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蘇云金芽胞桿菌工程菌及其應用.pdf

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蘇云金芽胞 桿菌 工程 及其 應用
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摘要
申請專利號:

CN201310210953.6

申請日:

2013.05.31

公開號:

CN103266078B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 1/21申請日:20130531|||公開
IPC分類號: C12N1/21; C12N15/75; A01N47/44; A01P7/04; C12R1/07(2006.01)N 主分類號: C12N1/21
申請人: 中國農業科學院植物保護研究所
發明人: 賈艷華; 張杰; 束長龍; 王慶雷; 宋福平; 黃大昉; 彭琦
地址: 100193 北京市海淀區圓明園西路2號
優先權:
專利代理機構: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333 代理人: 胡敬紅
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310210953.6

授權公告號:

103266078B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.09.25|||2013.08.28

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及“蘇云金芽胞桿菌工程菌及其應用”,屬于生物防治領域。本發明將含有cry8Ga1基因的穿梭載體pSTK-8G導入受體菌株BIOT185中,得到重組菌株BIOT1858G。該重組菌株BIOT1858G對鞘翅目多發性害蟲暗黑鰓金龜、銅綠麗金龜、大黑鰓金龜等同時具有毒力,同時對幾種害蟲的毒力均有所提高。

權利要求書

權利要求書
1.   一株蘇云金芽胞桿菌工程菌,其特征在于:以菌株BIOT185為受體菌株,且轉入有cry8Ga1基因。

2.   根據權利要求1所述的蘇云金芽胞桿菌工程菌,命名為BIOT1858G,為將cry8Ga1基因導入受體菌株BIOT185而得到。

3.   權利要求1或2所述的蘇云金芽胞桿菌工程菌所表達的混合蛋白。

4.   權利要求2所述的蘇云金芽胞桿菌工程菌BIOT1858G的構建方法,將含有cry8Ga1基因的穿梭載體pSTK?8G導入受體菌株BIOT185中,得到重組菌株BIOT1858G。

5.   權利要求2所述的蘇云金芽胞桿菌工程菌BIOT1858G在殺滅鞘翅目害蟲中的應用。

6.   權利要求5所述的應用,為將工程菌BIOT1858G表達的混合蛋白制成殺蟲劑。

說明書

說明書蘇云金芽胞桿菌工程菌及其應用
技術領域
本發明涉及生物防治領域,特別是涉及一種廣譜殺蟲活性的蘇云金芽胞桿菌工程菌及其應用。
背景技術
蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細菌。在形成芽孢的同時,能產生由一種或幾種殺蟲晶體蛋白組成的伴孢晶體(parasporal crystal)。這種殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)又稱δ?內毒素(delta?endotoxin),對人畜無害,不污染環境,因而Bt在害蟲的生物防治中得到了最廣泛的應用。
迄今為止已有人從不同的Bt菌株中克隆了746種殺蟲晶體蛋白基因,根據殺蟲晶體蛋白氨基酸的同源性,可將他們分為75大類,分屬292種模式基因(http://www.biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。其中cry3A對鞘翅目葉甲科害蟲(如大猿葉甲[Colaphellus bowringi]和檢疫性害蟲馬鈴薯甲蟲[Leptinotarsa decemlineata]等)具有特異毒性,該基因編碼73kD的蛋白,可不依賴芽胞形成晶體,在昆蟲中腸液的作用下,被降解為55kD的毒性多肽(Krieg A,Huger AM,Langenbruch GA,et al.,1983Bacillus thuringiensis var.tenebrionis:ein neuer gegenuber larven von Coleopteren wirksamer pathotyp.Z.Ang.Entomol.,96:500?508)。cry8類基因對金龜子科、象甲科、葉甲科等多種鞘翅目害蟲具有殺蟲作用。目前已發現38種cry8類基因,編碼的蛋白由1160?1210個氨基酸組成,分子量在128?137kDa之間。用胰蛋白酶處理可生成60kD的毒性核心片段(Whiteley,HR and Schnepf HE,The molecular biology of parasporal crystal body formation in B.thuringiensis,Annu.Rev.Microbiol.,1986,40:549;Ibrahim MA,Griko N,Junker M,Bulla LA,Bacillus thuringiensis A genomics and proteomics perspective,Bioeng Bugs,2010,1(1):31?50.)。其中美國Mycogen公司分離的Cry8Aa1和Cry8Ba1對金龜科的多種害蟲具有明顯的殺蟲活性(Michaels TE,et al.,Bacillus thuringiensis toxins active against scarab pests,1994,USP5554534)。美國從Bt菌株中分離了兩種基因cry8Bb1和cry8Bc1基因,發現對西方玉米根葉甲(Diabrotica virgifera,Western corn rootworm)具有顯著的殺蟲效果,并已用于轉基因抗蟲玉米的開發(Abad AR,Duck NB,Feng X,Flannagan RD,Kahn TW,Sims LE.Genes encoding novel proteins with pesticidal activity againstco leopterans.2002.WO02/34774A2)。在我國篩選獲得了對黃褐麗金龜(Anomala exoleta)、銅綠麗金龜(A.corpulenta)、四紋麗金龜(Popillia quadriguttata)、蒙古麗全龜(A.mongolica)、和蘋毛麗金龜(Proagopertha lucidula)等害蟲幼蟲具有特異殺蟲活性的Bt菌株HBF?1(馮書亮等,《中國生物防治》,2000,16(2):74?78);《植物保護》2006,33(4):417?422)。中國農業科學院植物保護研究所在2003年首次從Bt185菌株中克隆到cry8類基因?cry8Ea1、cry8Fa1,該基因對暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela)具有高活力(Yu H,Zhang J,Huang D,Song F.Current Microbiology.2006,53:13–17)。隨后又從HBF?1中克隆到cry8Ca2基因(Shu C,Liu R,Wang R,Zhang J,Feng S,Huang D,Song F.2007.Current Microbiology.55:492–496)。2007年,從BtSU?4克隆到cry8Ha1、cry8Ia1(閆貴欣博士學位論文,2010),從HBF?18中克隆到cry8Ga1(Shu C,Yan G,Wang R,Zhang J,Feng S,Huang D,Song F,Characterization of a novel cry8 gene specific to Melolonthidae pests:Holotrichia oblita and Holotrichia parallela,Appl Microbiol Biotechnol.2009;84(4):701?707)。目前,cry8Ca2基因(專利號:ZL200410009807.8),cry8Ea1(專利號:ZL200410009808.2)、cry8Fa1(ZL200710090542.2)基因已經獲得國家發明專利保護,cry8G(專利號:ZL200710118289.7)和cry8H(專利號:ZL2007 10120020.2)。
為了擴大殺蟲譜,延緩昆蟲抗藥性,國內外科研人員利用生物工程的方法,構建了一些蘇云金芽胞桿菌工程菌。如美國Ecogen公司首次利用質粒結合轉移等細胞工程手段構建了含有cry3B和cry1Ca基因、對鱗翅目和鞘翅目害蟲有活性的Bt工程菌(Sick A,et al.,1990.Nucleotide sequence of a coleopteran?active toxin from a new isolate of B.t.subsp.tolworth.Nucl.Acids Res.18;Entwistle,P.F.,1993.An Environmental Biopesticide:Theory and Practice.Wiley Chichester Press.U.K.125?146.)。美國Mycogen(Frank.H.Gaertner.et al.Bacillus thuringiensis isolate.US Patent,NO.4910016.Mar.20,1990.)公司和Sandoz(Dimitri?Karamata.et al.Insecticidal hybrid bacteria from B.t.subsp.kustaki and B.t.subsp.tenebrionis.US Patent NO.4797279.Jan10,1989.)公司用上述同樣的方法研制出MT104和B?18013,分別用于粉紋夜蛾、甜菜夜蛾和馬鈴薯甲蟲的防治。
在我國,大量調查表明,蠐螬在地下害蟲中的危害居首位,其中主要以鰓金龜科和麗金龜科幼蟲為主,占總地下害蟲量的70?80%以上。據統計每年全國蠐螬發生面積約1億畝,嚴重年份曾達3億2千萬畝,產量損失高達20%以上,有些地塊甚至絕產(許婷婷、江晨、宮清軒,陳金鳳,曲明凈.青島市花生田蠐螬發生與無公害防治研究花生學報,2010,39(1):42?44.)。2007年8月中下旬在山東省菏澤地區挖查,蠐螬蟲口密度平均為8.7頭/m2,最高達22頭/m2(王愛東。農田蠐螬發生及綜合防治技術,現代農業科技。2008),主要種類有暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela)、銅綠麗金龜(Anomala corpulenta)、華北大黑鰓金龜(H.oblita);草坪受到蠐螬為害時,輕者部分植株變黃,嚴重時植株枯死,在北京地區,為害最嚴重的蠐螬蟲口密度平均為118頭/m2,最高205頭/m2,其中黃褐麗金龜、銅綠麗金龜和華北大黑鰓金龜幼蟲數量占90%以上(羅晨,郭曉軍,張芝利。京郊草坪蠐螬的種類和為害特點。昆蟲學報,2008,51(1):108?112.)。近年發生面積最大、發生量最多的為黃淮海地區,主要危害糧食、油料等作物;其它地區的危害情況也很嚴重,如危害甘蔗的蠐螬,在廣東、廣西、云南、四川、福建等地普遍發生;在西藏、青海、甘肅、新疆等西部地區,蠐螬的發生也很嚴重(魏鴻鈞等,《中國地下害蟲》,上海:上海科學技術出版社,1989,1?41;王永祥等,“冀中平原區蠐螬種類及綜合防治技術”,《河北師范大學學報》(自然科學版),1998,22(2):268?270)。我國多年來為控制蠐螬的危害,一般采用農業、化學、物理等綜合防治策略,在一定程度上起到了積極的作用,已經將這類害蟲危害控制在較低水平。自2005年起,國內高毒力、高殘留劇毒化學農藥相繼禁用,使得地下害蟲的防治面臨新的問題,蠐螬從過去為害較輕的次要害蟲逐漸發展成主要害蟲,在局部地區猖獗危害,直接威脅到我國糧食、油料等作物的安全生產。
目前我國油料作物中種植面積居第二位的花生,占世界花生總產量的35%左右,居世界首位,年出口收入達207億美元,僅2011年全國花生種植面積達到470萬公頃,總產量為1434萬噸。隨著近兩年來全球糧油價格飛漲,花生等重要油料作物的高產穩產是關系到社會穩定、糧食和食品安全的頭等大事。當前對花生生產威脅最大的就是蟲害-蠐螬,直接造成減產和影響花生籽粒品質,危害十分嚴重,而且在大田中存在多種蠐螬混發的現象。因此,開辟新的有效防治途徑,已成為當務之急。cry8G對大黑鰓金龜具有殺蟲活性,cry8C對銅綠麗金龜有殺蟲活性,本課題組將含cry3A基因的穿梭質粒pSTK?3A轉入含cry8C基因的野生菌株HBF?1中,獲得工程菌3A?HBF,該工程菌不但獲得了對馬鈴薯甲蟲、大猿葉甲和銅綠麗金龜的殺蟲活性,而且對大猿葉甲和銅綠麗金龜的活性有約2倍的提高,推測這兩種基因具有協同增效作用(Yan GX,Song FP,Shu CL,Liu JJ,Liu CQ,Huang DF,Feng SL,Zhang J.(2009)An engineered Bacillus thuringiensis strain with insecticidal activity against Scarabaeidae(Anomala corpulenta)and Chrysomelidae(Leptinotarsa decemlineata and Colaphellus bowringi).Biotechnol Lett.31:697–703.)。本實驗室分離篩選的Bt野生菌株Bt185含有對鞘翅目暗黑鰓金龜良好殺蟲活性的cry8Ea基因,通過同源重組的方法,將對銅綠麗金龜有良好殺蟲活性的cry8Ca基因轉到Bt185中,得到了工程菌株BIOT185,由于cry8Ca基因對cry8Ea的協同增效作用,使得該菌株對暗黑鰓金龜的殺蟲活性增加了12.4倍(Liu J,Yan G,Shu C,Zhao C,Liu C,Song F,Zhou L,Ma J,Zhang J,Huang D.Construction of Bacillus thuringiensis engineered strain with high toxicity and broad pesticidal spectrum against coleopteran insects.Appl Microbiol Biotechnol.2010,87(1):243?249),本研究將在此基礎之上,通過基因重組技術,導入新的殺蟲基因,拓寬其殺蟲譜,提高殺蟲毒力,具有非常廣闊的應用前景。
發明內容:
本發明的目的是發現可以提高殺蟲毒力和擴大殺蟲譜的有效的殺蟲蛋白和基因組合,以獲得毒力更高、殺蟲譜更寬的蘇云金芽胞桿菌工程菌制劑(即Bt產品),并期望能有效延緩害蟲對其產生抗藥性。
一株蘇云金芽胞桿菌工程菌,其特征在于:以菌株BIOT185為受體菌株,且轉入有cry8Ga1基因。
上述蘇云金芽胞桿菌工程菌,命名為BIOT1858G,為將cry8Ga1基因導入受體菌株BIOT185而得到。
上述蘇云金芽胞桿菌工程菌所表達的混合蛋白。
上述工程菌BIOT1858G的構建方法,將含有cry8Ga1基因的穿梭載體pSTK?8G導入受體菌株BIOT185中,得到重組菌株BIOT1858G。
上述工程菌BIOT1858G在殺滅鞘翅目害蟲中的應用。
所述的應用為將工程菌BIOT1858G表達的混合蛋白制成殺蟲劑。
因蘇云金芽胞桿菌野生菌株Bt185(其本身帶有cry8Ea1基因)對鞘翅目害蟲暗黑鰓金龜有較高毒力,其獲得cry8Ca2基因后的工程菌菌株BIOT185對鞘翅目害蟲暗黑鰓金龜和銅綠麗金龜同時有高毒力。本發明將cry8Ga1轉入BIOT185后篩選得到的工程菌BIOT1858G對鞘翅目多發性害蟲暗黑鰓金龜、銅綠麗金龜、大黑鰓金龜同時具有高毒力。
附圖說明
圖1.BIOT1858G中cry8Ga基因的PCR鑒定
圖2.來源于BIOT1858G的cry8G的Southern Blotting結果
圖3.cry8基因在工程菌BIOT1858G中的表達
圖4.掃描電子顯微鏡下觀察到的晶體形態
圖5.cry8基因在工程菌BIOT1858G中的RT?PCR結果
圖6.工程菌BIOT1858G與對照菌株BIOT185、Bt185的生長曲線
圖7重組質粒pSTK?8C的電泳鑒定圖,
圖8重組質粒pSTK?8G的電泳鑒定圖。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明。
發明的整個技術方案的概括:
1.大腸桿菌JM110熱擊感受態的制備
為了獲得含有外源基因的大腸桿菌轉化子,制備大腸桿菌的熱擊轉化感受態細胞(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.1989.Molecular cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbour Lab.,Cold Spring Harbour,NY)。采用熱擊轉化的方法轉化大腸桿菌受體菌細胞,以獲得更多的含有外源基因的轉化子。
2.大腸桿菌電擊感受態的制備
為了提高大腸桿菌SCS110的轉化效率,制備SCS110的電擊轉化感受態細胞(Sambrook J,Fritsch,EF,and Maniatis T.1989.Molecular cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbour Lab.,Cold Spring Harbour,NY),采用電擊轉化的方法轉化SCS110受體細胞,以去除外源基因中甲基化的影響,同時獲得更多的含有外源基因的轉化子。
3.Bt電擊感受態的制備
為了提高Bt的轉化效率,制備Bt的電擊轉化感受態細胞(Sambrook J,Fritsch E F,and Maniatis T,1989.Molecular cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbour Lab,Cold Spring Harbour,NY),采用電擊轉化的方法轉化Bt受體菌細胞,以獲得更多的含有外源基因的轉化子。
4.工程菌的檢測
PCR檢測和測序檢測:用特異PCR引物,以得到的Bt轉化子為模板,進行PCR擴增,檢測工程菌中是否含有外源cry8Ga1基因(圖1)并進行測序驗證(見table2)及Southern blot驗證分析(圖2)。
SDS?PAGE檢測:將得到的工程菌菌株進行SDS?PAGE檢測,觀察工程菌中cry8Ga基因和cry8Ea1、cry8Ca2表達變化情況(圖3)。SDS?PAGE方法參見分子克隆實驗指南(J.薩姆布魯克.分子克隆實驗指南(第二版)(金冬雁等).北京:科學出版社,1992)。
掃描電鏡檢測:通過掃描電鏡觀察工程菌形成伴孢晶體的情況,從而檢測外源蛋白在工程菌中的表達情況,由圖中可以看出導入cry8基因能夠產生正常的球形晶體(圖4)。
生長情況觀察:將得到的工程菌菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養基中,按固定的時間間隔取樣,觀察工程菌株與受體菌株之間細胞生長情況的變化(圖6)。
工程菌的遺傳穩定性:采用連續培養法(Wang G,Zhang J,Song F,Wu J,Feng S,Huang D.Engineered Bacillus thuringiensis G033A with broad insecticidal activity against lepidopteran and coleopteran pests.Appl Microbiol Biotechnol(2006)72:924–930)測定工程菌的遺傳穩定性,證明工程菌中含有外源cry8Ga基因的可以穩定遺傳(表1)。
5.工程菌殺蟲活性研究
將工程菌BIOT1858G、受體菌株BIOT185及野生菌株Bt185、HBF?18制成粉劑,確定粉劑中活孢子的數量以及晶體蛋白的含量。然后將粉劑稀釋成不同的濃度,測定工程菌株對鞘翅目害蟲暗黑鰓金龜、銅綠麗金龜及大黑鰓金龜的活性(表2、3、4、5)。
以下是本發明的實施例,這些實施例只對本發明舉例說明。在實施例中,盡管詳細描述了不同基因的組合,但本發明的基因組合并不限于對Bt菌株進行轉化和用于生產對上述害蟲有抗性的Bt工程菌。
以下所用材料包括載體,野生菌株,工程菌均為公開的產品,本申請人實驗室均有保藏,可以對外公開發放。
實施例1 大腸桿菌SCS110電感受態的制備
挑取單菌落于5ml LB震蕩37℃培養過夜。按1%接種量接種于100ml LB液體培養基中,37℃,230rpm培養2hrs(OD600=0.5)。4℃,4000rpm離心6min。棄上清,加入預冷的超純水沖洗兩次。加入預冷的超純水懸浮細胞。4℃,9000rpm離心6min,回收細胞。加入預冷的超純水洗兩次,加入10%甘油1?2ml重新懸浮細胞,分裝,?70℃保存備用。
實施例2 Bt電擊感受態的制備
挑取單菌落于5ml LB震蕩30℃培養過夜。按1%接種量接種于100ml BH液體培養基中,37℃,230rpm培養3?4hr(OD600=2.0)。4℃,9000rpm離心6min。棄上清,加入預冷的超純水洗兩次。加入預冷的超純水懸浮細胞,4℃,9000rpm離心6min,回收細胞。加入預冷的超純水洗兩次,加入40%PEG重懸細胞,分裝,?70℃保存備用。
實施例3 Bt質粒DNA提取
接菌于5mL液體LB培養基試管中30℃,230rpm活化。按1%接菌量接菌于三角瓶中37℃,230rpm震蕩培養4h左右(OD600=2.0)。5,000rpm,5min離心收集菌體。每100mL菌液加1.5mLSI(10%蔗糖,50mM Tris·Cl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0)Lysozyme20mg/ml,(用時現配),混勻,37℃放置2?4h。每100mL菌液加13.5mL SII(10mM Tris·Cl,1mM EDTA,0.085MNaOH,1.1%SDS用時現配),輕輕混勻,放置10min。每100mL菌液加7.5mL SIII(5M KAc,用冰乙酸調至pH4.8),輕輕混勻,0℃放置4h上。12,000rpm離心5min,取上清,加入等體積異丙醇,?20℃放置30min以上。12,000rpm離心5min,棄上清,沉淀用70%乙醇漂洗。將沉淀在真空干燥器中干燥后用3mL超純水溶解。加入50μl RNase,37℃作用2h,除去RNA。酚、氯仿抽提后,補水至10mL,加入1/103M NaAC和2倍體積無水乙醇,?20℃沉淀2h。12,000rpm離心5min,棄上清,沉淀用70%乙醇漂洗。將沉淀在真空干燥器中干燥后用1mL超純水溶解。
實施例4 大腸桿菌熱擊感受態細胞制備及轉化
挑取單菌落于5ml LB震蕩培養過夜;按1%接種量接種于LB液體培養基中,37℃,230rpm培養2?2.5hr,(OD600=0.5?0.6);4℃,4000rpm離心10min;棄上清,加入預冷的0.1M CaCl250ml懸浮細胞,置于冰上30min以上;4℃,4000rpm離心10min,回收細胞;用2?4ml冰預冷的0.1M CaCl2重懸細胞,分裝成200μL/0.5mL離心管中,于4℃保存,一周內用完。
E.coli的轉化:將200μL感受態細胞與要轉質粒混勻,冰浴30min,42°C熱擊1.5min,冰浴3min,加入800μL LB培養基37°C培養60min,取200μL涂板,37°C培養。
實施例5 大腸桿菌質粒DNA提取
離心收集菌體,用250μL SI懸浮,加入SII250μL,翻轉混勻,加入SIII350μL,迅速混勻,12000rpm離心10min,取上清倒入質粒提取試劑盒中的柱子里,柱子下面接有1.5ml的離心管,12000rpm離心1min,棄去離心液,在柱子里加500μLW1,12000rpm離心1min,棄去離心液,在柱子里加700μLW2,12000rpm離心1min,棄去離心液,700μLW2,12000rpm離心1min,棄去離心液,加適量ddH2O水,離心1min,獲得質粒溶液。
實施例6 cry8Ga基因在Bt中的表達
用含有cry8Ga基因的穿梭載體pSTK?8G轉化大腸桿菌SCS110,用卡那霉素進行篩選,得到轉化子,從中提取重組質粒,然后電擊轉化Bt自然菌株BIOT185,利用卡那霉素抗性篩選轉化子,得到工程菌BIOT1858G。PCR檢測和測序檢測:用P8GF/P8GR(表6)為引物,以得到的Bt轉化子為模板,進行PCR擴增,結果表明工程菌可以擴增出3.5kb的DNA條帶,證明其中含有cry8Ga基因,圖1為PCR鑒定結果;同時將PCR結果送樣測序,結果表明得到的序列為cry8Ga,證明cry8Ga已經成功重組到BIOT185中,以為P8G?F/P8G?R(表6)引物,擴增出365bps做探針,進行Southern blotting,圖2為Southern blotting驗證分析結果圖,結果顯示正確。
SDS?PAGE檢測:將得到的工程菌菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養基中,230rpm,30℃培養。在36小時取樣,將樣品進行處理后,進行SDS?PAGE檢測,觀察工程菌中cry8基因表達變化情況(圖3)。樣品處理方法:將所取樣品離心,收集菌體,菌體沉淀中加入100μl超純水和50μl3×Sample Buffer混勻,煮沸5分鐘,備用。SDS?PAGE方法參見分子克隆實驗指南(J.薩姆布魯克.分子克隆實驗指南(第二版)(金冬雁等)。北京:科學出版社,1992)。結果表明Bt185、BIOT185和BIOT1858G均表達約140kDa的蛋白帶;表明Cry8蛋白在受體菌株中可以正常表達(圖3)。
掃描電鏡檢測:將得到的工程菌菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養基中,230rpm、30℃培養;約36小時后,離心,棄上清,將沉淀重懸于無菌水中;同時將蓋玻片粘在載物臺上,然后將孢晶混合物涂在蓋玻片上,用無水乙醇逐級脫水、干燥,鋨酸固定,噴金;掃描電子顯微鏡下觀察晶體的形態。結果證明在BIOT1858G中可以形成球形晶體。圖4為掃描電鏡下的觀察結果。
RT?PCR檢測:將得到的工程菌菌株接種于LB培養基中,230rpm、30℃培養;在T?1,T0,T2,T4,T20and T30不同時間段取樣1ml,利用TRI試劑盒提取RNA,并在提取完畢后用DNAase I在37℃處理半個小時,電泳檢測RNA,并進行下一步的反轉錄PCR,每個樣品取500ng,以p8rtR為引物按照反轉錄試劑盒說明進行反轉錄,反轉錄的cDNA用于cry8類基因的擴增,cry8C基因所用引物為p8cF/p8rtR(表6),擴增大小為167bps;cry8E基因所用引物為p8eF/p8rtR(表6),擴增大小為305bps;cry8F基因所用引物為p8fF/p8rtR(表6),擴增大小為439bps;cry8G基因所用引物為p8gF/p8rtR(表6),擴增大小為440bps(圖5)。
生長情況觀察:將得到的工程菌菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養基中,230rpm、30℃培養,每2小時取樣,在紫外分光光度計下測定OD600值,觀察細胞生長變化。比較了Bt185、BIOT185和BIOT1858G的生長曲線,發現cry8G基因導入工程菌菌株BIOT185中,對它的生長速率沒有顯著的影響。圖6為它們的生長曲線。
實施例7 工程菌的遺傳穩定性
采用連續培養法(Guangjun Wang.Jie Zhang.Fuping Song.Jun Wu.Shuliang Feng.Dafang Huang Engineered Bacillus thuringiensis GO33A with broad insecticidal activity against lepidopteran and coleopteran pests.Appl Microbiol Biotechnol(2006)72:924–930)測定工程菌的遺傳穩定性,將待測菌株接種在含有抗生素的LB液體培養基中30℃振蕩培養過夜,以1%的接種量轉接至無抗生素的LB液體培養基中,30℃連續振蕩培養,于24、36、48、60、72、84、96hrs取樣,按菌濃度稀釋107?109倍,并分別取100ul稀釋液涂布于沒有選擇壓的LB平板上,30℃培養30?40hrs,待長出單菌落后,挑取500個單菌落于卡那霉素的LB平板上,30℃培養30?40hrs,計算陽性菌落數。重復三次。

實驗結果表明,在無抗性的培養基中培養96小時后工程菌的遺傳穩定性仍為100%(表1)。
表1工程菌中cry8G基因的遺傳穩定性

實施例8 無晶體芽胞工程菌的構建及檢測
含cry8C基因的Bt工程菌HD8C的構建
將含有cry8C基因的重組質粒pSTK?8C通過電擊轉化導入大腸桿菌SCS110,用卡那霉素篩選陽性轉化子;從得到的轉化子中提取重組質粒pSTK?8C,然后電擊轉化無晶體突變株工程菌菌株HD73?,同樣利用卡那霉素抗性篩選轉化子,得到工程菌株HD8C。以pSN5un8/pSN3un8(表6)為引物,以卡那霉素篩選陽性轉化子為模板,進行PCR擴增,擴增產物用DraI/KpnI酶切,電泳鑒定圖見圖7。
含cry8G基因的Bt工程菌HD8G的構建
將含有cry8G基因的重組質粒pSTK?8G通過電擊轉化導入大腸桿菌SCS110,用卡那霉素篩選陽性轉化子;從得到的轉化子中提取重組質粒pSTK?8G,然后電擊轉化無晶體突變株工程菌菌株HD73?,同樣利用卡那霉素抗性篩選轉化子,得到工程菌株HD8G。以P8G?F/P8G?R(表6)為引物,以卡那霉素篩選陽性轉化子為模板,進行PCR擴增,電泳鑒定圖見圖8。
實驗9 工程菌殺蟲活性研究
將工程菌BIOT1858G、出發菌株BIOT185以及對照菌株Bt22、Bt185進行牛肉膏蛋白胨培養基搖瓶培養,然后將培養液進行離心,收集菌體,菌體經過低溫干燥制成粉劑。檢測粉劑中活孢子的數量為107cfu/mg(colony form unit/mg)(表2),SDS?PAGE電泳檢測粉劑中晶體蛋白的含量為BIOT185中140kD的蛋白為16.23%,BIOT1858G中140kD的蛋白為17.22%。將粉劑稀釋成不同的濃度,采用拌土法,在室內來測定工程菌株對鞘翅目害蟲暗黑鰓金龜、銅綠麗金龜以及大黑鰓金龜的殺蟲活性。14天后調查工程菌對三種害蟲的殺蟲效果。生測結果表明受體菌株Bt185對暗黑鰓金龜具有較高的殺蟲活性,LC50為11.80×107(8.40?13.9×107)cfu/g干土(表3),對銅綠麗金龜有一定的殺蟲活性,LC50為1.73×108(1.07~2.32×108)cfu/g干土(表4);工程菌株BIOT185不僅對暗黑鰓金龜具有很高的毒力,同時對銅綠麗金龜具有較高的毒力,LC50分別為1.20×107(0.56?1.85×107)cfu/g干土、1.66×107(1.08~2.48×107)cfu/g干土(表3、4、5)。而工程菌株BIOT1858G同時對暗黑鰓金龜、銅綠麗金龜及大黑鰓金龜三種種鞘翅目害蟲具有很高的毒力,LC50分別為1.09×107(0.35?2.01×107)cfu/g干土、0.83×107(0.59~1.14×107)cfu/g干土、4.33×108(3.41~6.80×108)cfu/g干土(表3、4、5)。Cry8C在無晶體突變株HD73?里表達,對銅綠麗金龜的LC50為2.86×107(1.21?3.32×107)cfu/g干土(表4);Cry8G在無晶體突變株HD73?里表達,對大黑鰓金龜的LC50為67.85×108(26.63~173.26×108)(表5);
實驗表明,基因cry8Ga1在工程菌BIOT1858G中的殺蟲效果比重組菌株HD8G的殺蟲效果要好,這表明,在工程菌中除了基因擴大了殺蟲譜外,菌株Bt185中還存在影響cry8Ga1殺蟲活性活性因子。
表2各Bt工程菌菌粉中芽胞含量

表3BIOT1858G在室內對暗黑鰓金龜的殺蟲活性

表4BIOT1858G在室內對銅綠麗金龜的殺蟲活性

表5BIOT1858G在室內對大黑鰓金龜的殺蟲活性

表6引物序列

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