鬼佬大哥大
  • / 22
  • 下載費用:30 金幣  

解淀粉芽孢桿菌植物亞種B01及其應用.pdf

關 鍵 詞:
淀粉 芽孢 桿菌 植物 B01 及其 應用
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201310225053.9

申請日:

2013.06.06

公開號:

CN103289933B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 1/20申請日:20130606|||公開
IPC分類號: C12N1/20; C02F3/34; A23K1/16; C12R1/07(2006.01)N 主分類號: C12N1/20
申請人: 揚州大學
發明人: 孫鎮平; 李佳
地址: 225009 江蘇省揚州市大學南路88號
優先權:
專利代理機構: 南京知識律師事務所 32207 代理人: 盧亞麗
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201310225053.9

授權公告號:

103289933B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.10.16|||2013.09.11

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及涉及微生物領域,具體涉及一種解淀粉芽孢桿菌及其應用。所述的解淀粉芽孢桿菌是解淀粉芽孢桿菌植物亞種B-01,它的保藏號為CCTCC:M2012191。該菌株可作為水環境生態凈化劑,用于凈化。本發明菌株能夠在低溫條件下保持較高的酶活力特性,能夠在我國大多數環境溫度較低地區發揮較好的生物學作用。

權利要求書

權利要求書
1.   解淀粉芽孢桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B?01菌株,它的保藏號為CCTCC:M2012191。

2.   權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種B?01菌株作為水環境生態凈化劑的應用。

3.   權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種B?01菌株作為動物微生物飼料添加劑的應用。

說明書

說明書解淀粉芽孢桿菌植物亞種B?01及其應用
技術領域
本發明涉及微生物領域,具體涉及一種解淀粉芽孢桿菌及其應用。
背景技術
解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens,BA)是目前農業部令(2008年1126號)酶制劑類飼料添加劑所允許使用的益生菌種類,但該菌在農業部令動物微生物飼料添加劑欄目中尚未列出。研究表明該菌作為益生菌可調控動物消化道微生態環境,抑制有害菌,改善機體代謝功能,目前國家保種中心提供的此類菌種適宜生長溫度通常為28?35℃左右,在低溫水體環境條件下,由于相關酶系活力較低,極大的抑制了益生菌類生物學功能的發揮,目前該菌類主要用于酶制劑的生產,在水質凈化中尚未涉及。
發明內容
為了解決現有B?01解淀粉芽孢桿菌在低溫下酶活性較低的問題,本發明從我國北方地區?35℃的寒冷環境中的稗草中分離、純化、培育到一株低溫高活性菌株并保種,與目前國家保種中心現存的相關菌種具有不同的生物學特性,有效地解決了現在技術存在的不足。
本發明所述解淀粉芽孢桿菌菌株與中國工業微生物菌種保藏管理中心等國家保藏機構現存菌種來源及生物學特性不同,具有耐低溫特性,18℃條件下生長良好。在中國工業微生物菌種保藏管理中心進行菌種分類鑒定,明確鑒定B?01為解淀粉芽孢桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum),由中國工業微生物菌種保藏管理中心進行了遺傳穩定性試驗,證明該菌株性狀可穩定遺傳。其保藏編號是CCTCC:M2012191
本發明所述B?01解淀粉芽孢桿菌植物亞種在水質凈化中能夠發揮較高的生物學活性。該菌在18℃偏低溫條件下生長良好,該菌所分泌的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶均具有較高的酶活力,在富營養低水溫環境中可將大分子有機物降解為小分子物質,一方面可反哺益生菌,另一方面可被水生動、植物直接利用,有助于水體環境的生態修復。該菌株作為水質凈化劑,能夠有效降解水體中的大分子有機物(蛋白質、糖類、脂肪),降低化學需氧量(COD)、氨氮、亞硝酸鹽、,提高氧容量(DO)、改善pH、濁度、懸浮物含量等指標。
B?01解淀粉芽孢桿菌可作為新型水環境益生菌生態凈化劑以及新型動物微生物飼料添加劑應用。
與現有的解淀粉芽孢桿菌相比,本發明菌株能夠在低溫條件下保持較高的酶活力特性,能夠在我國大多數環境溫度較低地區發揮較好的生物學作用。本發明菌株能夠有效的降解環境水體中過度營養化的有機物質,將大分子有機物降解為水生動植物能夠利用的小分子物質,變廢為寶,作為水環境生態凈化劑。這對于緩解當前日趨惡化的水資源環境,凈化畜牧業養殖水體及生活河流環境的生態修復,營造綠色安全的生活、生產水環境,具有積極的社會學意義和經濟學價值。此外,該菌株也可作為動物微生物飼料添加劑應用于畜牧養殖業,作為抗生素替代品應用,可為緩解抗生素濫用現狀發揮重大作用。
附圖說明
圖1  培養條件的正交試驗設計中不同條件細菌數隨時間變化圖。
圖2  益生菌液體發酵活菌數隨時間變化圖。
圖3  益生菌液體發酵pH隨時間變化圖。
圖4  益生菌液體發酵脫氫酶活力隨時間變化圖。
圖5  是本發明解淀粉芽孢桿菌植物亞種B?01菌株場發射掃描電鏡照片。2萬倍S4800場發射掃描電鏡照片,細菌長0.8?3um,寬0.6um。
圖6  是本發明解淀粉芽孢桿菌植物亞種B?01菌株油鏡下照片
注:NA培養基,37℃,培養1天,菌體形態:桿狀,0.5μm×2.0~2.67μm,單個、成對或柵欄狀排列,革蘭氏陽性。
圖7  是本發明解淀粉芽孢桿菌植物亞種B?01菌株瓊脂培養菌落照片
注:NA培養基,37℃,培養1天,菌落形態:乳白色,不規則形,表面皺褶、粗糙,半透明,邊緣不整齊。
圖8  18℃淀粉酶(AMS)活力隨時間變化圖。
圖9  18℃脂肪酶(LPS)活力隨時間變化圖。
圖10  18℃蛋白酶活力隨時間變化圖。
圖11  18℃細菌數隨時間變化圖。
圖12  實驗室益生菌水質凈化效果圖(實驗前)
注:未加益生菌的富營養水對照瓶。
圖13  實驗室益生菌水質凈化效果圖(實驗后)
注:加入2%B?01解淀粉芽孢桿菌的富營養水試驗瓶。
圖14  大量水池污水(210m3)益生菌水質凈化(實驗前)。
圖15  大量水池污水(210m3)益生菌水質凈化(實驗后)。
圖16  B?01菌株與相關種的16SrDNA序列系統發育樹。
圖17  B?01與相關種的gyrA基因序列系統發育樹。
圖18  B?01菌株(第1批)與相關種的gyrA基因序列系統發育樹。
圖19B?01菌株(第1批連續傳代5次后菌株)與相關種的gyrA基因序列系統發育樹。
本發明解淀粉芽孢桿菌植物亞種B?01(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum B?01),于2012年5月30日保藏于位于中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心,它的保藏號為CCTCC NO:M2012191。
具體實施方式
實施例一菌株的篩選
1.1菌株的分離,篩選,純化過程
選取我國北方地區?35℃的寒冷環境中的稗草、麻草、羊草各1克接種于生理鹽水中浸泡2h,取2mL浸泡液接種于100mL刺激芽孢生長培養液(蛋白胨10g,酵母膏3g,淀粉3g,MgSO40.1g,KH2PO41.5g,Na2HPO42g蒸餾水1000mL,pH7.8,121℃滅菌20min)18℃培養至有白色菌絲長出。
取菌懸液于80℃水浴15min(殺死不產芽孢菌體),選取菌懸液10倍稀釋平板涂布于芽孢分離培養基(蛋白胨5g,葡萄糖5g,酵母膏5g,K2HPO44g,3.08%MnSO41mL,瓊脂18g,蒸餾水1000mL,pH自然)18℃培養至有單個菌落長出。
挑選低溫條件下生長狀態良好的菌落,染色觀察,菌落低溫純化培養,命名為B?01。
2.1營養底物正交設計試驗
以保證最佳培養條件進行培育。采用活菌數作為培養狀態的評定指標。
正交設計見表1:接種B?01菌液量為30%+70%培養液(重量百分比)
表1正交試驗設計方案

按照能量、蛋白質和礦物質的不同含量,應用金牧軟件設計出配方如表2:
表2正交試驗方案(9種優化處理)

按照表設計的營養標準配方,應用金牧軟件設計出原料配方如表:
表3.9組原料營養配方

注:上述9組配方中均按表4添加小料
表4添加小料配方
各配方組均添加小料:MgSO4MnSO4K2HPO4合計重量百分比(%)0.150.010.110.27
正交設計不同影響因素間的比較,各試驗組合菌落數見表5。
表5正交試驗設計測定結果

表6正交試驗設計單因素統計

從表6直觀分析,各因素水平的優劣順序是:A1>A2>A3,B1>B2>B3,C2>C3>C1。
表7正交試驗設計方差分析結果
方差來源離均差平方和自由度均方F值P值能量(A)353.0182176.50945.8080.021粗蛋白(B)995.7042497.852129.2050.008礦物質(C)23.341211.6703.0290.248誤差7.70623.853  總變異1379.7698   
從表7的方差分析結果可見,粗蛋白(B)對菌落數有極顯著性影響(P<0.001);能量(A)對菌落數有顯著性影響(P<0.005);礦物質對菌落數影響較小,差異不顯著,各營養因素主次順序為B>A>C,選定細菌培養的最佳營養底物為A1B1C2,即,能量2.0MC/kg,蛋白15%,礦物質3.5%(CaHPO43%、NaCl0.5%)
結合正交試驗結果,利用金牧軟件(VF123?2006版)設計出營養底物配方如表8:
表8營養底物最佳配方
名稱麩皮豆粕玉米稻殼CaHPO4NaCl小料重量百分比(%)29.815.1835.815.453.00.50.27
2.2培養條件正交試驗
表9正交試驗設計方案

按表9進行4因素3水平正交設計試驗,每3h測定細菌的活菌數,共計48h。培養條件的正交試驗設計中不同條件細菌數隨時間變化圖見圖1.不同條件菌落數隨時間變化可知24h左右為細菌數增長峰值點,因此以24h活菌數作為衡量標準。
表10正交試驗設計方差分析結果
方差來源離均差平方和自由度均方F值P值pH(A)3513.84921756.924184.608.000溫度(B)721.5292360.76437.907.000接種量(C)4386.59622193.298230.460.000底物(D)264.4272132.21313.892.000誤差171.307189.517.  總變異9057.70726   
正交試驗設計方差分析結果見表10,從表10的方差分析結果可見,ABCD各因素均對活菌數有極其顯著性影響(P<0.001),各因素主次順序為C>A>B>D,選定細菌培養的最佳營養底物為A2B2C3D2。
得出B?01的最佳培養條件:pH7.2、溫度35℃、接種量15%、底物濃度10%。
2.3B?01解淀粉芽孢桿菌菌株液體發酵代謝規律的動態性研究
選擇B?01菌株的上述最適培育條件,發酵容量為30L,每3h動態測定活菌數,pH值和脫氫酶總活力,共24h,重復4次。如圖2.B?01解淀粉芽孢桿菌菌株液體發酵菌落數隨時間變化圖所示,第1批、第2批、第3批、第4批菌落數分別由8×108cfu/mL擴繁到141×108cfu/mL,由13×108cfu/mL擴繁到149×108cfu/mL,由16×108cfu/mL擴繁到168×108cfu/mL,由17×108cfu/mL擴繁到162×108cfu/mL。與發酵0h相比,6?24h菌落數較高,差異極顯著(P<0.01);與發酵3h、6h和9h相比,12?24h菌落數較高,差異極顯著(P<0.01);與發酵12h、15h相比,18?24h菌落數較高,差異極顯著(P<0.01);與發酵18h相比,24h菌落數較高,差異極顯著(P<0.01)。菌落數隨著菌液不斷培養呈上升趨勢,益生菌群活性增強;如圖3.B?01解淀粉芽孢桿菌菌株液體發酵pH數隨時間變化圖所示,第1批、第2批、第3批、第4批pH分別由6.76降到6.2,由6.62降到6.01,由6.78降到5.94,由6.76降到5.99。與發酵0h、3h相比,6?24h pH降低,差異極顯著(P<0.01);與發酵6h相比,18?24hpH降低,差異極顯著(P<0.01);發酵9h?21h相比,24h pH降低,差異極顯著(P<0.01)。pH值隨時間變化而不斷降低,表明細菌在不斷發酵增殖;如圖4,B?01解淀粉芽孢桿菌菌株液體發酵TDHA隨時間變化圖所示,第1批、第2批、第3批、第4批TDHA分別由0.005提高到0.694,由0.010提高到0.896,由0.023提高到1.003,由0.029提高到0.997。與發酵0h、3h相比,12?24h TDHA較高,差異極顯著(P<0.01);與發酵6?12h相比,18?24h TDHA較高,差異極顯著(P<0.01);與發酵15?21h相比,24h TDHA較高,差異極顯著(P<0.01)。24h發酵周期中,TDHA隨著發酵進程呈逐漸增加趨勢,表明益生菌群的菌酶活力逐漸增強。
3、低溫型高活性B?01解淀粉芽孢桿菌形態學研究
上述篩選所得菌株B?01在2萬倍S4800場發射掃描電鏡照片如圖5,細菌長0.8?3um,寬0.6um。
將菌株B?01在NA培養基,37℃,培養1天,然后油鏡下觀察,照片如圖6,可見菌體形態:桿狀,0.5μm×2.0~2.67μm,單個、成對或柵欄狀排列,革蘭氏陽性。
將菌株B?01在NA培養基,37℃,培養1天,菌落形態:乳白色,不規則形,表面皺褶、粗糙,半透明,邊緣不整齊(圖7)。
實施例二菌株的鑒定
菌株B?01送中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)進行微生物鑒定分析。
1.BA菌株與相與相關種的16S rDNA序列系統發育樹
采用MEGA4.1軟件,鄰位連接法顯示B?01與相關種的16S rDNA系統發育樹,進行1000次的相似度重復計算,圖中發育樹節點只顯示Bootstrap值大于50%數值,(E.,Escherichia)。
由圖16.菌株B?01的16S rDNA系統發育樹分析表明:菌株B?01與枯草芽孢桿菌群(Bacillus subtilis group)內多個種聚在一個系統發育分支,序列同源性為99.2%以上。
B?01菌株DNA序列如SEQ ID No.1所示。
2.B?01與相關種的gyrA基因序列系統發育樹
采用MEGA4.1軟件,鄰位連接法顯示B?01與相關種的gyrA基因系統發育樹,進行1000次的相似度重復計算,圖中發育樹節點只顯示Bootstrap值大于50%數值。
由圖17.B?01解淀粉芽孢桿菌菌株與相關種的pheS基因序列系統發育樹系統發育分析表明:菌株B?01與解淀粉芽孢桿菌植物亞種(Bacillusamyloliquefaciens subsp.plantarum)聚在一個系統發育分支,序列同源性為98.7%。該菌株能利用聚糖產酸,芽孢中生,這一特點與解淀粉芽孢桿菌一致。
通過16S rDNA序列和gyrA基因序列系統發育分析,菌株B?01被鑒定為:解淀粉芽孢桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)。3.B?01解淀粉芽孢桿菌菌種遺傳穩定性分析
菌株解淀粉芽孢桿菌B?01送中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)進行微生物菌種遺傳穩定性分析。菌株解淀粉芽孢桿菌B?01(1批)經連續傳代培養,菌株形態學特征未發現可見變化,gyrA基因序列無變化,生理生化特征無明顯變化,菌株性狀可穩定遺傳。
3.1B?01菌株生理生化特征(見表11)
表11B?01菌株生理生化特征

符號說明:“+”,陽性;“?”,陰性;“+w”,弱陽性;ND,未測。
3.2序列分析
序列比對:解淀粉芽孢桿菌B?01(1批)
98.4%Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum FZB42T(CP000560)
95.1%Bacillus amyloliquefaciens supsp.amyloliquefaciens KCTC1660T(AF272015)
83.6%Bacillus mojavensis NRRL B?14698T(EU138598)
83.4%Bacillus subtilis subsp.inaquosorum NRRL B?23052T(EU138605)
83.0%Bacillus subtilis subsp.spizizenii NRRL B?23049T(AF272020)
82.6%Bacillus subtilis subsp.subtilis KCTC3135T(AF272021)
82.4%Bacillus tequilensis NRRL B?41771T(EU138625)
82.3%Bacillus atrophaeus KCTC3701T(AF272016)
82.2%Bacillus vallismortis NRRL B?14890T(AF272025)
80.3%Bacillus sonorensis NRRL B?23154T(EU138611)
菌株解淀粉芽孢桿菌B?01(1批)與相關種的gyrA基因序列系統發育樹(圖18B?01解淀粉芽孢桿菌菌株(1批)與相關種的gyrA基因序列系統發育樹)
鑒定結論:解淀粉芽孢桿菌植物亞種B.amyloliquefaciens subsp.Plantarum
序列比對:解淀粉芽孢桿菌B?01(1批連續傳代5次后菌株)
98.4%Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum FZB42T(CP000560)
95.1%Bacillus amyloliquefaciens supsp.amyloliquefaciens KCTC1660T(AF272015)
83.6%Bacillus mojavensis NRRL B?14698T(EU138598)
83.4%Bacillus subtilis subsp.inaquosorum NRRL B?23052T(EU138605)
83.0%Bacillus subtilis subsp.spizizenii NRRL B?23049T(AF272020)
82.6%Bacillus subtilis subsp.subtilis KCTC3135T(AF272021)
82.4%Bacillus tequilensis NRRL B?41771T(EU138625)
82.3%Bacillus atrophaeus KCTC3701T(AF272016)
82.2%Bacillus vallismortis NRRL B?14890T(AF272025)
80.3%Bacillus sonorensis NRRL B?23154T(EU138611)
菌株解淀粉芽孢桿菌B?01(1批連續傳代5次后菌株)與相關種的gyrA基因序列系統發育樹(見圖19B?01解淀粉芽孢桿菌菌株(1批連續傳代5次后菌株)與相關種的gyrA基因序列系統發育樹)
鑒定結論:解淀粉芽孢桿菌植物亞種B.amyloliquefaciens subsp.Plantarum。
實施例三低溫型高活性B?01解淀粉芽孢桿菌菌株酶活性動態研究及細菌動態計數
相關菌系酶活性測定均控制在18℃培養條件下進行,每份樣品發酵容量為200Ml,3份平行重復樣。目前市場應用產品菌類酶活性測定,因為低溫條件下酶活力較差,通常測定采用淀粉酶活力60℃、脂肪酶40℃、蛋白酶40?55℃等高溫條件,低溫型益生菌產品在實際環境溫度較低的水質凈化過程中將顯現獨特的優勢,能保持較高的生物學活性,因此具有很好的市場應用前景。
18℃進行酶活力測定(用南京建成生物工程研究所提供的脂肪酶、淀粉酶測定試劑盒,用GB/T1803?1993方法測定蛋白酶活力)
淀粉酶活力單位定義:100ml酶液中的AMS,在18℃與底物作用30分鐘,水解10mg淀粉為1個單位
淀粉酶AMSu/dl=(空白管吸光度?測定管吸光度)/空白管吸光度*(0.4*0.5/10)*(30分鐘/7.5分鐘)*(1/0.05)*樣本測試前稀釋倍數
=(空白管吸光度?測定管吸光度)/空白管吸光度*0.16
脂肪酶活力單位定義:18℃條件下,每豪升酶液在本反應體系中與底物反應1分鐘,每消耗1umol底物為一個酶活力單位。
LPS活力=(A1?A2)/As*標準管濃度(umol/l)*樣本在反應體系中的稀釋倍數*反應時間(10分鐘)
蛋白酶活力定義:1ml液體酶在18℃,PH7.3條件下,1min水解酪素產生1ug酪氨酸為一個酶活力單位(u/ml)
蛋白酶活力=A*K*4/10*n
1.B?01菌的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶酶活力動態變化規律研究
由圖8.B?01解淀粉芽孢桿菌菌株淀粉酶活力隨時間變化圖所示,18℃淀粉酶(AMS)活力隨時間變化圖可知,淀粉酶活力一直在上升,淀粉酶活力分別在44h和62h有大幅的增長,62h?74h維持在較高水平,最高淀粉酶活力為11.532u/dl。
由圖9.B?01解淀粉芽孢桿菌菌株脂肪酶活力隨時間變化圖所示,18℃脂肪酶(LPS)活力隨時間變化圖可知,在44h時脂肪酶活力大幅上升,直到56h時達到最高值為1.56411u/l,隨后脂肪酶活力又有所下降。
由圖10.B?01解淀粉芽孢桿菌菌株蛋白酶活力隨時間變化圖所示,18℃蛋白酶活力隨時間變化圖可知,蛋白酶活力隨時間變化而不斷升高,直到62h?74h時維持在較高水平,其中在62h時達到最高值為8.836u/mL。
2.B?01菌在低溫培養條件下菌落數隨時間動態變化規律研究(圖11.B?01解淀粉芽孢桿菌菌株低溫條件下菌落數隨時間變化圖)
20h后測定低溫條件下菌落數,如圖11所示,20h?44h細菌生長較緩慢,44h?68h菌體生長旺盛,68h時達到最高菌落數81×108cfu/mL,隨后含菌量有所降低。
實施例四B?01解淀粉芽孢桿菌水質凈化特性的研究
1.實驗室益生菌水質凈化
在實驗室條件下,采用特制的富營養水(配方:豬肉糜50g+麩皮粉50g+豆粕粉50g+玉米粉50g+水1L,經100℃煮沸1h后,取濾液并加水至10L定容),按每100mL營養水加入本發明B?01解淀粉芽孢桿菌菌液2mL(活菌數:100億/mL)混勻,靜置觀察20天時的水質表觀變化如圖12、13。
未加益生菌的富營養水對照瓶水體渾濁并散發臭味,加入2%B?01解淀粉芽孢桿菌的富營養水試驗瓶水體清澈透亮,無異味。
2.大量水池污水(210m3)益生菌水質凈化20天前后對比
在污水池中潑灑1噸菌液(0.48%菌液)至水面,觀察凈水效果并測定20天前后相對照的各項水質指標,見表12。水質表觀變化如圖14、15.
各項水質測定指標均采用國標測定方法:
1.化學需氧量(COD)采用高錳酸鉀法GB/T15456?2008,
2.氧容量(DO)采用碘量法GB7489?87
3.氨氮奈氏試劑分光光度法GB7479?87
4.亞硝酸鹽分光光度法GBT7493?87
5.pH用pH計測定
表12采用B?01解淀粉芽孢桿菌凈化水質前后相關水質指標變化
水質凈化指標凈化前水體凈化后水體化學需氧量(COD)11.4mg/L5.8mg/L氧容量(DO)1.72mg/L6.8mg/L:氨氮2.7mg/L1.83mg/L亞硝酸鹽0.047mg/L0.023mg/LpH6.47.2
注:凈化前水體渾濁并散發臭味凈化后水質清澈,無異味。

關于本文
本文標題:解淀粉芽孢桿菌植物亞種B01及其應用.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6418858.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大 11341518490547661656274869187463015617546798951245921215686988338927977816043919052261767927654956 (function(){ var bp = document.createElement('script'); var curProtocol = window.location.protocol.split(':')[0]; if (curProtocol === 'https') { bp.src = 'https://zz.bdstatic.com/linksubmit/push.js'; } else { bp.src = 'http://push.zhanzhang.baidu.com/push.js'; } var s = document.getElementsByTagName("script")[0]; s.parentNode.insertBefore(bp, s); })();