鬼佬大哥大
  • / 22
  • 下載費用:30 金幣  

OCT4B蛋白異構體的用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210001826.0

申請日:

2012.01.05

公開號:

CN103191413B

公開日:

2014.11.26

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 專利權的轉移IPC(主分類):A61K 38/17登記生效日:20180612變更事項:專利權人變更前權利人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所變更后權利人:北京中科再康生物技術有限公司變更事項:地址變更前權利人:100101 北京市朝陽區朝陽區北辰西路1號院2號變更后權利人:100190 北京市海淀區中關村大街甲38號1號樓B座1層170號|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 38/17申請日:20120105|||公開
IPC分類號: A61K38/17; A61K48/00; A61P35/00; C12N15/861 主分類號: A61K38/17
申請人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
發明人: 肖志峰; 陳冰; 王霞; 高原; 魏建樹; 韓津; 戴建武
地址: 100101 北京市朝陽區北辰西路1號院2號
優先權:
專利代理機構: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245 代理人: 關暢
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201210001826.0

授權公告號:

|||103191413B||||||

法律狀態公告日:

2018.06.29|||2014.11.26|||2013.08.07|||2013.07.10

法律狀態類型:

專利申請權、專利權的轉移|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種OCT4B蛋白異構體的新用途,本發明提供的應用為OCT4B-265蛋白在制備促進細胞凋亡的產品中的應用;所述OCT4B-265蛋白為如下1)或2):1)序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;2)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。本發明的實驗證明,本發明首次鑒定了OCT4B-265蛋白特異在干性細胞中的表達,并首次揭示了OCT4B-265蛋白在細胞基因毒性應激反應中促進細胞凋亡的功能,并且這一應激反應受到抑癌基因p53的調節。

權利要求書

權利要求書
1.   OCT4B?265蛋白在制備細胞凋亡促進劑中的應用或在制備預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用;所述OCT4B?265蛋白為如下1)或2):1)序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;2)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。

2.   根據權利要求1所述的應用,其特征在于:
2)所示OCT4B?265蛋白為序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質;
所述細胞凋亡是由細胞凋亡引發劑引起的;所述細胞凋亡引發劑為具有基因毒性的刺激物;所述具有基因毒性的刺激物具體為絲裂霉素C。

3.   根據權利要求1或2所述的應用,其特征在于:
所述細胞為表達OCT4B?265蛋白的離體細胞,
所述腫瘤為乳腺癌;
所述表達OCT4B?265蛋白的離體細胞具體為內源表達OCT4B?265蛋白的離體細胞和外源表達OCT4B?265蛋白的離體細胞;
所述內源表達OCT4B?265蛋白的離體細胞具體為離體的人胚胎干細胞hES(H9)、離體的人畸胎瘤PA?1或離體的畸胎瘤細胞NTERA?2;
所述外源表達OCT4B?265蛋白的離體細胞具體為將OCT4B?265蛋白的編碼基因導入宿主細胞中,得到轉基因細胞。

4.   根據權利要求1?3中任一所述的應用,其特征在于:所述應用為將OCT4B?265蛋白的編碼基因導入宿主細胞中,得到轉基因細胞;所述轉基因細胞的細胞凋亡率大于所述宿主細胞。

5.   根據權利要求1?4中任一所述的應用,其特征在于:所述OCT4B?265蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4或序列表中序列2。

6.   根據權利要求1?5中任一所述的應用,其特征在于:所述宿主細胞為離體的乳腺癌細胞系MCF?7。

7.   抑癌基因p53的抑制劑在制備細胞凋亡抑制劑或抑制細胞凋亡的應用;所述抑癌基因p53的抑制劑為核苷酸A;所述核苷酸A為由序列表中序列5所示的正向序列和序列表中序列6所示的反向序列組成的雙鏈核苷酸。

8.   根據權利要求7所述的應用,其特征在于:
所述抑制細胞凋亡通過降低細胞中所述OCT4B?265蛋白表達量實現;
所述細胞為表達OCT4B?265蛋白的離體細胞,所述表達OCT4B?265蛋白的離體細胞具體為將OCT4B?265蛋白的編碼基因導入宿主細胞中,得到轉基因細胞;所述宿主細胞具體為離體的乳腺癌細胞系MCF?7。

9.   一種抑制細胞中OCT4B?265蛋白表達的方法,為干擾細胞中的抑癌基因p53的表達,實現抑制細胞中OCT4B?265蛋白表達;所述抑癌基因p53的核苷酸序列為序列表中的序列7。

10.   根據權利要求9所述的方法,其特征在于:所述干擾細胞中的抑癌基因p53的表達通過將所述的核苷酸A導入細胞實現;
所述細胞為表達OCT4B?265蛋白的離體細胞,所述表達OCT4B?265蛋白的離體細胞具體為離體的人畸胎瘤PA?1細胞或離體細胞A;
所述離體細胞A為將OCT4B?265蛋白的編碼基因導入宿主細胞中,得到轉基因細胞;所述宿主細胞具體為離體的乳腺癌細胞系MCF?7。

說明書

說明書OCT4B蛋白異構體的新用途
技術領域
本發明涉及生物技術領域,尤其涉及一種OCT4B蛋白異構體的新用途。
背景技術
OCT4是由POU5F1基因編碼的一類同源域轉錄因子,典型的OCT4主要表達于胚胎干細胞、生殖干細胞和具有分化潛能的畸胎瘤細胞中,是維持胚胎干細胞自我更新能力與全能性的關鍵轉錄因子。OCT4的缺失或者過量表達都會引起胚胎干細胞的分化。同時,OCT4也是體外誘導全能干細胞技術中最為關鍵的因子。
人的OCT4基因可以通過選擇性剪切形成三種mRNA異構體,OCT4A,OCT4B1和OCT4B。其中OCT4A可以生成典型的360個氨基酸的OCT4A蛋白,對維持ES細胞自我更新和多能性起關鍵作用。OCT4B1可以通過剪切形成OCT4B,并且被預測可產生一類截斷的蛋白。OCT4B可以產生多個異構體,其中OCT4B?190被證明在細胞應激條件下具有抗凋亡功能,而其他異構體(如OCT4?265,OCT4?164)的生物學功能大多還不能明確。
發明內容
本發明的一個目的是提供OCT4B?265蛋白的一種應用。
本發明提供的應用為OCT4B?265蛋白在制備細胞凋亡促進劑中的應用或在制備預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用;所述OCT4B?265蛋白為如下1)或2):1)序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;
2)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質。
上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指為了滿足不同機體內蛋白高表達而進行不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
上述應用中,2)所示OCT4B?265蛋白為序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質;所述細胞凋亡是由細胞凋亡引發劑引起的;所述細胞凋亡引發劑為具有基因毒性的刺激物;所述具有基因毒性的刺激物具體為絲裂霉素C。
上述應用中,所述細胞為表達OCT4B?265蛋白的離體細胞,所述腫瘤為乳腺癌;
所述表達OCT4B?265蛋白的離體細胞具體為內源表達OCT4B?265蛋白的離體細胞和外源表達OCT4B?265蛋白的離體細胞;
所述內源表達OCT4B?265蛋白的離體細胞具體為離體的人胚胎干細胞hES(H9)、離體的人畸胎瘤PA?1或離體的畸胎瘤細胞NTERA?2;
所述外源表達OCT4B?265蛋白的離體細胞具體為將OCT4B?265蛋白的編碼基因導入宿主細胞中,得到轉基因細胞。
上述應用中,所述應用為將OCT4B?265蛋白的編碼基因導入宿主細胞中,得到轉基因細胞;所述轉基因細胞的細胞凋亡率大于所述宿主細胞。
上述應用中,所述OCT4B?265蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4或序列表中序列2;所述宿主細胞為離體的乳腺癌細胞系MCF?7。
上述應用中,所述OCT4B?265蛋白的編碼基因通過含有OCT4B?265蛋白的編碼基因的重組腺病毒導入宿主細胞,上述重組腺病毒可由北京諾賽基因公司合成。
上述OCT4B?265蛋白在促進細胞凋亡中的應用也是本發明保護的范圍。
含有上述OCT4B?265蛋白的編碼基因的重組載體或重組腺病毒也是本發明保護的范圍。
本發明的另一個目的是提供抑癌基因p53的抑制劑的一個應用。
本發明提供的應用為在抑癌基因p53的抑制劑在制備細胞凋亡抑制劑或抑制細胞凋亡的應用也是本發明保護的范圍。
在上述應用中,所述抑癌基因p53的抑制劑為核苷酸A;所述核苷酸A為由序列表中序列5所示的正向序列和序列表中序列6所示的反向序列組成的雙鏈核苷酸。
在上述應用中,所述抑制細胞凋亡通過降低細胞中所述OCT4B?265蛋白表達量實現;
在上述應用中,所述細胞為表達OCT4B?265蛋白的離體細胞,所述表達OCT4B?265蛋白的離體細胞具體為將OCT4B?265蛋白的編碼基因導入宿主細胞中,得到轉基因細胞;所述宿主細胞具體為離體的乳腺癌細胞系MCF?7。
在上述應用中,所述應用為將上述的核苷酸A導入上述轉基因細胞中,得到目的細胞;所述目的細胞凋亡率小于所述轉基因細胞。
本發明的第三個目的是提供一種抑制細胞中OCT4B?265蛋白表達的方法。
本發明提供的方法為干擾細胞中的抑癌基因p53的表達,實現抑制離體細胞中OCT4B?265蛋白表達;所述抑癌基因p53的核苷酸序列為序列表中的序列7。
在上述方法中,所述干擾離體細胞中的抑癌基因p53的表達通過將核苷酸A導入細胞實現;
所述細胞為表達OCT4B?265蛋白的離體細胞,所述表達OCT4B?265蛋白的離體細胞具體為離體的人畸胎瘤PA?1細胞或離體細胞A;所述離體細胞A為將OCT4B?265蛋白的編碼基因導入宿主細胞中,得到轉基因細胞;所述宿主細胞具體為離體的乳腺癌細胞系MCF?7。
本發明的實驗證明,本發明首次鑒定了OCT4B?265蛋白特異在干細胞中的表達,并首次揭示了OCT4B?265蛋白在細胞基因毒性應激反應中促進細胞凋亡的功能,并且這一應激反應受到抑癌基因p53的調節。鑒于OCT4B?265蛋白的重要的生物學功能和特異的表達模式,該蛋白可能作為一個靶點進行藥物設計,或者作為病理檢測標記蛋白,在臨床上有重要的應用價值。此外,應用OCT4B?265蛋白在基因毒性應激條件下促進細胞凋亡這一特點,可能有效地用于防治干細胞移植治療過程和胚胎發育過程中受到的基因損傷毒害。
附圖說明
圖1為OCT4B?265蛋白在基因毒性損傷應激反應中的表達
圖2為OCT4B?265蛋白的亞細胞定位
圖3為OCT4B?265蛋白轉基因細胞系鑒定
圖4為OCT4B?265蛋白的功能及所受調節
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業途徑得到。
實施例1、在細胞應激條件下不同細胞系中OCT4B?265蛋白的表達及其亞細胞定位
OCT4B?265蛋白是OCT4B mRNA以ATG為起始密碼子翻譯而成的具有265個氨基酸的蛋白異構體,其氨基酸序列為序列表中的序列1,其cDNA的全長序列為序列表中的序列2,整個開放讀碼框全長798個堿基。
一、在細胞應激條件下不同細胞系中OCT4B?265蛋白的表達
NTERA?2、MCF?7、293T、PA?1、HepG2、RT?4細胞細胞系購自北京協和細胞中心;資源編號依次分別為3111C0001CCC000019、3111C0001CCC000013、3111C0001CCC000091、3111C0001CCC000021、3111C0001CCC000035、3131C0001001200015;
人胚胎干細胞細胞系(hES)H9購自中科院上海生科院生化細胞所干細胞技術平臺購買。
上述細胞用的培養基具體如下:
NTERA?2,MCF?7和293T細胞培養基均為在Dulbecco’s modified Eagle’s培養基中(DMEM,添加10%FBS(Hyclone,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)中添加glutamine(Hyclone,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)、sodium pyruvate(Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA)、non?essential amino acids(Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA)、penicillin(Hyclone,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)、streptomycin(Hyclone,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)得到的培養基;glutamine的終濃度為2mM,sodiumpyruvate的終濃度為1mM,non?essential amino acids的終濃度為1%,penicillin的終濃度為100U/ml、streptomycin的終濃度為100μg/ml。
PA?1和HepG2細胞培養基均為在MEM/EBSS培養基中添加glutamine、sodium pyruvate、non?essential amino acids、penicillin、streptomycin得到的培養基;glutamine的終濃度為2mM,sodium pyruvate的終濃度為1mM,non?essential amino acids的終濃度為1%,penicillin的終濃度為100U/ml、streptomycin的終濃度為100μg/ml。
RT4細胞培養基為在McCOY’s 5a培養基中(Hyclone,SH30200.01,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)添加glutamine、sodium pyruvate、non?essential amino acids、penicillin、streptomycin得到的培養基;glutamine的終濃度為2mM,sodium pyruvate的終濃度為1mM,non?essential amino acids的終濃度為1%,penicillin的終濃度為100U/ml、streptomycin的終濃度為100μg/ml。
hES細胞系培養基為在DMEM培養基中添加FBS、bFGF、β?巰基乙醇、glutamine、sodium pyruvate、non?essential amino acids、penicillin、streptomycin得到的培養基;FBS的終濃度為20%;bFGF的終濃度為10ng/ml,β?巰基乙醇的終濃度為0.1mM,glutamine的終濃度為2mM,sodium pyruvate的終濃度為1mM,non?essential amino acids的終濃度為1%,penicillin的終濃度為100U/ml、streptomycin的終濃度為100μg/ml。
所有細胞均按標準培養方法進行培養。
將上述細胞NTERA?2、MCF?7、293T、PA?1、HepG2、RT?4和H9分別進行如下三組基因毒性損傷處理:
絲裂霉素C處理組(mmc):將細胞NTERA?2、MCF?7、293T、PA?1、HepG2、RT?4和H9分別在含有絲裂霉素C(GR?311,Enzo Life Sciences International Inc.)的細胞培養基中培養,絲裂霉素C在含有絲裂霉素C的細胞培養基中的濃度為5μg/ml;
多柔比星處理組(dox):將NTERA?2細胞在含有多柔比星(GR?319,Enzo Life Sciences International Inc.)的細胞培養基中培養,多柔比星在含有多柔比星的細胞培養基中的濃度為1μg/ml;
紫外照射處理組(PA?1UV):將PA?1細胞在0?50J/m2劑量的紫外照射下培養。
上述三組均用不進行上述各處理而正常培養的細胞作為對照(ctrl)。
培養12小時之后,收集上述三組處理的細胞,分別用添加蛋白酶抑制劑(P8340,Sigma?Aldrich,1∶100稀釋)的RIPA裂解液(R0278,SIGMA?ALDRICH)裂解(冰上裂解半小時)各組細胞,在4℃條件下離心(12000g離心30分鐘),分別收集上清液。
將上述上清液在12%的SDS?PAGE上進行電泳,隨后轉膜到PVDF膜上,膜用TBST溶液稀釋的10%奶粉室溫封閉2小時,隨后進行一抗孵育(OCT4B?265抗體:SC?8629(Santa Cruz Biotechnology Inc)1∶1000稀釋)和偶聯辣根過氧化物酶的二抗(Donkey Anti?Goat,sc?2020(SantaCruz)1∶10000)孵育。
以OCT4A(一抗為OCT4B?265抗體:SC?8629(Santa Cruz Biotechnology Inc)1∶1000稀釋;二抗為Donkey Anti?Goat,sc?2020(SantaCruz)1∶10000)和Tubulin(Tubulin的抗體:T5168(Sigma?Aldrich)1∶3000。二抗為:Goat Anti?Mouse,1030?05(SouthernBiotech)1∶10000)為參照對照。
所用的發光底物為SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce,Thermo Fisher Scientific)。
結果如圖1所示,A為受到絲裂霉素C(mmc)、多柔比星(DOX,又名阿霉素)和紫外輻照(UV)應激處理時部分細胞中OCT4B?265蛋白的表達,可以看出,在絲裂霉素C(mmc)處理下,OCT4B?265蛋白在畸胎瘤細胞系NTERA?2,PA?1以及人胚胎干細胞H9(hES)中的均有表達(大小為34KD左右),且與不進行處理的對照相比,表達量高;
在紫外輻照(UV)處理下,OCT4B?265蛋白在PA?1細胞中有表達,且與不進行處理的對照相比,表達量高;
B為受到絲裂霉素C(mmc)應激處理時部分細胞中OCT4B?265蛋白的表達,可以看出,在受到絲裂霉素C(mmc)應激處理時,OCT4B?265蛋白在人畸胎瘤PA?1中有表達,且OCT4B?265蛋白在人畸胎瘤PA?1表達量高于不進行處理的對照(ctrl);在乳腺癌細胞系MCF?7、肝癌細胞系HepG2、腎上皮細胞系293T細胞和膀胱癌細胞系RT?4無論是否應激處理,均無OCT4B?265蛋白表達。
從上述可以看出,細胞受到基因毒性刺激損傷處理后,內源性的OCT4B?265蛋白在人胚胎干細胞hES(H9)、人畸胎瘤PA?1和畸胎瘤細胞NTERA?2中相對表達量都有增加。
研究表明OCT4B?265蛋白是一個基因毒性應激相關蛋白,細胞中內源性的OCT4B?265蛋白在應激過程中上調,而且這種現象僅限于如胚胎干細胞和畸胎瘤細胞等具有多能性的細胞中。
二、OCT4B?265蛋白的亞細胞定位
對OCT4B?265表達序列進行了點突變,以消除OCTB其他異構體蛋白的表達,得到OCT4B?265(m),突變后的氨基酸為序列表中的序列3,核苷酸序列為序列表中的序列4,其中序列3為將序列1自N末端第102的Met突變為Val得到的氨基酸序列;序列4為將序列2的第226?228的CTG突變為CTT,且將序列2的第304?306位ATG突變為GTC得到的核苷酸序列。
1、表達GFP的載體的獲得
制備GFP,其核苷酸序列為序列8;
表達GFP的載體為將GFP(序列8)插入pQCXIN穿梭載體(Clontech Laboratories,Inc.)的BamHI和EcoRI酶切位點間得到的載體命名為pQCXIN?GFP。
2、融合表達GFP和OCT4B?265表達載體的構建
1)、制備序列1,以下引物進行PCR擴增:正向引物:5’?OCT4B?265ATG5’?ATTACCGGTATGCACTTCTACAGACT?3’(AgeI酶切位點被標出);反向引物:3’?OC45’?AGTCGTACGTCAGTTTGAATGCATGG?3’(BsiWI酶切位點被標出),得到798bp的PCR產物,經過測序,該PCR產物具有序列表中列1。
2)、將上述PCR產物經過AgeI和BsiWI酶切,與經過同樣酶切的pQCXIN?GFP連接,得到重組載體,pQCXIN?OCT4B?265?GFP。
3)一次突變
以pQCXIN?GFP?OCT4B?265為模板,以5’?OCT4B?265ATG作為正向引物,3’?OCT4B?190m 5’?AAATAGAACCCCAAGGGTGAGCC?3’(突變位點226?228,CTG變成CTT)作為反向引物,進行一次PCR擴增,得到一次PCR產物。再在一次PCR產物中加入3’?OC4進行二次PCR擴增,得到一次突變的PCR產物;
4)二次突變
以上述一次突變的PCR產物為模板,以5’?OCT4B?265ATG作為正向引物,3’?OCT4B?164m 5’?CCGCAGCTTACAGACGTTCTTGA?3’(突變位點304?306,ATG變成GTC)為反向引物,行一次PCR擴增,得到一次PCR產物。再在一次PCR產物中加入3’?OC4進行二次PCR擴增,得到二次突變PCR產物。
5)pQCXIN?GFP?OCT4B?265(m)的獲得
將步驟4)得到的二次突變PCR產物產物經過AgeI和BsiWI酶切,與同樣經過酶切的pQCXIN?GFP連接,得到重組質粒為pQCXIN?OCT4B?265?GFP(m),經過測序,該質粒為將序列表中的序列4所示的核苷酸插入pQCXIN?GFP的AgeI和BsiWI位點間得到的載體。
3、OCT4B?265蛋白的亞細胞定位
將上述的載體pQCXIN?OCT4B?265?GFP(m)和pQCXIN?GFP用LipofectamineTM2000(Invitrogen,Carlsbad)轉染試劑分別轉染到MCF?7細胞中,得到MCF?7/pQCXIN?OCT4B?265?GFP(m)和MCF?7/pQCXIN?GFP,轉染后24小時進行如下兩組處理:
正常處理:將細胞MCF?7/pQCXIN?OCT4B?265?GFP(m)和MCF?7/pQCXIN?GFP在細胞培養基中培養12小時,得到265(ctrl)和GFP(ctrl);
絲裂霉素C處理:將細胞MCF?7/pQCXIN?OCT4B?265?GFP(m)和MCF?7/pQCXIN?GFP在含有絲裂霉素C(GR?311,Enzo Life Sciences International Inc.)的細胞培養基中培養12小時,絲裂霉素C在含有絲裂霉素C的細胞培養基中的濃度為5μg/ml,得到265(mmc)和GFP(mmc)。
用熒光顯微鏡觀察結果如圖2所示,265代表轉染OCT4B?265組,mmc代表絲裂霉素C處理組;從圖中看出,正常狀態(正常處理)下,265(ctrl)中OCT4B?265蛋白在細胞核和細胞質中都有分布;當受到基因毒性損傷(絲裂霉素C處理)時,265(mmc)中OCT?265蛋白傾向于在核內聚集。
實施例2、OCT4B?265蛋白促進細胞凋亡
1、腺病毒轉染
從北京諾賽基因公司購買了含有OCT4B?265(m)蛋白的編碼基因腺病毒(OCT4B?265(m)蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4)和陰性對照病毒;病毒的滴度均為1×1010pfu/ml。
按照生產廠家標準步驟將稀釋為不同滴度(MOI=70和MOI=35)的含有OCT4B?265(m)蛋白的編碼基因腺病毒和陰性對照病毒(MOI=35)轉染MCF?7細胞,分別得到不同滴度(MOI=70和MOI=35)轉染的轉基因細胞V?265和對照組V?null細胞。
上述轉染36小時的不同滴度(MOI=70和MOI=35)轉染的轉基因細胞V?265和對照組V?null細胞在含有絲裂霉素C(GR?311,Enzo Life Sciences International Inc.)的細胞培養基中分別培養,絲裂霉素C在含有絲裂霉素C的細胞培養基中的濃度為5μg/ml;12小時后,得到不同滴度(MOI=70和MOI=35)轉染的V?265c和V?nullc;以不進行應激處理為對照,得到不同滴度(MOI=70和MOI=35)轉染的V?265和V?null;以絲裂霉素C處理PA?1細胞作為陽性對照(PA?1mmc)。
將上述不同滴度(MOI=70和MOI=35)轉染的V?265c和V?null c、不同滴度(MOI=70和MOI=35)轉染的V?265和V?null各組細胞進行western blotting鑒定(提取蛋白和鑒定的方法同實施例1中的一),結果如圖3所示,V?null代表空病毒,MOI代表病毒的滴度,MMC代表絲裂霉素處理,CTRL代表不進行應激處理的正常細胞;可以看出,不同滴度轉染的V?265c和不同滴度的V?265均有目的蛋白的表達,說明得到陽性的轉基因細胞V?265。
2、細胞凋亡率檢測
將上述1中得到的且鑒定為陽性的V?265c(MOI=35)、V?null c(MOI=35)、V?265(MOI=35)和V?null(MOI=35)分別用約1×106個細胞進行凋亡檢測,具體用北京四正柏公司的Annexin V?FITC(檢測早期凋亡)和PI(檢測晚期凋亡)雙染試劑盒(SiZhengBai,Beijing,China)以及南京凱基生物的Annexin V?APC和7?AAD凋亡試劑盒對細胞樣品進行標記,按照說明書的標準步驟,然后將標記好的細胞用FACS?LSR流式細胞儀(BD Biosciences)進行檢測細胞凋亡率。
實驗重復三次,結果取平均值±標準差。
結果如圖4A1和圖4B所示,其中,圖4A1為V?265組和對照組V?null在受到絲裂霉素C處理后的凋亡率;絲裂霉素C處理后V?265組(V?265c)的凋亡率為26.38±1.38%;絲裂霉素C處理后對照組V?null(V?null c)的凋亡率為21.64±0.79%;從上述看出,過量表達OCT4B?265蛋白的MCF?7細胞在基因毒性損傷過程中的凋亡率比對照組細胞的凋亡率顯著升高。
圖4B為A1的流式細胞檢測散點圖,其中c代表經過絲裂霉素C的處理,可以看出,過量表達OCT4B?265蛋白的MCF?7細胞在基因毒性損傷過程中的凋亡率比對照組細胞的凋亡率顯著升高。
實施例3、與OCT4B?265蛋白表達相關基因
1、小干擾RNA轉染對過量表達OCT4B?265蛋白的MCF?7細胞凋亡率的影響
人的p53抑癌基因的核苷酸為序列表中的序列7。
人的p53小干擾RNA購自上海吉瑪公司,其正向序列為:5’CUACUUCCUGAAAACACGdTdT 3’(序列5);反向序列為:5’CGUUGUUUUCAGGAAGUAGdTdT3’(序列6)。
按照說明書的標準步驟,利用LipofectamineTM RNAiMAX(Invitrogen)轉染試劑,將人的p53小干擾RNA轉染到由實施例2的1得到的轉基因細胞V?265(經過鑒定為陽性,MOI=35)中,得到轉基因細胞p53i?V?265(MCF?7);
對照p53i?V?null細胞(MCF?7):將人的p53小干擾RNA轉染到由由實施例2的1得到的對照組V?null細胞中,得到對照p53i?V?null細胞(MCF?7);
將上述轉基因細胞p53i?V?265(MCF?7)和對照p53i?V?null細胞(MCF?7)進行western blot檢測細胞內磷酸化p53和總p53的量,提取蛋白的方法同實施例1中的一,p?p53的一抗為ab?1431(Abcam)抗體,1∶1000稀釋;二抗為Goat Anti?Rabbit,1858415(Pierce)1∶3000;total?p53的一抗為ab?7757(Abcam),1∶1000稀釋,二抗為Goat Anti?Mouse,1030?05(SouthernBiotech)1∶10000。
結果為細胞內有磷酸化p53和總p53表達的為陽性轉基因細胞p53i?V?265(MCF?7)和陽性對照p53i?V?null細胞(MCF?7)(與圖4C的p53i ctrl一致)。
將上述鑒定陽性的且轉染后36小時得到的轉基因細胞p53i?V?265(MCF?7)和對照p53i?V?null細胞(MCF?7)在含有絲裂霉素C(GR?311,Enzo Life SciencesInternational Inc.)的細胞培養基中培養,絲裂霉素C在含有絲裂霉素C的細胞培養基中的濃度為5μg/ml;12小時后,得到p53i?V?265c和p53i?V?null c;
將上述得到的p53i?V?265c和p53i?V?null c分別用約1×106個細胞進行凋亡檢測,具體用北京四正柏公司的Annexin V?FITC(檢測早期凋亡)和PI(檢測晚期凋亡)雙染試劑盒(SiZhengBai,Beijing,China)以及南京凱基生物的Annexin V?APC和7?AAD凋亡試劑盒對細胞樣品進行標記,按照說明書的標準步驟,然后將標記好的細胞用FACS?LSR流式細胞儀(BD Biosciences)進行檢測細胞凋亡率。
結果如圖4A2所示,為p53i?V?265(MCF?7)和對照組p53i?V?null(MCF?7)組在受到絲裂霉素C處理后的凋亡率;絲裂霉素C處理后p53i?V?265(MCF?7,p53i?V?265c)的凋亡率為15.83%;絲裂霉素C處理后對照組p53i?V?null(MCF?7,p53i?V?null c)的凋亡率為14.67%;可以看出,與圖4A1的絲裂霉素C處理后V?265組和對照組V?nul l相比,本實驗轉入p53小干擾RNA的p53i?V?265和p53i?V?null的凋亡率均降低;說明外源轉入的OCT4B?265蛋白表達受到抑癌基因p53的調節。
2、小干擾RNA轉染對PA?1中內源OCT4B?265蛋白表達的影響
按照上述1的方法將人的p53小干擾RNA轉染到PA?1細胞,得到p53i(PA?1),然后進行如下處理:
正常處理:將p53i(PA?1)細胞和PA?1細胞在細胞培養基中培養12小時,得到p53i ctrl和ctrl;
絲裂霉素C處理:將p53i(PA?1)細胞和PA?1細胞在含有絲裂霉素C的細胞培養基中培養12小時,絲裂霉素C在含有絲裂霉素C的細胞培養基中的濃度為5μg/ml,得到p53i mmc和mmc。
將處理12小時后的p53i ctrl和ctrl、p53i mmc和mmc分別按照實施例1的一的方法進行裂解細胞,Western Blot檢測,一抗為OCT4B?265抗體,二抗為Donkey Anti?Goat,sc?2020(SantaCruz)1∶10000。以p?p53(一抗為ab?1431(Abcam)抗體,1∶1000稀釋;二抗為Goat Anti?Rabbit,1858415(Pierce)1∶3000)、total?p53(一抗為ab?7757(Abcam),1∶1000稀釋,二抗為Goat Anti?Mouse,1030?05(SouthernBiotech)1∶10000)和Tubulin(Tubulin的抗體:T5168(Sigma?Aldrich)1∶3000,二抗為Goat Anti?Mouse,1030?05(SouthernBiotech)1∶10000)為內參對照。
結果如圖4C所示,可以看出,p53i(PA?1)細胞內有磷酸化p53和總p53表達,說明為陽性轉基因細胞,無論是否經過絲裂霉素C處理,p53i(PA?1)細胞比PA?1細胞中OCTB?265蛋白表達量降低,說明內源的OCT4B?265蛋白表達受到抑癌基因p53的調節。
上述可以看出,在細胞中過量表達OCT4B?265蛋白,可以增加細胞在應激基因毒性損傷中的凋亡率,且OCT4B?265蛋白的表達受到抑癌基因p53的調節。

關 鍵 詞:
OCT4B 蛋白 異構體 用途
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:OCT4B蛋白異構體的用途.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6418872.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大