備:取N,N?二甲基乙酰胺適量,精密稱定,用水制成每1ml約含0.1mg的溶液,搖勻,作為內標溶液;精密稱取己內酰胺適量,加內標溶液制成每1ml約含己內酰胺37.5μg的溶液,作為對照品溶液。
供試品溶液的制備:取本發明銀杏內酯約2.5g,精密稱定,置錐形瓶中,加正己烷25ml,回流2小時,取出,放冷,濾過,用少量正己烷洗滌,合并濾液與洗滌液,于60℃水浴蒸干,殘渣加內標溶液1ml使溶解,作為供試品溶液。
測定法:以聚乙二醇(PEG?20M)(或極性相近)為固定液;起始溫度為100℃,維持2分鐘,以每分鐘40℃的速率升溫至160℃,維持3分鐘,再以40℃的速率升溫至220℃,維持7分鐘;進樣口溫度為240℃;檢測器溫度為260℃。精密量取對照品溶液與供試品溶液各1μl,注入氣相色譜儀,記錄色譜圖。按內標法以峰面積計算,供試品溶液中己內酰胺峰面積與內標峰面積的比值小于對照品溶液中己內酰胺峰面積與內標峰面積的比值。
己內酰胺未檢出。
實施例11
銀杏內酯質量控制——含量測定
色譜條件與系統適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇?四氫呋喃?水(25∶10∶65)為流動相;用蒸發光散射檢測器,漂移管溫度:105℃;載氣流速:3.00L/min;柱溫:40℃;理論板數按白果內酯峰計算應不低于2500。白果內酯峰與銀杏內酯C峰的分離度應大于1.5。
對照品溶液的制備:分別精密稱取白果內酯對照品、銀杏內酯A對照品、銀杏內酯B對照品、銀杏內酯C對照品適量,加甲醇制成每1ml分別含0.15mg、0.12mg、0.1mg、0.1mg的混合溶液,搖勻,作為對照品溶液。
供試品溶液的制備:取本發明銀杏內酯6mg,精密稱定,置10ml量瓶中加甲醇1ml溶解,加流動相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。
測定法:分別精密量取對照品溶液10μl、20μl和供試品溶液10~20μl,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,用外標兩點法對數方程分別計算白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B和銀杏內酯C的含量。
按干燥品計算,白果內酯(C15H18O8)為42.5%、銀杏內酯A(C20H24O9)為25.4%、銀杏內酯B(C20H24O10)為18.7%、銀杏內酯C(C20H24O11)為10.6%,且白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C總量97.2%。
實施例12
銀杏內酯質量控制——異常毒性檢查
供試品溶液的制備:取本發明銀杏內酯,加氯化鈉注射液制成每1ml中含0.2mg的溶液。
檢查法:取體重17~20g小鼠5只,分別注入小鼠尾靜脈供試品溶液0.5ml,48小時內無死亡。
實施例13
銀杏內酯質量控制——熱原檢查
供試品溶液的制備:取本發明銀杏內酯10mg,加入到0.9%氯化鈉注射液50ml中,搖勻。
檢查法:取家兔3只,測定其正常體溫后15分鐘內,按家兔體重每1kg注射5ml自耳靜脈緩緩注入供試品溶液,每隔30分鐘測定體溫1次,共測6次,體溫升高均低于0.6℃,并且3只家兔體溫升高總和低于1.3℃。
實施例14
銀杏內酯注射液質量控制——有關物質檢查
注射液處方:

制備方法為:
a)配制:混合乙醇和甘油,加入銀杏內酯、溶解,補加乙醇或注射用水至全量,用5~10%枸櫞酸溶液或1~10%鹽酸溶液調節pH值至3.2~3.8;
b)過濾除菌;
c)灌封;
d)滅菌。
(1)蛋白質:取銀杏內酯注射液2ml,加水制成50ml,作為供試品溶液。稱取考馬斯亮藍G?250約50mg,溶于25ml乙醇中,再加入85%(w/v)的磷酸50ml,加水稀釋至500ml,搖勻,過濾,精密量取濾液5ml置試管中,再加入1ml供試品溶液,搖勻,放置3min。同法做空白,于595nm波長下,測定吸光度,供試品溶液吸光度小于0.05。
(2)鞣質:取蛋白質檢查項供試品溶液1ml加入稀醋酸1滴,再加明膠氯化鈉試液5滴,搖勻,放置10分鐘,未出現渾濁或沉淀。
(3)樹脂:取蛋白質檢查項供試品溶液5ml,加鹽酸1滴,放置30分鐘,無樹脂狀物質析出。
(4)草酸鹽:取蛋白質檢查項供試品溶液2ml,用稀鹽酸調節pH值至1~2,濾過,濾液用氨水調節pH值為5~6,加3%氯化鈣溶液3滴,放置10分鐘,未出現渾濁或沉淀。
(5)鉀離子:取蛋白質檢查項供試品溶液2ml,置10ml納氏比色管中,加堿性甲醛溶液0.6ml、3%EDTA溶液2滴、3%四苯硼鈉溶液0.5ml,加水稀釋至10ml,另取標準氯化鉀溶液0.8ml,同法試驗,濁度低于對照溶液。
實施例15
銀杏內酯注射液質量控制——溶血與凝聚檢查
供試品溶液的制備:取銀杏內酯注射液(按實施例14制備)6ml,加入到0.9%氯化鈉注射液100ml中搖勻。
檢查法:取潔凈玻璃試管5只,編號,1、2號管為供試品管,3號管為陰性對照管,4號管為陽性對照管,5號管供試品對照管。按表12所示依次加入2%紅細胞懸液、0.9%氯化鈉溶液、蒸餾水,混勻后立即置37℃±0.5℃的恒溫箱中進行溫育。
表12  溶血和凝聚試驗加入量
試管編號123452%紅細胞懸液/ml2.52.52.52.5 0.9%氯化鈉溶液/ml2.22.22.5 4.7蒸餾水/ml   2.5 供試品溶液/ml0.30.3  0.3
如試管中的溶液呈澄明紅色,底部無細胞殘留或有少量紅細胞殘留,表明有溶血發生;如紅細胞全部下沉,上清液無色澄明,或上清液雖有色澄明,但1,2號管和5號管肉眼觀察無明顯差異,則表明無溶血發生。3小時后觀察未產生溶血和凝聚反應。
實施例16
銀杏內酯注射液質量控制——指紋圖譜檢查
色譜條件與系統適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇?四氫呋喃?水(25∶10∶65)為流動相;用蒸發光散射檢測器,漂移管溫度:105℃;載氣流速:3.00L/min;柱溫:40℃;理論板數按白果內酯峰計算應不低于2500。白果內酯峰與銀杏內酯C峰的分離度應大于1.5。
參照物溶液的制備:分別精密稱取白果內酯對照品、銀杏內酯A對照品、銀杏內酯B對照品、銀杏內酯C對照品適量,加甲醇制成每1ml分別含0.15mg、0.12mg、0.1mg、0.1mg的混合溶液,搖勻,作為參照物溶液。
供試品溶液的制備:取[含量測定]項下的供試品溶液。
測定法:分別精密吸取參照物溶液和供試品溶液各20μl,注入液相色譜儀,記錄60分鐘的色譜圖。
按中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統,供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜經相似度大于0.95。
實施例17
銀杏內酯注射液質量控制——含量測定
色譜條件與系統適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇?四氫呋喃?水(25∶10∶65)為流動相;用蒸發光散射檢測器,漂移管溫度:105℃;載氣流速:3.00L/min;柱溫:40℃;理論板數按白果內酯峰計算應不低于2500。白果內酯峰與銀杏內酯C峰的分離度應大于1.5。
對照品溶液的制備:分別精密稱取白果內酯對照品、銀杏內酯A對照品、銀杏內酯B對照品、銀杏內酯C對照品適量,加甲醇制成每1ml分別含0.15mg、0.12mg、0.1mg、0.1mg的混合溶液,搖勻,作為對照品溶液。
供試品溶液的制備:精密量取銀杏內酯注射液(按實施例14制備)1ml,加磷酸鹽緩沖溶液(pH6.5)14ml,搖勻,上Extrelut?20柱,吸附15分鐘,用乙酸乙酯100ml洗脫,收集洗脫液,于水浴上蒸干,殘渣用流動相溶解并轉移至10ml量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過,作為供試品溶液。
測定法:分別精密吸取對照品溶液10μl、20μl,供試品溶液15μl,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,用外標兩點法對數方程分別計算白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B和銀杏內酯C的含量。
銀杏內酯注射液中每1ml含銀杏萜類內酯5.15mg。
銀杏內酯注射液中每1ml含銀杏萜類內酯以白果內酯(C15H18O8)、銀杏內酯A(C20H24O9)、銀杏內酯B(C20H24O10)和銀杏內酯C(C20H24O11)的總量計為1?10mg,優選4.25~5.75mg。

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銀杏 內酯 注射液 含量 測定 方法
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