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一種強心苷化合物的用途.pdf

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一種 強心 化合物 用途
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摘要
申請專利號:

CN201310124216.4

申請日:

2013.04.11

公開號:

CN103191143B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 31/7048申請日:20130411|||公開
IPC分類號: A61K31/7048; A61P35/00; A61P35/02; C07J71/00 主分類號: A61K31/7048
申請人: 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所
發明人: 王茂媛; 晏小霞; 王祝年; 王建榮; 王清隆; 王鵬
地址: 571737 海南省儋州市寶島新村
優先權:
專利代理機構: 廣州市越秀區海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295 代理人: 王洪娟
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310124216.4

授權公告號:

103191143B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.08.07|||2013.07.10

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了強心苷化合物12β-hydroxycalotropin在制備具有治療和預防腫瘤作用的藥物中的用途,該強心苷化合物12β-hydroxycalotropin具有顯著的抗腫瘤活性,可作為治療腫瘤的先導化合物;同時,本發明提供的強心苷化合物12β-hydroxycalotropin的提取分離方法簡單易行,成本低,效率和得率高,提取物質量好。

權利要求書

權利要求書
1.   強心苷化合物12β?hydroxycalotropin在制備具有治療和預防腫瘤作用的藥物中的用途,所述強心苷化合物12β?hydroxycalotropin的分子式為C29H40O10,結構式如下:
                                                 


2.   根據權利要求1所述的強心苷化合物12β?hydroxycalotropin在制備具有治療和預防腫瘤作用的藥物中的用途,其特征是:所述腫瘤為膽管癌、腎癌、胰腺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、大腸癌、肝癌、膽癌、膽道癌、急性白血病、惡性淋巴瘤、腦瘤、骨腫瘤、黑素瘤、神經膠質瘤、口腔癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。

3.   根據權利要求1所述的強心苷化合物12β?hydroxycalotropin在制備具有治療和預防腫瘤作用的藥物中的用途,其特征是:所述強心苷化合物12β?hydroxycalotropin的制備方法如下:
A、選取牛角瓜莖,粉碎后,加入乙醇,浸提3~4次,每次6~8天,合并浸提液,減壓濃縮至無醇味得到牛角瓜的乙醇提取物;
B、將牛角瓜的乙醇提取物分散于水中制成牛角瓜懸濁液,分別按牛角瓜懸濁液與石油醚的體積比為1:3、1:2和1:1,用石油醚對牛角瓜懸濁液重復萃取后,保留石油醚萃取后的水相;
C、將石油醚萃取后的水相過濾,將濾液用D?101大孔吸附樹脂柱色譜分離,并依次用水和甲醇洗脫,收集甲醇洗脫液,減壓濃縮回收甲醇后,得到甲醇浸膏;
D、將甲醇浸膏經減壓硅膠柱層析,以氯仿與甲醇的體積比分別為100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2:1和0:100作為洗脫劑,對減壓硅膠柱進行梯度洗脫,分別得粗提物Fr.1~Fr.7;
E、將步驟D所得粗提物Fr.4經硅膠柱層析,以氯仿與甲醇的體積比分別為10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、0:1作為洗脫劑,對硅膠柱進行梯度洗脫,得到6個部分Fr.4?1~Fr.4?6;
F、將E步驟的Fr.4?2經硅膠柱層析,采用氯仿和丙酮作為洗脫劑進行洗脫,洗脫時采用TLC薄層色譜收集相同的成分,得到6個部分Fr.4?2?1~Fr.4?2?6;將Fr.4?2?3依次進行Sephadex LH?20凝膠柱層析、反相柱層析、以及再次硅膠柱層析,最終得到強心苷化合物12β?hydroxycalotropin。

4.   根據權利要求1所述的強心苷化合物12β?hydroxycalotropin在制備具有治療和預防腫瘤作用的藥物中的用途,其特征是:步驟A中牛角瓜莖與乙醇的質量體積比為1kg:1~3L;所述乙醇的體積百分含量為92~98%。

5.   根據權利要求1所述的強心苷化合物12β?hydroxycalotropin在制備具有治療和預防腫瘤作用的藥物中的用途,其特征是:步驟B中用石油醚對牛角瓜懸濁液重復萃取3次后,保留石油醚萃取后的水相。

6.   根據權利要求1所述的強心苷化合物12β?hydroxycalotropin在制備具有治療和預防腫瘤作用的藥物中的用途,其特征是:步驟F中氯仿和丙酮的體積比為4:5;凝膠柱層析時采用的凝膠柱為Sephadex LH?20凝膠柱,凝膠柱層析時洗脫溶劑采用體積百分含量為95%的乙醇;再次硅膠柱層析時采用的洗脫溶劑為體積比為11:1:1 的氯仿、甲醇和丙酮混合溶劑。

說明書

說明書一種強心苷化合物的新用途
技術領域
本發明涉及強心苷化合物,具體涉及一種強心苷化合物12β?hydroxycalotropin及其用途。
背景技術
腫瘤對人類健康和生命的威脅很大,它和心血管疾患已成為醫學上的兩大難關,在全世界構成死亡原因的頭兩位。全世界52億人口中,每年約有700萬人新患腫瘤,每年約有500多萬人死于腫瘤,幾乎每6秒鐘就有一名腫瘤患者死亡。我國目前每年平均約有150萬人新患腫瘤,每年約有80萬人死于腫瘤。現有的抗腫瘤藥物都不能徹底有效地治愈。同時由于新型腫瘤的不斷發現,迫使人們努力尋找新的抗腫瘤藥物。長期以來,從藥用植物尤其是熱帶藥用植物中尋找抗腫瘤藥物成為各國醫學、藥學、化學及生物學家的一個共同愿望。研究表明,抗腫瘤藥物70%來源于熱帶或亞熱帶植物。繼長春花新堿之后,紫杉醇及其衍生物Epothilones的發現,使此項工作取得了突破性的進展。然而,由于有些抗腫瘤成分在植物體內含量極低,有些植物還是瀕危珍稀物種,且植物生長緩慢,過度采挖可能導致該物種的滅絕,這些因素限制了抗腫瘤植物藥的發展。
牛角瓜[Calotropis gigantea (L.) Dryand ex Ait. f.]為蘿藦科(Asclepiadaceae)牛角瓜屬(Calotropis)植物。在我國主要分布于海南、廣東、四川和云南等地。牛角瓜全株有毒,其根、莖、葉、花、果及各部位的白色汁液均可藥用,具有抗菌、消炎、驅蟲、化痰、解毒等功效,是一種民間常用藥。國內外研究表明牛角瓜主要含強心苷類化合物,為其毒性成分。但是關于牛角瓜中的強心苷化合物12β?hydroxycalotropin是否具有抗腫瘤作用目前還是未知的。
發明內容
本發明的目的在于提供一種強心苷化合物12β?hydroxycalotropin在制備具有治療和預防腫瘤作用的藥物中的用途。
本申請發明人對牛角瓜中的強心苷類化合物12β?hydroxycalotropin進行了提取、分離、純化和抗腫瘤活性測試發現,該牛角瓜中的強心苷化合物12β?hydroxycalotropin具有抗腫瘤的新用途。
本發明的上述目的是通過如下技術方案來實現的:強心苷化合物12β?hydroxycalotropin在制備具有治療和預防腫瘤作用的藥物中的用途,所述強心苷化合物12β?hydroxycalotropin的分子式為C29H40O10,結構式如下:

本發明所述腫瘤主要是為膽管癌、腎癌、胰腺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、大腸癌、肝癌、膽癌、膽道癌、急性白血病、惡性淋巴瘤、腦瘤、骨腫瘤、黑素瘤、神經膠質瘤、口腔癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌等。
本發明強心苷化合物12β?hydroxycalotropin可以從牛角瓜中利用包括吸附樹脂柱層析、硅膠柱層析、反相硅膠柱層析、凝膠柱層析、減壓柱層析等多種分離手段獲得,或者通過合成以及半合成手段獲得。與適宜的賦形劑相結合,按照常規方法制成各種劑型。
本發明所述強心苷化合物12β?hydroxycalotropin優選的制備方法如下: 
A、選取牛角瓜莖,粉碎后,加入乙醇,浸提3~4次,每次6~8天,合并浸提液,減壓濃縮至無醇味得到牛角瓜的乙醇提取物;
B、將牛角瓜的乙醇提取物分散于水中制成牛角瓜懸濁液,分別按牛角瓜懸濁液與石油醚的體積比為1:3、1:2和1:1,用石油醚對牛角瓜懸濁液重復萃取后,保留石油醚萃取后的水相;
C、將石油醚萃取后的水相過濾,將濾液用D?101大孔吸附樹脂柱色譜分離,并依次用水和甲醇洗脫,收集甲醇洗脫液,減壓濃縮回收甲醇后,得到甲醇浸膏;
D、將甲醇浸膏經減壓硅膠柱層析,以氯仿與甲醇的體積比分別為100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2:1和0:100作為洗脫劑,對減壓硅膠柱進行梯度洗脫,分別得粗提物Fr.1~Fr.7;
E、將步驟D所得粗提物Fr.4經硅膠柱層析,以氯仿與甲醇的體積比分別為10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、0:1作為洗脫劑,對硅膠柱進行梯度洗脫,得到6個部分Fr.4?1~Fr.4?6;
F、將E步驟的Fr.4?2經硅膠柱層析,采用氯仿和丙酮作為洗脫劑進行洗脫,洗脫時采用TLC薄層色譜收集相同的成分,得到6個部分Fr.4?2?1~Fr.4?2?6;將Fr.4?2?3依次進行Sephadex LH?20凝膠柱層析、反相柱層析、以及再次硅膠柱層析,最終得到強心苷化合物12β?hydroxycalotropin。
本發明步驟A中牛角瓜莖與乙醇的質量體積比為1kg:1~3L;所述乙醇的體積百分含量為92~98%。
本發明步驟B中用石油醚對牛角瓜懸濁液重復萃取3次后,保留石油醚萃取后的水相。
本發明步驟F中氯仿和丙酮的體積比為4:5;凝膠柱層析時采用的凝膠柱為Sephadex LH?20凝膠柱,凝膠柱層析時洗脫溶劑采用體積百分含量為95%的乙醇;再次硅膠柱層析時采用的洗脫溶劑為體積比為11:1:1 的氯仿、甲醇和丙酮混合溶劑。
上述步驟A、B、C、D、E、F中采用的溶劑如石油醚、氯仿、甲醇、乙醇等均為工業級溶劑,重蒸后使用。
上述D、E、F步驟中使用的硅膠柱、凝膠柱以及反相柱等均為現有技術中的常規設備。
本發明具有如下優點:本發明提供的強心苷化合物12β?hydroxycalotropin具有顯著的抗腫瘤活性,可作為治療腫瘤的先導化合物;同時,本發明提供的提取分離方法簡單易行,成本低,效率高,得率高,提取物質量好。
具體實施方式
下面結合具體實例對本發明作進一步闡述,但不限制本發明。
實施例1
A、將牛角瓜(Calotropis gigantea)莖25.4 kg自然風干粉碎后,按牛角瓜樣品:乙醇水溶液約為1:2的質量/體積比(kg/L),將50 L體積分數為95%的乙醇水溶液與25.4 kg牛角瓜樣品進行充分混合,密封,于室溫浸提3次,每次7天,過濾合并浸提液,減壓濃縮至無醇味得到乙醇提取物;
B、在室溫下,將乙醇提取物分散于水中制成懸濁液,按乙醇提取液:石油醚=1:3、1:2、1:1的體積比,用石油醚對乙醇提取液重復萃取3次,減壓濃縮回收石油醚后,得到石油醚浸膏(254.1 g);
C、將石油醚萃取后的水液過濾,將過濾液用D?101大孔吸附樹脂柱色譜分離,依次用水和甲醇洗脫,收集甲醇洗脫液,減壓濃縮回收甲醇后,得到甲醇浸膏(255.7 g);
D、將甲醇浸膏經減壓硅膠柱層析,以氯仿:甲醇=100:1,50:1,25:1,10:1,5:1,2:1,0:100體積比的洗脫劑,進行梯度洗脫,分別得到7個部分Fr.1~Fr.7;
E、將D步驟用氯仿:甲醇=10:1洗脫得到的Fr.4(38.4 g)經硅膠柱層析,用氯仿:甲醇=10:1,8:1,6:1,4:1,2:1體積比的洗脫劑進行梯度洗脫,最后用甲醇洗脫,得到6個部分Fr.4?1~Fr.4?6;
F、將E步驟的Fr.4?2 (16.7 g)經硅膠柱層析,用氯仿:丙酮=4:5體積比的洗脫劑進行洗脫,然后采用TLC薄層色譜收集相同的成分,得到6個部分,在這6個部分中的第3部分,也就是Fr.4?2?3,將Fr.4?2?3 (2.0 g)依次進行Sephadex LH?20凝膠柱層析(體積分數為95%的乙醇洗脫)、反相柱層析、以及硅膠柱層析(氯仿:甲醇:丙酮=11:1:1洗脫),最終得到強心苷化合物12β?hydroxycalotropin (98.2 mg)。 
實施例2
將實施例1中E步驟的Fr.4?1 (3.2 g) 經柱層析后,用氯仿:甲醇=25:1體積比的洗脫劑進行洗脫,采用TLC薄層色譜收集相同的成分,得到7個部分Fr.4?1?1~Fr.4?1?7;將Fr.4?1?4(869.5 mg) 經硅膠柱層析,依次用氯仿:甲醇=40:1、氯仿:丙酮=6:2體積比的洗脫劑進行洗脫,最終得到強心苷化合物calotropin (109.9 mg)。研究發現,該化合物與本發明的目的化合物結構上的區別在于12位的碳上沒有羥基,而本發明的目的化合物12位的碳上有羥基取代。在進一步的體外抗腫瘤活性測試中發現這兩個化合物的抗IC50值差異顯著(見表2)。
實施例3
強心苷化合物12β?hydroxycalotropin的結構鑒定:
利用光譜技術,包括紫外、紅外、核磁共振及高分辨質譜分析,鑒定了實施例1中的強心苷化合物12β?hydroxycalotropin 的結構。運用2D?NMR技術對牛角瓜莖中首次發現的強心苷化合物12β?hydroxycalotropin的13C?NMR,1H?NMR數據進行了歸屬(見下表1)。
以下為強心苷化合物12β?hydroxycalotropin 的理化常數:
12β?hydroxycalotropin:C29H40O10,白色無定形粉末(甲醇),10%硫酸乙醇溶液顯棕色。m.p. 214?216 °C; [α]D+6.4° (c 0.045, MeOH); HR?ESI?MS: m/z [M+Na]+ 583.2318 ( calcd. For C29H40O10Cl, 583.2310); IRλmax (cm?1): 3433 cm?1, 2957 cm?1, 2923 cm?1, 2852 cm?1, 1712 cm?1, 1655 cm?1, 1648cm?1, 1638 cm?1, 1630cm?1, 1459 cm?1, 1262 cm?1, 1105 cm?1, 1025 cm?1; UVλmax nm (MeOH): 218 nm. 13C?NMR和1H?NMR見下表1。
表1 強心苷化合物12β?hydroxycalotropin的碳譜和氫譜數據

實施例4
強心苷化合物12β?hydroxycalotropin 和calotropin體外抗腫瘤活性測試的對比實驗: 
采用MTT法測試了強心苷化合物12β?hydroxycalotropin和calotropin,對人胃癌細胞(SGC?7901)、人胃腺癌細胞(KKLS、MKN?28、MKN?45)、人慢性骨髓性白血病細胞(K562)、人口腔表皮癌細胞(KB)、人乳腺癌細胞(MCF7)、人肺癌細胞(NCI?H187)、人骨纖維肉瘤細胞(HT?1080)、人骨肉瘤細胞(G?292)、人骨肉瘤細胞(KHOS/NP)、人前列腺癌細胞(LNCap)等細胞株的體外抗腫瘤活性(結果見表2)。
活性測試方法如下:
實驗設陰性對照組(水)、DMSO溶劑對照組、陽性對照組(絲裂霉素C)和8個不同濃度(0.1、0.3、0.9、2.7、 8.1、24.3 μg·mL?1 )的待測樣品,IC50值<0.1 μg·mL?1的待測樣品繼續往下稀釋,再設6個不同濃度(0.0003、0.001、0.004、0.011、0.033和0.100μg·mL?1),每個濃度設3個平行。收集對數生長期細胞,血球計數板計數,按每孔4500個癌細胞量接種于96孔平底細胞培養板中,置于5% CO2、濕度90%以上、37℃溫箱中培養。24h后取出加入一定量的待測樣品,繼續培養72 h后取出置于顯微鏡下觀察每孔細胞形態,記錄細胞形態變化情況,接著每孔加入5 mg/mL的MTT溶液(溶于平衡鹽溶液PBS)15 μL, 37℃反應4 h后,將細胞培養液吸出,每孔加入100 μL DMSO將Formazane充分溶解,將細胞培養板置于MK3酶標儀上,用570 nm波長測各孔的吸光度(A),按下列公式求生長抑制率。
生長抑制率(%)=(1 - )×100%
以樣品濃度為橫坐標,以抑制率為縱坐標,根據濃度梯度利用origin軟件擬合出抑制率曲線圖,當抑制率為50 %時的樣品濃度即是細胞毒活性的IC50值,樣品活性結果即以半數抑制濃度(IC50)表示。
從表2可看出,強心苷化合物12β?hydroxycalotropin 和calotropin結構上的差異進而抗腫瘤活性上也存在著顯著差異。本發明的強心苷化合物抗腫瘤活性明顯比calotropin強。
表2強心苷化合物12β?hydroxycalotropin 的體外抑瘤結果

實施例5
將實施例1制備的強心苷化合物 12β?hydroxycalotropin 8g與微晶纖維素75g及硬脂酸鎂7g混合,混合物用單沖壓片機打成直徑5 mm,重量100mg的片劑。本片劑中每片含12β?hydroxycalotropin 8mg。結合病癥,每次1?2片,每日服用2?3次。 
實施例6
將實施例1制備的強心苷化合物12β?hydroxycalotropin 20g 與乳糖95g及硬脂酸鎂6g混合,以每300mg填充膠囊。本膠囊劑中,每個膠囊含12β?hydroxycalotropin 25mg。結合病癥,每次1?2 個,每日服用3?4次。 
以上列舉的具體實施例是對本發明進行的說明。需要指出的是,以上實施例只用于對本發明作進一步說明,不代表本發明的保護范圍,其他人根據本發明的提示做出的非本質的修改和調整,仍屬于本發明的保護范圍。   內容來自專利網www.wwszu.club轉載請標明出處

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