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植物抗病相關蛋白GBMBL1及其編碼基因和應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210034394.3

申請日:

2012.02.16

公開號:

CN103254301B

公開日:

2014.11.26

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 14/42申請日:20120216|||公開
IPC分類號: C07K14/42; C12N15/29; C12N15/63; C12N5/10; C12N1/21; C12N15/82; C12N15/84; A01H5/00 主分類號: C07K14/42
申請人: 中國科學院微生物研究所
發明人: 王付欣; 王海云; 仲乃琴; 夏桂先
地址: 100101 北京市朝陽區北辰西路1號院3號
優先權:
專利代理機構: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245 代理人: 關暢
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210034394.3

授權公告號:

103254301B||||||

法律狀態公告日:

2014.11.26|||2013.09.18|||2013.08.21

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種植物抗病相關蛋白GbMBL1及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白質,命名為GbMBL1蛋白,來源于海島棉(Gossypium?barbadense),是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病相關的由序列1衍生的蛋白質。本發明提供的蛋白及其編碼基因可用于培育抗病植物新品種,在植物的抗黃萎病分子育種方面具有重要的應用價值。

權利要求書

權利要求書
1.   蛋白質,是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;
(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病相關的由序列1衍生的蛋白質。

2.   編碼權利要求1所述蛋白的基因。

3.   如權利要求2所述的基因,其特征在于:所述基因為如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的DNA分子:
(1)序列表中序列2自5’末端第15至1334位核苷酸所示的DNA分子;
(2)序列表中序列2自5’末端第15至1337位核苷酸所示的DNA分子;
(3)序列表中序列2所示的DNA分子;
(4)在嚴格條件下與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子;
(5)與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且植物抗病相關蛋白的DNA分子。

4.   含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。

5.   一種培育轉基因植物的方法,是將權利要求2或3所述基因導入目的植物中,得到抗病性高于所述目的植物的轉基因植物。

6.   如權利要求5所述的方法,其特征在于:權利要求3所述基因通過權利要求4所述重組載體導入所述目的植物中。

7.   如權利要求5或6所述的方法,其特征在于:所述抗病性為對黃萎病的抗性。

8.   如權利要求5或6所述的方法,其特征在于:所述抗病性為對大麗輪枝菌所引發的病害的抗性。

9.   如權利要求5至8中任一所述的方法,其特征在于:所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物;所述雙子葉植物具體為擬南芥。

10.   權利要求1所述蛋白,或權利要求2或3所述基因,在調控植物抗病性中的應用。

說明書

說明書植物抗病相關蛋白GbMBL1及其編碼基因和應用
技術領域
本發明涉及一種植物抗病相關蛋白GbMBL1及其編碼基因和應用。
背景技術
棉花黃萎病是一種世界性病害,由大麗輪枝菌侵染所致,是制約我國棉花生產的主要病害。目前我國各棉區的發病面積已占植棉總面積的50%以上,每年損失皮棉7.5?10萬噸,直接經濟損失16?20億元。面對棉花黃萎病在生產上的危害,加強棉花抗病性研究,篩選抗病基因并研究其對黃萎病的抗病機制,利用基因工程方法提高棉花栽培品種的抗病性具有重要應用意義。
凝集素廣泛分布于植物、動物和微生物中,是一類非免疫來源的對糖及其綴合物能夠可逆專一識別的蛋白質分子,可以凝集細胞或沉淀糖綴合物。1888年,植物凝集素由俄國Dorpt大學的Stillmark首次在蓖麻子中發現,隨后,人們又發現了上百個此類蛋白并對它們的結合特性、分子結構和生物學功能進行了分析。1995年,植物凝集素被統一定義為至少具有一個可與單糖或寡聚糖特異可逆結合的非催化結構域的植物蛋白。除幾丁質酶等幾種酶之外,凝集素是僅有的可以識別并結合昆蟲腸胃及真菌、細菌等微生物表面的糖綴合物的植物蛋白,幾乎能夠識別目前所知的所有表面糖類,在植物抗病毒、細菌、真菌、蟲害乃至動物危害方面發揮著非常重要的作用。基于水稻、擬南芥、大豆來源的植物凝集素的序列、結構特征及進化關系,植物凝集素的最新分類為12類,其中有4類系新近發現。
甘露糖結合凝集素(mannose?binding lectin)最早發現于雪花蓮球莖中,它能專一性結合甘露糖,被命名為雪花蓮凝集素(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)。當前,甘露糖結合凝集素通常是指一類與雪花蓮凝集素相似的凝集素,它們含有一個或兩個GNA結構域,能夠識別并結合外源微生物中的甘露糖型聚糖,在植物防御中起到很重要的作用。對雪花蓮凝集素的結合特性研究表明,它的每個亞基都具有三個相似的甘露糖結合位點,這些位點可緊密附著甘露寡糖或高甘露糖型聚糖,但與甘露糖單體僅有較弱的相互作用。
發明內容
本發明的目的是提供一種植物抗病相關蛋白GbMBL1及其編碼基因和應用。
本發明提供的蛋白質,命名為GbMBL1蛋白,來源于海島棉(Gossypium barbadense),是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;
(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病相關的由序列1衍生的蛋白質。
為了使(a)中的蛋白質便于純化,可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
表1標簽的序列
  標簽  殘基  序列  Poly?Arg  5?6(通常為5個)  RRRRR  Poly?His  2?10(通常為6個)  HHHHHH  FLAG  8  DYKDDDDK  Strep?tag II  8  WSHPQFEK  c?myc  10  EQKLISEEDL
上述(b)中的蛋白質可人工合成,也可先合成其編碼基因,再進行生物表達得到。上述(b)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子,和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變,和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
本發明提供的GbMBL1蛋白,具有大麗輪枝菌應答屬性,在蛋白水平和轉錄水平都能夠受大麗輪枝菌強烈誘導,生物信息學分析屬于甘露糖結合凝集素。
編碼所述蛋白的基因也屬于本發明的保護范圍。
所述基因具體可為如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的DNA分子:
(1)序列表中序列2自5’末端第15至1334位核苷酸所示的DNA分子;
(2)序列表中序列2自5’末端第15至1337位核苷酸所示的DNA分子;
(3)序列表中序列2所示的DNA分子;
(4)在嚴格條件下與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子;
(5)與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且植物抗病相關蛋白的DNA分子。
所述嚴格條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1%SDS的溶液中,65℃條件下雜交并洗膜。
含有所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。
可用現有的表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。所述表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于微彈轟擊的載體等。所述表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域,即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構建重組表達載體時,在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子,它們可單獨使用或與其它的啟動子結合使用;此外,使用本發明的基因構建重組表達載體時,還可使用增強子,包括翻譯增強子或轉錄增強子,這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等,但必需與編碼序列的閱讀框相同,以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于鑒定及篩選,可對所用表達載體進行加工,如加入編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。也可不加任何選擇性標記基因,直接根據表型篩選。
所述重組載體具體可為將所述基因插入載體pPZP?GFP的多克隆位點得到的重組質粒。
本發明還保護一種培育轉基因植物的方法,是將所述基因導入目的植物中,得到抗病性高于所述目的植物的轉基因植物。所述基因具體可通過所述重組載體導入所述目的植物中。攜帶有所述基因的重組載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導、基因槍等常規生物學方法轉化所述植物的細胞或組織。所述抗病性具體可為對黃萎病的抗性。所述黃萎病具體可為大麗輪枝菌引發的黃萎病。所述抗病性具體可為對大麗輪枝菌引發的病害的抗性。所述目的植物可為雙子葉植物或單子葉植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥,如哥倫比亞生態型擬南芥。
本發明還保護所述蛋白或所述基因在調控植物抗病性中的應用。所述抗病性具體可為對黃萎病的抗性。所述黃萎病具體可為大麗輪枝菌引發的黃萎病。所述抗病性具體可為對大麗輪枝菌引發的病害的抗性。所述植物可為雙子葉植物或單子葉植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥,如哥倫比亞生態型擬南芥。
本發明提供的蛋白及其編碼基因可用于培育抗病植物新品種,特別是抗黃萎病的棉花新品種,在植物抗黃萎病分子育種方面具有重要的應用價值。
備注:本發明由農業部“轉基因生物新品種培育重大專項”(課題號:2009ZX08005?001B;2009ZX08010?001B)資助。
附圖說明
圖1為GbMBL1蛋白受大麗輪枝菌的誘導表達。
圖2為GbMBL1基因受大麗輪枝菌的誘導表達。
圖3為GbGML1在棉花中不同組織器官中的表達特征。
圖4為擬南芥在大麗輪枝菌侵染后的生長情況。
圖5為擬南芥在大麗輪枝菌侵染后的病葉率統計。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發明,但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗,均設置三次重復實驗,結果取平均值。
哥倫比亞生態型擬南芥(Columbia ecotype Arabidopsis thaliana,col?0):購自英國Nottingham.Arabidopsis Stock Centre。
實施例中所用的海島棉(Gossypium barbadense)品種為Hai7124,大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)菌株為新疆V592;公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得該品種的海島棉和該大麗輪枝菌菌株;提及該品種的海島棉和該大麗輪枝菌菌株的參考文獻:Wang FX,Ma YP,Yang CL,Zhao PM,Yao Y,Jian GL,Luo YM,Xia GX.(2011)Proteomic analysis of the sea?island cotton roots infected by wilt pathogen Verticillium dahliae.Proteomics,11(22):4296?4309。
農桿菌EHA105:公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得;參考文獻:Hood EE,Gelvin SB,Melchers LS,Hoekema A.(1993)New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants.Transgenic Res,2:208?218。
載體pPZP?GFP:公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得;參考文獻:馬銀平,沈法富,夏桂先,王付欣,楊淳淋(2012).海島棉幾丁質酶基因GbCHI的克隆與功能分析.遺傳,V34(2)。
實施例1、植物抗性相關蛋白GbMBL1及其編碼基因的發現
通過用大麗輪枝菌新疆V592菌株對海島棉品種Hai7124的有效接種、高質量根部蛋白的提取、雙向電泳、MS/MS分析、棉花EST數據庫搜尋,共得到69個不同功能分類的差異表達蛋白,其中GbMBL1蛋白的表達能受到大麗輪枝菌的強烈誘導。GbMBL1蛋白在大麗輪枝菌假接種和接種處理5天后的根部總蛋白的代表性Blue silver染色雙向凝膠分析圖中的位置及在接種后第1、3、5、7天及對照的定量分析的結果如圖1所示。
將序列表的序列1所示的蛋白質命名為GbMBL1蛋白,由440個氨基酸殘基組成。將編碼GbMBL1蛋白的基因命名為GbMBL1基因,其開放閱讀框如序列表的序列2自5’末端第15至1334位核苷酸所示。
實施例2、GbMBL1基因的表達分析
一、大麗輪枝菌侵染后GbMBL1基因的表達分析
為了分析GbMBL1基因在大麗輪枝菌侵染后的轉錄表達特征,進行如下實驗:
用大麗輪枝菌V592菌株侵染海島棉品種Hai7124(接種處理);同時設置用水代替大麗輪枝菌V592菌株的平行處理,即假接種處理。分別在接種和假接種處理12、24、36、48、60、72、84、96小時后收取樣品,提取各個樣品的總RNA且反轉錄為cDNA。等量混合假接種各時間段的cDNA作為假接種對照cDNA樣品。將假接種對照cDNA樣品以及各個時間段收取的接種樣本的cDNA分別進行實時熒光定量PCR分析,以假接種對照cDNA樣品中的GbMBL1基因量作為本底,計算接種處理不同時間后GbMBL1基因的相對表達量,結果見圖2。
在受大麗輪枝菌誘導后12?96小時海島棉中GbMBL1基因的轉錄水平都有不同程度的增高,在侵染后12小時就達到了近60倍高峰值,在誘導后24、36、48小時的增加幅度也都大于10倍,表明GbMBL1基因可以受到大麗輪枝菌迅速而強烈的誘導。
二、GbMBL1基因在棉花不同組織器官中的表達特征分析
為了分析GbMBL1基因不同組織器官中的表達特征,進行如下實驗:
分別提取海島棉品種Hai7124的根、莖、葉、花的總RNA且反轉錄為cDNA,進行實時熒光定量PCR分析,以棉花組成型基因histone 3的表達量為本底表達量,計算不同組織器官中GbMBL1基因的相對表達量,結果見圖3。
GbMBL1基因在根、莖、葉、花中都有表達,以在根中的表達量最高,在莖、葉、花中的表達量相近,約為根中表達量的一半,表明GbMBL1基因可能在棉花各器官中都能夠發揮作用,尤其在根中可能有重要功能。
實施例3、轉基因植物的獲得和鑒定
一、重組表達載體的構建
1、GbMBL1基因的克隆
提取海島棉Hai7124的總RNA,將其反轉錄為cDNA。以cDNA為模板,用Primer?F和Primer?R組成的引物對進行PCR擴增,得到PCR擴增產物。PCR擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠回收試劑盒回收1300bp左右的目的片段。
Primer?F:5’?TAGGATCCATGTCTCTTCACTCTTCTCTCACCA?3’(下劃線標注BamH I酶切識別位點);
Primer?R:5’?GCTGACGAGCTCTCACTGTTGGGGTGCCTTTATATAAC?3’(下劃線標注Sac I酶切識別位點)。
PCR擴增體系(50μl):含有10×LA Buffer 5μl,MgCl2 2.5mmol/L,Primer?F與Primer?R各0.3μmol/L,dNTP 0.2mmol/L,LA Taq 3U,cDNA模板0.4μg;試劑和酶均購自Takara公司。
PCR擴增條件:95℃熱變性3min;94℃ 30s,61℃ 30s,72℃ 30s,28個循環;最后72℃延伸10min。
2、重組表達載體的構建
①用限制性內切酶BamH I和Sac I雙酶切步驟1回收的目的片段,回收酶切產物。
②用限制性內切酶BamH I和Sac I雙酶切載體pPZP?GFP,回收載體骨架(約9.9kb)。
③將步驟①的酶切產物和步驟②的載體骨架連接,得到重組質粒。根據測序結果,從重組質粒進行結構描述如下:在載體pPZP?GFP的BamH I和Sac I酶切位點之間插入了序列表中序列2自5’末端第15至1334位核苷酸所示的GbMBL1基因。
二、轉基因植物的獲得
1、重組農桿菌的獲得
用步驟一得到的重組質粒轉化農桿菌EHA105,得到重組農桿菌。
2、轉基因擬南芥的獲得
利用重組農桿菌,通過花浸泡法(Clough,S.J.,and Bent,A.F.(1998).Floral dip:a simplified method for Agrobacterium?mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J 16,735?743.)將GbMBL1基因導入哥倫比亞生態型擬南芥,得到T1代種子。
T1代種子收獲后在MS培養基(含有50mg/L的卡那霉素)中篩選抗性植株,將抗性植株移栽到土中,收獲T2代種子并將其培育為植株(T2代植株)。
分別提取T1代植株和T2代植株的葉片的總RNA并反轉錄為cDNA,用Primer?F和Primer?R組成的引物對對來自各個樣本的cDNA進行PCR鑒定,PCR鑒定為陽性的植株即轉基因植株。對于某一T1代植株,如果其T2代植株均PCR鑒定為陽性,則該植株為純合的轉基因植株,該植株及其后代即為1個純合的轉基因株系。
T2代轉基因植株自交產生T3代種子。
隨機選取兩個轉基因植株株系(L1、L6、)的T3代種子進行步驟四的鑒定。
三、轉空載體植株的獲得
用載體pPZP?GFP代替重組質粒,其它同步驟二,得到轉空載體植株的T3代種子,作為轉基因植株T3代種子的對照。
四、抗病性鑒定
兩個轉基因植株株系(L1和L6)的T3代植種子(每個株系100粒),轉空載體植株的T3代種子(100粒),哥倫比亞生態型擬南芥(col?0)的種子(100粒),分別進行如下抗病性鑒定(采用平行處理):
1、接種
將種子播種在1/2MS培養基平板上,萌發6天后將幼苗移栽到1/2MS培養基上,將培養皿豎直放置,培養3天(為了發根,便于接種),然后隨機均分為兩組,其中第一組用大麗輪枝菌V592孢子液(1×107個/毫升)浸根接種,第二組用水進行浸根接種(假接種)。
2、轉GbMBL1基因與野生型擬南芥在大麗輪枝菌侵染后的生長差異
從接種開始計時,7天后觀察到的植物的生長差異,如圖4所示。哥倫比亞生態型擬南芥已表現出典型的黃萎病癥狀,底部葉片失綠變黃,整株萎蔫。相比哥倫比亞生態型擬南芥,轉GbMBL1基因擬南芥的生長僅受到抑制,尚未出現典型的黃萎病病癥。轉空載體植株的表型與哥倫比亞生態型擬南芥沒有顯著差異。上述結果表明,轉基因植株在大麗輪枝菌侵染后的抗病能力顯著優于野生型植株,具有較強的抵抗初侵染能力。
3、轉GbMBL1基因與野生型擬南芥在大麗輪枝菌侵染后的病葉率統計
將病葉率(對于1個植株,病葉數與全部葉數的百分比)為病情指標,在大麗輪枝菌接種后7、14和21天對各個株系的病葉率進行統計(取該株系內所有植株的平均值),結果如圖5所示。
接種7天后,轉基因植株的病葉率不及10%,而哥倫比亞生態型擬南芥和轉空載體植株的病葉率已近30%。接種14天后,哥倫比亞生態型擬南芥和轉空載體植株的病葉率均增至近60%,而轉基因擬南芥的兩個株系的病葉率大約為20%和30%。接種21天后,哥倫比亞生態型擬南芥和轉空載體植株的病葉率均增至近80%,而轉基因擬南芥的兩個株系的病葉率反而有所下降,約降至原來的一半。上述結果表明,轉基因植株在大麗輪枝菌侵染后的抗病能力顯著優于野生型植株和轉空載體植株,同時具有較強的抵抗初侵染和耐病能力,在大麗輪枝菌處理后能夠保持較好的生長勢。

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