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一種突變的聚半乳糖醛酸酶8FNA及其編碼基因和應用.pdf

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一種 突變 半乳糖 醛酸 FNA 及其 編碼 基因 應用
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摘要
申請專利號:

CN201310199348.3

申請日:

2013.05.26

公開號:

CN103289975B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 9/26申請日:20130526|||公開
IPC分類號: C12N9/26; C12N15/56; C12N15/63; C12N15/81; C12N1/21; C12N1/19; A23K1/165; C12R1/84(2006.01)N 主分類號: C12N9/26
申請人: 中國農業科學院飼料研究所
發明人: 姚斌; 孟昆; 潘霞; 羅會穎; 楊培龍; 石鵬君; 黃火青; 柏映國; 王亞茹
地址: 100086 北京市海淀區中關村南大街12號
優先權:
專利代理機構: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318 代理人: 高宇
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310199348.3

授權公告號:

103289975B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.10.16|||2013.09.11

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明屬于基因工程和蛋白質工程領域,具體涉及一種突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA及其編碼基因和應用。本發明對聚半乳糖醛酸酶8fnA進行定點突變,精氨酸取代8fn113位點的氨基酸序列(即113位由Thr突變為Arg)。改造后聚半乳糖醛酸酶8fnA的比活比原來提高58%,而改造后的最適溫度方面也有5℃的提高。

權利要求書

權利要求書
1.   一種突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA,其特征在于,其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。 

2.   一種突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA基因,其特征在于,編碼權利要求1所述的突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA。 

3.   如權利要求2所述的突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA基因,其特征在于,其堿基序列如SEQ ID NO.4所示。 

4.   包含權利要求2所述突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA基因的重組載體。 

5.   根據權利要求4所述的重組載體,其特征在于,所述重組載體為載體pPIC9γ?8fnA。 

6.   包含權利要求2所述突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA基因的重組菌株。 

7.   根據權利要求6所述的重組菌株,其特征在于,所述重組菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。 

8.   一種制備權利要求1所述突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA的方法,其特征在于,包括以下步驟: 
1)用權利要求4的重組載體轉化宿主細胞,得重組菌株; 
2)培養重組菌株,誘導重組纖維素酶表達; 
3)回收并純化所表達的聚半乳糖醛酸酶8fnA。 

9.   權利要求1所述聚半乳糖醛酸酶8fnA的應用。 

說明書

說明書一種突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA及其編碼基因和應用
技術領域
本發明屬于基因工程和蛋白質工程領域,具體涉及一種突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA及其編碼基因和應用。
背景技術
目前在NCBI注冊的多聚半乳糖醛酸酶蛋白序列已達10760條,主要來源于植物(3485)、真菌(2604)和細菌(4179),其余來自其他物種。真菌多聚半乳糖醛酸酶主要來源于青霉屬、曲霉屬、根霉屬、毛霉屬、酵母屬、克魯維酵母屬及畢赤酵母屬等。與細菌及植物的多聚半乳糖醛酸酶基因進行系統進化分析,結果顯示三種來源的多聚半乳糖醛酸酶明顯的聚為三大類,很好的反映了它們的起源進化關系。真菌來源的多聚半乳糖醛酸酶處于完全獨立的分支中,總體相似性介于11.3%~100%之間。內切聚半乳糖醛酸酶的最適pH介于3.5?5.5,最適溫度介于30?50°C,已經報道的內切多聚半乳糖醛酸酶都是酸性。不同真菌來源的多聚半乳糖醛酸酶序列表現了很大的差異,但都含有4個保守性極強的結構域(175NTD、197DD、218GHG和250RIK)。其中結構域Ⅰ(NTD)和Ⅱ(DD)中的3個天冬酰氨(D)殘基和結構域III(GHG)中的組氨酸(H)殘基被認為與催化反應有關。目前有7個PG晶體結構報道,其中6個都來源于真菌Aspergillusniger,Fusariummoniliforme,Aspergillusaculeatus,Stereumpurpureum和Colletotrichumlupini,一個來源于細菌Erwiniacarotovora。來源于Aspergillusniger的endo?PG晶體解析顯示了這類酶典型的三維結構:10個完整的轉角組成一個右手螺旋,此螺旋含有4個平行的β折疊,一個小的α螺旋在N端覆蓋了酶內部的疏水中心,無規卷曲loop在螺旋外部形成了一個口袋,口袋通道中的Asp(180),Asp(201)、Asp(202)與酶的催化活性相關,而His(223)、Arg(256)和Lys(258)則與底物結合有關。
果膠內切聚半乳糖醛酸酶在多個領域都有廣泛的應用,當前應用最廣的是在果蔬汁加工中。同樣,內切聚半乳糖醛酸酶在飼料生產中也有很大的應用前景。飼料中的菜粕、豆粕、麩皮等原料都含有大量的果膠質,由于動物體內缺乏降解果膠的酶類,因而果膠被認為是動物飼料中的抗營養因子。已有實驗證明將內切聚半乳糖醛酸酶添加到飼料中作用于果膠質能隨機地從多聚半乳糖醛酸鏈內部消解α?1,4?糖苷鍵,產生聚合度為10~14的寡聚半乳糖醛酸,或從寡聚半乳糖醛酸鏈的非還原末端消除單個半乳糖醛酸,產生聚合度逐步降低的寡聚半乳糖醛酸鏈和半乳糖醛酸單體,從而降低食糜的粘度,提高營養物質的利用率。
目前國內飼料產業中果膠酶的應用還未得到推廣,主要原因之一是缺乏性質優良適合飼用的酶種。與果蔬汁應用的酸性聚半乳糖醛酸酶不同,理想的飼用聚半乳糖醛酸酶應是高比活、pH中酸性。已有研究報道的大部分真菌來源聚半乳糖醛酸酶多為酸性,目前市場上性質優良的果膠酶產品多來自于國外酶制劑企業如諾維信等并且主要用于果蔬汁生產,飼用果膠酶產品則相對缺乏。因此研發pH中酸性具有高比活優良性質的飼用果膠酶將有力促進這一新興酶種在飼料產業中的應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA。
本發明的再一目的是提供編碼上述突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA的基因。
本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
本發明的另一目的是提供一種制備上述突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA的基因工程方法。
本發明的另一目的提供上述突變的聚半乳糖醛酸酶8fnA的應用。
本發明對聚半乳糖醛酸酶8fnA(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)進行定點突變,精氨酸取代8fn113位點的氨基酸序列(即113位由Thr突變為Arg)。
因此突變后的聚半乳糖醛酸酶8fnA氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示:
MIPSVLILSLGALAAANPLPAKRASCTFTDAASAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLD
LTKLNDGTKVIFSGKTSFGYKEWAGPLISVSGNNIHVEGAPGHVIDGNGAKWWD
RKGSNGGKKKPKFFYAHSMKNSNIKGLNVKNTPVQAFSINGAENLGVYDVHLDN
SAGDSQGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGSCSGGH
GLSIGSVGGRKDNTVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGAKGSVSDVEYSGITLSNI
SKYGIVIEQDYENGSPTGKPTNGVPITDLTVKGVTGTVKSGATDVYILCAKGACSN
WKWSGVSVTGGKKSSKCSNVPSPASC
本發明提供了編碼上述突變后的聚半乳糖醛酸酶8fnA的基因序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示:
atgattccgt cggtcctcat tctttccctc ggcgccctgg cggcggccaa cccgctcccc60
gccaagcgcg cgagctgcac ctttaccgat gctgcctctg ccatcagcgg caagaagagc120
tgcagcacca tcaccctcaa ggacatcacc gtccccgccg gcaccacgtt ggacctcaca180
aagctcaacg acggcaccaa ggtcatcttc tccggcaaga cctccttcgg ctacaaggaa240
tgggccgggc ctctcatctc cgtctccggc aacaacatcc acgtcgaggg cgcccccggc300
catgtcatcg acggcaacgg tgccaagtgg tgggacagta agggtagcaa tggcggcaag360
aagaagccca agttcttcta cgcccatagc atgaagaact ccaacatcaa gggactcaac420
gtgaagaaca cgcccgtcca ggccttcagc atcaacggcg ctgaaaacct cggagtgtac480
gacgtccacc tcgacaactc ggccggcgac tcccagggcg gccacaacac cgacgcgttc540
gacgtcggtt cgtccaacgg cgtctacatc tcgggtgccg tggtcaagaa ccaggacgac600
tgcctggcca tcaactccgg caccaacatc accttcaccg gcggctcgtg cagcggcggc660
cacggcctgt ccatcggctc ggtcggcggg cgcaaggaca acacggtcaa gacggtgcgc720
atcctcaact cgtccatcag caactcgcag aacggcgtgc gcatcaagac cgtctacggc780
gccaagggct ccgtgtcgga cgtcgagtact cgggcatcac actgtccaac atcagcaagt840
acggcatcgt catcgagcag gactacgaga acggctcgcc caccggcaag cccaccaacg900
gcgtgcccat caccgacctg accgtcaagg gcgtcaccgg caccgtcaag tcgggcgcca960
ccgacgtcta catcctctgc gccaagggcg cctgctccaa ctggaagtgg tctggcgtca1020
gcgtcaccgg cggcaagaag tcgtccaagt gtccaacgtt cccagccctg cctcttgc1080
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本發明通過過Overlap PCR的方式引入突變,獲得聚半乳糖醛酸酶8fnA以及編碼基因。本發明還提供了包含上述聚半乳糖醛酸酶8fnA基因的重組載體,命名為pPIC9γ?8fnA。將本發明的聚半乳糖醛酸酶8fnA基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間,使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案,優選為將本發明的纖維素酶基因插入到質粒pPIC9上的SnaBI和Not I限制性酶切位點之間,使該核苷酸序列位于AOX1啟動子的下游并受其調控,得到重組酵母表達質粒pPIC9γ?8fnA。
本發明還提供了包含上述pPIC9γ?8fnA基因的重組菌株,優選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌,優選為重組菌株GS115/8fnA。
本發明還提供了一種制備聚半乳糖醛酸酶8fnA的方法,包括以下步驟:
1)用上述的重組載體轉化宿主細胞,得重組菌株;
2)培養重組菌株,誘導重組纖維素酶表達;
3)回收并純化所表達的聚半乳糖醛酸酶8fnA。
其中,優選所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞,優選將重組酵母表達質粒轉化畢赤酵母細胞(Pichia pastoris)GS115,得到重組菌株GS115/celH61。
本發明還提供了上述聚半乳糖醛酸酶8fnA的應用。
飼料中的菜粕、豆粕、麩皮等原料都含有大量的果膠質,而動物體內缺乏降解果膠的酶類。聚半乳糖醛酸酶8fnA具有最適溫度為中低溫,最適pH為5.0,高比活等特性,這些性質使其在中酸性的腸道內能有效發揮作用,對腸道內飼料中的果膠質進行講解,從而提高飼料營養轉化率。因此,8fnA具有較強的飼料酶制劑的應用潛力。
針對8fnA應用潛力的評價,我們進行了8fnA對玉米粉、麩皮、豆粕、棉籽粕、菜粕原料的應用試驗。試驗結果表明,8fnA在模擬腸道條件下作用2h,對兩種果膠質含量高的飼料原料菜粕和麩皮效果明顯,分別比對照組的還原糖量增加10.08%和5.15%,而對其他原料作用不明顯。
附圖說明
圖1半乳糖醛酸酶突變PCR示意圖。
具體實施方式
試驗材料和試劑
1、菌株及載體:畢赤酵母表達載體pPIC9及菌株GS115購自于Invitrogen公司。
2、酶類及其它生化試劑:內切酶購自TaKaRa公司,連接酶購自Invitrogen公司。購自Sigma公司,其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。
3、培養基:
(1)Phialophora sp.培養基為馬鈴薯培養基:1000mL200g土豆煮汁,10g葡萄糖,25g瓊脂,pH5.0。
(2)大腸桿菌培養基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。
(3)BMGY培養基:1%酵母提取物,2%蛋白胨,1.34%YNB,0.00004%Biotin,1%甘油(V/V)。
(4)BMMY培養基:除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均與BMGY相同,pH4.0。
說明:以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法,均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行,或者按照試劑盒和產品說明書進行。
實施例1
1、突變基因的獲得:
以來源于Chaetomiaceae sp.SZ8的內切聚半乳糖醛酸酶8fn的基因序列進行改造,通過Overlap PCR的方式引入突變,并對其進行測序,獲得突變基因。
突變包括四條PCR引物::8fn F、8fn R、R F、R R
引物序列如下:
8fn F5'?CTGCCTACGTAAACCCGCTCCCCGCCA?3'
8fn R5'?TTAGCGGCCGCCTAGCAAGAGGCAGGG?3'
R F5'?CAAGTGGTGGGACAGTAAGGGTAGCAATG?3'
R R5'?CCATTGCTACCCTTACTGTCCCACCACTTG?3'
重疊延伸PCR法是通過3個PCR反應來完成的。
PCR反應體系:
PCR1

PCR1程序設定:
95°C,5min;94°C30sec,60°C30sec,72°C,1min,30個循環;72°C,8min;10°C,hold。
PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后,用DNA回收試劑盒進行膠回收,溶于20ulddH2O,命名為R R。
PCR2:

PCR2程序設定:
95°C,5min;94°C30sec,60°C30sec,72°C,1min,30個循環;72°C,8min;10°C,hold。
PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后,用DNA回收試劑盒進行膠回收,溶于20ulddH2O,命名為R F。
PCR3

PCR程序設定:
95°C,5min;94°C30sec,60°C30sec,72°C,1min30s,30個循環;72°C,8min;10°C,hold。
PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后,切去1kb作用的條帶,用DNA回收試劑盒進行膠回收,溶于20ulddH2O。
將PCR產物連接pEasy?T3載體,轉入TransI感受態細胞,挑取單克隆,送去測序,篩選出突變基因。
2、8fnA表達載體的構建
用PCR擴增全長:
PCR體系:

PCR程序設定:
95°C,5min;94°C30sec,60°C30sec,72°C,1min30s,30個循環;72°C,8min;10°C,hold。
PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后,切去1kb作用的條帶,用DNA回收試劑盒進行膠回收,溶于20ul ddH2O。
將8fn與克隆載體pPIC9γ分別進行限制性內切酶SnaB I/Not I雙酶切,酶切條件如下:

37℃酶切2h,電泳后分別回收兩個目的片段,用T4DNA連接酶連接,連接體系如下:

16℃過夜,電泳檢測結果顯示有大約9kb的片段,說明連接成功,構建得到p8fnA載體(8fnA為單點突變改造后的聚半乳糖醛酸酶基因的代號)pPIC9γ?8fnA。
3、8fnA克隆載體轉化畢赤酵母GS115及工程菌的篩選
3.1受體感受態細胞的制備:將畢赤酵母GS115菌株在YPD平板上劃線,30°C培養48h,挑取生長茁壯的單菌落于20mL YPD液體培養基中,30°C、200rpm搖床培養48h;將活化的新鮮GS115菌液按0.1%的比例接種于100mL的YPD中,200rpm,30°C培養至OD600約1.3,放置冰上預冷;將菌液轉移至預冷的離心管中,4°C、2000g離心5min,棄上清,用500mL預冷的無菌水重懸菌體;將重懸菌體在4°C,2000g離心5min,沉淀再用250mL預冷的無菌水重懸;將重懸菌體在4°C,2000g離心5min,用20mL預冷的1mol/L山梨醇溶液重懸沉淀;將重懸的菌體沉淀在4°C,2000g離心5min,用1mL預冷的1mol/L的山梨醇溶液重懸;對重懸細胞懸浮液分別以80μL分裝到1.5mL的EP管中,并保存在?70°C,備用。
3.2電擊轉化:將線性化的質粒溶于10μL無菌水,取80μL已制備好的GS115感受態細胞與之混勻,后將其轉至預冷的電轉杯中;調整基因導入儀的參數為電壓2kV,電擊;電擊完成后立即加入1mL預冷的1mol/L山梨醇,在室溫靜置30min后,涂布于MD平板上,倒置于30°C培養箱中培養2天;
3.3酵母轉化子的篩選:用滅菌牙簽從MD板上挑取單克隆,按先后次序標號,先點到MM上,再點到相應編號的MD平板上;將兩平板置于30°C培養箱中培養2天。按編號挑取正常生長的轉化子接種于3mL BMGY培養基中,裝有BMGY培養基的離心管需要嚴格無菌且包有八層紗布,將其置于30°C、220rpm搖床培養48h;將搖床培養48h的菌液置于3000g離心10min,去上清,向離心管中加入1mL含有0.5%甲醇的BMMY培養基,在30°C、260rpm誘導培養。誘導培養48h后,將菌液置于12000rpm離心3min,取上清檢測活性,從中篩選出具有多聚半乳糖醛酸酶活性的轉化子;
3.4目的基因在畢赤酵母中搖瓶水平的表達:將含有較高的多聚半乳糖醛酸酶酶活菌株接種于300mL BMGY培養基的1L三角瓶中,置于30°C,220rpm搖床培養48h;后將培養液3000g離心5min,棄上清,沉淀用100mL含有0.5%甲醇的BMMY培養基重懸,并再次置于30°C,220rpm條件下誘導培養。每隔12h補加0.5mL甲醇,使菌液中的甲醇濃度保持在0.5%,同時取上清用于酶活性檢測。
4、本發明所述的突變聚半乳糖醛酸酶活力的測定
4.11個多聚半乳糖醛酸酶的活性單位(U)定義:在給定的條件下,每分鐘分解多聚半乳糖醛酸生成1μmolD?(+)?半乳糖醛酸所需的酶量。
4.2重組酶反應最適pH和pH穩定性的測定:
將純化好的重組突變聚半乳糖醛酸酶在39°C下,不同pH的底物中進行酶學反應,以測定其最適pH。所用緩沖液為:pH2.0–7.0的McIlvaine緩沖液(0.2M磷酸氫二鈉/0.1M檸檬酸),pH8.0–9.0的0.1mol/L的Tris?HCl緩沖液,以及pH10.0–12.0的Gly?NaOH緩沖液。
pH穩定性測定:將濃縮后的純酶液在不同pH值的緩沖液中置于37°C下處理1h,用最適pH的緩沖液作適當稀釋,在最適pH和最適溫度的條件下測定剩余酶活性。
重組酶反應最適溫度的測定:在最適pH的緩沖液中及不同溫度下(0–80°C)測定活性以確定最適溫度。
4.3重組酶比活、Km值及Vmax的測定重組酶
參照李寧的方法(李寧,2009),測定反應的一級反應時間。確定測定Km及Vmax的反應時間為3min。用不同濃度的多聚半乳糖醛酸(0.5,0.4,0.25,0.2,0.2,0.175,0.15、0.1、0.05%)為底物,在最適條件下測定酶活性,計算出相應的反應速度,利用GraphPad Prism5軟件計算Km值及Vmax。
按照Bio?Rad試劑盒的方法,繪制標準曲線。測定方法:首先通過標準曲線計算目的蛋白的含量,其次是在最適條件下測得重組酶的酶活,用酶活數除以蛋白的濃度可得酶的比活。比活力的定義為:每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位數。
5.應用實驗的測定
5.1原料的處理:5g干物質、20ml的緩沖液,總體積25ml,含水量80%,沸水浴處理5min;
5.2體外環境消化:40℃,pH6.5;
5.3實驗設計酶的添加量為500U/g底物
5.4實驗操作步驟:
稱取2g待測原料置于三角瓶中,添加8ml pH6.5緩沖液,至40℃恒溫震蕩2h,檢測其還原糖指標。即將反應完后的樣品10000rpm離心5min,取上清1ml,加入1.5ml DNS,充分混勻,沸水浴反應5min,測定其540nm下的吸光值。
實驗結果:
對改造前后的聚半乳糖醛酸酶的性質測定,結果如下:

改造前的比活20387.82U/mg,改造后的比活比原來提高58%,而改造后的最適溫度方面也有5℃的提高。

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