鬼佬大哥大
  • / 19
  • 下載費用:30 金幣  

一種莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白及其編碼基因與應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310168965.7

申請日:

2013.05.06

公開號:

CN103243108B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 15/29申請日:20130506|||公開
IPC分類號: C12N15/29; C07K14/415; C12N15/70; C12N15/84; A01H5/00 主分類號: C12N15/29
申請人: 重慶郵電大學
發明人: 向瀏欣; 蔡應繁; 劉吉軍; 王小艷; 付于銀
地址: 400065 重慶市南岸區南山街道崇文路2號
優先權:
專利代理機構: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129 代理人: 謝殿武
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201310168965.7

授權公告號:

103243108B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.09.11|||2013.08.14

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白及其基因與應用。本發明鈣離子結合蛋白基因BjCBP1,其堿基序列如SEQ?ID?NO.1;本發明所構建的重組原核表達載體pET32a-BjCBP1是由SEQ?ID?NO.1序列和原核表達載體pET-32a(+)構成,重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjCBP1是由SEQ?ID?NO.1序列和植物表達載體pCAMBIA1302構成;所述植物表達載體用于植物遺傳轉化,BjCBP1基因在CaMV35S啟動子的啟動下超量表達,大量合成BjCBP1蛋白,從而提高植物耐逆境特性。

權利要求書

權利要求書
1.   莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1,其特征在于,其基因序列為SEQ ID NO.1。

2.   莖瘤芥鈣離子結合蛋白BjCBP1,其特征在于:其氨基酸序列為SEQ ID NO.3所示。

3.   莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1的重組原核表達載體pET32a?BjCBP1,其特征在于:由權利要求1所述SEQ ID NO.1序列與原核表達載體pET?32a(+)構成。

4.   莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1的重組植物表達載體pCAMBIA1302?BjCBP1,其特征在于:由權利要求1所述SEQ ID NO.1序列與植物表達載體pCAMBIA1302構成。

5.   莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1在提高植物耐逆境特性的應用。

6.   根據權利要求5所述的莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1在提高植物耐逆境特性的應用,其特征在于,所述耐逆境特性為耐鹽特性。

說明書

說明書一種莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白及其編碼基因與應用
技術領域
本發明涉及基因工程領域,具體涉及莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術
鈣離子信號在許多細胞活動,如細胞代謝、基因表達、細胞骨架動態變化、細胞周期、細胞死亡、信號傳導等過程中有重要作用。
在植物細胞中,鈣離子的作用之一是作為第二信使,很多外界環境信號,如光、生物脅迫、非生物脅迫、植物激素等都會刺激胞液中Ca2+濃度的增加,從而引發鈣離子信號傳導。鈣離子信號傳導途徑中首先響應的即是鈣離子結合蛋白,其結合Ca2+以后會發生構想變化,使疏水面外露,從而激活或抑制其它蛋白的活性,從而引發信號傳導。
高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫環境對作物的產量及生長發育有很大影響,因此,有關植物抗逆性基因的研究一直是植物學研究領域的熱點之一。
莖瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee),又稱青菜頭,是十字花科蕓薹屬植物,為榨菜的主要原料,是我國重慶、四川、浙江等地區主要的經濟作物之一。多年來,莖瘤芥的相關研究主要集中在遺傳育種、良種繁育、栽培技術、品質安全等領域,近年才陸續有生物學方面研究的報道,包括基因的克隆、功能研究以及莖瘤芥瘤狀莖膨大相關研究,企圖通過基因工程方法提高莖瘤芥的產量、質量以及抗病性、抗逆性等。
對于莖瘤芥,目前還未見其鈣離子結合蛋白的序列以及基因功能的報道,本發明克隆了第一個莖瘤芥鈣離子結合蛋白,且經大量實驗研究表明,該蛋白具有提高植物抗逆性的作用,為植物抗逆性基因的研究和應用提供了新內容和新基礎。
發明內容
鑒于此,本發明的目的之一是提供莖瘤芥(英文:Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)來源的鈣離子結合蛋白(英文:calcium?binding protein)基因,將其命名為BjCBP1,其核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示,該基因長627bp。
本發明的目的之二是提供莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白BjCBP1,其氨基酸序列為SEQ ID NO.3所示,有208個氨基酸,且序列通過NCBI的保守結構域(conserved domains)檢測知具有4個EFh結構域。
本發明的目的之三是提供莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1的重組原核表達載體pET32a?BjCBP1,其由SEQ ID NO.1序列與原核表達載體pET?32a(+)構成。
本發明的目的之四是提供莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1的重組植物表達載體pCAMBIA1302?BjCBP1,其由SEQ ID NO.1序列與植物表達載體pCAMBIA1302構成。
本發明的目的之五是提供莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1在提高植物耐逆境特性的應用,尤其是提高植物在高鹽條件的耐受力。
本發明通過莖瘤芥轉錄組測序獲得序列片段SEQ ID NO.4,然后根據片段SEQ ID NO.4設計巢式引物并通過RACE方法擴增獲得莖瘤芥第一個鈣離子結合蛋白基因BjCBP1,基因編碼208個氨基酸,NCBI比對預測具有4個EF?hand結構域,屬于鈣離子結合蛋白家族成員;通過構建BjCBP1基因的原核表達載體進行原核表達和蛋白純化,發現BjCBP1能夠結合鈣離子,證明是鈣離子結合蛋白;通過構建BjCBP1基因植物表達載體,可直接用于農桿菌介導的遺傳轉化,創制耐逆境新種質,提高植物的逆境耐受力特性,尤其是耐鹽特性,可進行植物品種改良。
附圖說明
圖1為本發明BjCBP1基因編碼區序列PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖;
圖2為本發明原核表達純化后的BjCBP1蛋白的SDS?PAGE凝膠電泳圖;
圖3為本發明重組植物表達載體pCAMBIA1302?BjCBP1的構建流程圖;
圖4為本發明轉基因型擬南芥和野生型的BjCBP1基因表達水平檢測圖;
圖5為本發明NaCl、Mannitol和ABA條件下野生型與轉基因型擬南芥種子發芽率結果圖;
圖6為本發明NaCl、Mannitol和ABA條件下野生型與轉基因型擬南芥的生長情況攝影圖;
圖7為本發明NaCl和ABA條件下野生型與轉基因型擬南芥的抗逆基因的表達水平檢測結果圖
圖8為本發明NaCl下野生型與轉基因型擬南芥的存活率統計圖。
具體實施方式
下面將結合實施例和附圖來詳細說明本發明,這些實施例和附圖僅起說明性作用,并不局限于本發明的應用范圍。本發明不限于下述實施方式或實施例,凡不違背本發明精神所做出的修改及變形,均應包括在本發明范圍之內。
實驗例1:莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1的克隆
1主要試劑:柱式小量植物總RNA抽提試劑盒(W7021)購自上海華舜生物技術有限公司;DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司;5’?Full RACE Kit試劑盒、M?MLV反轉錄酶、Premix Ex Taq、DL2000DNA Marker、pMD19?T載體均購自大連寶生物工程有限公司。
2實驗方法與步驟:
BjCBP1基因序列片段SEQ ID NO.4的獲取:采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒方法提取獲得莖瘤芥瘤莖的總RNA,總RNA取小部分通過紫外分光光度計檢測OD260/OD280的比值為1.92,通過瓊脂糖凝膠電泳28S的亮度約是18S的2倍,說明RNA的純度高且無降解,達到實驗要求。將總RNA樣品送北京華大基因研究中心進行轉錄組測序(RNA?seq),方法為用帶有Oligo(dT)的磁珠富集莖瘤芥總RNA中的mRNA,加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段,以mRNA為模板,用六堿基隨機引物合成第一條cDNA鏈,然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈,在經過QiaQuick PCR試劑盒(Qiagen公司)純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復、加poly(A)并連接測序接頭,然后用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇,最后進行PCR擴增,建好的測序文庫(200bp)用Illumina HiSeqTM2000進行測序。通過對測序結果進行注釋,選取可能的鈣離子結合蛋白片段序列SEQ ID NO.4,然后根據該片段序列進行基因全長的克隆以及功能分析。
2.1BjCBP1基因5’端未知序列擴增
2.1.1總RNA提取和反轉錄:采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒方法提取獲得莖瘤芥瘤莖的總RNA,然后取約1μg總RNA通過5’?Full RACE Kit試劑盒方法去磷酸化、去帽子、加接頭,最后反轉錄獲得cDNA第一鏈。
2.1.2引物設計:根據轉錄組測序得到的已知序列SEQ ID NO.4設計兩個反向巢式引物:
BjCBP1?AOUT:5'?TCGTCTCCAATAGCCGAGAAAACT?3'
BjCBP1?AIN:5'?TACCGTCTCCGTCGCAGTCCAC?3'
2.1.3巢式PCR擴增:
首先為OUT擴增:以步驟2.1.1中cDNA第一鏈為模板,采用引物BjCBP1?AOUT和5’RACE Outer Primer(此引物為5’?Full RACE Kit試劑盒中的引物)做PCR擴增,反應體系為:ddH2O7.4μL,Premix Ex Taq10μL,模板1μL,上下游引物各0.8μL。PCR程序為:94℃3min,94℃30s、56℃30s、72℃1min,30個循環;72℃延伸10min。
再做IN擴增:以OUT擴增的PCR產物為模板,采用引物BjCBP1?AIN和5’RACE Inner Primer(此引物也為5’?Full RACE Kit試劑盒中的引物)做PCR擴增。20μL反應體系為:ddH2O7.4μL,Premix Ex Taq10μL,模板1μL,上下游引物各0.8μL。PCR程序為:94℃3min,94℃30s、58℃30s、72℃1min,32個循環;72℃延伸10min。
2.1.4電泳:將IN擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳在450bp左右有一特異條帶。
2.1.5TA克隆:將IN擴增做3個20μL反應體系,電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至pMD19?T載體,然后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,經PCR篩選,將重組陽性質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。
2.1.6測序結果:測序獲得的序列的3’端序列與SEQ ID NO.4的5’端序列完全吻合,兩者成功拼接,說明成功獲得BjCBP1基因的5’端序列。
2.2BjCBP1基因3’端未知序列擴增
2.2.1總RNA提取和反轉錄:采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒方法提取獲得莖瘤芥瘤莖的總RNA,然后取約1μg總RNA為模板,采用接頭引物5'?ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG?d(T)30MN?3'(N=A,G,C或T;M=A,G或C)(此接頭引物來自Clontech公司的SMART RACE cDNA Synthesis Kit試劑盒)以及M?MLV反轉錄酶反轉獲得cDNA第一鏈。
2.2.2引物設計:根據轉錄組測序得到的已知序列SEQ ID NO.4設計兩個正向巢式引物:
BjCBP1?SOUT:5'?ATGCTCAGGGAGGTGGACT?3'
BjCBP1?SIN:5'?GCTATTGGAGACGAGCGGTGC?3'
2.2.3巢式PCR擴增:
首先為OUT擴增:以步驟2.2.1中cDNA第一鏈為模板,采用引物BjCBP1?SOUT和3’RACE Primer(此引物為步驟2.2.1中接頭引物的前部分,即5'?ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG?3')做PCR擴增,20μL反應體系為:ddH2O7.4μL,Premix Ex Taq10μL,模板1μL,上下游引物各0.8μL。PCR程序為:94℃3min,94℃30s、54℃30s、72℃60s,30個循環;72℃延伸10min。
再做IN擴增:以OUT擴增的PCR產物為模板,采用引物BjCBP1?SIN和3’RACE Primer做PCR擴增。20μL反應體系為:ddH2O7.4μL,Premix Ex Taq 10μL,模板1μL,上下游引物各0.8μL。PCR程序為:94℃3min,94℃30s、59℃30s、72℃50s,32個循環;72℃延伸10min。
2.2.4電泳:將IN擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳在300bp左右有一特異條帶。
2.2.5TA克隆:將IN擴增做3個20μL反應體系,電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至pMD19?T載體,然后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,經PCR篩選,將重組陽性質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。
2.2.6測序結果:測序獲得的序列的5’端序列與SEQ ID NO.4的3’端序列完全吻合,兩者成功拼接,說明成功獲得BjCBP1基因的3’端序列。
2.3BjCBP1基因編碼區序列擴增
2.3.1序列拼接:將2.1.6獲得的5’端序列、2.2.6獲得的3’端序列和已知序列SEQ ID NO.4進行拼接,得到BjCBP1基因全長序列SEQ ID NO.2,其全長905bp,編碼區即SEQ ID NO.1序列有627bp,5’端非編碼區有92bp,3’端非編碼區有186bp。為進一步驗證拼接的全長是否為真實的全長序列,于是從5’端和3’端的非編碼區設計引物進行PCR驗證。
2.3.2引物設計:根據2.3.1的序列SEQ ID NO.2,從兩端的非編碼區設計一對上下游引物:
上游引物BjCBP1?F:5'?TTCCCCATCAAAAATAAATCTT?3'
下游引物BjCBP1?R:5'?CAAACGATACTCATAACCCTCA?3'
2.3.3全長序列的PCR擴增:以步驟2.2.1中cDNA第一鏈為模板,采用引物BjCBP1?F和BjCBP1?R做PCR擴增。20μL反應體系為:ddH2O7.4μL,Premix Ex Taq 10μL,模板1μL,上下游引物各0.8μL。PCR程序為:94℃3min,94℃30s、60℃30s、72℃1min,32個循環;72℃延伸10min。
2.3.4電泳:將2.3.3擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳發現特異條帶如圖1所示,M為MarkerIII,1為擴增條帶,可見在750bp左右有一特異條帶,與預期結果相符。
2.3.5TA克隆:將2.3.3中的擴增做3個20μL反應體系,電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至pMD19?T載體,然后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,經PCR篩選,將重組陽性質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。
2.3.6測序結果:測序獲得的序列與拼接序列的相應片段完全一致,說明成功獲得BjCBP1基因。BjCBP1基因編碼的蛋白含有208個氨基酸,如SEQ ID NO.3序列所示,在NCBI上進行保守結構域預測其含有4個EF?hand基序,EF?hand基序可能具有結合鈣離子的能力,因此預測BjCBP1蛋白能結合鈣離子,進一步的實驗驗證見實驗例2。
實驗例2:莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1在大腸桿菌BL21(DE3)中的原核表達及特性檢測
1、主要試劑:His?Tag蛋白純化試劑盒購自北京康為試劑生物科技有限公司;T4DNA連接酶、限制性內切酶BamH I和HindШII購自大連寶生物工程有限公司;含原核表達質粒pET?32a(+)的DH5α菌種、大腸桿菌菌株由本實驗室保存。
2、重組原核表達載體pET32a?BjCBP1的構建
2.1引物設計:根據BjCBP1基因的編碼區序列SEQ ID NO.3設計上下游引物,并分別引入酶切位點BamH I(GGATCC)和HindШ(AAGCTT)序列,引物為:
上游引物pET?F:5’?CGGATCCATGAAATTCGCAAAACTG?3’
下游引物pET?R:5’?CAAGCTTTCATCGCTGGAGATCCA?3’
2.2PCR擴增:以實驗例1中步驟2.2.1中cDNA第一鏈為模板,引物pET?F和pET?R做PCR擴增:體系為ddH2O7.4μL,Premix Ex Taq10μL,模板1μL,上下游引物各0.8μL。PCR程序為:94℃3min,94℃30s、60℃30s、72℃1min,32個循環;72℃延伸10min。
2.3電泳:將2.2擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳在630bp左右有一特異條帶,與預期結果相符。
2.4TA克隆獲得重組載體pMD?T?BjCBP1:將2.2中的擴增做3個20μL反應體系,電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至pMD19?T載體得重組載體pMD?T?BjCBP1,然后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,經PCR篩選,將含重組載體pMD?T?BjCBP1的陽性DH5α菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。
2.5測序結果:與預期結果完全一致。
2.6重組原核表達載體pET32a?BjCBP1的構建:將2.4含重組載體pMD?T?BjCBP1的陽性DH5α菌液擴大培養,并采用普通質粒提取試劑盒的方法提取菌液中的重組質粒pMD?T?BjCBP1;將實驗室保存的含原核表達質粒pET?32a(+)的DH5α菌種擴大培養,并用同樣的方法提取質粒pET?32a(+)。用BamH I和HindШ雙酶切質粒pMD?T?BjCBP1和pET?32a(+),參照酶的說明書兩種質粒各做2個50μL酶切體系。酶切后電泳,并切下pMD?T?BjCBP1質粒的小片段和pET?32a(+)質粒的大片段,利用膠回收試劑盒回收。用T4DNA連接酶連接小片段和大片段(連接體系為:小片段7μL,大片段1μL,T4DNA連接酶1μL,10×T4DNA Ligase Buffer1μL)至少24小時,然后利用熱擊法轉化大腸桿菌感受態DH5α;PCR篩選陽性克隆,再進行測序驗證,得到序列完全正確的重組原核表達載體pET32a?BjCBP1及含該表達載體的大腸桿菌。
2.7pET32a?BjCBP1重組原核表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株及進行誘導表達、純化蛋白和蛋白特性檢測:從2.6中含pET32a?BjCBP1載體的菌株中提取重組質粒,用熱激法轉化BL21(DE3)菌株感受態,PCR篩選得到陽性克隆。將此陽性克隆在含50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養基中37℃、180rpm轉速振搖培養至菌液濃度OD600為0.4?0.8,然后加入IPTG(中文名:異丙基?β?D?硫代吡喃半乳糖苷;終濃度為1mM)誘導5小時使表達BjCBP1蛋白。然后根據His?Tag蛋白純化試劑盒說明書純化獲得BjCBP1蛋白。將獲得的BjCBP1蛋白分別于含10mM鈣離子和10mM EGTA金屬離子螯合劑條件下進行的12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS?PAGE)檢測,電泳結果如圖2所示,BjCBP1蛋白在含Ca2+的條件下電泳的遷移速率更快,說明BjCBP1蛋白能夠結合Ca2+,是鈣離子結合蛋白。
實驗例3:莖瘤芥鈣離子結合蛋白基因BjCBP1的重組植物表達載體pCAMBIA1302?BjCBP1的構建
1主要試劑:普通質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;T4DNA連接酶、限制性內切酶BamH I、Bgl II和BstE II購自大連寶生物工程有限公司;含質粒pCAMBIA1302的菌種由本實驗室保存。
2重組植物表達載體pCAMBIA1302?BjCBP1的構建
2.1引物設計:根據BjCBP1基因的編碼區序列SEQ ID NO.3設計上下游引物,并分別引入酶切位點BamH I(GGATCC)和BstE II(GGTCACC)序列,引物為:
上游引物BjCBP1?Bam:5’?GGATCCATGAAATTCGCAAAACTG?3’
下游引物BjCBP1?Bst:5’?GGTCACCTCATCGCTGGAGATCCA?3’
2.2PCR擴增:以實驗例1中步驟2.2.1中cDNA第一鏈為模板,引物BjCBP1?Bam和BjCBP1?Bst做PCR擴增:體系為ddH2O7.4μL,Premix Ex Taq10μL,模板1μL,上下游引物各0.8μL。PCR程序為:94℃3min,94℃30s、60℃30s、72℃1min,32個循環;72℃延伸10min。
2.3電泳:將2.2擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳在630bp左右有一特異條帶,與預期結果相符。
2.4TA克隆獲得重組載體pMD19?T?BjCBP1:將2.2中的擴增做3個20μL反應體系,電泳后用DNA純化回收試劑盒回收特異條帶并連接至pMD19?T載體得重組載體pMD19?T?BjCBP1,然后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,經PCR篩選,將含重組載體pMD19?T?BjCBP1的陽性DH5α菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。
2.5測序結果:與預期結果完全一致。
2.6重組植物表達載體pCAMBIA1302?BjCBP1的構建:構建方法如圖3所示,將2.4含重組載體pMD19?T?BjCBP1的陽性DH5α菌液擴大培養,并采用普通質粒提取試劑盒的方法提取菌液中的重組質粒pMD19?T?BjCBP1;將實驗室保存的含有植物表達質粒pCAMBIA1302的DH5α菌種擴大培養,并用同樣的方法提取質粒pCAMBIA1302。用BamH I和BstE II雙酶切質粒pMD19?T?BjCBP1、用Bgl II(Bgl II與BamH I為同尾酶)和BstE II雙酶切質粒pCAMBIA1302,參照酶的說明書兩種質粒各做2個50μL酶切體系。酶切后電泳,并切下pMD19?T?BjCBP1質粒的小片段和pCAMBIA1302質粒的大片段,利用膠回收試劑盒回收。用T4DNA連接酶連接小片段和大片段(連接體系為:小片段7μL,大片段1μL,T4DNA連接酶1μL,10×T4DNA Ligase Buffer1μL)至少24小時,然后利用熱擊法轉化大腸桿菌感受態DH5α;PCR篩選陽性克隆,再進行測序驗證,得到序列完全正確的重組表達載體pCAMBIA1302?BjCBP1及含該重組表達載體的大腸桿菌。
2.7pCAMBIA1302?BjCBP1重組質粒轉化農桿菌:從2.6中含pCAMBIA1302?BjCBP1載體的菌株中提取重組質粒,用液氮冷激法轉化根瘤農桿菌GV3101,方法為:①200μL根瘤農桿菌GV3101感受態細胞中加入2μg(5?10μL)重組質粒DNA,冰浴5min,然后轉至液氮中冷凍8min;②迅速與37℃水浴中溫浴5min后,加入800μLLB液體培養基③28℃﹑250rpm預培養4?5h,然后涂布于含有Kan(50mg/l)﹑Gent(50mg/l)的LB平板,28℃培育24?28小時后可出現菌落;④挑取菌體做菌體PCR鑒定,確定正確后保存于?70℃,即為植物遺傳轉化的工程菌株。
實施例3:擬南芥的遺傳轉化
1主要試劑:熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMKit購自大連寶生物工程有限公司;柱式小量植物總RNA抽提試劑盒W7021,購自上海華舜生物技術有限公司;DNA酶購自Promega公司。
2擬南芥的培養及農桿菌侵染實驗
①取野生型擬南芥種子,用75%乙醇消毒1min后無菌水清洗;再用5%NaClO滅菌10min,無菌水清洗5次,去盡NaClO殘留液。加一定量無菌水,于4℃條件下春化3?4天;
②將春化3?4天的擬南芥種子在MS空白培養基上光照培養7天,待長出幼苗,移栽至蛭石培養基(蛭石:營養土:珍珠巖=3:1:1),1/2MS液體培養基澆灌;
③待植物培養至初生花序10?15cm,次生花序剛剛形成花芽狀時,去除初生花序;培養至可進行侵染實驗;
④將實驗例2步驟2.7中制備好的已轉化pCAMBIA1302?BjCBP1質粒的農桿菌菌液擴大培養,即在轉化前1天晚上轉入大瓶過夜培養;至菌液濃度為OD600=2.0;離心,棄上清,將農桿菌沉淀懸浮于約3倍體積的滲透培養液中,使OD600在0.8左右;
⑤將植物的地上部分浸入農桿菌懸浮液中侵染5分鐘;用保鮮膜將侵染過的植物(T0代植物)罩起來以保持濕度,置培養箱中黑暗培養12小時后正常條件培養;2?3天揭去保鮮膜,7天后可澆水;并定期侵染幾次;
⑥繼續培養至植物成熟,收種子(T1代種子)。
MS培養基由大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質、激素等按一定比例組成。MS培養基作為目前使用最廣的離體細胞培養基,由于其中無機鹽濃度較高,為外植體的生長提供了足夠的礦質營養并能使愈傷組織加速生長。為便于溶液配制及減小誤差,先按大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質配制一定體積的母液。待用時再按一定比例稀釋混合。
3擬南芥轉基因純合體的篩選
T1代種子經消毒、滅菌和春化處理后均勻地涂布在含有潮霉素(25mg/L)抗生素的MS培養基上,至人工氣候培養箱中培養,觀察幼苗(T1代植物)的生長狀況。10?12天后明顯可以觀察到非轉基因擬南芥只能長出2片子葉、沒有真葉、根非常短,而轉基因擬南芥長出2?4片真葉、根長,于是將轉基因苗移栽至蛭石培養基中,成熟后分別收取各個轉基因苗種子(T2代種子)。T2代種子經消毒、滅菌和春化處理后均勻地涂布在含有潮霉素(25mg/L)抗生素的MS培養基上,抗性苗與非抗性苗的數量比約為3:1的,再將抗性苗(T2代植物)移栽至蛭石培養基中,成熟后分別收取各個轉基因苗種子(T3代種子)。取各個T2代植物的小部分T3代種子,經消毒、滅菌和春化處理后均勻地涂布在含有潮霉素(25mg/L)抗生素的MS培養基上,若全為抗性苗的即為純合體,則相應的T3代種子可以用于后續實驗,相應的T2代植物為純合體。
隨機選取純合體T2代植物6株,分別命名為TL1、TL2、TL3、TL4、TL5和TL6,采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒方法提取各株植物葉片的總RNA,經DNA酶去除DNA,根據定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMKit說明書操作檢測各個轉基因擬南芥中的BjCBP1基因的表達量,BjCBP1基因的引物為:
上游引物:5’?CGTTAGAGGAGTGCGAGCGTATG?3’
下游引物:5’?CGAGAACTCAGTGAAGCACACGAAT?3’,
內參基因為擬南芥18S基因,其引物為:
上游引物:5’?CGTCCCTGCCCTTTGTACAC?3’
下游引物:5’?CGAACACTTCACCGGATCATT?3’,
定量PCR結果如圖4所示,橫坐標WT表示野生型擬南芥,TL1至TL6表示隨機選取的6株轉基因擬南芥植株,縱坐標表示BjCBP1基因的相對表達量,知TL3和TL4表達量較高,于是選取TL3和TL4的T3代種子用于后續實驗,TL3和TL4的T3代種子及其發芽后生長的植株均簡稱為轉基因TL3和轉基因TL4。
實驗例4:轉BjCBP1基因擬南芥的逆境反應實驗
將轉基因TL3和TL4種子和野生型種子經消毒、滅菌和春化處理后均勻地涂布在MS培養基上,至人工氣候培養箱中培養,觀察發芽率情況和植物生長情況,轉基因型和野生型沒有明顯差異。將轉基因TL3和TL4種子和野生型種子經消毒、滅菌和春化處理后分別均勻地涂布在含100mM NaCl、250mM甘露醇(英文mannitol)或0.5μM脫落酸(簡稱ABA)的MS培養基上,觀察發芽率情況和植物生長情況。發芽率情況如圖5所示,A為在0.5μM ABA條件下的從0?9天發芽率統計,B為在0.5μM ABA條件下的第5天的發芽率圖片,C為在100mM NaCl條件下的從0?9天發芽率統計,C為在250mM mannitol條件下的從0?9天發芽率統計,A、C、D中黑方塊、黑圓、白圓分別代表野生型、轉基因TL3、轉基因TL4。發芽率實驗圖5顯示轉基因型種子在2?6天比野生型發芽率明顯低,即轉基因型種子發芽率對逆境條件(NaCl、mannitol和ABA)具有超過敏現象,說明BjCBP1基因在植物逆境條件生長時起重要作用。
另外,當轉基因TL3和TL4種子和野生型種子在MS培養基上發芽3天后取部分轉移至含100mM NaCl、250mM甘露醇(英文mannitol)或0.5μM脫落酸(簡稱ABA)的MS培養基上繼續生長,10天后觀察植物生長情況,如圖6所示,轉基因型TL3、TL4和野生型在正常的MS培養基上生長無明顯區別,但轉基因型在逆境條件下生長比野生型明顯受抑制,即轉基因型種子發芽后生長對逆境條件(NaCl、mannitol和ABA)也具有超過敏現象,再次說明BjCBP1基因在植物逆境條件生長時起重要作用。
實施例4:轉BjCBP1基因擬南芥的抗逆境實驗
1轉BjCBP1基因擬南芥中抗逆基因RD29B和RD22表達檢測
擬南芥RD29B和RD22基因為脅迫誘導基因,具有提高植物逆境耐受力的作用。將野生型和轉基因型種子于MS培養基發芽并長出4片真葉時移栽至蛭石中生長,當植物有3周大時,對植物全株噴灑水、NaCl(200mM)水溶液或ABA(10μM)水溶液,3小時后,提取各自的總RNA,熒光定量PCR檢測抗逆基因RD29B和RD22的表達情況。
RD29B基因的引物為:
上游引物:5’?AAGATTTTCCGACAAGAGGTGAT?3’
下游引物:5’?TTGGGACGAGATAGTTCTGGTGA?3’,
RD22基因的引物為:
上游引物:5’?GTGGCTAAGAAGAACGCACCGAT?3’
下游引物:5’?TGGCATACCGCAACTGCTTTAG?3’,
內參基因仍為擬南芥18S基因,其引物為:
上游引物:5’?CGTCCCTGCCCTTTGTACAC?3’
下游引物:5’?CGAACACTTCACCGGATCATT?3’,
定量PCR結果如圖7所示,橫坐標CK為對照,即噴灑水的條件,縱坐標為抗逆基因的相對表達水平,結果表明抗逆基因RD29B和RD22在對照條件下,野生型和轉基因型的表達水平基本相同,但在逆境條件時,轉基因型中RD29B和RD22基因的表達均比野生型顯著升高。由此說明逆境條件下,BjCBP1基因具有提高植物耐逆境生長的能力。
2鹽脅迫下BjCBP1基因對擬南芥的存活率的影響
將野生型WT種子和轉基因型種子TL3、TL4經消毒、滅菌和春化處理后均勻地涂布在含300mM的NaCl的MS培養基上生長2周后移栽至無鹽脅迫的蛭石中繼續培養使恢復生長,12天后觀察仍然存活的植株數量(植株全部白化被認為死亡)。結果如圖8所示,高鹽脅迫生長2周后于正常狀態下培養12天后,野生型植株死亡率高,存活率不到10%,而轉基因型的存活率達到30%以上,具有顯著性差異。說明BjCBP1基因有助于植物在高鹽下的生長,即提高了植物的抗逆性。
綜上所述,BjCBP1基因具有提高植物抗逆性的作用,促進植物在逆境下的適應能力和生長能力。
最后說明的是,以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制,盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明,本領域的普通技術人員應當理解,可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換,而不脫離本發明技術方案的宗旨和范圍,其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。

關 鍵 詞:
一種 莖瘤芥 來源 離子 結合 蛋白 及其 編碼 基因 應用
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:一種莖瘤芥來源的鈣離子結合蛋白及其編碼基因與應用.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6418738.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大