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一株龍膽內生真菌及其應用.pdf

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龍膽 真菌 及其 應用
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摘要
申請專利號:

CN201310194836.5

申請日:

2013.05.23

公開號:

CN103289906B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 1/14申請日:20130523|||公開
IPC分類號: C12N1/14; A01N63/04; A01P3/00; C12R1/645(2006.01)N 主分類號: C12N1/14
申請人: 都曉偉
發明人: 都曉偉; 周云婷; 尚曉琳; 劉多
地址: 150040 黑龍江省哈爾濱市香坊區和平路24號黑龍江中醫藥大學藥學院
優先權:
專利代理機構: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139 代理人: 孫皓晨;費碧華
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310194836.5

授權公告號:

103289906B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.11.27|||2013.09.11

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一株龍膽(Gentiana?manshurica?Kitag)中分離得到的內生真菌(Metarrhizium)LD421,微生物保藏號為:CGMCC?NO.6454;保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所;保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心;保藏時間:2012年8月17日。本發明可用于防治龍膽葉枯病,且隨菌液含量增加,對龍膽葉枯病病原菌的抑菌率升高。

權利要求書

權利要求書
1.   一株龍膽(Gentiana manshurica Kitag)中分離得到的內生真菌(Metarrhizium)LD421,其特征在于,所述內生真菌LD421的微生物保藏號為:CGMCC NO.6454;保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所;保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心;保藏時間:2012年8月17日。

2.   權利要求1所述的內生真菌LD421在防治龍膽葉枯病中的應用。

3.   權利要求1所述的內生真菌LD421在制備防治龍膽葉枯病的藥物中的應用。

說明書

說明書一株龍膽內生真菌及其應用
技術領域
本發明涉及植物內生真菌,特別涉及來源于龍膽植物的內生真菌,本發明還涉及該內生真菌在防治龍膽葉枯病方面的應用,屬于植物內生真菌及其代謝產物生物防治的應用領域。
背景技術
龍膽為龍膽科植物龍膽(Gentiana scabra Bge.)、條葉龍膽(Gentiana manshurica Kitag.)、三花龍膽(Gentiana triflora pall.)或堅龍膽(Gentiana rigescens Franch.)的干燥根及根莖,為我國傳統常用中藥。在藥材上,前三種習稱“關龍膽”,后一種習稱“滇龍膽”。龍膽味苦性寒,歸肝、膽經,具有清熱燥濕,瀉肝膽火的功效,臨床多用于治療黃疸性肝炎、肝膽火逆、目赤腫痛、耳聾耳鳴、消化不良、胃炎、膽道炎、膀胱炎、尿道炎、濕熱黃疸、陰部腫痛、帶下、濕疹瘙癢等癥。現代研究證明龍膽有保肝、健胃、抗炎、抗甲亢等多種藥理作用。
隨著龍膽藥用價值研究的不斷深入,藥材使用量逐年增大,野生龍膽資源遭到不可逆的破壞,龍膽產量急劇下降。栽培龍膽病害嚴重,其中龍膽葉枯病是較為嚴重的病害之一,發病率高、損失大,可引起葉片枯死,發病后期龍膽的葉片幾乎全部枯死,嚴重影響龍膽的產量和質量。目前在龍膽栽培生產中主要采用化學防治法,但農藥殘留影響藥材的品質和安全。由于對龍膽病害的相關研究尚不完善,對其病害的發生規律等重要問題還不清楚,尚沒有實際可行的生物防治方法。
在關龍膽中,龍膽根及根莖的栽培產量大于條葉龍膽和三花龍膽,但條葉龍膽的發病率及病情指數明顯低于同生長期的龍膽,其發病時期也要晚于龍膽,因此,條葉龍膽被認為是關龍膽中的抗病品種。本研究從條葉龍膽中分離、篩選獲得了抗龍膽葉枯病菌的內生菌LD421,并經溫室和室外生物防治研究,證明其對龍膽葉枯病菌具有顯著的防治效果。
發明內容
本發明目的之一是提供一株龍膽中分離得到的新的內生真菌;
本發明目的之二是將所分離到的內生真菌進行液體發酵,根據發酵物的抗菌活性;將其應用于防治龍膽葉枯病。
本發明的上述目的通過以下實驗技術方案實現:
本發明從條葉龍膽(Gentiana manshurica Kitag.)根中分離得到一株內生真菌LD421,其微生物保藏號:CGMCC NO.6454;其分類命名是:半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、綠僵菌屬(Metarrhizium)真菌;保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所;保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心;保藏時間:2012年8月17日。
本發明內生真菌LD421的形態學特征:將內生真菌LD421接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養基上,可見其生長緩慢,28℃,暗培養16天,菌落直徑達到5?6cm,菌落正面白色毯狀菌絲平伏,從中心向外3/4處環繞一圈白色絨毛,生長后期會在菌落表面出現綠色粒狀孢子,反面淡黃色(圖1);分生孢子小梗單生,成對或環,分生孢子生成向基的鏈,緊密成柱,長卵圓形或倒棍棒形,單胞(圖2)。
結合菌株LD421的形態特征與《半知菌屬圖解》進行相對比較,初步推斷該菌為半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、綠僵菌屬(Metarrhizium)真菌。
本發明內生真菌LD421的分子生物學鑒定結果:提取菌株LD421的基因組DNA并進行測序,測序結果為SEQ ID No.1;將測序結果提交至GeneBank數據庫,通過Blast搜索相關序列,選取相似性高(一般要求大于97%,個別種大于95%)、種屬地位明確且有相關文獻發表的ITS序列信息,結合各菌自身的ITS序列信息,先應用CLUSTAL X1.83軟件進行多序列比對,再將計算結果導入PHYLIP軟件,構建系統進化樹(圖3),LD421與EU307915.1(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)聚類于同一末端分支,親緣關系極近,兩者序列對比分析,其相似度為98%,但未發現目前GeneBank中存在與其基因序列和形態特征完全相同的已知菌種。初步鑒定LD421為子囊菌亞門(Ascomycotina)、核菌綱(Pyrenomycetes)、球殼菌目(Sphaerosidales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、綠僵菌屬真菌(Metarhizium),與形態學鑒定結果一致。
本發明的主要目的是應用分離到的內生真菌LD421的發酵液,拮抗龍膽葉枯病菌(Alternaria sp.),并應用于龍膽葉枯病的防治,包括:(1)制備內生真菌LD421的發酵液;(2)考察內生真菌LD421拮抗龍膽葉枯病菌的時效、量效關系;(3)在最佳發酵時間制備發酵液,滅活后,噴施在栽培龍膽的葉片上,考察并確定發酵液對龍膽葉枯病的生防效果。
附圖說明
圖1為菌株LD421正面菌落形態特征;
圖2為菌株LD421孢子形態特征(×400);
圖3為菌株LD421的ITS序列系統進化樹;
圖4為菌株LD421發酵液拮抗龍膽葉枯病致病菌,其中A為葉枯病菌單獨培養(5d),B為LD421發酵液拮抗葉枯病菌(5d);
圖5為菌株LD421發酵液拮抗龍膽葉枯病菌時效關系考察結果;
圖6為菌株LD421發酵液拮抗龍膽葉枯病菌量效關系曲線;
圖7為龍膽溫室生物防治不同處理組植株發病情況圖示;
圖8為龍膽田間生物防治不同處理組植株染病情況圖示。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明,本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的,并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是,在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換,但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
實施例1內生真菌LD421的分離純化及保存
樣本:人工種植龍膽的根,采自黑龍江中醫藥大學藥園,其原植物經黑龍江中醫藥大學都曉偉教授鑒定為龍膽科植物條葉龍膽(Gentiana manshurica Kitag.)。
1.內生真菌的分離
1.1植物樣本表面消毒
將采集的樣本先在流水下沖洗,去除表面的泥土和灰塵,再放入無菌操作臺。樣本表面自然晾干后,將樣本切成約5cm長的小段,按下列程序表面消毒:
75%乙醇漂洗l min→無菌水沖洗2min→3.33%的次氯酸鈉溶液浸泡3?5min(或者0.1%升汞溶液消毒1?3min)→無菌水沖洗3次(每次2min),用無菌濾紙吸干。
1.2植物樣本接種培養
將1.1中處理過的樣本在無菌條件下切去兩端,剩余部分橫切及縱切成小段,隨機將小段分別種植于各種平板培養基上,每皿4?7段,置于28℃恒溫培養箱中暗培養7~15天,每天觀察記錄。
1.3表面消毒的效果檢測
1.3.1無菌水懸浮液法
將1.1中樣本表面消毒的最后一次無菌水0.l mL涂于PDA平板培養基表面,置于28℃恒溫培養箱暗培養7~15天,觀察記錄是否有真菌生長。
1.3.2組織塊印跡法
隨機取1.1中消毒完畢的一段樣本材料,在PDA平板培養基表面滾動兩圈后取出,將該培養皿置于28℃恒溫培養箱暗培養7~15天,觀察記錄是否有真菌生長。
2.內生真菌的純化
待各平板培養基上的樣本切割邊緣長出新菌絲,根據顏色、形態的差異,用三點法將不同的菌絲及時轉入新配制的同種平板培養基上培養,待菌落長成后,如菌落的顏色、形態仍有不同,繼續用三點法純化,培養數日后,觀察菌落的顏色、形態是否均勻,邊緣是否整齊,直至得到單一的菌株。
3.內生真菌菌種保存
3.1斜面PDA培養基的制備
馬鈴薯(去皮)20%,葡萄糖1.5%,瓊脂2%。
將馬鈴薯去皮,稱重,切成約0.5cm3的小塊,放入鍋中,加入5倍量蒸餾水煮沸30min。冷卻后經八層紗布過濾,濾液加水補足至原先加入量,放入葡萄糖、瓊脂,攪拌煮沸,趁熱過濾,濾液分裝于各試管,121℃、0.1MPa、濕熱滅菌30min后取出,放入操作臺,傾斜放置,待其冷卻后即成斜面培養基,備用。
3.2無菌液體石蠟的制備
將液體石蠟油裝入三角瓶中,裝量達瓶體積的1/3,塞好棉塞,外包牛皮紙,121℃、0.1MPa、濕熱滅菌30min,連續滅菌2次。置105℃烘箱2小時,以除去石蠟油中的水分,使石蠟油變為透明狀。置操作臺,冷卻至室溫,備用。
3.3接種培養
將生長良好的單一菌株編號,轉移到相應的斜面培養基,置于28℃恒溫培養箱中暗培養5~10天,觀察沒有雜菌生長后,置4℃冰箱冷藏,以備后期篩選活性菌株時活化培養用。
3.4封存
將3.3中未被冷藏的菌種試管用無菌石蠟油封藏。將3.2中制備的石蠟油小心倒于菌種試管內,加入量以直立試管時高出斜面頂端約1cm為宜,試管口用橡膠塞外加封口膜密封,放入4℃冰箱保存。
實施例2龍膽內生真菌LD421的鑒定
1.菌株LD421的形態學鑒定
主要根據分離得到的內生真菌菌落特征,觀察真菌的孢子及產孢結構,進行菌種的經典分類鑒定。
1.1菌落形態觀察
將活化好的菌株接種于PDA平板,28℃恒溫培養,記錄菌株生長速度,觀察菌落的特征。
1.2真菌形態觀察
采用挑片觀察法:在載玻片上加一滴乳酸?棉蘭染液,用接種針從生長有真菌的平板中挑取帶有孢子的真菌菌絲,放入載玻片上的液滴中,并且用針尖將其分散開,蓋好蓋玻片即得載片標本,置顯微鏡下觀察。
乳酸?棉蘭染液的制備:苯酚10g,乳酸10g,甘油20mL,甲基蘭0.02g,蒸餾水10mL,將蒸餾水與苯酚混合直至溶解,然后加入乳酸和甘油,最后加入甲基蘭,溶解即得。
1.3菌株LD421的形態學鑒定結果
真菌生長緩慢,28℃在PDA平板上培養16d,菌落直徑達5?6cm,菌落正面白色毯狀菌絲平伏,從中心向外3/4處環繞一圈白色絨毛,生長后期會在菌落表面出現綠色粒狀孢子,反面淡黃色;分生孢子小梗單生,成對或環,分生孢子生成向基的鏈,緊密成柱,長卵圓形或倒棍棒形,單胞(見圖1、圖2)。初步確定該菌為半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、綠僵菌屬(Metarrhizium)真菌。
2.菌株LD421的分子生物學鑒定
2.1菌株LD421基因組DNA的提取
(1)在PDA平板上打取內生真菌菌餅,接入300mL液體培養基,28℃、120r/min搖床培養4~7天,無菌紗布過濾得菌絲,無菌水清洗2次,無菌濾紙吸干水分后置?20℃冰箱保存;
(2)取一定量菌體放入研缽,加液氮研磨至粉末狀,取100~200mg粉末于1.5mL離心管;加入700μl DNA提取緩沖液,用微量移液器混勻,37℃水浴30min;
(3)11000r/min離心5min,將上清移入新的離心管中;
(4)加等體積酚?氯仿(1:1),混勻,11000r/min離心5min,將上清移入新的離心管;
(5)加等體積氯仿,混勻,11000r/min離心2min,將上清移入新的離心管;
(6)加入2倍體積無水乙醇,?20℃放置2h;
(7)取放置2h的DNA提取緩沖液,11000r/min離心5min,去上清,加入70%乙醇,清洗沉淀2次,11000r/min離心2min;
(8)去上清,揮干溶劑,加入50μl TE溶液溶解沉淀即為DNA模板;
(9)DNA模板置于?20℃保存備用。
2.2菌株LD421基因組DNA的檢測
2.2.1瓊脂糖凝膠的制備
(1)用白膠布封住電泳槽兩端作為擋板;
(2)稱取1.5g瓊脂糖于250mL錐形瓶中,加入100mL TAE緩沖液,置微波爐中,搖勻煮沸至澄清透明,冷卻至約60℃,加入1μl濃度為10mg/mL的EB溶液,搖勻后倒于已插好梳子的電泳槽中。
(3)凝膠完全凝固后(30min以上),小心取出擋板與梳子。
(4)將凝膠放入電泳槽內,加樣孔一側靠近負極,加入適量的TAE緩沖液,使其液面恰好沒過膠面約1mm深。
2.2.2電泳
取真菌DNA模板與Marker(250bp?15000bp)5μl,加入1μl LoadingBuffer溶液混合后上樣于瓊脂糖凝膠,恒壓120V電泳30min,關閉電源。取出凝膠后,置紫外分析儀中,檢測真菌DNA提取結果。
2.3菌株LD421基因組ITS序列的擴增
50μl反應體系見表1:
表1

PCR反應程序如下:

反應結束后,取擴增產物與Marker(100bp?1500bp)各5μl,1.5%瓊脂糖凝膠電泳,記錄擴增片段長度,若片段長度在500bp?700bp,則為所需ITS目的片段。否則,調整PCR體系,重新擴增。
2.4擴增產物的序列測定與數據處理
PCR擴增產物由上海生物工程技術服務有限公司測序,測序結果為SEQ ID No.1。將測序結果提交至GeneBank數據庫,通過Blast搜索相關序列,選取相似性高、種屬地位明確且有相關文獻發表的ITS序列信息,結合真菌自身的ITS序列信息,先應用CLUSTAL X1.83軟件進行多序列比對,再將計算結果導入PHYLIP軟件,構建系統進化樹,從生物進化的親緣關系層面進一步確定內生真菌的種類。2.5菌株LD421的分子生物學鑒定結果
將測序結果與GeneBank中已知序列進行比較分析,從GeneBank數據庫中獲得相關種屬的ITS序列信息,應用CLUSTAL X1.83軟件進行多序列比對,將計算結果導入PHYLIP軟件,構建系統進化樹(圖3)。
可看出LD421與EU307915.1(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)聚類于同一末端分支,親緣關系極近,將兩者的序列對比分析,其相似度為98%,鑒定LD421為綠僵菌屬真菌(Metarhizium),與形態學鑒定結果一致。
試驗例1LD421拮抗葉枯病菌抑菌活性的時效以及量效關系考察
1.菌株LD421發酵液的制備
1.1培養基的制備:
真菌培養基:PDA固體培養基
馬鈴薯(去皮)200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,蒸餾水1000mL。
將馬鈴薯去皮,稱重,切成約0.5cm3的小塊,放入潔凈的鍋中,加入5倍量蒸餾水煮沸30min。冷卻后經八層紗布過濾,濾液加水補足至原加入量,放入稱好的葡萄糖和瓊脂,煮沸同時不斷攪拌,趁熱過濾,濾液分裝,0.1MPa、121℃條件下濕熱滅菌30min。滅菌后趁熱取出,在無菌操作臺中,將培養基倒入直徑為90mm的培養皿中,每皿大約20mL,以紫外滅菌30min,冷卻凝固后即可使用。
種子培養基和發酵培養基:PD培養基
馬鈴薯(去皮)200g,葡萄糖20g,蒸餾水1000mL。
將馬鈴薯去皮,稱重,切成約0.5cm3的小塊,放入潔凈的鍋中,加入5倍量蒸餾水煮沸30min。冷卻后經八層紗布過濾,濾液加水補足至原加入量,放入稱好的葡萄糖,煮沸同時不斷攪拌直至葡萄糖全部溶解,分裝,0.1MPa、121℃條件下濕熱滅菌30min。取出,置于無菌操作臺中,待其冷卻后,紫外滅菌30min,即可使用。
1.2菌株LD421的活化培養:
在無菌條件下,將4℃冰箱內石蠟油封存的龍膽內生真菌LD421接種到新制備的PDA培養基中,置于28℃恒溫恒濕箱中培養5~7天。
1.3菌株LD421液體發酵液的制備:
以下步驟均在無菌操作臺中進行。
待LD421菌落長到培養皿的2/3時,用無菌打孔器(直徑5mm)打取菌餅接種到含100mLPD培養基的250mL錐形瓶(種子培養基)中,封好,置于恒溫振蕩培養箱中,28℃、120r/min搖床培養2~7天,得到種子液。
取1mL種子液接種于裝有200mLPD液體培養基的500mL錐形瓶(發酵培養基)中,置于恒溫振蕩培養箱中,28℃、120r/min培養3~6天,所得發酵液經8層紗布過濾,濾液在0.1MPa、121℃條件下濕熱滅菌30min,冷卻后置于4℃冰箱中保存備用。
2.菌株LD421發酵液抗龍膽葉枯病致病菌的活性檢測
本實驗所用供試病原菌為龍膽葉枯病致病菌,是由黑龍江中醫藥大學中藥資源學教研室孫海峰等從黑龍江北安栽培的龍膽(Gentiana scabra Bge.)病組織中分離純化得到的菌株,應用柯赫氏證病法則(Koch’s postulate)證明其為龍膽葉枯病病原菌,通過對其分生孢子梗、分生孢子等的觀察鑒定為Alternaria sp.。
采用生長速率法,將菌株LD421發酵液與滅菌熔化的PDA培養基混合均勻(發酵液含量為50%),制成含藥平板,并用無菌水代替發酵液作為對照,每組三個平行樣。待培養基凝固后,在每個培養皿中分別接入相同大小的葉枯病菌菌餅(直徑為0.5cm),置于黑暗培養箱中,28℃下培養5天后,觀察對照組和含藥組病菌生長情況見圖4。測量各含藥平板中病原菌菌落的直徑,計算抑菌率。

3.菌株LD421發酵液抑菌活性的時效、量效關系考察
3.1菌株LD421發酵液抑菌活性時效關系考察
3.1.1實驗方法
在無菌條件下,取1mL種子液接種于裝有200mL PD液體培養基的500mL錐形瓶中,共30瓶,置于恒溫振蕩培養箱,120r/min、28℃培養10天,每天取出3瓶,抽濾,所得濾液121℃、0.1MPa、濕熱滅菌30min,滅活的菌液冷卻后置于4℃冰箱保存備用。
培養1?10天的發酵液制備完成,在無菌操作臺中,待PDA培養基冷卻到60℃左右時與各組滅菌的發酵液混合均勻(發酵液含量為50%),倒入平皿中制成含藥平板,每組3個平行,無菌水為空白對照。待培養基凝固后,在各平皿中央接種大小一致的黑斑病菌菌塊(直徑0.5cm),置于黑暗培養箱培養5天后,用十字交叉法測量菌落直徑,按上述抑制率的計算公式計算病原菌的被抑制率。用SPSS18.0軟件進行數理統計,結合抑菌率和各組數據差異顯著性情況,確定最佳發酵時間;同時將抑菌率與發酵時間的關系繪成曲線,進而得到趨勢回歸曲線和回歸方程,描述菌株LD421發酵液抑菌活性的時效關系。
3.1.2實驗結果與分析
由圖5看出,抑菌率與發酵時間的關系呈拋物線趨勢,表2的數理統計結果為4d、5d、6d、7d、8d之間的抑菌率沒有顯著性差異;同時在實驗中發現,LD421液體發酵第5天開始,發酵液變得粘稠而過濾困難,發酵時間越長,發酵液越粘稠,確定LD421的最佳發酵時間為4天。
表2菌株LD421代謝液拮抗龍膽葉枯病菌時效關系考察結果

注:**與對照組有極顯著性差異(p<0.01);*與對照組有顯著性差異(p<0.05);AX:X為相同字母者屬同一等級,按字母順序依次遞減。
3.2菌株LD421發酵液抑菌活性量效關系的考察
3.2.1實驗方法
按3.1方法得到最佳發酵時間擴大培養的發酵液,濕熱滅菌后對半稀釋,再與未凝固的PDA培養基混合,按方法2步驟制成含發酵液濃度為1.5%、3%、6%、12.5%、25%、50%、100%的PDA含藥培養基,以不含發酵液的PDA培養基作為對照。在恒溫恒濕培養箱中,28℃暗培養5天后,取出,十字交叉法測量菌落直徑,計算抑菌率,比較抑菌效果。
3.2.2實驗結果與分析
采用對半稀釋法,制備不同濃度的含藥培養基,生長速率法檢測抑菌率,所得量效實驗結果見圖6,隨菌液含量增加,抑菌率升高,當濃度為100%時,抑菌率達到最高值為94.69%。表3結果顯示,濃度在1.5%菌液,與對照組相比無顯著性差異,P值為0.241,濃度3%的菌液與對照組相比有顯著差異,P值為0.030,其他各組與對照均有極顯著性差異,P<0.01。而濃度超過6%的菌液,各組之間存在極顯著性差異,P<0.01。室內抑菌試驗證明,100%濃度LD421發酵液對龍膽葉枯病致病菌抑菌效果最為顯著。
表3菌株LD421代謝液拮抗龍膽葉枯病菌量效關系考察結果

注:**與對照組有極顯著性差異(p<0.01);*與對照組有顯著性差異(p<0.05);AX:X為相同字母者屬同一等級,按字母順序依次遞減。
實驗例2菌株LD421發酵液的生物防治研究
1.實驗方法
1.1菌株LD421發酵液的制備
將保存的菌種活化培養,待菌落長到平皿的2/3時,切取菌餅于PD液體培養基中,28℃,120r/min搖床培養4~8d。發酵產物經紗布過濾后,滅菌,冷藏備用,噴藥前取出常溫放置2h。
1.2種子的處理
播種前15d左右,取種子,用赤霉素0.15g兌1L清水配制成150ppm的溶液,將種子浸泡24h撈出,用清水沖洗數次,再浸在75%的乙醇中30s,取出清水沖洗4~5次。
1.3種子的催芽
取滅菌的潔凈玻璃平皿,底部放一層脫脂棉,上面放平皿大小的濾紙,開水浸濕,5分鐘后倒掉多余的水分,將處理好的種子均勻擺放在平皿中,以潔凈濕潤的紙巾覆蓋,放于恒溫箱中,溫度穩定在25~28℃,每天取出給予6~8h的光照,并經常噴水保持足夠濕度,3~5d種子表面剛露出白色小芽時即可播種。
1.4溫室育苗
播種前,將土壤用70%甲基托布津1000倍液滅菌,裝入育苗盤中刮平,用壓板壓實,澆透水,放置過夜。第二天將催好芽的種子均勻撒在育苗盤中,播后覆土(過60目篩)1mm。一周左右出苗,出苗后遮陰避免陽光直射,除草和間苗,待幼苗長出3~5對真葉時移至育苗缽中,以提供足夠的營養。
1.5溫室生物防治
溫室栽培一年生龍膽,選取長勢一致的植株,隨機分成4組,分別為空白組、對照組、陽性對照組和實驗組,每組8株,每處理3個平行。第一階段,陽性對照組噴施70%甲基托布津1000倍液,實驗組噴施滅活的LD421菌液,對照組以無菌水代替,施用量為50mL/株,空白組正常澆水,每隔6天噴施一次。四個周期后進行第二階段,除空白組以外的其他各組,噴施龍膽葉枯病菌菌液50mL/株,早晚各噴施一次,間隔6天后再次噴施葉枯病菌菌液,早晚各噴施一次。第7天開始觀察發病情況并進行記錄,之后每隔一周檢測各項指標,計算病情指數(病情分級標準見表4)和防效。
1.6田間生物防治
試驗采用三次重復,每個試驗區面積為10㎡。五月中旬開始對各實驗區噴施相應藥劑(空白組:正常澆水;陽性對照組:噴施70%甲基托布津1000倍液;實驗組:噴施滅活的LD421發酵液),每周噴施1次,連續噴施9次。6月中旬空白組開始發病時調查病級,至7月下旬共調查4次,同時計算病情指數(病情分級標準見表4)和相對防效。
表4龍膽葉枯病病情分級標準



2.實驗結果
2.1溫室生物防治實驗結果
溫室防治效果見圖7,實驗數據列于表5?表7。通過溫室防治試驗,進一步驗證,菌株LD421發酵液對龍膽葉枯病具有防治作用,接種葉枯病菌后15天,發酵液防治效果顯著,防效最好可達到83.77%,與70%甲基托布津1000倍液無顯著差異。一個月后,防治效果降低,表明LD421菌液對葉枯病菌防治的持續時間較甲基托布津短,需繼續噴施,以加強防治。
表5溫室龍膽接種葉枯病病原菌后第15天發病情況(溫度20?25℃)

注:**與對照組有極顯著性差異(p<0.01);70%甲托1000倍液組與LD421菌液組之間無顯著差異(p=0.522>0.05)。
表6溫室龍膽接種葉枯病病原菌后第21天發病情況(溫度20?25℃)

注:**與對照組有極顯著性差異(p<0.01);70%甲托1000倍液組與LD421菌液組之間無顯著差異(p=0.111>0.05)。
表7溫室接種龍膽葉枯病病原菌后一個月發病情況(溫度20?25℃)

注:**與對照組有極顯著性差異(p<0.01);70%甲托1000倍液組與LD421菌液組之間有極顯著差異(p<0.01)。
2.2田間生物防治實驗結果
田間防治效果見圖8,實驗數據見表8?表11。田間防治試驗證實,LD421發酵液在龍膽葉枯病發病期(6?7月間)具有極顯著的防治效果,龍膽植株的病情指數與化學藥劑(70%甲托1000倍液)無顯著性差異,相對防效最高可達到88.95%。
表8龍膽田間六月中旬發病情況(溫度16?26℃)

注:**與對照組有極顯著性差異(p<0.01);70%甲托1000倍液組與LD421菌液組之間無顯著差異(p=0.631>0.05)。
表9龍膽田間七月初發病情況(溫度18?27℃)

注:**與空白組有極顯著性差異(p<0.01);70%甲托1000倍液組與LD421菌液組之間無顯著差異(p=0.446>0.05)。
表10龍膽田間七月中旬發病情況(溫度22?33℃)

注:**與空白組有極顯著性差異(p<0.01);70%甲托1000倍液組與LD421菌液組之間無顯著差異(p=0.316>0.05)。
表11田間七月下旬發病情況(溫度17?28℃)

注:**與空白組有極顯著性差異(p<0.01);70%甲托1000倍液組與LD421菌液組之間有顯著差異(p=0.002<0.01)。

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