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一株棘孢木霉及其生物制劑和在防治黃瓜疫霉病中的應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310159606.5

申請日:

2013.05.02

公開號:

CN103289902B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 1/14申請日:20130502|||公開
IPC分類號: C12N1/14; A01N63/04; A01P3/00; C12R1/885(2006.01)N 主分類號: C12N1/14
申請人: 華南農業大學
發明人: 習平根; 姜子德; 袁玉花; 李敏慧; 駱晶晶; 李升浩
地址: 510642 廣東省廣州市天河區五山路483號
優先權:
專利代理機構: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245 代理人: 裘暉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310159606.5

授權公告號:

103289902B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.10.16|||2013.09.11

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明屬于生物農藥領域,公開了一株棘孢木霉及其生物制劑和在防治黃瓜疫霉病中的應用。將該株棘孢木霉命名為棘孢木霉(Trichoderma?asperellum)PD-19,于2013年4月1日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC),地址:中國武漢武漢大學,保藏號為CCTCC?No:M2013113。該菌株由黃瓜根際土壤分離得到,能適應本地的自然環境;對黃瓜疫霉病菌具有強烈的寄生抑制作用,而且來源環保無毒性,對生態環境影響小;培養條件要求低,具有很好的開發應用前景。

權利要求書

權利要求書
1.   一株棘孢木霉,其特征在于,將其命名為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)PD?19,保藏于中國典型培養物保藏中心,簡稱CCTCC,地址:中國武漢武漢大學,保藏號為CCTCC No:M2013113,保藏時間為2013年4月1日。

2.   根據權利要求1所述的棘孢木霉,其特征在于:所述菌株在PDA培養基上27℃培養,菌落綠色,形成同心環,在同心環上產生稠密的分生孢子,氣生菌絲稀少,菌落背面略帶淺黃綠色;分生孢子梗形成墊狀至球形叢束,初級分枝與主枝呈直角,多數對生,瓶梗瓶狀至安瓶狀。

3.   一種生物制劑,其特征在于:基于權利要求1所述棘孢木霉制備得到。

4.   根據權利要求3所述的生物制劑,其特征在于通過包含以下步驟的方法制備得到:將棘孢木霉接種至PD液體培養基培養,獲得生物制劑。

5.   根據權利要求4所述的生物制劑,其特征在于:所述PD液體培養基的pH值為7.0。

6.   根據權利要求4所述的生物制劑,其特征在于:所述的培養指在26~28℃,搖床震蕩速率為180~200rpm下培養2~3d。

7.   根據權利要求3~6任一項所述的生物制劑在防治黃瓜疫霉病中的應用。

8.   權利要求1所述的棘孢木霉在防治黃瓜疫霉病中的應用。

說明書

說明書一株棘孢木霉及其生物制劑和在防治黃瓜疫霉病中的應用
技術領域
本發明屬于生物農藥領域,特別涉及一株棘孢木霉及其生物制劑和在防治黃瓜疫霉病中的應用。
背景技術
黃瓜(Cucumis sativas L.)是一種重要的瓜類蔬菜作物,在我國種植廣泛,具有極高的經濟價值。近年來,隨著黃瓜連作和種植面積的擴大,黃瓜疫霉病(Phytophthora melonis Katsura)已成為影響黃瓜生產的限制因子之一。在廣東省各市、縣(區)調查發現,該病害在全生育期均可發生,為害嚴重時可導致植株枯死,部分田塊發病率高達40%以上,給黃瓜安全生產造成嚴重威脅。目前,生產上對該病害的控制主要以化學藥劑防治為主。
木霉菌(Trichoderma spp.)是一種廣譜性的拮抗絲狀真菌,有多個木霉種在植物病害生物防治中具有重要的地位。產祝龍等報道了哈茨木霉(T.harzianum)對水稻惡苗病菌的拮抗作用,胡明江等報道了康寧木霉(T.koningii)對大白菜軟腐病的防治作用,張海軍報道綠色木霉(T.viride)對棉花枯萎病菌有顯著的抑菌作用。對于棘孢木霉(Trichoderma asperellum),夏偉等報道了該菌對立枯絲核菌的拮抗機制,Kolombet等報道了該菌對小麥赤霉病的生防作用,龐漫宇等克隆了該菌的木聚糖酶I基因,湯偉等克隆了該菌的幾丁質酶基因。Lorito等報道木霉幾丁質酶對多種植物病原真菌有拮抗作用,轉化到作物中可表現出廣譜的抗病性,且其生物防治效果要優于植物、細菌和其他真菌的幾丁質酶。
因此,棘孢木霉作為一類重要的自然資源,已引起國內外研究者的廣泛關注,具有開發生物農藥的潛力。
發明內容
為了克服上述現有技術防治黃瓜疫霉病的缺點與不足,開發棘孢木霉的應用,本發明的首要目的在于提供一株以黃瓜根際微生物為篩選對象,分離得到的對黃瓜疫霉病菌有寄生作用的棘孢木霉,命名為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)PD?19,為黃瓜疫霉病的生物防治奠定基礎。
本發明另一目的在于提供一種基于上述棘孢木霉制備得到的生物制劑。
本發明再一目的在于提供上述棘孢木霉在防治黃瓜疫霉病中的應用。
本發明的目的通過下述方案實現:
一株棘孢木霉,將其命名為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)PD?19,保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC),地址:中國武漢武漢大學,保藏號為CCTCC No:M2013113,保藏時間為2013年4月1日。
所述的棘孢木霉在PDA培養基上26~28℃培養,菌落綠色,形成同心環,在同心環上產生稠密的分生孢子,氣生菌絲稀少,菌落背面略帶淺黃綠色;分生孢子梗形成墊狀至球形叢束,初級分枝與主枝呈直角,多數對生,瓶梗瓶狀至安瓶狀。
一種生物制劑,基于上述棘孢木霉制備得到。
所述的生物制劑由棘孢木霉經液體發酵制備得到,優選包含以下步驟:將棘孢木霉接種至PD液體培養基培養,即可獲得生物制劑。
所述PD液體培養基的pH值為7.0。
所述的培養指在26~28℃,搖床震蕩速率為180~200rpm下培養2~3d。
上述生物制劑在防治黃瓜疫霉病中的應用。
上述棘孢木霉在防治黃瓜疫霉病中的應用。
本發明相對于現有技術具有如下的優點及有益效果:
1、本發明得到的棘孢木霉來源于本地黃瓜根際土壤,能適應本地的自然環境;
2、本發明的生物制劑對黃瓜疫霉病菌具有強烈的抑制作用,而且該生物制劑來源環保無毒性,對生態環境影響小;
3、本發明得到的棘孢木霉,培養條件要求低,具有很好的開發應用前景。
附圖說明
圖1為棘孢木霉在PDA培養基上的單菌落背面圖。
圖2為棘孢木霉對黃瓜疫霉病菌的抑制作用結果圖。
圖3為棘孢木霉對黃瓜疫霉病菌的寄生作用測定的結果圖。
具體實施方式
下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細的描述,但本發明的實施方式不限于此。
實施例1:棘孢木霉的分離、純化和保藏
(1)PDA培養基的配置:稱取200g馬鈴薯,洗凈去皮切碎,加水1000ml煮沸0.5h,紗布過濾,再加20g葡萄糖和20g瓊脂,充分溶解后趁熱紗布過濾,121℃滅菌20min,分裝入培養皿中冷卻后貯存備用。
(2)棘孢木霉的分離、純化:
稱取50g新鮮黃瓜根際土樣(該土樣為患病黃瓜根際土樣,取自深圳市郊區)加入盛有450mL0.9wt%生理鹽水的1000mL三角瓶中。置搖床振蕩20min左右,制備得到稀釋倍數為10?1的土壤稀釋液;取1mL10?1土壤稀釋液加入到盛有9mL0.9%生理鹽水的試管中,制備得到稀釋倍數為10?2的土壤稀釋液;依此類推,將土壤液進行梯度稀釋。取100μL稀釋液(稀釋倍數分別為:10?1、10?2和10?3)涂布在步驟(1)制備得到的PDA培養基上,每個稀釋倍數重復3次,26℃培養3d。待長出真菌菌落再挑邊緣菌絲進行純化,獲得純化菌株。
所述純化所得菌株經ITS序列分析,其序列(如下所示)與GenBank中登陸號為GQ131390.1的Trichoderma asperellum Samuels同源性達99%,證實其分類命名為棘孢木霉(Trichoderma asperellum),命名為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)PD?19。序列片段如下:
TCTACCTGATCCGAGGTCACATTTCAGAAAGTTGGGTGTTTTACGG ACGTGGACGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTTGTGCAAACTACTGCGCA GGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTAGGGGCCGGCACCCGT GTGAGGGGTCCCGATCCCCAACGCCGATCCCCCGGAGGGGTTCGAGGG TTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGC AATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATT ACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATC CGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAA GAAATACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAGAGTTTGGTTGGTTCCTCC GGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCGTGACCCCG CCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAA CTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTT。
棘孢木霉在PDA培養基上27℃培養,菌落綠色,形成同心環,在同心環上產生稠密的分生孢子,氣生菌絲稀少,菌落背面略帶淺黃綠色;分生孢子梗形成墊狀至球形叢束,初級分枝與主枝呈直角,多數對生,瓶梗瓶狀至安瓶狀(見圖1)。
(3)棘孢木霉的保藏:將該菌株于2013年4月1日保藏于中國湖北武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心,保藏號為CCTCC M2013113。
實施例2:對峙培養法測定棘孢木霉的活性
(1)PDA培養基的制備同實施例1。
(2)PD培養液的制備:稱取200g馬鈴薯切成小塊,加水煮沸20~30min,至能被玻璃棒戳破,用八層紗布過濾;濾液加熱,加入葡萄糖20g,攪拌均勻,稍冷卻后再補足水分至1000mL,分裝于錐形瓶(每瓶100mL培養液),加塞、包扎,121℃滅菌20min,冷卻后貯存備用。
(3)棘孢木霉菌餅的制備:將棘孢木霉接種于PDA培養基平板活化培養3d后,用直徑5mm的打孔器打孔制成菌餅。
(4)棘孢木霉培養濾液的制備:取3個步驟(3)制備得到的棘孢木霉菌餅接入步驟(2)制備得到的PD培養液錐形瓶中,置于27℃,搖床速率為200rpm下培養6d,將獲得的培養液于12,000rpm離心10min,取上清液,再用0.2μm的過濾器濾除菌體,獲得培養濾液。
(5)活性測定:
①棘孢木霉對黃瓜疫霉病菌的抑制作用測定:將步驟(3)制得的棘孢木霉菌餅接種到PDA培養基平板的中央,在距該菌餅3cm處接種黃瓜疫霉病菌。用直徑5mm的打孔器在PDA培養基上打孔,孔內加入80μL步驟(4)制得的棘孢木霉培養濾液,在距該孔3cm處接種黃瓜疫病菌菌塊。結果如圖2所示。
②棘孢木霉對黃瓜疫霉病菌的寄生作用的測定:以僅在平板中央接種黃瓜疫霉病菌菌餅為對照,3個重復,25℃恒溫培養,當對照菌落直徑達到6cm時,測量抑菌帶寬度,觀察霉菌。結果如圖3所示。
結果分析:由圖2和圖3可知,棘孢木霉對黃瓜疫霉病菌具有明顯的抑制作用,且作用表現為寄生關系;而棘孢木霉培養濾液對黃瓜疫霉病菌沒有抑制作用。
實施例3:棘孢木霉防治黃瓜疫霉病
(1)PDA培養基的制備同實施例1。PD培養液的制備同實施例2。
(2)棘孢木霉菌餅的制備、黃瓜疫霉病菌培養同實施例2.
(3)棘孢木霉生物制劑的制備:取5個步驟(1)制備得到的菌餅接入含有100mL PD培養液的250mL三角瓶中,置于27℃,200rpm,搖床培養2d,用滅菌水配成濃度為約108個/mL的菌體懸浮液,即得到棘孢木霉菌株PD?19生物制劑。
(4)花盆中裝有滅菌土1.3kg,將10mL步驟(3)制得的棘孢木霉生物制劑混土(孢子濃度為1*106個/g土)培養7d,再混入用勻漿機打碎了的半皿黃瓜疫霉病菌(步驟(2)培養得到),放置2d后植入黃瓜苗,跟蹤調查防治效果。以加入10mL PD培養液為對照,3個重復,每次重復10株1葉1心的黃瓜幼苗(見表1)。
盆栽試驗是在平均溫度17.67℃,相對濕度60%的條件下進行的,第4天接有黃瓜疫霉菌的對照開始發病;在對照發病率超過60%的第10天開始調查,結果表明:接種棘孢木霉防治黃瓜疫病的效果可高達75.81%,此時黃瓜疫病的發病率和病情指數均最低,且重復性好;同時,在未混有病原菌的情況下,生防棘孢木霉并不引起黃瓜發病,說明該菌株不是黃瓜的病原菌,可以作為防治黃瓜疫病的田間施用菌株。
表1棘孢木霉對黃瓜疫霉病的生防作用
處理發病率(%)病情指數防病效果(%)CK清水對照0.00±0.00b0.00±0.00b PD?190.00±0.00b0.00±0.00b 黃瓜疫霉菌65.48±7.81a49.85±8.30a PD?19+黃瓜疫霉菌26.19±1.19ab12.06±2.93ab75.81±5.87a
注:CK為清水對照;采用Duncan新復極差法進行方差分析,同組數據里相同字母表示差異不顯著(P=0.05)。
上述實施例為本發明較佳的實施方式,但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制,其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應為等效的置換方式,都包含在本發明的保護范圍之內。

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一株棘孢木霉 及其 生物制劑 防治 黃瓜 疫霉病 中的 應用
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