鬼佬大哥大
  • / 10
  • 下載費用:30 金幣  

一種杜仲提取物及其用途.pdf

關 鍵 詞:
一種 杜仲 提取物 及其 用途
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201310027831.3

申請日:

2013.01.25

公開號:

CN103040915B

公開日:

2014.12.24

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 著錄事項變更IPC(主分類):A61K 36/46變更事項:發明人變更前:譚湘陵 羌利民 張艷紅 錢曉偉變更后:錢曉偉 譚湘陵 張艷紅 羌利民|||授權|||著錄事項變更IPC(主分類):A61K 36/46變更事項:發明人變更前:譚湘陵 羌利民 張艷紅 張謙 錢曉偉變更后:譚湘陵 羌利民 張艷紅 錢曉偉|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 36/46申請日:20130125|||公開
IPC分類號: A61K36/46; A61P19/10 主分類號: A61K36/46
申請人: 南通大學
發明人: 譚湘陵; 羌利民; 張艷紅; 錢曉偉
地址: 226019 江蘇省南通市嗇園路9號
優先權:
專利代理機構: 南京知識律師事務所 32207 代理人: 汪旭東
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201310027831.3

授權公告號:

|||103040915B|||||||||

法律狀態公告日:

2018.04.27|||2014.12.24|||2013.07.24|||2013.05.15|||2013.04.17

法律狀態類型:

著錄事項變更|||授權|||著錄事項變更|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供了一種杜仲提取物,由如下步驟制備而成:(1)以杜仲為提取原料,用醇與水的混合溶液進行提取;(2)將步驟(1)的提取液經中性氧化鋁層析柱除去色素,收集洗脫液,濃縮;(3)使用有機溶劑萃取步驟(2)得到的洗脫液,得到杜仲提取物。本發明還提供了本發明所述杜仲提取物在在制備預防和治療骨代謝異常疾病的藥物組合物中的應用。

權利要求書

權利要求書一種杜仲提取物,其特征在于由如下步驟制備而成:
(1)以杜仲為提取原料,用醇與水的混合溶液進行提取;
(2)將步驟(1)的提取液經中性氧化鋁層析柱除去色素,收集洗脫液,濃縮;
(3)使用有機溶劑萃取步驟(2)得到的洗脫液,得到杜仲提取物。
如權利要求1所述的杜仲提取物,其特征在于所述步驟(1)醇與水的混合溶液為甲醇、乙醇或異丙醇中的一種或幾種與水任意比例的混合物。
如權利要求2所述的杜仲提取物,其特征在于所述步驟(1)具體為取鹽杜仲粉,60%乙醇室溫浸泡10分鐘,充分溶脹,60℃浸提30分鐘,過濾,殘渣再用60%乙醇60℃浸提30分鐘,合并兩次提取液。
如權利要求1所述的杜仲提取物,其特征在于所述步驟(2)中性氧化鋁為100?200目。
如權利要求4所述的杜仲提取物,其特征在于所述步驟(2)采用95%的乙醇進行洗脫。
如權利要求1所述的杜仲提取物,其特征在于所述步驟(3)有機溶劑為乙醚、氯仿、正丁醇中的一種或幾種混合物。
如權利要求6所述的杜仲提取物,其特征在于所述步驟(3)萃取次數為3次。
如權利要求1?7之一所述的杜仲提取物在在制備預防和治療骨代謝異常疾病的藥物組合物中的應用。
如權利要求8所述的應用,其特征在于所述的藥物組合物中含權利要求1?7之一所述的杜仲提取物以及藥學上可以接受的載體。
如權利要求8所述的應用,其中所述骨代謝異常疾病包括:骨質疏松癥、藥物療法繼發的或者由于藥物療法導致的骨損失、與不活動和空間飛行有關的骨損失和與類風濕性關節炎、骨質減少、成骨不全、甲狀腺機能亢進、神經性厭食癥、器官移植、人工關節松動有關的骨損失。

說明書

說明書一種杜仲提取物及其用途
技術領域
本發明屬于醫藥領域,具體涉及一種杜仲提取物及其用途。
背景技術
杜仲為杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)的干燥樹皮,是中國名貴滋補藥材。具補肝腎、強筋骨、降血壓、安胎等諸多功效。《神農本草經》列為上品。謂其“主治腰膝痛,補中,益精氣,堅筋骨,除陰下癢濕,小便余瀝。久服,輕身耐老。”杜仲是中國特有藥材,其藥用歷史悠久,在臨床有著廣泛的應用。
近年來,國內外專家對杜仲成分進行了反復細致的研究,杜仲游離氨基酸極少,含有的少量蛋白質,是和絕大多數食品類似的完全蛋白,即能夠水解檢出對人體必需的8種氨基酸。測定了杜仲所含的15種礦物元素,其中有鋅、銅、鐵等微量元素,及鈣、磷、鉀、鎂等宏量元素。 
杜仲具有補肝腎,強筋骨,清除體內垃圾,加強人體細胞物質代謝,防止肌肉骨骼老化,平衡人體血壓,分解體內膽固醇,降低體內脂肪,恢復血管彈性,利尿清熱,廣譜抗菌,興奮中樞神經,提高白血球數量,增強人體免疫力等顯著功效。
骨代謝疾病是指由多種因素引起骨組織中鈣、磷等礦物質、成骨細胞和/或破骨細胞功能異常從而導致骨基質、骨細胞代謝紊亂。包括骨質疏松癥、骨軟化病、佝僂病等。其中最常見的骨質疏松癥(Osteoporosis, OP)已經成為世界范圍的、日趨嚴重的重要問題。資料顯示,美國、歐洲和日本受累人數大約有7500萬,其中1/3為絕經后婦女。國內的情況亦不容樂觀,據統計,60~69歲老年婦女骨質疏松發生率高達50%~70%,老年男性發生率約為30%左右。隨著社會人口老齡化,世界各國骨質疏松的發生率還會增加。骨質疏松因其引起的嚴重后果—骨折和巨額的醫療費用而受到了社會的高度重視。
骨代謝疾病的細胞學本質是承擔骨重建任務的成骨細胞(osteoblast, OB)和骨吸收的破骨細胞(osteoclast, OC)數量和功能比例的失調,因此成骨細胞數量上的補充和功能的強化,以糾正失調的比例就成為了學術界重點關注的熱點之一,也是治療骨質疏松的一個方向。
骨髓間充質干細胞(bMSCs)具有多向分化的功能,在不同的因素調節之下,可向著不同細胞(成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞和肌細胞)方向分化。因此誘導和調節bMSCs向成骨細胞方向分化,同時抑制bMSCs的成脂分化,也成為目前治療與成骨細胞功能異常相關疾病的熱點。體外培養的bMSCs成骨/成脂分化的指標有多種,最有說服力的指標是已進入分化末端或接近末端出現的特異性標志物。標志物主要包括了形態學指標、化學特異性染色指標、分子指標(包括特異性基因表達、蛋白表達—Western blot法 或免疫細胞化學法)。骨質疏松癥在體檢測指標也有多種,主要包括影像學的骨密度、生化的血清標志物、組織學的骨切片、物理學的骨重和抗破壞性力學數據,化學分析的無機元素含量和組成比率等。
臨床上治療骨質疏松癥藥物普遍存在著毒副作用,如雌激素的長期使用將增加乳腺癌或子宮內膜增生發生的風險,二磷酸鹽的使用容易導致骨殘、骨關節或肌肉疼痛等,因而近年來中藥及中藥提取物對骨質疏松癥的防治作用引起了廣泛的關注。中藥普遍具有雙向調節作用,毒副作用較小,便于長期服用,因此應用前景廣闊。目前已被證實對骨質疏松癥治療有效的單味中藥主要有淫羊藿、杜仲、蛇床子、黃芪、紅曲、骨碎補、葛根、牛膝、續斷等,中藥提取物(有效組份、有效部位)也有一些報道,目前尚無中藥杜仲的藥效成分用于骨代謝異常疾病的臨床應用。
發明內容
本發明以杜仲為原料,提取得到一類具有抗骨質疏松藥理活性的物質,開拓了杜仲的藥用范圍,也為骨質疏松病人提供了一種新的治療用藥選擇。
本發明具體技術方案如下:
一種杜仲提取物,由如下步驟制備而成:
(1)以杜仲為提取原料,用醇與水的混合溶液進行提取;
(2)將步驟(1)的提取液經中性氧化鋁層析柱除去色素,收集洗脫液,濃縮;
(3)使用有機溶劑萃取步驟(2)得到的洗脫液,得到杜仲提取物。
上所述杜仲優選鹽杜仲,由如下方法制得:將杜仲干燥樹皮浸入飽和NaCl溶液中15分鐘,取出晾干,制成小塊或小條,150?180℃烘烤4h,形成鹽杜仲,此步驟為破壞杜仲膠,以使有效成分更多的溶出。
上述杜仲可采用粉碎機粉碎,提高提取效率。
上述醇與水的混合溶液為甲醇、乙醇或異丙醇中的一種或幾種與水任意比例的混合物。
上述步驟(1)優選條件為取鹽杜仲粉,60%乙醇室溫浸泡10分鐘,充分溶脹,60℃浸提30分鐘,過濾,殘渣再用60%乙醇60℃浸提30分鐘,合并兩次提取液。
上述步驟(2)選用中性氧化鋁層析柱,中性氧化鋁可吸附去除提取液中無用的色素,優選100?200目的中性氧化鋁,優選采用柱體積為φ60mm×80mm,填料預先用乙醇飽和。收集過柱后的流出液,濾液全部過柱后,在用100ml乙醇洗柱,并收集流出液。
上述醚類有機溶劑為乙醚、氯仿、正丁醇中的一種或幾種混合物。
上述步驟(3)優選萃取次數為3次。
本發明還提供了上述的杜仲提取物在制備預防和治療骨代謝異常疾病的藥物組合物中的應用。
本發明所述骨代謝異常疾病包括:骨質疏松癥,包括絕經后的骨質疏松癥,絕經后的骨損失,男性骨質疏松癥,皮質類固醇誘導的骨質疏松癥等;
藥物療法繼發的或者由于藥物療法,如二苯乙內酰脲、甲狀腺激素替代療法,導致的骨損失;
或與不活動和空間飛行有關的骨損失和與類風濕性關節炎、骨質減少、成骨不全、甲狀腺機能亢進、神經性厭食癥、器官移植、人工關節松動有關的骨損失。
本發明所述的藥物組合物,包含本發明所述的杜仲提取物以及一種或多種可藥用的稀釋劑或載體。
本發明所述的杜仲提取物可以單獨使用或以藥物組合物的形式使用。藥物組合物包括作為活性成分的本發明的化合物或其可藥用鹽及可藥用載體。較佳的,本發明的藥物組合物有0.1?99.9%重量百分比的作為活性成分的本發明的化合物或其可藥用鹽。“可藥用載體”不會破壞本發明的化合物或其可藥用鹽的藥學活性,同時其有效用量,即能夠其藥物載體作用是的用量對人體無毒。
“可藥用載體”包括但不限于:離子交換材料、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物傳遞系統(SEDDS)如d?維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐溫或其他類似聚合介質等藥物制劑用的表面活性劑、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、鹽、電解質如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、硅酸鎂等。聚乙烯吡咯酮、纖維素物質、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、乙烯?聚氧乙烯?嵌段聚合物和羊毛脂、環糊精如α?、β?、γ?環糊精或其經化學修飾的衍生物如2?和3?羥丙基?β?環糊精等羥烷基環糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促進本發明的化合物、其藥用鹽或前藥的藥物傳遞。
其他可藥用輔料如填充劑(如無水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合劑(如微晶纖維素)、崩解劑(如交聯羧甲基淀粉鈉、交聯羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素和交聯PVP)、潤滑劑(如硬脂酸鎂)、吸收促進劑、香味劑、甜味劑、稀釋劑、賦形劑、潤濕劑、溶劑、增溶劑和著色劑等也可加入本發明的藥物組合物中。
上述本發明的杜仲提取物以及藥物組合物可通過腸道或者非腸道途徑給藥。非腸道給藥制劑包括注射劑、霜劑、軟膏劑、貼劑、噴霧劑等。給藥途徑包括皮下、皮內、動脈內、靜脈內、肌內、關節內、滑液內、胸骨內、鞘內、病灶內、顱內注射或輸注,或者,口服、局部、直腸、經鼻、經頰、陰道、舌下、皮內、粘膜、氣管、尿道給藥,或者通過吸入氣霧或植入蓄積或者針刺方式給藥。
 上述本發明的杜仲提取物以及藥物組合物的治療有效量為0.001?100mg/kg/d之間,可用于相關疾病的單一用藥或聯合用藥治療,為本領域技術人員能夠理解的范圍。
附圖說明
圖1為本發明杜仲提取物誘導bMSCs對ALP、PPAR?γ基因表達的影響。
圖2為本發明杜仲提取物進行去勢大鼠灌胃3個月后,體重測定結果。
圖3為本發明杜仲提取物進行去勢大鼠灌胃3個月后,脛骨抗彎曲力測定。
 圖4為本發明杜仲提取物進行去勢大鼠灌胃3個月后,血清ALP測定。
具體實施方式
以下通過實施例說明本發明的具體步驟,但不受實施例限制。
在本發明中所使用的術語,除非另有說明,一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
下面結合具體實施例并參照數據進一步詳細描述本發明。應理解,這些實施例只是為了舉例說明本發明,而非以任何方式限制本發明的范圍。
在以下實施例中,未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。
實施例1、杜仲提取物的制備
取杜仲干燥樹皮,浸入飽和NaCl溶液中15分鐘,取出晾干,制成小塊或小條,150?180℃烘烤4h,粉碎機粉碎,制得鹽杜仲粉。取100克鹽杜仲粉,加入300ml 60%乙醇室溫浸泡10分鐘,充分溶脹,60℃水浴30分鐘,抽濾漏斗濾紙減壓過濾,殘渣再一次60℃水浴30分鐘,減壓過濾,合并濾液。濾液加入到填料為中性氧化鋁(100?200目)層析柱中,柱體積為φ60mm×80mm,填料預先用乙醇飽和。收集過柱后的流出液,濾液全部過柱后,在用100ml乙醇洗柱,并收集流出液。使用旋轉蒸發儀60℃減壓蒸發濃縮,直至剩余100ml左右時結束。分別使用100ml乙醚萃取濃縮液3次,收集合并乙醚萃取液,室溫蒸發乙醚。使用30ml 80%甲醇溶解乙醚蒸發后的產物,攪拌,8000rpm離心5分鐘,取上清得到杜仲粗提物。
實施例2、杜仲提取物的制備誘導bMSCs實驗
堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是細胞成骨分化的標志分子,ALP的升高提示細胞已經完成了成骨分化的主要階段。常用RT?PCR、RT?熒光定量PCR、Western blot、免疫細胞化學等方法檢測。
1. 大鼠bMSCs培養:
1)2月齡SD大鼠(雌雄不拘),頸椎脫臼法處死,浸入70%乙醇消毒5?10分鐘。無菌條件下剪開腿部皮膚和肌肉,取股骨和脛腓骨,剔凈肌肉,骨兩端剪去端部組織,暴露紅骨髓。用無菌注射器吸取少許培養基,從骨的一段插入骨髓腔中,沖出骨髓細胞于無菌培養皿/培養瓶/培養板中,或用骨鉗夾碎骨骼,釋放細胞,用培養基調整細胞密度為1×105/ml后,置培養瓶/培養板中,放入37℃,5%CO2培養箱中。48小時后首次換液,之后實時換液;
2)細胞生長融合達90%后傳代。傾去培養基,PBS洗滌,加入0.25%胰酶,消化數分鐘,傾去胰酶,加入培養基吹打,分瓶,補足培養基,放入37℃,5%CO2培養箱中。2?3天后再次傳代。
培養基組成:DMEM/F12(1:1),含15%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml,適量NaHCO3,pH7.2?7.4。
2. 杜仲提取物誘導:
將bMSCs接種至6孔細胞培養板中培養,培養基血清濃度降為7.5%,以2μg/ml濃度的杜仲提取物進行誘導,并設非誘導的陰性對照組,誘導時間為10天,期間實時換液。
3. RNA提取、熒光定量PCR檢測成骨和成脂標志基因表達:
1)RNA提取:
1.將1ml RNAiso Plus試劑加入到6孔培養板中,震蕩1分鐘,使其裂解培養細胞;
2.將裂解液轉移到1.5ml EP管中,加入0.2ml氯仿,震蕩,室溫靜置5分鐘;
3.1200rpm離心5分鐘,轉移上清液至另一1.5ml EP管中(約400ul);
4.加入400ul異丙醇,充分混勻,室溫靜置10分鐘;
5.1200rpm離心5分鐘,棄上清;
6.沉淀加入0.5ml 75%乙醇(DEPC水配制),上下顛倒洗滌沉淀;
7.1200rpm離心5分鐘,棄上清,室溫充分揮發乙醇;
8.加入適量(一般20?50ul)DEPC水,溶解沉淀,?80℃保存。
2)逆轉錄反應:
1. 按下列組份配制RT反應液(反應液配制請在冰上進行)。

2. 37℃ 15 min;85℃ 5 sec,4℃保存
3)熒光定量PCR:
1. 按下列組份配制PCR反應液(冰上進行):
SYBR Premix Ex TaqTM II(2×)12.5μl,PCR Forward Primer(10 μM)1μl,PCR Reverse Primer(10μM)1μl,cDNA 2μl,dH2O 8.5μl,總體積25μl。
ABI 7500 Real?Time PCR需使用ROX Reference Dye II作為內標熒光,每管(1ml) SYBR Premix Ex TaqTM II中加入20μl。
2. 反應參數:95℃30秒;95℃5秒→60℃34秒,循環40次;95℃15秒,60℃1分鐘(熒光監測點),以1%速率緩慢升至95℃15秒(溶解曲線測定,熒光監測點),60℃1分鐘。 
3. ABI 7500 Software v2.0.4軟件設置反應參數,分析采集數據。
成骨標志基因選定堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),成脂標志基因選定過氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator? activating receptor?γ,PPAR?γ) 。
實驗結果見圖1,結果表明,杜仲提取物在2μg/ml誘導濃度下,bMSCs中的ALP表達較對照高2.18(2.18/1.0)倍;PPARγ較對照低9.09(1.0/0.11)倍。說明本發明的杜仲提取物能夠誘導和調節骨髓間充質干細胞向成骨細胞方向分化,同時抑制骨髓間充質干細胞的成脂分化。
實施例3、杜仲提取物對去勢大鼠體重、脛骨抗彎曲力和血清ALP的影響實驗
去勢動物模型是骨質疏松常用的模型,雌性動物去除卵巢后,雌激素分泌水平下降,導致骨質疏松。該模型模擬了人類女性更年期后,因卵巢功能的下降,雌激素分泌的減少而導致的骨質疏松癥。動物去勢后,伴隨著骨質疏松過程,體重往往會增加,這其中的原因之一是干細胞的成脂分化被加強,這不僅體現在骨小梁中出現大量脂肪,也體現在其他組織器官的脂肪積累。因此藥物干預后,去勢動物體重增加的抑制是骨質疏松癥狀改善的間接體現。
骨抗彎曲力是骨強度生物力學的重要指標,動物去勢后,伴隨著骨質疏松過程,骨的韌性下降,脆性升高,導致其抗彎曲力下降。因此藥物干預后,去勢動物骨抗彎曲力的提高,是骨質疏松癥狀改善的直接體現。
血清ALP是骨質疏松的生化指標,與成骨細胞活性相關,成骨細胞數量和活性較高時,血清ALP會下降,反之亦然。因此該指標與骨質疏松間接相關。陽性對照ALF:阿法骨化醇 (Alfacalcidol,ALF,又稱法能)是目前臨床上用于治療骨質疏松癥的一種藥物,在實驗中,能夠發揮與ALF類似作用的樣品,可在數據統計分析后,判斷是否具有干預治療骨質疏松的作用。
1. 實驗動物分組和去勢動物的制備:
SD大鼠隨機分成4組,每組20只,即假手術組、陰性對照組、陽性對照組和實驗組。腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉大鼠,陰性對照、陽性對照和實驗組大鼠在無菌環境下打開腹腔,摘除卵巢,腹腔分層縫合,肌注青霉素(2萬單位/只)。假手術組大鼠除不摘除卵巢外,手術操作均與其他組相同。
2. 實驗動物灌胃處理:
4組大鼠中,陽性對照組和實驗組分別用阿法骨化醇 (Alfacalcidol,ALF) 和杜仲提取物灌胃,陽性對照組的灌胃計量為每3粒ALF(0.25ug/粒)灌10只大鼠,實驗組灌杜仲提取物 50μg/只。手術后第10天開始,每天1次,連續灌胃90天。
3. 體重、脛骨抗彎曲力和血清ALP測定:
各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后,稱量體重,解剖取雙側脛骨;心臟采血,凝固后離心制備血清。脛骨抗彎曲力測定方法如下:取脛骨置相距2.5cm(V型槽)的支架上,使用“V”型壓頭的手持指針式推拉力計,于脛骨中端下壓,直至脛骨斷裂,計壓力值。左右脛骨分別記錄,取平均值。血清ALP測定測定方法如下:采用南京建成生物工程公司試劑盒,取血清5μl,加緩沖液和基質液各50μl,37℃水浴15分鐘,加顯色劑150μl,搖勻,520nm測定吸光度。
結果見圖2~圖4。由圖可見,杜仲提取物能夠顯著抑制去勢大鼠體重、提高脛骨抗彎曲力以及降低血清ALP。與陰性對照組比較,去勢大鼠體重顯著下降了10%(p<0.01);脛骨抗彎曲力提高了7.3%(p<0.01);血清ALP下降了41.5%(p<0.01)。   內容來自專利網www.wwszu.club轉載請標明出處

關于本文
本文標題:一種杜仲提取物及其用途.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6418892.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大 133796137637904942170164237570722171780157648257074298021764311115572017621738101006984915870466565 (function(){ var bp = document.createElement('script'); var curProtocol = window.location.protocol.split(':')[0]; if (curProtocol === 'https') { bp.src = 'https://zz.bdstatic.com/linksubmit/push.js'; } else { bp.src = 'http://push.zhanzhang.baidu.com/push.js'; } var s = document.getElementsByTagName("script")[0]; s.parentNode.insertBefore(bp, s); })();