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河蜆糖胺聚糖及其制備方法和用途.pdf

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河蜆糖胺 聚糖 及其 制備 方法 用途
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摘要
申請專利號:

CN201210062864.7

申請日:

2012.03.12

公開號:

CN102603911B

公開日:

2014.11.26

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C08B 37/00申請日:20120312|||公開
IPC分類號: C08B37/00; A61P35/00 主分類號: C08B37/00
申請人: 浙江大學
發明人: 劉東紅; 廖寧波; 陳士國; 葉興乾
地址: 310027 浙江省杭州市西湖區浙大路38號
優先權:
專利代理機構: 杭州中成專利事務所有限公司 33212 代理人: 金祺
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210062864.7

授權公告號:

102603911B||||||

法律狀態公告日:

2014.11.26|||2012.09.26|||2012.07.25

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種河蜆糖胺聚糖的制備方法,包括下列步驟:(1)河蜆預處理;(2)河蜆脫脂;(3)超聲波處理;(4)木瓜蛋白酶酶解;(5)TCA沉淀;(6)溶解;(7)離心取上清后,氯化十六烷基吡啶(CPC)沉淀多糖;(8)鹽溶去除CPC;(9)乙醇沉淀,干燥;(10)經截留分子量7000Da的透析袋透析后冷凍干燥,得凍干后的河蜆糖胺聚糖粗品。上述河蜆糖胺聚糖粗品經DEAE-Cellulose陰離子交換柱層析,能近一步純化河蜆糖胺聚糖粗品,從而得河蜆糖胺聚糖的精糖。本發明方法制備而得的河蜆糖胺聚糖能用于抑制胃癌細胞或卵巢癌細胞的生長活性。

權利要求書

1.河蜆糖胺聚糖的制備方法,其特征是包括以下步驟:
1)、河蜆預處理:
將新鮮的河蜆冷凍干燥后粉碎,得河蜆粉末;
2)、河蜆脫脂:
將河蜆粉末于2~6℃的丙酮中浸泡20~28h,室溫抽濾至干燥,得脫脂后河蜆粉末;
3)、超聲波處理:
向脫脂后河蜆粉末中加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH?6.0),于190~475W的超聲
功率下超聲10~30min,得超聲處理液;所述河蜆粉末與醋酸-醋酸鈉緩沖液的料液比為:
1g/25~35ml;
4)、木瓜蛋白酶酶解:
向超聲處理液中加入乙二胺四乙酸和L-半胱氨酸,從而使乙二胺四乙酸和L-半胱氨
酸的終濃度均分別為4.8~5.2mM;混勻后升溫至55~65℃,再加入木瓜蛋白酶保溫水解
30~110min,所述木瓜蛋白酶是河蜆粉末質量的1.4~1.6%;最后再加入用以沉淀蛋白的三
氯乙酸至終濃度50g/L;于3~5℃靜置20~40min;
5)、沉淀:
將步驟4)所得的酶解液離心,收集上清,向上清中加2.8~3.2體積倍的質量濃度為5%
的乙酸鉀乙醇溶液,于3~5℃靜置10~14小時;
6)、溶解:
將步驟5)所得的溶液離心,所得的沉淀先用無水乙醇洗滌,烘干至恒重后,得干燥
后沉淀;在干燥后沉淀中加入摩爾濃度為0.2M的NaCl溶液,所述干燥后沉淀與NaCl溶液
的料液比為1g/30~50ml;再次離心,收集上清;
7)、CPC沉淀:
向步驟6)所得的上清中加入質量濃度為5%的氯化十六烷基吡啶溶液,離心收集沉淀;
所述氯化十六烷基吡啶溶液與上述步驟6)中的干燥后沉淀的料液比為1g/0.4~0.6ml;
8)、鹽溶:
步驟7)所得的沉淀用2.5M的NaCl溶液溶解,所述NaCl溶液與上述步驟6)中的干燥
后沉淀的料液比為1g/8~12ml;
9)、醇沉:
向步驟8)所得的溶液中加入4.5~5.5體積倍的無水乙醇,直至沉淀出現后離心,收集
沉淀;
10)、透析:
將步驟9)所得的沉淀加水溶解后,經截留分子量7000Da的透析袋透析后冷凍干燥,
得凍干后的河蜆糖胺聚糖粗品。
2.根據權利要求1所述的河蜆糖胺聚糖的制備方法,其特征是:將凍干后的河蜆糖胺
聚糖粗品依次進行以下步驟:
①、DEAE-cellulose?DE-52離子交換柱層析:
DEAE-cellulose?DE-52層析柱(15cm×5cm)用醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH6.0)
以10ml/min流速平衡體系后,將凍干后的糖胺聚糖粗品5g用8~12ml上述醋酸-醋酸鈉緩沖
液(0.1M,pH6.0)溶解后加入層析柱中,再次用醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH6.0)平衡
體系90min后,用洗液進行均勻洗脫;
所述洗液為:以NaCl和醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH6.0)配制而得;所述NaCl在洗
脫液中的線性梯度濃度為0M-1.5M;
②、檢測洗脫后所收集的液體中有糖醛酸特有吸收峰和硫酸化糖胺聚糖特有吸收峰的
樣品,3體積倍醇沉,沉淀收集透析后,冷凍干燥,得河蜆糖胺聚糖的精糖。
3.根據權利要求2所述的河蜆糖胺聚糖的制備方法,其特征是:將河蜆糖胺聚糖的精
糖進行Sephacryl-300HR柱層析:
將1g河蜆糖胺聚糖的精糖溶于1~2ml,0.2M?NaCl溶液后,加入Sephacryl-300HR層析
柱中,以醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH6.0)為洗液,0.2ml/min流速,收集洗脫液;用
硫酸-苯酚法檢測收集的洗脫液中糖的特征吸收峰,收集各洗脫峰;得河蜆糖胺聚糖的精
糖成分CFGS-2。
4.利用如權利要求1、2或3所述的制備方法所得的河蜆糖胺聚糖的用途,其特征是:
用于抑制胃癌細胞或卵巢癌細胞的生長活性。
5.根據權利要求4所述的河蜆糖胺聚糖的用途,其特征是:所述胃癌細胞為SGC7901,
所述卵巢癌細胞為A2780或SKOV3。

說明書

河蜆糖胺聚糖及其制備方法和用途

技術領域

本發明涉及一種來源于河蜆的糖胺聚糖及其超聲輔助制備方法和用途;屬于生物技
術天然活性物質提取領域。

背景技術

糖胺聚糖(glycosaminoglycan),曾稱為黏多糖,為雜多糖的一種,由重復的二糖單
位構成的長鏈多糖,其二糖單位之一是氨基己糖(氨基葡萄糖或氨基半乳糖),故稱糖胺
聚糖;另一個是糖醛酸。通常分為4類:(1)透明質酸(HA)、(2)硫酸角質素、(3)硫
酸軟骨素(CS)和硫酸皮膚素(DS)、(4)肝素(Hep)和硫酸乙酰肝素(HS)。糖胺聚糖
是細胞間質的重要組成部分,細胞間質絕大部分都是糖胺聚糖。因此,在自然界中有廣泛
的分布,在動物界、植物界以及細菌界均有相關報道。

高血壓、高血脂、糖尿病、冠心病、惡性腫瘤等所謂現代“文明病”的發病率居高
不下,時刻威脅著地球上每一個人的身心健康。研究表明糖胺聚糖具有抗凝血、抗腫瘤、
抗病毒、增強免疫等多種活性并且對以上“文明病”有一定的治療效果,在治療以上現代
病尤其是在抑制惡性腫瘤細胞生長的治療中效果極其顯著。如海參糖胺聚糖可以使腫瘤內
毛細血管量減少,出血壞死區變小,癌周淋巴細胞反應明顯,癌細胞浸潤減輕或無,電鏡
觀察可發現瘤細胞內細胞器減少,線粒體腫脹,粗面內質網擴張和脫顆粒,以及多聚核糖
體解聚等,因此,近年來在臨床病理及藥學領域備受關注。

糖胺聚糖分布廣泛,對不同種類的無脊椎動物的綜合研究發現,不同的物種同樣存在
著硫酸軟骨素、硫酸角質素、肝素、硫酸乙酰肝素類似物。之前的研究也表明不同的軟體
動物都存在著肝素。如Mercenaria?mercenaria存在著一類肝素類似物。Anomalocardia?
brasiliana,Ti?ela?mactroides,Tapes?phylippinarum中分離到具有抗凝血活性的肝素類似物。
此外,從其它的軟體動物門中也分離到了DS,CS以及硫酸角質素。

然而,商業上的硫酸軟骨素、硫酸角質素及肝素主要是以脊椎動物為原料的。然而近
年來發現,以脊椎動物為原料存在著各種各樣的問題,如存在病原體污染(瘋牛病)及一
些地區的宗教限制(豬硫酸角質素)。再者,非動物來源的糖胺聚糖如化學合成、酶解合
成及重組體合成不能作為藥物被運用。種種原因需要我們去找到新的糖胺聚糖來源。

河蜆是一種淡水貝類,外殼或呈黃綠色、棕黃色,或呈黑褐色。河蜆營養豐富,內臟
可同食,故人體很容易吸收河蜆所含有的鈣、鐵、碘等元素,是高蛋白質低脂肪的食物。
據有關專家測定,每100克蜆肉含蛋白質15克,脂肪僅3克,還含有多種維生素、碳水
化合物和鈣、磷、鐵、硒等人體所需的營養物質。有較高的藥用價值和食用功效。《本草
綱目》稱“蜆肉能下濕氣,利小便”。現代有關資料也記載河蜆有清熱解毒、明目利尿、
利濕等功效。適量食用蜆肉可以治療疔瘡腫毒、濕熱黃疸、小便不利等癥,還能促進產婦
乳汁分泌。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種河蜆糖胺聚糖及其制備方法和用途。

為了解決上述技術問題,本發明提供一種河蜆糖胺聚糖的制備方法,包括以下步驟:

1)、河蜆預處理:

將新鮮的河蜆冷凍干燥后粉碎,得河蜆粉末;

2)、河蜆脫脂:

將河蜆粉末于2~6℃的丙酮中浸泡20~28h,室溫抽濾至干燥,得脫脂后河蜆粉末;

3)、超聲波處理:

向脫脂后河蜆粉末中加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH?6.0),于190~475W的超聲
功率下超聲10~30min,得超聲處理液;所述河蜆粉末與醋酸-醋酸鈉緩沖液的料液比為:
1g/25~35ml;

4)、木瓜蛋白酶酶解:

向超聲處理液中加入乙二胺四乙酸(EDTA)和L-半胱氨酸,從而使乙二胺四乙酸
(EDTA)和L-半胱氨酸的終濃度均分別為4.8~5.2mM;混勻后升溫至55~65℃,再加入木瓜
蛋白酶保溫水解30~110min(較佳為70~110min),木瓜蛋白酶是河蜆粉末質量的1.4~1.6%;
最后再加入用以沉淀蛋白的三氯乙酸(TCA)至終濃度50g/L;于3~5℃靜置20~40min;

5)、沉淀:

將步驟4)所得的酶解液離心,收集上清,向上清中加2.8~3.2體積倍的質量濃度為5%
的乙酸鉀乙醇溶液,于3~5℃靜置10~14小時;

6)、溶解:

將步驟5)所得的溶液離心,所得的沉淀先用無水乙醇洗滌,烘干至恒重后,得干燥
后沉淀;在干燥后沉淀中加入摩爾濃度為0.2M的NaCl溶液,所述干燥后沉淀與NaCl溶液
的料液比為1g/30~50ml;再次離心,收集上清;

7)、CPC沉淀:

向步驟6)所得的上清中加入質量濃度為5%的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液,離心
收集沉淀;所述氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液與上述步驟6)中的干燥后沉淀的料液比
為1g/0.4~0.6ml;

8)、鹽溶:

步驟7)所得的沉淀用2.5M的NaCl溶液溶解,所述NaCl溶液與上述步驟6)中的干燥
后沉淀的料液比為1g/8~12ml;

9)、醇沉:

向步驟8)所得的溶液中加入4.5~5.5體積倍的無水乙醇,直至沉淀出現后離心,收集
沉淀;

10)、透析:

將步驟9)所得的沉淀加水溶解后,經截留分子量7000Da的透析袋透析后冷凍干燥,
得凍干后的河蜆糖胺聚糖粗品。

作為本發明的河蜆糖胺聚糖的制備方法的改進:將凍干后的河蜆糖胺聚糖粗品依次
進行以下步驟:

①、DEAE-cellulose?DE-52離子交換柱層析:

DEAE-cellulose?DE-52層析柱(15cm×5cm)用醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH6.0)
以10ml/min流速平衡體系90min后(柱體積約500ml),將凍干后的糖胺聚糖粗品5g用8~12ml
上述醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH6.0)溶解后加入層析柱中,再次用醋酸-醋酸鈉緩沖
液(0.1M,pH6.0)平衡體系90min后,用洗液進行均勻洗脫;

洗液為:以NaCl和醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH6.0)配制而得;所述NaCl在洗脫液
中的線性梯度濃度為0M-1.5M;

②、檢測洗脫后所收集的液體中有糖醛酸特有吸收峰(硫酸-咔唑法)和硫酸化糖胺
聚糖(二甲基亞甲基藍法,DMB)特有吸收峰的樣品,3體積倍醇沉,沉淀收集透析后,
冷凍干燥,得河蜆糖胺聚糖的精糖。

作為本發明的河蜆糖胺聚糖的制備方法的進一步改進:將河蜆糖胺聚糖的精糖進行
Sephacryl-300HR柱層析:

將1g河蜆糖胺聚糖的精糖溶于1~2ml,0.2M?NaCl溶液后,加入Sephacryl-300HR層析
柱中,以醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH6.0)為洗液,0.2ml/min流速,收集洗脫液;用
硫酸-苯酚法檢測收集的洗脫液中糖的特征吸收峰,收集各洗脫峰;得河蜆糖胺聚糖的精
糖成分CFGS-2。注:洗脫液用自動部分收集器收集,一般每管4ml。

本發明還同時公開了利用上述制備方法所得的河蜆糖胺聚糖的用途:用于抑制胃癌細
胞或卵巢癌細胞的生長活性。

作為本發明的河蜆糖胺聚糖的用途的改進:胃癌細胞為SGC7901,卵巢癌細胞為A2780
或SKOV3。

本發明解決的一個技術問題彌補了現有存在技術中提取率較低,提取時間過長的不
足,提出一種新的可作為抑制癌細胞生長的糖胺聚糖,它來源于河蜆,藥效好,無毒害及
其它不良副作用。

本發明解決的一個技術問題彌補了現有存在技術的不足,提供了一種超聲波輔助制備
河蜆糖胺聚糖的新方法,以便有效快速地提取河蜆糖胺聚糖,并提高其純度,平衡河蜆糖
胺聚糖得率、制備時間和純度之間的關系。

本發明提供了一種新的來源于河蜆的糖胺聚糖,并建立了一種有效的制備河蜆糖胺聚
糖的方法,在對河蜆組織進行酶解作用之前,結合超聲波提取技術,即首先采用超聲波處
理河蜆組織,再用木瓜蛋白酶酶解,這樣大大縮短了酶解時間,增強了酶解的效率。同時
為了提高河蜆糖胺聚糖的純度,本發明綜合運用了三氯乙酸去除蛋白質、氯化十六烷基吡
啶(CPC)沉淀法和乙醇沉淀法。本發明能夠平衡河蜆糖胺聚糖制備效率和純度的關系,
大大縮短了提取時間,提高了純度。

在本發明中,原料能通過市購的方式獲得,新鮮的河蜆冷凍干燥后的蜆干可購自湖州
凡人食品公司;木瓜蛋白酶可購自杭州昊天生物公司產品;氯化十六烷基吡啶(CPC)、
氯化鈉、EDTA、L-半胱氨酸、醋酸鈉、無水乙醇、丙酮、三氯乙酸、硫酸、咔唑、二甲
基亞甲基藍可購自國藥集團化學試劑有限公司;透析袋7000Da(杭州越欣);
DEAE-Cellulose-DE52(上海索萊寶生物科技有限公司)

本發明所涉及的儀器中Scientz-IID型超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份
有限公司;TSK-GEL?G3000SWXL(北京綠百草科技發展有限公司);恒溫水浴鍋(國華
電器有限公司);冷凍干燥機(thermo?SuperModulyo);pH劑(TP-311,北京時代新維測
控設備股份有限公司);離心機(Hitachi?CP100WX)。

本發明所得的河蜆糖胺聚糖黏性較強,粗糖呈棕黃色,精糖呈現亮白色,如圖1所示。
最終所得的河蜆糖胺聚糖CFGS-2的分子量在12000Da,單糖組成分析表明該糖胺聚糖含葡
萄糖醛酸、葡萄糖等。其純度檢測圖如圖3所示,其單糖組成分析圖如圖4所示。其對胃癌
細胞(SGC7901)的IC50為0.028mg/ml、卵巢癌細胞(A2780)的IC50為0.364mg/ml、卵巢癌
細胞(SKOV3)的IC50為0.157mg/ml。

特別要指出的是,本發明所得的河蜆糖胺聚糖對胃癌細胞(SGC7901)、卵巢癌細胞
(A2780/A2780)也具有很好的抑制效果;因此,河蜆糖胺聚糖的發現將對胃癌及卵巢癌細
胞抑制藥物的開發打開一扇新的大門。

附圖說明

下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。

圖1是過Cellulose?DE-52柱(A前,B后)河蜆糖胺聚糖(即,A為河蜆糖胺聚糖粗品,
B為河蜆糖胺聚糖的精糖)。

圖2是河蜆精糖(河蜆糖胺聚糖的精糖)經Sephacryl-300HR柱層析(硫酸-苯酚法檢
測)。

圖3是河蜆糖胺聚糖的精糖成分CFGS-2的純度檢測(TSK?Gel?G3000SWxL);

圖4是河蜆糖胺聚糖CFGS-2單糖組成分析:

PMP柱前衍生高效液相色譜法檢測河蜆糖胺聚糖CFGS-2的單糖組成,以乳糖為內標;
A:不同單糖標準品的PMP衍生;1甘露糖,2氨基葡萄糖,3鼠李糖,4葡萄糖醛酸,5
半乳糖醛酸,6乳糖,7氨基半乳糖,8葡萄糖,9半乳糖,10木糖,11阿拉伯糖,12巖
藻糖。B:河蜆糖胺聚糖CFGS-2的單糖分析其中還有(2氨基葡萄糖,6乳糖,7氨基
半乳糖,8葡萄糖,9半乳糖,12巖藻糖);各單糖組成的摩爾質量比為:氨基葡萄糖∶
乳糖∶氨基半乳糖∶葡萄糖∶半乳糖∶巖藻糖=2∶17∶2∶17∶5∶5。

具體實施方式

下面結合具體的實施案例對本發明進一步詳細說明

實施例1、一種河蜆糖胺聚糖的制備方法,依次進行以下步驟:

1)、原料預處理:

將新鮮河蜆經-80℃冷凍過夜(12小時)后置于冷凍干燥機-50℃干燥24h,再經粉碎
機粉碎后過篩(40目),得河蜆粉末;

2)、脫脂:

稱取1g的河蜆粉末于4℃丙酮中浸泡24h,室溫抽濾至干燥(恒重);得脫脂后河蜆
粉末;

3)、超聲處理:

向步驟2)所得的脫脂后河蜆粉末中加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH?6.0)30ml
(即,物料比W∶V=1∶30)超聲時間30min,功率190W。

4)、酶解:

向步驟3)所得的超聲處理液中加入EDTA(乙二胺四乙酸)和L-半胱氨酸,從而使
EDTA和L-半胱氨酸的終濃度均分別為5mM;混勻后升溫至60℃,再加入15mg木瓜蛋
白酶于振蕩水浴鍋(200rpm)保溫水解110min;最后再加入TCA(從而使TCA的終濃度
為50g/L)用以沉淀蛋白,于4℃靜置30min。

5)、沉淀:

將步驟4)所得的酶解液離心(8000rpm,20min)去除沉淀后收集上清,向上清中加
3倍體積的質量濃度為5%的乙酸鉀乙醇溶液,4℃過夜靜置(即靜置12小時)。

6)、溶解:

將步驟5)所得的溶液離心(8000rpm,30min)收集沉淀。用無水乙醇洗滌并于50℃
烘箱中烘干(至恒重)沉淀后,得干燥后沉淀。

向干燥后沉淀中加入濃度為0.2M的NaCl溶液(干燥后沉淀與該NaCl溶液的質量/
體積=1g∶40ml)。再次離心(8000rpm,30min)棄去沉淀中不溶解的物質;同時收集上
清。

7)、CPC沉淀:

向步驟6)收集的上清中加入質量濃度為5%的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液,會出
現沉淀,離心(8000rpm,30min),收集沉淀。

氯化十六烷基吡啶溶液與上述步驟6)中的干燥后沉淀的料液比為1g/0.5ml。

8)、鹽溶:

將步驟7)所得的沉淀用2.5M的NaCl溶液溶解,NaCl溶液與上述步驟6)中的干
燥后沉淀的料液比為1g/10ml;

9)、醇沉:

向步驟8)所得的溶液中加入5倍體積的無水乙醇,沉淀出現后,離心(10000rpm,
30min),收集沉淀。

10)、透析:

步驟9)所得的沉淀加水溶解(水的用量只需能溶解該沉淀即可,約1ml)后,經透
析袋(截留分子量7000Da,扁寬10mm)透析后,得透析溶液。

透析溶液經-80℃冷凍過夜后置于冷凍干燥機于-50℃干燥24h,得凍干后的河蜆糖胺
聚糖粗品240mg。

注:提取率以此處的粗糖(河蜆糖胺聚糖粗品)與河蜆干粉(即,步驟2)的河蜆粉
末)計算。

改變實施例1的步驟3)中的超聲功率(P)、超聲時間(UT)、步驟4)中的水解時間
(ET),從而得到不同的案例。具體如表1所示,每個案例所對應的收率也同表1所示。

表1、不同超聲頻率、時間、不同水解時間對糖胺聚糖得率的影響


注:P:功率,UT(min):超聲時間,ET(min):酶解時間,V(%):提取率。

實施例2、制備河蜆糖胺聚糖的精糖:

1)、DEAE-cellulose?DE-52離子交換柱層析:

DEAE-cellulose?DE-52層析柱(15cm×5cm)用醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH?6.0)
以10ml/min流速平衡體系90min后(柱體積約500ml),將凍干后的糖胺聚糖粗品(上述實施
例1所得)5g用10ml醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH?6.0)溶解后加入上述層析柱中,再
次用醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH?6.0)平衡體系90min(以10ml/min流速)后,用洗
液進行均勻洗脫。

洗液是NaCl和醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH6.0)配制而得的溶液;NaCl在洗液中的
濃度為0M-1.5M的線性梯度(可依靠梯度混合儀自動生成),洗液的總用量為1000ml。洗
液的流速為1ml/min,于分布收集器中每10min收集一管;即,每管10ml,共收集100管。

2)、檢測不同收集管的洗脫液中是否有糖醛酸特有吸收峰(硫酸-咔唑法)和硫酸化
糖胺聚糖(二甲基亞甲基藍法,DMB),具體如下:

a)硫酸-咔唑法:

從收集管中(10ml洗脫液)取0.5ml洗脫液,在冰浴中預冷后逐滴加入0.0125mol/L
四硼酸鈉硫酸溶液2.5ml。振搖混合,在沸水浴中煮沸5min。以冰浴冷卻至室溫,加入質
量濃度0.125%咔唑無水乙醇溶液0.1ml。搖勻后,在沸水浴中煮沸10min。冷卻搖勻后
觀察顏色變化,如有顏色變化(呈紫紅色),則該收集管中的其余洗脫液需要收集。可在530
nm處測定吸收度。

b)、二甲基亞甲基藍法:

用移液槍從a)步驟收集的洗脫液中(還剩9.5ml洗脫液)取100μl洗脫液加入到比色
皿中,沿著比色皿壁加入2.5mL顯色劑(稱取16mg二甲基亞甲基藍,3.04g甘氨酸和2.37g
NaCl溶于900mL去離子水中,利用濃HCl調整pH至3.00,去離子水定容至1L),放
置4~6min后觀察顏色變化。如有顏色變化(呈藍色),則收集該收集管中的剩余洗脫液。
可在測量520nm處吸光度。

同時滿足上述有糖醛酸特有吸收峰和硫酸化糖胺聚糖特有吸收峰的洗脫液進行收集
(第15管~第45管的洗脫液同時符合上述2種條件)。將滿足上述要求的洗脫液匯總后用
3體積倍的乙醇沉淀,沉淀收集透析(截留分子量7000Da,扁寬10mm)后冷凍干燥(-50℃
干燥24h),得河蜆糖胺聚糖的精糖CFGS。

實施例3、Sephacryl-300HR柱層析

將實施例2所得的河蜆糖胺聚糖的精糖CFGS(簡稱河蜆精糖)1g溶于1ml,0.2M?NaCl
溶液后,加入Sephacryl-300HR層析柱中,以醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1M,pH6.0)為洗液,
以0.2ml/min流速進行洗脫,收集洗脫液(每管4ml),檢測收集的洗脫液中糖的特征吸收
峰(硫酸-苯酚法)。硫酸苯酚法:取收集的洗脫液0.5ml于玻璃試管中,加入0.5ml,0.6M苯
酚溶液后再加入2.5ml濃硫酸(分析純,95.5%),室溫放置20分鐘以后于490nm測光密
度。以水按同樣顯色操作為空白,橫坐標為收集的試管數,縱坐標為光密度值,收
集各洗脫峰如圖2。所得的河蜆糖胺聚糖的精糖成分CFGS-2經氨基酸測定儀、PMP柱
前衍生高效液相色譜法進行檢測,各項性能理化指標如表2和圖2~圖4所示。

表2、河蜆糖胺聚糖精糖CFGS-2的氨基酸組成


河蜆糖胺聚糖精糖CFGS-2中氨基酸的含量(104.60mg/g)

實驗1、將本發明實施例2所得的河蜆糖胺聚糖的精糖CFGS和實施例3所得的河蜆
糖胺聚糖的精糖成分CFGS-2按照四氮唑藍還原法(MTT法)法進行抗腫瘤細胞活性的測
定;所得結果如表3所示。

表3、抗腫瘤細胞活性的對比


FLB:海參糖胺聚糖,TAXOL:泰素(紫杉醇),SGC7901:胃癌細胞,A2780/SKOV3:卵巢癌
細胞。

最后,還需要注意的是,以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然,本發明
不限于以上實施例,還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直
接導出或聯想到的所有變形,均應認為是本發明的保護范圍。

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