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高強度絲素骨修復支架材料的制備方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310122956.4

申請日:

2013.04.10

公開號:

CN103223193B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61L 27/22申請日:20130410|||公開
IPC分類號: A61L27/22; A61L27/56 主分類號: A61L27/22
申請人: 浙江大學
發明人: 楊明英; 帥亞俊; 周官山; 朱良均; 閔思佳
地址: 310058 浙江省杭州市西湖區余杭塘路866號浙大紫金港校區動物科學學院
優先權:
專利代理機構: 杭州天欣專利事務所(普通合伙) 33209 代理人: 楊顯儉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310122956.4

授權公告號:

103223193B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.08.28|||2013.07.31

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種高強度絲素骨修復支架材料的制備方法。目前還沒有一種制備條件溫和,對環境無污染的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法。本發明的特點在于:該制備方法包括如下步驟:(1)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出,除去中部絲腺外部的上皮組織,得絲腺蛋白;(2)將絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌1-5次,除去可溶性的絲膠蛋白,得絲素蛋白膠狀物;(3)將絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中,雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物,置于搖床上振搖0.3-4個小時得到溶液,將溶液經離心分離以去除不溶物,得絲素蛋白水溶液;(4)將絲素蛋白水溶液加工制備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。本發明制備條件溫和,對環境無污染。

權利要求書

權利要求書
1.   一種高強度絲素骨修復支架材料的制備方法,其特征在于:該制備方法包括如下步驟:
(1)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,該條帶即為絲腺蛋白;
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌1?5次,以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白,從而得到絲素蛋白膠狀物;
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中,使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物,然后置于搖床上輕輕振搖0.3?4個小時得到溶液,再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物,從而得到絲素蛋白水溶液;
(4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液加工制備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。

2.   根據權利要求1所述的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法,其特征在于:所述步驟(4)中,先用雙蒸水將絲素蛋白水溶液的濃度調整到1wt%?20wt%,然后滴加到細胞培養板中,在25?35℃的條件下保存8?16個小時,使得絲素蛋白水溶液中的水分減少,以及絲素蛋白的二級結構向β?折疊轉變,從而得到絲素蛋白;將絲素蛋白放在?30?(?10)℃的條件下冷凍1?3個小時,再經過真空冷凍干燥14?34個小時,從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料。

3.   根據權利要求1或2所述的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法,其特征在于:將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為65?85%的酒精中8?16個小時,此過程作為后處理過程,目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能,以及延緩高強度絲素骨修復支架材料在生物體內的降解速度。

4.   根據權利要求1所述的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法,其特征在于:所述步驟(1)中,含有絲腺蛋白的昆蟲為家蠶、野蠶或蜘蛛。

5.   根據權利要求1所述的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法,其特征在于:所述步驟(3)中,將浸有絲素蛋白膠狀物的雙蒸水置于搖床上輕輕振搖1個小時得到溶液,再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物,從而得到絲素蛋白水溶液,該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa;所述步驟(4)中,所述高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量在5Mpa以上。

6.   根據權利要求1所述的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法,其特征在于:所述步驟(4)中,將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍干燥方式或鹽析法加工制備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。

7.   根據權利要求1所述的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法,其特征在于:所述步驟(2)和(3)均在0℃的環境中進行。

8.   根據權利要求2所述的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法,其特征在于:所述步驟(4)中,先用雙蒸水將絲素蛋白水溶液的濃度調整到1wt%?20wt%,然后滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板為準,在30℃的條件下保存12個小時,使得絲素蛋白水溶液中的水分減少,以及絲素蛋白的二級結構向β?折疊轉變,從而得到絲素蛋白;將絲素蛋白放在?20℃的條件下冷凍2個小時,再經過真空冷凍干燥24個小時,從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料。

9.   根據權利要求3所述的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法,其特征在于:將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時。

10.   根據權利要求4所述的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法,其特征在于:所述家蠶為五齡第7天的家蠶幼蟲。

說明書

說明書高強度絲素骨修復支架材料的制備方法
技術領域
本發明涉及一種骨修復支架材料的制備方法,尤其是涉及一種高強度絲素骨修復支架材料的制備方法,是一種制備高強度絲素骨修復支架材料的方法,屬于生物材料領域。
背景技術
家蠶絲素蛋白、柞蠶絲素蛋白和蜘蛛絲蛋白具有優良的力學性能、生物相容性、無免疫排斥或者炎癥反應、可降解性以及本質是天然蛋白質的結構特點,在生物材料領域受到高度的關注。絲蛋白可用作骨組織修復、創面覆蓋材料、藥物緩釋材料、微膠囊、人造器官等不同形狀與功能的生物材料,以滿足人類對生物材料的不同需求。
天然絲蛋白在昆蟲體內合成、分泌,并且以高濃度(家蠶中部絲腺蛋白可達30wt%)的絲蛋白溶液的形式貯存在各種絲腺中。然而,一旦經過昆蟲噴出的絲纖維凝固之后,便很難再溶于水中,只能溶于強酸、強堿、HFA、HFIP、LiBr、LiSCN等化學溶劑中,這些溶劑都屬于材料制備當中的腐蝕性溶液,不僅對生物體有毒副作用,有違于相應的生物安全標準,而且廢棄的溶劑對環境也有很大的污染性,溶劑的成本高。經過化學試劑處理得到的再生絲蛋白,因為其分子量大為下降,制備得到的生物支架材料機械性能也顯著降低。有研究采用化學交聯法來制備不溶性絲素多孔支架,但也可能帶來交聯劑在生物體內殘留影響生物相容性。這些缺點一直以來都制約著絲蛋白材料在生物材料中的應用,如何消除生物材料中殘留的化學試劑以及如何提高其力學性能,是絲蛋白多孔支架材料制備中亟待解決的難題,并對絲素蛋白在生物醫學材料領域的應用具有重要意義。
現在也有一些其他方式來制備絲素蛋白材料,如公開日為2009年12月09日,公開號為CN101596327的中國專利中,公開了一種三維絲素蛋白多孔支架材料的制備方法,該制備方法是將體積濃度為2%~50WT%的絲素蛋白水溶液置于容器中,然后在20℃~80℃不斷攪拌的情況下在絲素溶液中加入氯化鈉,其中氯化鈉顆粒的質量(單位為克)與絲素溶液的體積(單位為ML)比為1~20∶1;絲素溶液經凝膠、靜置、沉淀后,取沉淀部分,繼續攪拌將沉淀物混合均勻,然后將其放入所需形狀的模具中,烘干;最后經蒸餾水洗去支架中的氯化鈉,即得到具有三維多孔結構的絲素支架材料。該方法雖然沒有使用任何有機溶劑,對生物體無毒副作用,但是制備而成的絲素支架材料的力學性能較差。又如公開日為2010年10月20日,公開號為CN101864177A的中國專利中,公開了一種多孔蠶絲絲素蛋白材料的制備方法,該制備方法將蠶絲脫膠、溶解、透析獲得絲素蛋白溶液;按摩爾比,將等比例的羧酸或羧酸溶液與檸檬酸混合,加熱溶解后再加入聚乙二醇,得到促膠凝劑;將絲素蛋白溶液與促膠凝劑混合后倒入模具中,得到絲素蛋白凝膠,在10~100℃的溫度條件下加熱干燥后得到多孔絲素蛋白材料。該方法中使用的有機溶劑對生物存在一定的毒副作用。
綜上所述,目前還沒有一種加工工藝簡單,制備條件溫和,絲素支架材料的力學性能強,成本低廉,對環境無污染的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中存在的上述不足,而提供一種加工工藝簡單,制備條件溫和,絲素支架材料的力學性能強,成本低廉,對環境無污染的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法。
本發明解決上述問題所采用的技術方案是:該高強度絲素骨修復支架材料的制備方法的特點在于:該制備方法包括如下步驟:
(1)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,該條帶即為絲腺蛋白;
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌1?5次,以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白,從而得到絲素蛋白膠狀物;
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中,使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物,然后置于搖床上輕輕振搖0.3?4個小時得到溶液,再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物,從而得到絲素蛋白水溶液;
(4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液加工制備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。
由此使得本發明的加工工藝簡單,制備條件溫和,生產過程環保,制備而成的高強度絲素骨修復支架材料的力學性能強,而且成本低廉,對環境無污染。
作為優選,本發明所述步驟(4)中,先用雙蒸水將絲素蛋白水溶液的濃度調整到1wt%?20wt%,然后滴加到細胞培養板中,在25?35℃的條件下保存8?16個小時,使得絲素蛋白水溶液中的水分減少,以及絲素蛋白的二級結構向β?折疊轉變,從而得到絲素蛋白;將絲素蛋白放在?30?(?10)℃的條件下冷凍1?3個小時,再經過真空冷凍干燥14?34個小時,從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料。由此使得本發明制備而成的高強度絲素骨修復支架材料的力學性能更好。
作為優選,本發明將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為65?85%的酒精中8?16個小時,此過程作為后處理過程,目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能,以及延緩高強度絲素骨修復支架材料在生物體內的降解速度。
作為優選,本發明所述步驟(1)中,含有絲腺蛋白的昆蟲為家蠶、野蠶或蜘蛛。
作為優選,本發明所述步驟(3)中,將浸有絲素蛋白膠狀物的雙蒸水置于搖床上輕輕振搖1個小時得到溶液,再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物,從而得到絲素蛋白水溶液,該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa;所述步驟(4)中,所述高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量在5Mpa以上。
作為優選,本發明所述步驟(4)中,將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍干燥方式或鹽析法加工制備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。
作為優選,本發明所述步驟(2)和(3)均在0℃的環境中進行。
作為優選,本發明所述步驟(4)中,先用雙蒸水將絲素蛋白水溶液的濃度調整到1wt%?20wt%,然后滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板為準,在30℃的條件下保存12個小時,使得絲素蛋白水溶液中的水分減少,以及絲素蛋白的二級結構向β?折疊轉變,從而得到絲素蛋白;將絲素蛋白放在?20℃的條件下冷凍2個小時,再經過真空冷凍干燥24個小時,從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料。
作為優選,本發明將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時。
作為優選,本發明所述家蠶為五齡第7天的家蠶幼蟲。
本發明與現有技術相比,具有以下優點和效果:1、優良的機械性能:與再生家蠶絲素材料或者混合有家蠶絲素蛋白做成的多孔支架材料相比,其力學性能優良,具有很高的彈性模量。2、良好的生物相容性:材料本身或者降解產物對細胞無毒性反應,水溶性絲素蛋白具有較高的細胞粘附率和增殖率,表現出良好的生物相容性。3、操作簡單,生產周期短:加工工藝簡單,沒有復雜繁瑣的提取材料過程,時間上大為節省。4、經濟環保:制備過程中未使用其它成本高的化學試劑,制備條件溫和,成本低廉,相對于使用化學試劑制備的材料來說,對環境無污染。
本發明制備而成的高強度絲素骨修復支架材料的內部結構、孔徑尺寸和孔隙大小均勻,連通性好,有利于骨細胞的粘附分化增殖等。而且,隨著水溶性絲素蛋白濃度的增加,其孔隙率逐漸降低。本發明制備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長,將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位,能促進骨組織的生長。
本發明中絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa,即得到的水溶性絲素蛋白分子量高于250 kDa,與完整的絲素蛋白重鏈的分子量相近。本發明制備而成的高強度絲素骨修復支架材料的最大抗壓強度可高達6.9±0.4MPa,具有很強的力學性能,不僅沒有細胞毒性,而且對細胞具有粘附和促進作用。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明,以下實施例是對本發明的解釋而本發明并不局限于以下實施例。
實施例1。
本實施例中的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法包括如下步驟。
(1)用醫用鉗將五齡第7天的家蠶幼蟲中的一對中部絲腺拉出,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,該條帶即為絲腺蛋白。本發明也可以使用含有絲腺蛋白的其他昆蟲,如野蠶或蜘蛛。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌兩次,以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白,從而得到絲素蛋白膠狀物。步驟(2)在0℃的環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中,使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物,然后置于搖床上輕輕振搖1個小時得到溶液,再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物,從而得到絲素蛋白水溶液。步驟(3)在0℃的環境中進行。
(4)先用雙蒸水將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液的濃度調整到1wt%?20wt%,然后滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板為準,在30℃的條件下保存12個小時,使得絲素蛋白水溶液中的水分減少,以及絲素蛋白的二級結構向β?折疊轉變,從而得到絲素蛋白。將絲素蛋白放在?20℃的條件下冷凍2個小時,再經過真空冷凍干燥24個小時,從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料。
將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時,此過程作為后處理過程,目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能,以及延緩高強度絲素骨修復支架材料在生物體內的降解速度。
本實施例制備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長,將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位,能促進骨組織的生長。
實施例2。
本實施例中的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法包括如下步驟。
(1)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,該條帶即為絲腺蛋白。含有絲腺蛋白的昆蟲可以為家蠶、野蠶或蜘蛛。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌1?5次,以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白,從而得到絲素蛋白膠狀物。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中,使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物,然后置于搖床上輕輕振搖0.3?4個小時得到溶液,再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物,從而得到絲素蛋白水溶液。
(4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液加工制備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。
本實施例制備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長,將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位,能促進骨組織的生長。
實施例3。
本實施例中的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法包括如下步驟。
(1)將含有絲腺蛋白的家蠶中的一對中部絲腺拉出,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,該條帶即為絲腺蛋白。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌三次,以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白,從而得到絲素蛋白膠狀物。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中,使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物,然后置于搖床上輕輕振搖1.5個小時得到溶液,再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物,從而得到絲素蛋白水溶液,該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa。
(4)先用雙蒸水將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液的濃度調整到20wt%,然后滴加到細胞培養板中,在25?35℃的條件下保存8?16個小時,使得絲素蛋白水溶液中的水分減少,以及絲素蛋白的二級結構向β?折疊轉變,從而得到絲素蛋白。將絲素蛋白放在?30?(?10)℃的條件下冷凍1?3個小時,再經過真空冷凍干燥14?34個小時,從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料,該高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量在5Mpa以上。
本實施例制備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長,將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位,能促進骨組織的生長。
實施例4。
本實施例中的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法包括如下步驟。
(1)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,該條帶即為絲腺蛋白。本發明中含有絲腺蛋白的昆蟲可以為家蠶、野蠶或蜘蛛,優選為五齡第7天的家蠶幼蟲。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌1?5次,以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白,從而得到絲素蛋白膠狀物。步驟(2)在0℃的環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中,使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物,將浸有絲素蛋白膠狀物的雙蒸水置于搖床上輕輕振搖1個小時得到溶液,再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物,從而得到絲素蛋白水溶液,該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa。本發明可以將浸有絲素蛋白膠狀物的雙蒸水置于搖床上輕輕振搖0.3?4個小時得到溶液。步驟(3)在0℃的環境中進行。
(4)先用雙蒸水將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液的濃度調整到1wt%,然后滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板為準,在30℃的條件下保存12個小時,使得絲素蛋白水溶液中的水分減少,以及絲素蛋白的二級結構向β?折疊轉變,從而得到絲素蛋白;將絲素蛋白放在?20℃的條件下冷凍2個小時,再經過真空冷凍干燥24個小時,從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料,該高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量在5Mpa以上。
再將步驟(4)制得的多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時,此過程作為后處理過程,目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能,以及延緩高強度絲素骨修復支架材料在生物體內的降解速度。本發明可以將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為65?85%的酒精中8?16個小時。
本實施例制備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長,將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位,能促進骨組織的生長。
當然,本發明可以先用雙蒸水將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液的濃度調整到1wt%?20wt%,然后滴加到細胞培養板中,可以在25?35℃的條件下保存8?16個小時,使得絲素蛋白水溶液中的水分減少,以及絲素蛋白的二級結構向β?折疊轉變,從而得到絲素蛋白。可以將絲素蛋白放在?30?(?10)℃的條件下冷凍1?3個小時,再經過真空冷凍干燥14?34個小時,從而得到多孔的高強度絲素骨修復支架材料。
本發明可以將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍干燥方式或鹽析法加工制備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。
實施例5。
本實施例中的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法包括如下步驟。
(1)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,該條帶即為絲腺蛋白。含有絲腺蛋白的昆蟲可以為家蠶、野蠶或蜘蛛。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌1?5次,以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白,從而得到絲素蛋白膠狀物。步驟(2)可以在?5℃至5℃的低溫環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到雙蒸水中,使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物,然后置于搖床上輕輕振搖0.3?4個小時得到溶液,再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物,從而得到絲素蛋白水溶液,該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa。步驟(3)可以在?5℃至5℃的低溫環境中進行。
(4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍干燥方式或鹽析法加工制備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料。再將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為65?85%的酒精中8?16個小時,此過程作為后處理過程,目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能,以及延緩高強度絲素骨修復支架材料在生物體內的降解速度。
本實施例制備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長,將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位,能促進骨組織的生長。
實施例6。
本實施例中高強度絲素骨修復支架材料制備方法依次包括如下步驟。
(1)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺。除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,即為絲腺蛋白。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌兩次,以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白,得到絲素蛋白膠狀物,此過程在0℃環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有10mL雙蒸水的燒杯中,當解剖的家蠶數量為20條時,作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.1小時,所得溶液經過離心分離去除不溶物后,即得到絲素蛋白水溶液,此過程在0℃環境中進行。
(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。
(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到2wt%濃度,滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板。30℃保存12小時,使絲素蛋白水溶液中的水分減少,及絲素蛋白的二級結構向β?折疊轉變。
(6)將步驟(5)中的絲素蛋白放在?20℃冰箱中冷凍2個小時,之后真空冷凍干燥24小時,得到高強度絲素骨修復支架材料。
(7)將步驟(6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時,此過程作用為后處理過程,目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能,及延緩支架材料在生物體內的降解速度。
(8)步驟(7)得到的高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量達5Mpa以上。
實施例7。
(1)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺。除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,即為絲腺蛋白。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌三次,以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白,得到絲素蛋白膠狀物,此過程在0℃環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有10mL雙蒸水的燒杯中,當解剖的家蠶數量為20條時,作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1小時,所得溶液經過離心分離去除不溶物后,即得到絲素蛋白水溶液,此過程在0℃環境中進行。
(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。
(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到2wt%濃度,滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板。30℃保存12小時,使絲素蛋白水溶液中的水分減少,及絲素蛋白的二級結構向β?折疊轉變。
(6)將步驟(5)中的絲素蛋白放在?20℃的冰箱中冷凍2個小時,之后真空冷凍干燥24小時,得到高強度絲素骨修復支架材料。
(7)將步驟(6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時,此過程作用為后處理過程,目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能,及延緩支架材料在生物體內的降解速度。
(8)將步驟(7)得到的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長。
實施例8。
(1)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺。除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,即為絲腺蛋白。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌兩次,以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白,得到絲素蛋白膠狀物,此過程在0℃環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有10mL雙蒸水的燒杯中,當解剖的家蠶數量為20條時,作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.2小時,所得溶液經過離心分離去除不溶物后,即得到絲素蛋白水溶液,此過程在0℃環境中進行。
(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。
(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到2wt%濃度,滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板。30℃保存12小時,使絲素蛋白水溶液中的水分減少及絲素蛋白的二級結構向β?折疊轉變。
(6)將步驟(5)中的絲素蛋白放在?20℃冰箱中冷凍2個小時,之后真空冷凍干燥24小時,得到高強度絲素骨修復支架材料。
(7)將步驟(6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時,此過程作用為后處理過程,目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能,及延緩支架材料在生物體內的降解速度。
(8)將步驟(7)得到的高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位,能促進骨組織的生長。
實施例9。
(1)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,即為絲腺蛋白。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌三次,以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白,得到絲素蛋白膠狀物,此過程在0℃環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有10mL雙蒸水的燒杯中,當解剖的家蠶數量為21條時,作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1小時,所得溶液經過離心分離去除不溶物后,即得到絲素蛋白水溶液,此過程在0℃環境中進行。
(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。
(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到5wt%濃度,將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻,滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板,20℃風干24小時。
(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中,將氯化鈉溶解到去離子水中,得到高強度絲素骨修復支架材料。
(7)將步驟(6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時,此過程作用為后處理過程,目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能,及延緩支架材料在生物體內的降解速度。
(8)步驟(7)得到的高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量達5Mpa以上。
實施例10。
(1)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,即為絲腺蛋白。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌兩次,以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白,得到絲素蛋白膠狀物,此過程在0℃環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有10mL雙蒸水的燒杯中,當解剖的家蠶數量為22條時,作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.1小時,所得溶液經過離心分離去除不溶物后,即得到絲素蛋白水溶液,此過程在0℃環境中進行。
(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。
(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到5wt%濃度,將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻,滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板,20℃風干24小時。
(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中,將氯化鈉溶解到去離子水中,得到高強度絲素骨修復支架材料。
(7)將步驟(6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時,此過程作用為后處理過程,目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能,及延緩支架材料在生物體內的降解速度。
(8)將步驟(7)得到的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長。
實施例11。
(1)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,即為絲腺蛋白。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌兩次,以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白,得到絲素蛋白膠狀物,此過程在0℃環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有10mL雙蒸水的燒杯中,當解剖的家蠶數量為21條時,作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.2小時,所得溶液經過離心分離去除不溶物后,即得到絲素蛋白水溶液,此過程在0℃環境中進行。
(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。
(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到5wt%濃度,將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻,滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板,20℃風干24小時。
(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中,將氯化鈉溶解到去離子水中,得到高強度絲素骨修復支架材料。
(7)將步驟(6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時,此過程作用為后處理過程,目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能,及延緩支架材料在生物體內的降解速度。
(8)將步驟(7)得到的高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位,能促進骨組織的生長。
實施例12。
(1)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,即為絲腺蛋白。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌兩次,以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白,得到絲素蛋白膠狀物,此過程在0℃環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有10mL雙蒸水的燒杯中,當解剖的家蠶數量為18條時,作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖0.95小時,所得溶液經過離心分離去除不溶物后,即得到絲素蛋白水溶液,此過程在0℃環境中進行。
(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。
(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到10wt%濃度,將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻,滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板,20℃風干24小時。
(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中,將氯化鈉溶解到去離子水中,干燥后得到高強度絲素骨修復支架材料。
(7)將步驟(6)得到的高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位,能促進骨組織的生長。
實施例13。
(1)用醫用鉗將五齡第7天家蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,即為絲腺蛋白。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌兩次,以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白,得到絲素蛋白膠狀物,此過程在0℃環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有10mL雙蒸水的燒杯中,當解剖的家蠶數量為20條時,作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1小時,所得溶液經過離心分離去除不溶物后,即得到絲素蛋白水溶液,此過程在0℃環境中進行。
(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。
(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到10wt%濃度,將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻,滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板,20℃風干24小時。
(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中,將氯化鈉溶解到去離子水中。干燥后得到高強度絲素骨修復支架材料。
(7)將步驟(6)得到的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長。
實施例14。
本實施例中的高強度絲素骨修復支架材料的制備方法包括如下步驟。
(1)將含有絲腺蛋白的昆蟲中的一對中部絲腺拉出,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,該條帶即為絲腺蛋白。含有絲腺蛋白的昆蟲可以為家蠶、野蠶或蜘蛛。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌3次,以除去絲腺蛋白中的大部分可溶性的絲膠蛋白,從而得到絲素蛋白膠狀物,此過程在0.1℃環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有10mL雙蒸水的燒杯中,使得雙蒸水浸沒絲素蛋白膠狀物,然后置于搖床上輕輕振搖1.3個小時得到溶液,再將所得溶液經過離心分離以去除不溶物,從而得到絲素蛋白水溶液,該絲素蛋白水溶液中的絲素蛋白分子量高于250kDa。此過程在0.1℃環境中進行。
(4)將步驟(3)得到的絲素蛋白水溶液通過冷凍干燥方式加工制備成多孔的高強度絲素骨修復支架材料,再將多孔的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為70%的酒精中12.5個小時,此過程作為后處理過程,目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能,以及延緩高強度絲素骨修復支架材料在生物體內的降解速度。
本實施例制備而成的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長,將該高強度絲素骨修復支架材料植入兔子的股骨頭缺損部位,能促進骨組織的生長。
實施例15。
本實施例中高強度絲素骨修復支架材料制備方法依次包括如下步驟。
(1)用醫用鉗將野蠶幼蟲解剖后取出中部絲腺,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,即為絲腺蛋白。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌一次,以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白,得到絲素蛋白膠狀物,此過程在0℃環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有10mL雙蒸水的燒杯中,當解剖的家蠶數量為25條時,作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.1小時,所得溶液經過離心分離去除不溶物后,即得到絲素蛋白水溶液,此過程在1℃環境中進行。
(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。
(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到13wt%濃度,滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板。30℃保存12.2小時,使絲素蛋白水溶液中的水分減少,及絲素蛋白的二級結構向β?折疊轉變。
(6)將步驟(5)中的絲素蛋白放在?20℃冰箱中冷凍2個小時,之后真空冷凍干燥24小時,得到高強度絲素骨修復支架材料。
(7)將步驟(6)中的高強度絲素骨修復支架材料浸泡于體積百分比為75%的酒精中12個小時,此過程作用為后處理過程,目的是提高高強度絲素骨修復支架材料的力學性能,及延緩支架材料在生物體內的降解速度,得到的高強度絲素骨修復支架材料的彈性壓縮模量達5Mpa以上。
實施例16。
(1)用醫用鉗將蜘蛛解剖后取出中部絲腺,除去中部絲腺外部的上皮組織,可見一段清澈透明的條帶,即為絲腺蛋白。
(2)將步驟(1)中的絲腺蛋白浸漬在雙蒸水中洗滌兩次,以除去大部分的可溶性的絲膠蛋白,得到絲素蛋白膠狀物,此過程在0℃環境中進行。
(3)將步驟(2)中的絲素蛋白膠狀物收集到含有10mL雙蒸水的燒杯中,當解剖的家蠶數量為20條時,作為一批實驗的量。在搖床上輕輕振搖1.3小時,所得溶液經過離心分離去除不溶物后,即得到絲素蛋白水溶液,此過程在0℃環境中進行。
(4)步驟(3)得到絲素蛋白分子量高于250kDa。
(5)將步驟(4)中的絲素蛋白水溶液用雙蒸水調整到13wt%濃度,將超飽和的氯化鈉溶液與絲素蛋白水溶液混合均勻,滴加到48孔細胞培養板中,每孔加入的量為浸沒48孔板,20℃風干24小時。
(6)將步驟(5)中的絲素蛋白支架放入大量去離子水中,將氯化鈉溶解到去離子水中,干燥后得到高強度絲素骨修復支架材料,得到的高強度絲素骨修復支架材料能促進骨肉瘤細胞的生長。
雖然本發明已以實施例公開如上,但其并非用以限定本發明的保護范圍,任何熟悉該項技術的技術人員,在不脫離本發明的構思和范圍內所作的更動與潤飾,均應屬于本發明的保護范圍。

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