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通讀誘導劑以及無義突變型遺傳疾病的治療藥物.pdf

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通讀 誘導劑 以及 突變型 遺傳 疾病 治療 藥物
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摘要
申請專利號:

CN201180008253.8

申請日:

2011.02.03

公開號:

CN102740860B

公開日:

2014.11.19

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):A61K 31/7036申請日:20110203授權公告日:20141119終止日期:20160203|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 31/7036申請日:20110203|||公開
IPC分類號: A61K31/7036; A61P1/16; A61P3/04; A61P3/06; A61P3/10; A61P5/14; A61P7/04; A61P9/02; A61P9/10; A61P11/00; A61P13/12; A61P17/00; A61P19/00; A61P19/02; A61P21/04; A61P25/00; A61P25/16; A61P25/28; A61P27/02; A61P29/00; A61P35/00; A61P37/02; A61P37/06; A61P43/00;... 主分類號: A61K31/7036
申請人: 公益財團法人微生物化學研究會; 國立大學法人東京大學
發明人: 松田良一; 鹽塚政孝; 我妻玲; 高橋良和; 池田大四郎; 野野村禎昭; 松尾雅文; 西田篤史
地址: 日本東京
優先權: 2010.02.03 JP 2010-021817
專利代理機構: 北京銘碩知識產權代理有限公司 11286 代理人: 金光軍
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201180008253.8

授權公告號:

|||||||||

法律狀態公告日:

2017.03.29|||2014.11.19|||2013.01.16|||2012.10.17

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供一種含有下述結構式(A)所示的化合物的、針對由無義突變形成的提前終止密碼子的通讀誘導劑以及含有前述通讀誘導劑的治療無義突變型遺傳疾病的藥物。

權利要求書

1.一種針對由無義突變形成的提前終止密碼子的通讀誘導劑,其特征在
于含有下述結構式(A)所示的化合物。
[化學式4]

2.一種治療無義突變型遺傳疾病的藥物,其特征在于含有權利要求1
所述的通讀誘導劑。
3.如權利要求2所述的治療無義突變型遺傳疾病的藥物,其中無義突變
型遺傳疾病是肌營養不良癥。

說明書

通讀誘導劑以及無義突變型遺傳疾病的治療藥物

技術領域

本發明涉及一種針對由無義突變形成的提前終止密碼子的通讀誘導劑
(Read?Through?Inducer)以及無義突變型遺傳疾病的治療藥物。

背景技術

無義突變型遺傳疾病的起因是:由于基因上的點突變導致形成了提前終
止密碼子,使得蛋白質的表達被阻礙。這類疾病例如可以列舉:肌營養不良
癥、多發性硬化癥、嬰兒神經元蠟樣質脂褐素沉積病、阿爾茨海默病、泰-薩
克斯病、神經組織變性、帕金森綜合癥、慢性關節風濕病、移植物抗宿主病、
關節炎、血友病、血管性血友病、毛細管擴張性運動失調、地中海貧血、腎
結石、成骨不全癥、肝硬變、神經纖維瘤病、水皰性疾病、溶酶體性貯積病、
賀勒氏癥(粘多糖癥)、家族性膽固醇血癥、小腦運動失調癥、結節性硬化癥、
家族性紅細胞增多癥、免疫缺陷、腎臟病、肺疾病、囊胞性纖維癥、家族性
高膽固醇血癥、色素性視網膜病、淀粉樣變性(淀粉沉積癥)、動脈粥樣硬化
癥、巨人癥、侏儒癥、甲狀腺機能低下癥、甲狀腺機能亢進癥、老化、肥胖、
糖尿病、尼曼-匹克(Niemann-Pick)病(神經鞘髓磷脂病)、馬凡氏綜合癥、
癌癥等。

例如,杜氏肌營養不良癥是由于肌纖維鞘中肌營養不良蛋白缺失導致的
疾病。在該疾病中,存在于X染色體中的肌營養不良基因上發生了突變,導
致生成終止密碼子(提前終止密碼子),在該突變部位,翻譯發生中斷或者終
了,導致正常的肌營養不良蛋白以及與肌營養不良相關聯的蛋白質的表達被
抑制,結果導致了肌營養不良蛋白缺失。

關于這樣的無義突變型遺傳疾病的治療方法,正在摸索使用具有通讀活
性的化合物進行治療的方法。前述的通讀活性是指,對于因無義突變導致提
前終止密碼子產生的特定蛋白質缺失的患者,在給他們施用特定化合物時,
前述化合物作用于核糖體,使得核糖體跳過終止密碼子進行翻譯。于是,通
讀的結果可以合成野生型正常蛋白質。

具有前述通讀活性的化合物,例如可以列舉已知的氨基糖苷類抗生素的
慶大霉素、二肽系抗生素的負霉素(Negamycin)等。

關于慶大霉素,Politano等通過給杜氏肌營養不良癥患者施用慶大霉素,
確認了肌營養不良蛋白的蓄積(例如,參照非專利文獻1)。另外,通過對囊
胞性纖維癥患者的呼吸道上皮局部施用慶大霉素,可以使得典型的電生理學
異常正常化的結果也有見報道(例如,參照非專利文獻2)。并且,美國正在
進行使用慶大霉素作為遺傳疾病治療方法的臨床試驗。然而,所存在的問題
是,由于慶大霉素毒性強,對于需要長期服用藥物的無義突變型遺傳疾病的
患者來說,并不能稱之為理想的治療藥物。

關于負霉素,通過將該化合物施用于肌營養不良癥模型小鼠,確認出肌
營養不良蛋白的表達得到恢復(例如,參照專利文獻1)。然而,所存在的問
題是,負霉素是尚未被承認的藥物,因此作為急需藥物的無義突變型遺傳疾
病治療藥物來說是不現實的。

另外,作為治療杜氏肌營養不良癥等的藥劑,具有通讀活性的Ataluren
(PTC124)的臨床試驗正在美國進行。然而,現在在第三階段停了下來,作
為急需藥物的無義突變型遺傳疾病治療藥物來說,并不現實。

于是,現在急需的是,迅速開發一種毒性弱,且含有具有通讀活性的化
合物的通讀誘導劑以及治療無義突變型遺傳疾病的藥物。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1:國際公開WO2002/102361號公報

非專利文獻

非專利文獻1:Acta.Myol.第22卷,第15~21頁,2003年

非專利文獻2:N.Engl.J.Med.第349卷,第1433~1441頁,2003年

發明內容

技術問題

本發明是以解決前述的到目前為止存在的諸多問題,并以達成以下目的
為課題。即本發明的目的是提供一種毒性弱,且含有具有通讀活性的化合物
的通讀誘導劑以及含有前述通讀誘導劑的治療無義突變型遺傳疾病的藥物。

技術方案

為了解決前述課題,本發明的發明者們經過專心研究,結果發現作為
MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)感染癥的特效藥被使用的、由如下結
構式(A)所表示的化合物(以下被稱為“阿貝卡星(arbekacin)”),具有優
異的通讀活性,并基于此完成了本發明。

[化學式1]


本發明是基于發明者們所得出的前述研究結果作出的,其用于解決前述
課題的手段如下:即,

<1>以含有如下的結構式(A)所表示的化合物為特征的,針對由無義
突變形成的提前終止密碼子的通讀誘導劑。

[化學式2]


<2>以含有前述<1>中所記載的通讀誘導劑為特征的、治療無義突變
型遺傳疾病的藥物。

<3>前述<2>所記載的治療無義突變型遺傳疾病的藥物所針對的無義
突變型遺傳疾病是肌營養不良癥。

<4>一種用于治療患有無義突變型遺傳疾病的個體的方法,其特征在于,
前述<1>中所記載的通讀誘導劑以及前述<2>所記載的治療無義突變型遺
傳疾病的藥物,至少使用其中一種進行治療。

<5>前述<4>中所記載的方法所針對的無義突變型遺傳疾病是肌營養
不良癥。

<6>在前述<4>或<5>所記載的治療方法中,使用前述<1>中所記
載的通讀誘導劑以及前述<2>所記載的治療無義突變型遺傳疾病的藥物這兩
者中的至少一種時,其給藥量,以前述結構式(A)所表示的化合物的量為
基準,為0.1mg/kg/日~300mg/kg/日。

<7>在前述<4>或<5>所記載的治療方法中,使用前述<1>中所記
載的通讀誘導劑以及前述<2>所記載的治療無義突變型遺傳疾病的藥物這兩
者中的至少一種時,其給藥量,以前述結構式(A)所表示的化合物的量為
基準,為0.5mg/kg/日~50mg/kg/日。

<8>前述<1>中所記載的通讀誘導劑,其特征在于,用于治療無義突
變型遺傳疾病。

<9>為制備治療無義突變型遺傳疾病的有效藥物,而使用前述<1>中
所記載的通讀誘導劑。

有益效果

根據本發明,可以提供一種毒性弱,且含有具通讀活性的化合物的通讀
誘導劑以及含有前述通讀誘導劑的無義突變型遺傳疾病的治療藥物。

附圖說明

圖1所示為正常小鼠的根據抗肌營養不良蛋白抗體的免疫染色圖像。

圖2所示為正常小鼠的蘇木精(Hematoxylin)以及曙紅染色圖像。

圖3所示為只施用生理鹽水的mdx小鼠的根據抗肌營養不良蛋白抗體的
免疫染色圖像。

圖4所示為只施用生理鹽水的mdx小鼠的蘇木精(Hematoxylin)以及曙
紅染色圖像。

圖5所示為施用了ABK的mdx小鼠的根據抗肌營養不良蛋白抗體的免
疫染色圖像。

圖6所示為施用了ABK的mdx小鼠的蘇木精(Hematoxylin)以及曙紅
染色圖像。

圖7所示為試驗例5中的B10小鼠、施用了阿貝卡星的mdx小鼠以及未
施用阿貝卡星的mdx小鼠的握力測定結果示意圖。

圖8所示為在試驗例6中的施用了阿貝卡星的mdx小鼠以及未施用阿貝
卡星的mdx小鼠的腓腸肌強直張力測定結果示意圖。

圖9所示為在試驗例7中的施用了阿貝卡星(2.5mg/日、5mg/日)的mdx
小鼠以及未施用阿貝卡星的mdx小鼠的腓腸肌單收縮張力的測定結果示意
圖。

圖10所示為試驗例8中的免疫印跡的結果示意圖。

具體實施方式

(通讀誘導劑)

本發明的通讀誘導劑,至少含有下述結構式(A)所示的化合物,根據需要
還可含有其他成分。

[化學式3]


前述通讀是指由于遺傳基因上的點突變,造成了一個堿基被置換,在原
來的翻譯終結部位的上游形成提前終止密碼子時,越過前述的提前終止密碼
子,一直翻譯到原來的翻譯終結部位。通過“通讀”前述提前終止密碼子,
能夠合成功能性的全長蛋白質。

<結構式(A)所表示的化合物(阿貝卡星)>

前述阿貝卡星(1-N-AHB地貝卡星)是在地貝卡星(3′,4′-去氧卡
那霉素B)中添加4-氨基-2-羥丁酰(AHB)基的產物,從1990年末開始用
作MRSA感染癥的特效藥。

前述阿貝卡星可以以鹽類化合物狀態,也可以以溶劑化物狀態存在。

對于前述的鹽類化合物,并無特別限制,可根據目的適當選擇,例如氫
鹵酸鹽、無機酸鹽、羧酸鹽、氨基酸鹽、有機酸鹽等。其中,優選無機酸鹽。

作為前述氫鹵酸鹽的具體例子,可以列舉:氫氟酸鹽、氫氯酸鹽、氫溴
酸鹽、氫碘酸鹽等。

作為前述無機酸鹽的具體例子,可以列舉:硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、
高氯酸鹽、碳酸鹽等。其中,優選硫酸鹽。

作為前述羧酸鹽的具體例子,可以列舉:醋酸鹽、三氯乙酸鹽、三氟乙
酸鹽、羥基乙酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、安息香酸鹽、
扁桃酸鹽、丁酸鹽、馬來酸鹽、丙酸鹽、蟻酸鹽、蘋果酸鹽等。

作為前述氨基酸鹽的具體例子,可以列舉:精氨酸鹽、天冬氨酸鹽、谷
氨酸鹽等。

作為前述有機酸鹽的具體例子,可以列舉:甲磺酸、對甲本磺酸等。

而前述的溶劑化物,并無特別限制,可以根據目的適當選擇,例如水溶
劑化物、乙醇溶劑化物等。

對于前述阿貝卡星,可以使用化學合成物,也可以使用市場銷售品。

前述阿貝卡星的合成方法,沒有特別限制,可以根據目的適當選擇,例
如“The?Journal?of?Antibiotics,26卷,1973年,412頁”所記載的方法等。

而前述阿貝卡星的市場銷售品,例如有哈貝卡星(ハベカシン,明治制
果株式會社制)等。

另外,作為前述阿貝卡星的鹽類化合物以及前述阿貝卡星的溶劑化物的
制備方法,并無特別限制,可以適當地選擇使用常規方法。

前述阿貝卡星也可以是其衍生物。

而前述通讀誘導劑中前述阿貝卡星的含量,沒有特別限制,可以根據目
的適當選擇。另外,前述的通讀誘導劑也可以是前述阿貝卡星本身。

<其他成分>

作為前述通讀誘導劑中的其他成分,沒有特別限制,可以根據目的適當
選擇,例如在藥理學上能夠相容的載體等。

作為前述在藥理學上能夠相容的載體,沒有特別的限制,可以根據目的
適當選擇,例如乙醇、水、淀粉等。

作為前述通讀誘導劑中前述其他成分的含量,沒有特別限制,只要在不
損害阿貝卡星的效果的范圍內,可以根據目的適當選擇。

<使用>

前述通讀誘導劑可以單獨使用,也可以和將其他成分作為有效成分的醫
藥品組合使用。另外,前述通讀誘導劑還可以以被包含到將其他成分作為有
效成分的醫藥品中的狀態來使用。

由于前述通讀誘導劑中含有阿貝卡星,所以如后述試驗例1~8中所示,
是一種毒性弱,且具有優異通讀活性的物質。

因此,前述通讀誘導劑可適用于治療無義突變型遺傳疾病。

<劑型>

作為前述通讀誘導劑的劑型,沒有特別限制,可以根據目的適當選擇,
例如可以使用液態狀、粉末狀、膠囊狀、片劑狀等劑型。采用這些劑型的前
述通讀誘導劑,可以按照通常的方法所制得。

<給藥>

前述通讀誘導劑的給藥方法,沒有特別限制,例如可以根據前述通讀誘
導劑的劑型等適當選擇,可以是口服給藥也可以是非口服給藥。

前述通讀誘導劑的給藥量也沒有特別限制,可以根據給藥對象個體的年
齡、體重、體質、癥狀、以及是否有以其他成分作為有效成分的醫藥品的給
藥等各項因素進行適當選擇。前述通讀誘導劑的給藥量,例如以前述結構式
(A)所表示的化合物(阿貝卡星)的量為基準,可以是0.1mg/kg/日~
300mg/kg/日,優選的給藥量為0.5mg/kg/日~50mg/kg/日。

前述通讀誘導劑的給藥時機,沒有特別限制,可以根據目的適當選擇。

作為前述通讀誘導劑的給藥對象的動物種類,沒有特別限制,可以根據
目的適當選擇,但以人類尤為適合。

關于前述通讀誘導劑的給藥,對事先從個體中采集的生物樣品中所包含
的基因進行檢查,檢查其中是否存在提前終止密碼子,優選對檢測出提前終
止密碼子的個體給藥。作為前述提前終止密碼子是否存在的檢查方法,沒有
特別限制,可以適當選擇常規方法,例如南方墨點法(Southern?blot)、聚合
酶鏈式反應(Polymerase?chain?reaction,PCR)、短串聯重復序列(short?tandem?
repeat,STR)、限制片段長度多態性(Restriction?Fragment?Length?
Polymorphisms,RFLP)等方法。

<無義突變型遺傳疾病的治療藥物>

本發明中的無義突變型遺傳疾病的治療藥物,至少含有前述的通讀誘導
劑,根據需要還可以含有其他成分。

<無義突變型遺傳疾病>

前述無義突變型遺傳疾病是由以下原因所導致的疾病:由于基因上的點
突變導致一個堿基被置換,使得在原來的翻譯終結部位的上游形成了提前終
止密碼子,由此,功能性的全長蛋白質的表達被阻礙,從而導致了該類疾病。

作為前述無義突變型遺傳疾病的具體例子,可以列舉:肌營養不良癥、
多發性硬化癥、嬰兒神經元蠟樣質脂褐素沉積病、阿爾茨海默病、泰-薩克斯
病、神經組織變性、帕金森綜合癥、慢性關節風濕病、移植物抗宿主病、關
節炎、血友病、血管性血友病、毛細管擴張性運動失調、地中海貧血、腎結
石、成骨不全癥、肝硬變、神經纖維瘤病、水皰性疾病、溶酶體性貯積病、
賀勒氏癥(粘多糖癥)、家族性膽固醇血癥、小腦運動失調癥、結節性硬化癥、
家族性紅細胞增多癥、免疫缺陷、腎臟病、肺疾病、囊胞性纖維癥、家族性
高膽固醇血癥、色素性視網膜病、淀粉樣變性(淀粉沉積癥)、動脈粥樣硬化
癥、巨人癥、侏儒癥、甲狀腺機能低下癥、甲狀腺機能亢進癥、老化、肥胖、
糖尿病、尼曼-匹克(Niemann-Pick)病(神經鞘髓磷脂病)、馬凡氏綜合癥、
癌癥等。其中,肌營養不良癥,特別是杜氏肌營養不良癥適合于作為研究病
例。

作為前述無義突變型遺傳疾病治療藥物中的前述通讀誘導劑的含量,沒
有特別限制,可以根據目的適當選擇。另外,前述無義突變型遺傳疾病的治
療藥物可以是前述通讀誘導劑本身。

<其他成分>

作為前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物中的其他成分,沒有特別限制,
可以根據目的適當選擇,例如在藥理學上能夠相容的載體等。

作為前述在藥理學上能夠相容的載體,沒有特別的限制,可以根據目的
適當選擇,例如乙醇、水、淀粉等。

作為前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物中前述其他成分的含量,沒有
特別限制,只要在不損害阿貝卡星的效果的范圍內,可以根據目的適當選擇。

<使用>

前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物可以單獨使用,也可以和將其他成
分作為有效成分的醫藥品組合使用。另外,前述無義突變型遺傳疾病的治療
藥物還可以以被包含到將其他成分作為有效成分的醫藥品中的狀態來使用。

由于前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物中含有前述通讀誘導劑,所以
如后述試驗例1~8中所示,是一種毒性弱,且具有優異通讀活性的藥物。

因此,前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物可適用于治療無義突變型遺
傳疾病。

<劑型>

作為前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物的劑型,沒有特別限制,可以
根據目的適當選擇,例如可以使用液態狀、粉末狀、膠囊狀、片劑狀等劑型。
采用這些劑型的前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物,可以按照通常的方法
所制得。

<給藥>

前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物的給藥方法,沒有特別限制,例如
可以根據前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物的劑型等適當選擇,可以是口
服給藥也可以是非口服給藥。

前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物的給藥量也沒有特別限制,可以根
據給藥對象個體的年齡、體重、體質、癥狀、以及是否有以其他成分作為有
效成分的醫藥品的給藥等各項因素進行適當選擇。前述無義突變型遺傳疾病
的治療藥物的給藥量,例如以前述結構式(A)所表示的化合物(阿貝卡星)
的量為基準,可以是0.1mg/kg/日~300mg/kg/日,優選的給藥量為0.5mg/kg/
日~50mg/kg/日。

前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物的給藥時機,沒有特別限制,可以
根據目的適當選擇。

作為前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物的給藥對象的動物種類,沒有
特別限制,可以根據目的適當選擇,但以人類尤為適合。

關于前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物的給藥,對事先從個體中采集
的生物樣品中所包含的基因進行檢查,檢查其中是否存在提前終止密碼子,
優選對檢測出提前終止密碼子的個體給藥。作為前述提前終止密碼子是否存
在的檢查方法,沒有特別限制,可以適當選擇常規方法,例如南方墨點法
(Southern?blot)、聚合酶鏈式反應(Polymerase?chain?reaction,PCR)、短串
聯重復序列(short?tandem?repeat,STR)、限制片段長度多態性(Restriction?
Fragment?Length?Polymorphisms,RFLP)等方法。

<治療方法>

前述無義突變型遺傳疾病的治療藥物由于含有前述通讀誘導劑,所以通
過給患有無義突變型遺傳疾病的個體施用,可以治療患有無義突變型遺傳疾
病的個體。因此,本發明也涉及以給個體施用前述無義突變型遺傳疾病的治
療藥物為特征的,治療患有無義突變型遺傳疾病的個體的治療方法。

實施例

通過列舉下述試驗例,對本發明進行具體說明,但是本發明不局限于這
些試驗例。

(試驗例1:通讀活性解析)

<通讀活性檢測用基因導入小鼠的制作>

為了解析生物體內的通讀活性,利用與國際公開WO2008/004610號
[0071]~[0083]段中記載的方法相同的方法,得到了通讀活性檢測用基因導入
小鼠(Readthrough?Evaluation?and?Assessment?by?Dual-reporter?mice,以下稱作
R.E.A.D.小鼠(R.E.A.D.マウス))。

前述R.E.A.D小鼠(R.E.A.D.マウス)中,含有將β-半乳糖苷酶基因和熒光
素酶基因連接起來、在其接點處插入提前終止密碼子(TGA)的構造(含有
mdx小鼠的外顯子23的提前終止密碼子前后12mer周邊序列的27mer)的具
備巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白雜合啟動子的表達載體(pCAGGS)被導
入到生殖細胞系。所制作出的R.E.A.D小鼠(R.E.A.D.マウス),正常時只能夠
表達β-半乳糖苷酶,通過通讀提前終止密碼子表達熒光素酶。

<通讀活性的評價>

給同母所生的3組雌性R.E.A.D.小鼠((8周齡的一組(7只),10周齡的
兩組(每組5只)),將下表1所記載的給藥化合物按照各自的給藥量,連續
7天進行皮下注射。

作為前述給藥化合物,使用阿貝卡星(以下稱為“ABK”)和慶大霉素
(以下稱為“GM”)。

前述阿貝卡星使用明治制果株式會社所提供的ABK粉末。另外,前述
慶大霉素作為比較用。

給藥是以采用生理鹽水(大塚制藥社制)對前述給藥化合物進行稀釋,
并給小鼠注射0.1mL的方式進行。

給試驗小鼠連續7天進行皮下注射后,從被摘出的肌肉組織提取液中,
使用熒光素半乳糖苷酶和熒光素,根據光度計測定β-半乳糖苷酶
(Beta-Galactosidase)的活性和熒光素酶(luciferase)的活性。將測定的熒光
素酶(luciferase)的活性除以β-半乳糖苷酶(Beta-Galactosidase)的活性所得
的值便是通讀效率。下表1中所記錄的是將施用慶大霉素時的通讀效率視為
1的情況下的相對通讀效率。

[表1]


從前述表1中的結果可以確認出阿貝卡星(ABK)具有通讀活性。并且,
通過與已知具有通讀活性的慶大霉素(GM)相比,確認出阿貝卡星的通讀活
性高于慶大霉素的通讀活性。

(試驗例2:毒性試驗)

利用10周齡的同母所生的R.E.A.D小鼠雄性、雌性各一組(每組3只),
按照下表2所記載的給藥量,作為阿貝卡星(ABK)使用明治制果株式會社
發售的哈貝卡星(阿貝卡星硫酸鹽)注射液(50mg/1mL),采用生理鹽水(大
塚制藥社制)稀釋后,每天注射0.2mL,連續7天進行皮下注射。

關于毒性,對7日間連續進行皮下注射的小鼠,測量其注射藥物前后的
體重,通過體重的增加率(6只的平均值)進行判斷。

另外,通讀效率和試驗例1相同,測定β-半乳糖苷酶(Beta-Galactosidase)
的活性和熒光素酶(luciferase)的活性,將前述測定的熒光素酶(luciferase)
的活性除以β-半乳糖苷酶(Beta-Galactosidase)的活性所得的值作為通讀效
率。下表2中所記錄的是將只施用生理鹽水時的通讀效率視為1的情況下的
相對通讀效率。

[表2]


ABK的給藥量為7.5mg/日時,給藥開始兩天后,一只死亡(體重:從
18.4g變為17.3g),給藥開始三天后,兩只死亡(體重:一只從21.0g變至19.0g,
另一只從19.3g變至18.2g)。

從前述表2的結果可以看出,阿貝卡星(ABK)的給藥量為7.5mg/日的
大劑量時,試驗小鼠死亡,但是當給藥量為能夠觀察到通讀活性的2.5mg/日
和5mg/日時,試驗小鼠的體重減少不大,可以被確認為毒性小。

另外,Development?of?Novel?Aminoglycoside(NB?54)with?Reduced?Tox?
icity?and?Enhanced?Suppression?of?Disease-Causing?Premature?Stop?Mutation
s.,J.Med.Chem.2009,52,2836-2845;Fujisawa,K.,Hoshiya,T.,Kawagu?
chi,H.,Aminoglycoside?antibiotics.VII.Acute?toxicity?of?aminoglycoside?a?
ntibiotics.,J.Antibiot.1974,27,677-681以及Kondo,S.,Hotta,K.,Semisyn?
thetic?aminoglycoside?antibiotics:Development?and?enzymatic?modifications.,
J.Infect.Chemother.1999,5,1-9的記載中顯示,給小鼠靜脈注射慶大霉素
時的LD50(50%致命劑量,Lethal?Dose)大約為76mg/kg,相對于該數值,
給小鼠靜脈注射阿貝卡星時的LD50大約為118mg/kg,由這一點也可知阿貝卡
星的毒性較弱。

(試驗例3:肌營養不良蛋白的表達)

給作為杜氏肌營養不良癥的模型動物的mdx小鼠(同母的雄性、雌性,
5月齡,n=8)給藥,所給藥物是用生理鹽水(大塚制藥社制)稀釋至1mg/0.1mL
的ABK粉末(明治制果株式會社提供),將該藥物連續兩周每天給試驗小鼠進
行皮下給藥。然后,將股直肌摘出并制成冷凍切片,以兔的多克隆抗肌營養
不良蛋白抗體(AbCam公司制造)作為第一抗體,對該切片進行免疫染色。

圖1所示為正常小鼠的根據抗肌營養不良蛋白抗體的免疫染色圖像,圖
2所示為正常小鼠的蘇木精(Hematoxylin)以及曙紅染色圖像,圖3所示為
只施用生理鹽水的mdx小鼠的根據抗肌營養不良蛋白抗體的免疫染色圖像,
圖4所示為只施用生理鹽水的mdx小鼠的蘇木精(Hematoxylin)以及曙紅染
色圖像,圖5所示為施用了ABK的mdx小鼠的根據抗肌營養不良蛋白抗體
的免疫染色圖像,圖6所示為施用了ABK的mdx小鼠的蘇木精(Hematoxylin)
以及曙紅染色圖像。

從圖1以及圖2所示可知,對于正常小鼠,體內有肌營養不良蛋白的表
達,肌肉組織的大小較整齊。而另一方面,從圖3以及圖4所示可知,對于
mdx小鼠,體內沒有肌營養不良蛋白的表達,肌肉組織的大小不整齊。

從圖5以及圖6所示可知,對于施用了阿貝卡星(ABK)的mdx小鼠,
體內有肌營養不良蛋白的表達,而且肌肉組織的大小較整齊。

由以上可以確定阿貝卡星是治療肌營養不良癥的有效藥物。

(試驗例4:前肢張力的測定)

按照下表3所記載的給藥量,給作為杜氏肌營養不良癥的模型動物的
mdx小鼠(同母的雄性、雌性,5月齡,n=8)給藥,所給藥物是用生理鹽
水(大塚制藥社制)稀釋的ABK粉末(明治制果株式會社提供),將該藥物連
續兩周每天以0.1ml的量給試驗小鼠進行皮下給藥。兩周后,測定了小鼠的
前肢張力。

前述的前肢張力是利用小動物握力測定裝置(測力計是日本計測系統株
式會社所制)來測定的。

下表3中所表示的,是將以體重校正了的正常小鼠的前肢張力計為100
的相對張力。

[表3]


從前述表3的結果可知,通過施用阿貝卡星(ABK),mdx小鼠的前肢
張力得到恢復。從而可以確定阿貝卡星是治療肌營養不良癥的有效藥物。

(試驗例5:握力的測定)

本試驗中使用了以下三種小鼠:(1)作為正常小鼠的B10小鼠(同母的
雄性、雌性,5個月齡,n=9);(2)作為杜氏肌營養不良癥的模型動物的
mdx小鼠(同母的雄性、雌性,5個月齡,n=9),將明治制果株式會社發售
的哈貝卡星(阿貝卡星硫酸鹽)注射液用生理鹽水(大塚制藥社制)稀釋,
并以1mg/日的量,連續三周每天給該mdx小鼠進行皮下給藥;(3)作為杜氏
肌營養不良癥的模型動物的mdx小鼠(同母的雄性、雌性,5個月齡,n=8)。

作為前述握力(Grip?Strength)的測定裝置,參考了小動物用的握力測定
裝置,是在市售的測力計(日本計測系統株式會社所制)上設置了長70mm、
寬55mm的不銹鋼金屬網而制成的。該測力計的精度為:±0.2%FS,反復精
度為:±0.1%FS,最大可以測定100N(10kgf),擁有0.01N(1gf)的1/10000
的分解能力,可以測定峰值。

小鼠的握力測定按如下操作進行測定。

將小鼠放于測定用的網上,用手沿水平方向拉小鼠的尾巴,測定直到前
述小鼠無法忍耐所受拉力從抓著的網脫離時的最大力(握力)。該握力的測定,
每隔兩分鐘測定一次,一共測定5次,取其平均值。另外,通過用體重去除
測定的握力將其標準化。

前述握力的測定結果用圖7表示。

圖7中,“B10”是作為正常小鼠的B10小鼠(前述(1))的結果,
“mdx-ABK”是施用了阿貝卡星的mdx小鼠(前述(2))的結果,“mdx”
是沒有施用阿貝卡星的mdx小鼠(前述(3))的結果。

從圖7的結果可以確認通過阿貝卡星的給藥,可以觀察到肌肉力量的改
善傾向。

(試驗例6:腓腸肌的強直張力的測定)

本試驗中使用了以下兩種小鼠:(1)作為杜氏肌營養不良癥的模型動物
的mdx小鼠(同母的雄性,4個月齡),將明治制果株式會社發售的哈貝卡星
(阿貝卡星硫酸鹽)注射液用生理鹽水(大塚制藥社制)稀釋,并以2.5mg/
日的量,連續三周每天給該mdx小鼠進行皮下給藥;(2)作為杜氏肌營養不
良癥的模型動物的mdx小鼠(同母的雄性,4個月齡)。

前述腓腸肌的強直張力的測定,是利用由個人電腦、AD/DA轉換器、電
極以及測力計構成的等長收縮張力測定系統,按照以下的操作進行。

首先,在戊巴比妥鈉麻醉下將小鼠的小腿三頭肌解剖出來,測量小腿三
頭肌的長度。

接著,將阿基里斯腱從踵骨部切掉,用棉線捆綁,裝在測力計上。同時,
在膝蓋處插入一支電刺激用的白金電極,通過診斷用神經肌肉電刺激裝置(日
本光電工業株式會社制)進行電刺激。

測定時,調整肌肉長(肌肉的長度)、刺激電壓量以獲得最大等長收縮張
力。等長收縮張力通過肌肉的橫截面積(通過肌肉重量、肌肉長、密度
1.06mg/mm3計算)標準化。

另外,為了防止小腿三頭肌表面干燥,在其表面上涂抹上生理鹽水。

前述腓腸肌的強直張力的測定,在顯示最大單收縮張力的刺激電壓
(0.5ms寬的短矩形波)的大小和肌肉的長度下,以80Hz~100Hz的頻率、
200ms破裂(burst)的狀態進行。另外,所測定的產生張力是根據肌肉的橫
截面積(通過肌肉重量、肌肉長、密度1.06mg/mm3計算)進行標準化的。

調節刺激電壓的大小(0V~20V)和肌肉的長度,使單發電刺激產生的
單收縮張力變得最大。另外,用千分尺測定肌肉的長度。

前述腓腸肌強直張力(Tetanus?Tension)的測定結果如圖8所示。

圖8中,“A”顯示的為施用了阿貝卡星的mdx小鼠的結果,“B”顯示
的為沒有施用阿貝卡星的mdx小鼠的結果。

從圖8的結果可以確認,通過阿貝卡星的給藥,能夠觀察到肌肉力量的
改善傾向。

(試驗例7:腓腸肌單收縮張力的測定)

本試驗中使用了以下三種小鼠:(1)作為杜氏肌營養不良癥的模型動物
的mdx小鼠(同母的雄性,4個月齡),將明治制果株式會社發售的哈貝卡星
(阿貝卡星硫酸鹽)注射液用生理鹽水(大塚制藥社制)稀釋,并以2.5mg/
日的量,連續三周每天給該mdx小鼠進行皮下給藥;(2)作為杜氏肌營養不
良癥的模型動物的mdx小鼠(同母的雄性,4個月齡),將明治制果株式會社
發售的哈貝卡星(阿貝卡星硫酸鹽)注射液用生理鹽水(大塚制藥社制)稀
釋,并以5mg/日的量,連續三周每天給該mdx小鼠進行皮下給藥;(3)作為
杜氏肌營養不良癥的模型動物的mdx小鼠(同母的雄性,4個月齡)。

前述腓腸肌單收縮張力的測定除了利用短脈沖寬度的電刺激之外,其他
都和前述腓腸肌強直張力的測定相同。

前述腓腸肌單收縮張力(Twitch?Tension)的測定結果如圖9所示。

圖9中,“C”顯示的為按照2.5mg/日的量連續三周進行阿貝卡星皮下給
藥的mdx小鼠(前述(1))的結果;“D”顯示的為按照5mg/日的量連續三
周進行阿貝卡星皮下給藥的mdx小鼠(前述(2))的結果;“E”顯示的為沒
有施用阿貝卡星的mdx小鼠的結果。

從圖9的結果可以確認,通過阿貝卡星的給藥,能夠觀察到肌肉力量的
改善傾向。

(試驗例8:來自DMD患者的培養肌細胞中的肌營養不良蛋白的表達)

<肌細胞的培養>

使用兩種(#919,#809,任何一種都是來自UAA無義突變患者的肌細
胞)來自無義突變型杜氏肌營養不良癥(DMD)患者的肌細胞,按照以下的
操作試驗來自DMD患者的培養肌細胞中的肌營養不良蛋白的表達。

利用明膠涂層的6孔板(IWAKI)在增殖培養液(含有20%胎牛血清(G?
ibco)、4%Ultrocer?G(Pall?Corporation)以及1%Antibiotic-Antimycotic(Gibco)
的杜爾貝科改良伊格爾最小必需培養液(DMEM,Sigma))中對前述來自患
者的肌細胞進行增殖。

為了使前述增殖細胞分化為肌管,在分化培養液(含有2%馬血清(Gibco)
的杜爾貝科改良伊格爾最小必需培養液(DMEM,Sigma))中培養2周。在
前述培養過程中,每2天交換一次培養液,并且要添加阿貝卡星(400μg/mL)。
另外,在未添加阿貝卡星時,只交換培養液。前述阿貝卡星是使用將由明治
制果株式會社發售的哈貝卡星(阿貝卡星硫酸鹽)注射液的濃度調整至前述
濃度的注射液。

<免疫印跡(Western?blot)>

前述培養結束后,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈細胞,然后采用1×細胞
裂解液(cell?signaling?technology)溶解并回收細胞。將前述回收的總蛋白質
(未添加阿貝卡星的細胞:60μg,添加阿貝卡星的細胞:30μg)在3-10%的
聚丙烯酰胺凝膠(PAGEL,ATTO株式會社)中進行電泳。將通過前述電泳
分離的蛋白質轉移至蛋白雜交膜HYBOND-P(通用電氣醫療集團,GE
Healthcare)。

免疫印跡是使用ECLAdvance?Western?Blotting檢測試劑盒(通用電氣醫
療集團,GE?Healthcare),按照制造商的操作說明書進行操作。所使用的抗肌
營養不良蛋白C端抗體,是將NCL-DYS2(Leica?Microsystems)稀釋10倍
的稀釋液,使用抗小鼠IgG(GE?Healthcare)檢測肌營養不良蛋白和抗肌營
養不良蛋白免疫復合體。

另外,按照同樣的方法,對結蛋白(Desmin)進行免疫印跡操作。所使
用的抗結蛋白抗體是將H-76(Santa?Cruz公司)稀釋50倍的稀釋液,使用抗
兔IgG(GE?Healthcare)檢測結蛋白一抗結蛋白免疫復合體。

前述免疫印跡的結果如表4以及圖10所示。

[表4]

根據肌營養不良蛋白/結蛋白的相對表達量


從表4以及圖10的結果可以看出,來自于UAA無義突變患者的兩種培
養細胞(#919,#809)中,肌營養不良蛋白的表達得到恢復。通過抑制提前
終止密碼子可以誘導肌營養不良蛋白的表達,使得在日常生活中因肌肉收縮
造成的肌肉損傷可以得到減輕。

產業上的利用可能性

本發明的通讀誘導劑,因含有阿貝卡星,毒性弱,通讀活性優異,所以
能夠適合用作無義突變型遺傳疾病的治療藥物。

并且,由于前述阿貝卡星是已獲得認可的治療MRSA感染癥的藥物,所
以本發明的治療無義突變型遺傳疾病的藥物,作為治療無義突變型遺傳疾病
的急需藥物,是非常適合的。

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