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攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒及其構建方法和應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310076298.X

申請日:

2013.03.11

公開號:

CN103215234B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 7/01申請日:20130311|||公開
IPC分類號: C12N7/01; C12N15/861; A61K48/00; A61P7/04; A61P43/00 主分類號: C12N7/01
申請人: 陜西師范大學
發明人: 夏海濱; 張偉鋒; 劉思也
地址: 710062 陜西省西安市長安南路199號
優先權: 2012.11.09 CN 201210447965.6
專利代理機構: 西安永生專利代理有限責任公司 61201 代理人: 申忠才
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310076298.X

授權公告號:

103215234B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.08.21|||2013.07.24

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

一種攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒,缺失E1區和E3區,在缺失區插入了鋅指核酸酶表達元件和供體DNA。構建方法由構建腺病毒骨架載體、構建攜帶鋅指核酸酶表達元件的腺病毒E3區穿梭載體、構建攜帶供體DNA的腺病毒E1區穿梭載體、構建攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒載體、包裝和擴增以及純化步驟組成,攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒在制備治療遺傳性疾病藥物中的用途。

權利要求書

權利要求書
1.   一種攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒,其特征在于:缺失E1和E3區,在缺失區插入了鋅指核酸酶表達元件和供體DNA。

2.   根據權利要求1所述的攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒,其特征在于:在缺失的E1區插入供體DNA、在缺失的E3區插入鋅指核酸酶表達元件,或在缺失的E1區插入鋅指核酸酶表達元件、在缺失的E3區插入供體DNA。

3.   根據權利要求1或2所述的攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒,其特征在于:所述的鋅指核酸酶表達元件是由真核啟動子與其下游的鋅指核酸酶基因和轉錄終止信號組成。

4.   根據權利要求3所述的攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒,其特征在于:所述的真核啟動子是Tet?on誘導性啟動子,該Tet?on誘導性啟動子由以下結構組成:7個重復的四環素反應元件,在該重復序列兩端連接有啟動子核心元件,包括左側的miniCMV和右側的tightminiCMV,在左側miniCMV的下游連接有rtTA2S?M2轉錄因子和SV40pA,在右側tight miniCMV的下游插入一對鋅指核酸酶基因,在鋅指核酸酶基因的3'端連接有轉錄終止信號;所述的兩個鋅指核酸酶基因間通過自剪切多肽相連;所說的轉錄終止信號是SV40pA、TKpA中的一種;
miniCMV的序列如下:
GGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTC
tight miniCMV的序列如下:
GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCGAATTCC。

5.   根據權利要求1或2所述的攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒,其特征在于:所述的供體DNA是靶向該腺病毒所攜帶的鋅指核酸酶的識別位點,它由上、下游同源臂組成,上、下游同源臂分別是由距離該腺病毒載體攜帶的鋅指核酸酶的識別位點1bp到5000bp堿基數的DNA序列組成,每條同源臂的長度為50bp到3000bp。

6.   根據權利要求1或2所述的攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒,其特征在于:所述的供體DNA在上、下游同源臂之間插入了限制性內切酶位點、報告基因表達元件、篩選基因表達元件、功能基因表達元件中的任意一種。

7.   一種攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒的構建方法,其特征在于由以下步驟組成:
(1)構建腺病毒骨架載體
以商業化的pAdEasy?1載體為基礎進行改造。構建腺病毒E3區穿梭載體,在E3區穿梭載體中插入lacZα篩選基因和SwaⅠ酶切位點,通過同源重組和藍白斑篩選將SwaⅠ酶切位點引入到腺病毒缺失的E3區,獲得可以在缺失的E3區插入外源基因的腺病毒骨架載體;
(2)構建攜帶鋅指核酸酶表達元件的腺病毒E3區穿梭載體
將真核啟動子、鋅指核酸酶基因、轉錄終止信號依次插入到腺病毒E3區穿梭載體中;
(3)構建攜帶供體DNA的腺病毒E1區穿梭載體
將供體DNA的上、下游同源臂依次插入到腺病毒E1區穿梭載體,在上、下游同源臂之間插入限制性內切酶位點、篩選基因表達元件、功能基因表達元件中的任意一種;
(4)將攜帶鋅指核酸酶表達元件的腺病毒E3區穿梭載體與SwaⅠ線性化的腺病毒骨架載體同源重組獲得攜帶鋅指核酸酶表達元件的腺病毒載體,將攜帶供體DNA的腺病毒E1區穿梭載體與攜帶鋅指核酸酶表達元件的腺病毒載體同源重組獲得攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒載體;
(5)將構建好的攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒載體通過磷酸鈣共沉淀轉染HEK293細胞進行包裝、擴增、純化獲得純化的攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒。

8.   攜帶鋅指核酸酶表達元件和供體DNA的腺病毒在制備治療遺傳性疾病藥物中的用途。

關 鍵 詞:
攜帶 核酸酶 表達 元件 供體 DNA 病毒 及其 構建 方法 應用
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