鬼佬大哥大
  • / 15
  • 下載費用:30 金幣  

一種獲得抗真菌病害植物的方法.pdf

關 鍵 詞:
一種 獲得 真菌 病害 植物 方法
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201210041450.6

申請日:

2012.02.21

公開號:

CN103254299B

公開日:

2014.11.26

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 14/415申請日:20120221|||公開
IPC分類號: C07K14/415; C12N15/29; C12N15/82; C12N15/84; A01H5/00 主分類號: C07K14/415
申請人: 中國科學院微生物研究所
發明人: 夏桂先; 楊淳淋; 王付欣
地址: 100101 北京市朝陽區北辰西路1號院3號
優先權:
專利代理機構: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245 代理人: 關暢
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201210041450.6

授權公告號:

103254299B||||||

法律狀態公告日:

2014.11.26|||2013.09.18|||2013.08.21

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種獲得抗真菌病害植物的方法。本發明提供了GhMLP1蛋白在調控植物抗病性中的應用;所述GhMLP1蛋白是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列1衍生的蛋白質。本發明還保護一種培育轉基因植物的方法,是將GhMLP1蛋白的編碼基因導入目的植物中,得到抗病性高于所述目的植物的轉基因植物。本發明對于培育抗病植物,特別是抗真菌病害的植物具有重大價值。

權利要求書

權利要求書
1.   GhMLP1蛋白在調控植物抗病性中的應用;所述GhMLP1蛋白是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;
(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列1衍生的蛋白質。

2.   GhMLP1蛋白的編碼基因在培育抗病植物中的應用;所述GhMLP1蛋白是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;
(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列1衍生的蛋白質。

3.   如權利要求2所述的應用,其特征在于:所述GhMLP1蛋白的編碼基因為如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的DNA分子:
(1)序列表中序列2自5’末端第57至527位核苷酸所示的DNA分子;
(2)序列表中序列2自5’末端第57至530位核苷酸所示的DNA分子;
(3)序列表中序列2所示的DNA分子;
(4)在嚴格條件下與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子;
(5)與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子。

4.   如權利要求1至3中任一所述的應用,其特征在于:所述抗病為抗真菌病害;所述真菌具體為大麗輪枝菌或黑脛病菌。

5.   如權利要求1至4中任一所述的應用,其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物;所述雙子葉植物具體為煙草。

6.   一種培育轉基因植物的方法,是將GhMLP1蛋白的編碼基因導入目的植物中,得到抗病性高于所述目的植物的轉基因植物;所述GhMLP1蛋白是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;
(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列1衍生的蛋白質。

7.   如權利要求6所述的方法,其特征在于:所述GhMLP1蛋白的編碼基因為如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的DNA分子:
(1)序列表中序列2自5’末端第57至527位核苷酸所示的DNA分子;
(2)序列表中序列2自5’末端第57至530位核苷酸所示的DNA分子;
(3)序列表中序列2所示的DNA分子;
(4)在嚴格條件下與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子;
(5)與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子。

8.   如權利要求6或7所述的方法,其特征在于:所述GhMLP1蛋白的編碼基因通過重組載體導入所述目的植物中;所述重組載體具體為將所述GhMLP1蛋白的編碼基因插入載體pPZP?GFP的多克隆位點得到的重組質粒。

9.   如權利要求6至8中任一所述的方法,其特征在于:所述抗病為抗真菌病害;所述真菌具體為大麗輪枝菌或黑脛病菌。

10.   如權利要求6至9中任一所述的方法,其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物;所述雙子葉植物具體為煙草。

說明書

說明書一種獲得抗真菌病害植物的方法
技術領域
本發明屬于基因工程領域,涉及一種獲得抗真菌病害植物的方法。
背景技術
棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的棉花病害,也是制約我國棉花生產的主要病害。黃萎病菌能夠在短時間內引起棉花產生枯黃、萎蔫的病狀,造成棉苗大面積死亡,致使農民遭遇減產甚至絕收。
利用傳統的育種方法來進行抗病種質的篩選,不僅種質資源缺乏、周期長,而且還存在著抗病性不穩定等問題,難以取得突破性進展。因此,篩選抗病基因并研究其對黃萎病的抗病機制,利用基因工程手段,通過抗病基因的克隆和轉化來改良棉花的黃萎病抗性,是棉花抗黃萎病育種的一個重要方向。
發明內容
本發明的目的是提供一種獲得抗真菌病害植物的方法。
本發明提供了GhMLP1蛋白在調控植物抗病性中的應用;所述GhMLP1蛋白是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;
(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列1衍生的蛋白質。
所述抗病可為抗真菌病害。所述真菌具體可為大麗輪枝菌(如大麗輪枝菌V991)或黑脛病菌(如煙草黑脛病菌)。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為煙草,如Nicotiana tabacum L.(cv.Petit havana SR1)。
本發明還提供了GhMLP1蛋白的編碼基因在培育抗病植物中的應用;所述GhMLP1蛋白是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;
(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列1衍生的蛋白質。
所述GhMLP1蛋白的編碼基因為如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的DNA分子:
(1)序列表中序列2自5’末端第57至527位核苷酸所示的DNA分子;
(2)序列表中序列2自5’末端第57至530位核苷酸所示的DNA分子;
(3)序列表中序列2所示的DNA分子;
(4)在嚴格條件下與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子;
(5)與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子。
所述嚴格條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1%SDS的溶液中,65℃條件下雜交并洗膜。
所述抗病可為抗真菌病害。所述真菌具體可為大麗輪枝菌(如大麗輪枝菌V991)或黑脛病菌(如煙草黑脛病菌)。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為煙草,如Nicotiana tabacum L.(cv.Petit havana SR1)。
本發明還保護一種培育轉基因植物的方法,是將GhMLP1蛋白的編碼基因導入目的植物中,得到抗病性高于所述目的植物的轉基因植物;所述GhMLP1蛋白是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;
(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關的由序列1衍生的蛋白質。
所述GhMLP1蛋白的編碼基因為如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的DNA分子:
(1)序列表中序列2自5’末端第57至527位核苷酸所示的DNA分子;
(2)序列表中序列2自5’末端第57至530位核苷酸所示的DNA分子;
(3)序列表中序列2所示的DNA分子;
(4)在嚴格條件下與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子;
(5)與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關蛋白的DNA分子。
所述嚴格條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1%SDS的溶液中,65℃條件下雜交并洗膜。
所述GhMLP1蛋白的編碼基因可通過重組載體導入所述目的植物中。
攜帶有所述基因的重組載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導、基因槍等常規生物學方法轉化所述目的植物的細胞或組織。
所述重組載體為將所述GhMLP1蛋白的編碼基因插入骨架載體的多克隆位點得到的重組質粒。可用現有的表達載體構建含有所述基因的重組載體。所述表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于微彈轟擊的載體等。所述表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域,即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構建重組載體時,在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子,它們可單獨使用或與其它的啟動子結合使用;此外,使用本發明的基因構建重組載體時,還可使用增強子,包括翻譯增強子或轉錄增強子,這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等,但必需與編碼序列的閱讀框相同,以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于鑒定及篩選,可對所用表達載體進行加工,如加入編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。也可不加任何選擇性標記基因,直接根據表型篩選。所述重組載體具體可為將所述GhMLP1蛋白的編碼基因插入載體pPZP?GFP的多克隆位點得到的重組質粒。
所述抗病可為抗真菌病害。所述真菌具體可為大麗輪枝菌(如大麗輪枝菌V991)或黑脛病菌(如煙草黑脛病菌)。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為煙草,如Nicotiana tabacum L.(cv.Petit havana SR1)。
本發明對于培育抗病植物,特別是抗真菌病害的植物具有重大價值。
備注:本發明由農業部“轉基因生物新品種培育重大專項”(課題號:2009ZX08005?001B;2009ZX08010?001B)資助。
附圖說明
圖1為GhMLP1基因在不同組織器官中的表達特征。
圖2為GhMLP1基因對不同激素(水楊酸、茉莉酸、乙烯)的應答。
圖3為煙草離體葉片的大麗輪枝菌抗性分析。
圖4為煙草植株的大麗輪枝菌抗性分析。
圖5為煙草植株的黑脛病抗性分析。
圖6為接種煙草黑脛病菌9天后煙草的根部及葉片的癥狀比較。
圖7為煙草抗病相關基因的轉錄表達分析。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發明,但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗,均設置三次重復實驗,結果取平均值。
實施例中所用的陸地棉(Gossypium hirsutum)品種為BD18,大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)菌株為V991;陸地棉BD18和大麗輪枝菌V991公眾均可從中國科學院微生物研究所獲得;提及陸地棉BD18和大麗輪枝菌V991的參考文獻:Qu ZL,Wang HY,Xia GX,(2006)Ecotopic expression of the cotton nonsymbiotic hemoglobin gene GhHb1 triggers defense responses and increases disease tolerance in Arabidopsis.Plant Cell Physiol.47:1058?1068。
農桿菌EHA105:公眾均可從中國科學院微生物研究所獲得;參考文獻:Hood EE,Gelvin SB,Melchers LS,Hoekema A.(1993)New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants.Transgenic Res,2:208?218。
實施例中所用的煙草為Nicotiana tabacum L.(cv.Petit havana SR1),實施例中又稱為野生型植株,公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得;參考文獻:Ivana T,ML,VB,Veljkovi.(2007)Ultrasonic extraction of oil from tobacco(Nicotiana tabacum L.)seeds.Ultrasonics Sonochemistry 14(5):646?652。
載體pPZP?GFP:公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得;參考文獻:馬銀平,沈法富,夏桂先,王付欣,楊淳淋(2012).海島棉幾丁質酶基因GbCHI的克隆與功能分析.遺傳,V34(2)。
煙草黑脛病菌(Phytophtora parasitica var.nicotianae Tucker):貴州省煙草科學研究所。
實施例1、植物黃萎病抗性相關蛋白GhMLP1及其編碼基因的發現
利用SSH差異顯示方法,從陸地棉BD18中分離到黃萎病菌侵染應答的62號克隆。根據62號克隆的序列進行EST搜索,通過電子拼接,設計引物,以棉花cDNA為模板進行PCR擴增,得到一條含有完整ORF的序列,編碼序列表的序列1所示的蛋白。蛋白比對結果表明,該蛋白含有Bet V 1功能域,屬于Bet V 1家族MLP亞家族。
將序列表的序列1所示的蛋白質命名為GhMLP1蛋白。將編碼GhMLP1蛋白的基因命名為GhMLP1基因,其開放閱讀框如序列表的序列2自5’末端第57至527位核苷酸所示。
實施例2、GhMLP1基因的轉錄表達分析
一、GhMLP1基因在棉花不同組織器官中的表達特征分析
為了分析GhMLP1基因在不同組織器官中的表達特征,分別提取陸地棉BD18的根、莖、葉、花的總RNA并反轉錄為cDNA,進行實時熒光定量PCR分析,結果見圖1。結果表明,GhMLP1基因在根、莖、葉、花中都有表達,在根和莖中的表達量較高且相近。GhMLP1基因可能在棉花各器官中都能夠發揮作用,尤其在根和莖中可能有重要功能。
二、GhMLP1基因對不同激素(水楊酸、茉莉酸、乙烯)的應答
為了分析GhMLP1基因是否參與了依賴激素的相關防御途徑,用水楊酸、茉莉酸和乙烯處理水培棉花植株,分別在處理前(0小時),處理后3、4.5、6小時取樣。提取樣品的總RNA并反轉錄為cDNA,進行實時熒光定量PCR分析,結果見圖2。圖2中,A為水楊酸處理,B為茉莉酸處理,C為乙烯處理。水楊酸處理后GhMLP1基因轉錄水平降低,而茉莉酸和乙烯處理后GhMLP1基因轉錄水平升高。推測GhMLP1基因能夠對多種植物防御相關激素產生應答,在植物體內可能受它們的綜合調控。
實施例3、轉基因植物的獲得和鑒定
一、重組表達載體的構建
1、GhMLP1基因的克隆
提取陸地棉BD18的總RNA,將其反轉錄為cDNA。以cDNA為模板,用Primer?F和Primer?R組成的引物對進行PCR擴增,得到PCR擴增產物。PCR擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠回收試劑盒回收500bp左右的目的片段(序列表中序列2自5’末端第56至530位核苷酸所示的GhMLP1基因)。
Primer?F:5’?AAAGGATCCATGACGTCTTCAGCTCTGACAGG?3’(下劃線標注BamH Ⅰ酶切識別位點);
Primer?R:5’?AAAGAGCTCTCA TTAACTTGCTTGGGTGAGGT?3’(下劃線標注Sac Ⅰ酶切識別位點)。
PCR擴增體系(20μl):含有10×LA Buffer 5μl,MgCl22.5mmol/L,Primer?F與Primer?R各0.3μmol/L,dNTP 0.2mmol/L,LA Taq 3U,cDNA模板0.4μg;試劑和酶均購自Takara公司。
PCR擴增條件:95℃熱變性3min;94℃30s,58℃30s,72℃30s,20個循環;最后72℃延伸10min。
2、重組表達載體的構建
①用限制性內切酶BamH Ⅰ和Sac Ⅰ雙酶切步驟1回收的目的片段,回收酶切產物。
②用限制性內切酶BamH Ⅰ和Sac Ⅰ雙酶切載體pPZP?GFP,回收載體骨架(約9.9kb)。
③將步驟①的酶切產物和步驟②的載體骨架連接,得到重組質粒。根據測序結果,對重組質粒進行結構描述如下:在載體pPZP?GFP的BamH和Sac Ⅰ酶切位點之間插入了序列表的序列2自5’末端第57至527位核苷酸所示的GhMLP1基因。
二、轉基因植物的獲得
1、重組農桿菌的獲得
用步驟一得到的重組質粒轉化農桿菌EHA105,得到重組農桿菌。
2、轉基因煙草的獲得
利用重組農桿菌,通過葉盤轉化法(Horsch R.,Fry J.,Hoffmann N.,Eichholtz D.,Rogers S.,Fraley R.(1985)A simple and genaral method for transferring genes into plants.Science N.Y.227,1129?1136)將重組質粒導入煙草,得到T1代種子。
T1代種子收獲后在MS培養基(含有50mg/L的卡那霉素)中篩選抗性植株,將抗性植株移栽到土中,自交并收獲T2代種子。將T2代種子培育為植株(T2代植株)。
分別提取T1代植株和T2代植株的葉片的總RNA并反轉錄為cDNA,用Primer?F和Primer?R組成的引物對對來自各個樣本的cDNA進行PCR鑒定,PCR鑒定為陽性的植株即轉基因植株。對于某一T1代植株,如果其T2代植株均PCR鑒定為陽性,則該植株為純合的轉基因植株,該植株及其后代即為1個純合的轉基因株系。
T2代轉基因植株自交產生T3代種子。
隨機選取一個轉基因株系(株系1)的T3代種子進行步驟四的鑒定。
隨機選取三個轉基因株系(株系1、株系2和株系3)的T3代種子進行步驟五的鑒定。
三、轉空載體植株的獲得
用載體pPZP?GFP代替重組質粒,其它同步驟二,得到轉空載體植株的T3代種子。
四、轉基因煙草對大麗輪枝菌的抗性分析
1、離體葉片的大麗輪枝菌抗性分析
轉基因植株的T3代植株(100株)、轉空載體植株的T3代T3代植株(100株)、野生型植株的T3代植株(100株),分別進行如下抗病性鑒定(平行試驗):
從培養兩月的健康煙草植株上取下完全展開的葉片(從頂端向下第3片),用大麗輪枝菌進行非通透劃傷接種,保持葉片濕潤,7天后觀察離體葉片的生長情況。
結果見圖3。野生型植株的離體葉片在接種點附近因感病而失綠變黃,葉片壞死區域較大。轉基因煙草的離體葉片僅在接種點附近略微褪色變黃。野生型植株和轉空載體植株的離體葉片表型沒有顯著差異。上述結果表明,侵染后,轉基因植株對大麗輪枝菌的抗侵染能力顯著優于野生型植株。
2、植株的大麗輪枝菌抗性分析
轉基因植株的T3代植株種子(100粒),轉空載體植株的T3代種子(100粒),野生型植株的種子(100粒),分別進行如下抗病性鑒定(平行試驗):
將的種子播種在1/2MS培養基平板上,萌發7天后移栽至土壤培養三周,然后用大麗輪枝菌V991菌液(1×107個孢子/毫升)進行灌根接種,持續觀察植株的生長情況,接種6天后拍照。
野生型植株接種大麗輪枝菌后地上部明顯萎蔫,且萎蔫癥狀在一周內都持續存在,此后恢復健康生長。轉基因煙草接種大麗輪枝菌后最初出現輕微萎蔫癥狀,2天后即可恢復正常生長狀態。野生型植株和轉空載體植株的生長狀態沒有顯著差異。接種6天后的照片見圖4。結果表明,轉基因植株在大麗輪枝菌侵染后的抗病能力顯著優于野生型植株,具有較強抗侵染能力。
五、轉基因煙草對煙草黑脛病菌的抗性分析
轉基因植株的T3代植株種子(每個株系100粒),轉空載體植株的T3代種子(100粒),野生型植株的種子(100粒),分別進行如下抗病性鑒定(平行試驗):
將種子播種在1/2MS培養基平板上,萌發7天后移栽至土壤培養三周,然后用煙草黑脛病菌進行土埋菌絲接種(在0.5cm厚的淀粉培養基平板上培養煙草黑脛病菌,菌絲生長飽和后,按照1cm2/株接種菌塊;該方法的參考文獻:趙芳,趙正雄,徐發華,段鳳云,呂芬,朱凱,王德勛,楊煥文,徐信養.施氮量對煙株接種黑脛病前、后體內生理物質及黑脛病發生的影響,植物營養與肥料學報,2011,17(3):737?743),持續觀察植株的生長情況。
接種5天后的照片見圖5A。野生型植株的地上部明顯萎蔫,多數植株死亡,存活植株全株變黑或枯萎。多數轉基因煙草植株地上部未見倒伏,葉片基本生長正常,僅有少數植株出現萎蔫癥狀。
接種9天后,野生型植株已嚴重感病,從根部到植株地上部均發生腐化,病害延伸至葉肉組織后,葉片疏導組織已明顯變黑,根部瓦解,全株壞死呈現黑色,被病原體菌絲侵染而完全腐爛。接種9天后,轉基因植株的葉片尚未出現感病癥狀,植株地上部生長良好,在根部有輕微感病癥狀,出現少量壞死區域,但壞死區域未能擴散到莖部,根部完整,在植株的整個生育期內能夠維持健康長勢。野生型植株和轉空載體植株的生長狀態沒有顯著差異。植株的葉片和根的放大圖見圖6。接種9天后的存活率統計見圖5B。野生型植株的存活率僅為3%,轉基因株系植株的存活率均大于70%。野生型植株和轉空載體植株的生長狀態沒有顯著差異。結果表明,轉基因植株對煙草黑脛病菌的抗侵染能力顯著優于野生型植株。
上述結果表明,轉基因植株能夠抵御煙草黑脛病菌侵害,植株可以在含有病原體菌絲的土壤中生長,在植株的整個生育期內能夠維持健康長勢。
六、轉基因植株抗病相關基因的轉錄水平分析。
取三個轉基因株系的T2代植株進行抗病標志基因的轉錄表達RT?PCR檢測,結果如圖7所示。相比野生型植株,轉基因植株中的PR1b基因、PR4基因、AC0基因的轉錄水平都有升高,且各株系中PR1b基因、PR4基因、AC0基因的轉錄水平與GhMLP1基因轉錄水平呈明顯正相關。上述結果表明,過表達GhMLP1基因的煙草中,PR1b基因、PR4基因、AC0基因等相關抗病基因的轉錄強度大幅度升高,可能是轉基因煙草較野生型的抗真菌病害能力顯著增加的原因之一。

關于本文
本文標題:一種獲得抗真菌病害植物的方法.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6418882.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大 5554301074988447919345846054447018611351380818324238912971373222150157769645732346670863346907180 (function(){ var bp = document.createElement('script'); var curProtocol = window.location.protocol.split(':')[0]; if (curProtocol === 'https') { bp.src = 'https://zz.bdstatic.com/linksubmit/push.js'; } else { bp.src = 'http://push.zhanzhang.baidu.com/push.js'; } var s = document.getElementsByTagName("script")[0]; s.parentNode.insertBefore(bp, s); })();