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黑果枸杞果實提取物及制備方法和應用.pdf

關 鍵 詞:
枸杞 果實 提取物 制備 方法 應用
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摘要
申請專利號:

CN201310274771.5

申請日:

2013.07.02

公開號:

CN103340983B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):A61K 36/815申請日:20130702授權公告日:20141210終止日期:20180702|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 36/815申請日:20130702|||公開
IPC分類號: A61K36/815; A61P7/00; A61K131/00(2006.01)N 主分類號: A61K36/815
申請人: 青海玉辰堂生物科技有限公司; 中國科學院上海藥物研究所
發明人: 譚昌恒; 譚俊杰; 朱大元; 胡宗江
地址: 810000 青海省西寧市城西區香格里拉路6號韻園6號樓2單元252室
優先權:
專利代理機構: 上海金盛協力知識產權代理有限公司 31242 代理人: 羅大忱
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310274771.5

授權公告號:

|||103340983B||||||

法律狀態公告日:

2019.06.28|||2014.12.10|||2013.11.06|||2013.10.09

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種黑果枸杞果實提取物及制備方法和應用,所述黑果枸杞果實提取物,是采用包括如下步驟的方法制備的:(1)將黑果枸杞果實,加入重量濃度為1~2‰酸的水溶液提取,過濾收集提取液;(2)將步驟(1)獲得提取液,通過裝有大孔樹脂的層析柱吸附;(3)先用水洗脫步驟(2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱,再用洗脫液洗脫,收集層析柱流出的洗脫液;(4)將步驟(3)所得的洗脫液減壓濃縮,得黑果枸杞果實提取物浸膏;(5)將步驟(4)所得浸膏干燥,獲得所述黑果枸杞果實提取物。本發明對改善細胞毒性藥物如環磷酰胺和有毒化學品如苯造成的小鼠白細胞降低有顯著療效,可以用于制備治療人體的白細胞降低的藥物。

權利要求書

權利要求書
1.  黑果枸杞果實提取物,其特征在于,是采用包括如下步驟的方法制備的:
(1)提取:將黑果枸杞果實,加入酸的水溶液提取,過濾收集提取液;
(2)吸附:將步驟(1)中得到的提取液,通過裝有大孔樹脂的層析柱吸附;
(3)洗脫:先用水洗脫步驟(2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱,再用洗脫液洗脫,收集層析柱流出的洗脫液;
(4)濃縮:將步驟(3)所得的洗脫液減壓濃縮,得黑果枸杞果實提取物浸膏;
(5)干燥:將步驟(4)中所得黑果枸杞果實提取物浸膏干燥,獲得所述黑果枸杞果實提取物。

2.  根據權利要求1所述的黑果枸杞果實提取物,其特征在于,步驟(1)中,提取溫度10~60℃,提取時間為0.5~3小時。

3.  根據權利要求2所述的黑果枸杞果實提取物,其特征在于,步驟(1)中,酸的水溶液的重量用量為黑果枸杞果實的8~12倍。

4.  據權利要求3所述的黑果枸杞果實提取物,其特征在于,步驟(1)中,所述的酸選自鹽酸、醋酸、甲酸、檸檬酸、草酸或磷酸。

5.  根據權利要求1所述的黑果枸杞果實提取物,其特征在于,步驟(2)中,將步驟(1)中得到的提取液,通過裝有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔樹脂的層析柱吸附。

6.  根據權利要求1所述的黑果枸杞果實提取物,其特征在于,步驟(3)中,先用水洗脫步驟(2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱,直至洗脫液為中性或檢測無糖反應,再用洗脫液洗脫。

7.  根據權利要求1所述的黑果枸杞果實提取物,其特征在于,步驟(3)中,所述洗脫液由如下重量百分比的組分組成:
酸                          0.1~2‰
體積濃度為75%的乙醇水溶液    余量
洗脫液的重量用量為步驟(1)中黑果枸杞果實重量的15~20倍;
所述的酸為鹽酸、醋酸或檸檬酸。

8.  根據權利要求1所述的黑果枸杞果實提取物,其特征在于,步驟(5)中,將步驟(4)中所得黑果枸杞果實提取物浸膏進行冷凍干燥。

9.  黑果枸杞果實提取物,其特征在于,是采用包括如下步驟的方法制備的:
(1)提取:將黑果枸杞果實,加入重量濃度為1~2‰酸的水溶液,溫度10~60℃攪拌提取,提取1~3次,每次0.5~1小時,過濾收集提取液;
酸的水溶液的重量用量為黑果枸杞果實的8~12倍;
所述的酸選自鹽酸或檸檬酸;
(2)吸附:將步驟(1)中得到的提取液,通過裝有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔樹脂的層析柱,使黑果枸杞果實提取液得到選擇性吸附;
(3)洗脫:先用水洗脫步驟(2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱,直至洗脫液為中性或檢測無糖反應,再用洗脫液洗脫,收集層析柱流出的洗脫液;
所述洗脫液由如下重量百分比的組分組成:
酸                          0.1~2‰
體積濃度為75%的乙醇水溶液    余量
洗脫液的重量用量為步驟(1)中黑果枸杞果實重量的15~20倍;
所述的酸為鹽酸或檸檬酸;
(4)濃縮:將步驟(3)中所得洗脫液于50~60℃條件下減壓濃縮回收乙醇,直至25℃時的溶液密度為1.1~1.2,得黑果枸杞果實提取物浸膏;
(5)干燥:將步驟(4)中所得黑果枸杞果實提取物浸膏進行冷凍干燥,獲得所述黑果枸杞果果實提取物。

10.  黑果枸杞果實提取物,其特征在于,是采用包括如下步驟的方法制備的:
(1)提取:將黑果枸杞果實,加入重量濃度為2‰鹽酸的水溶液,在溫度60℃攪拌提取三次,每次0.5小時,過濾收集提取液;
鹽酸的水溶液的重量用量為黑果枸杞果實的8倍;
(2)吸附:將步驟(1)中得到的提取液,通過裝有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔樹脂的層析柱,使黑果枸杞果實提取液得到選擇性吸附;
(3)洗脫:先用水洗脫步驟(2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱,直至洗脫液為中性或檢測無糖反應,再用洗脫液洗脫,收集層析柱流出的洗脫液;
洗脫液由如下重量百分比的組分組成:
酸                          2‰
體積濃度為75%的乙醇水溶液    余量
洗脫液的重量用量為步驟(1)中黑果果實的20倍;
所述的酸為鹽酸;
(4)濃縮:將步驟(3)中所得洗脫液于60℃條件下減壓濃縮回收乙醇,直至25℃時的溶液密度為1.1,得黑果枸杞果實提取物浸膏;
(5)干燥:將步驟(4)中所得黑果枸杞果實提取物浸膏進行冷凍干燥,獲得黑果枸杞果實提取物;其中:矮牽牛單寧(petanin)的重量含量為16.33%。

11.  黑果枸杞果實提取物,其特征在于,是采用包括如下步驟的方法制備的:
(1)提取:將黑果枸杞果實,加入重量濃度為1‰檸檬酸的水溶液,在溫度10℃攪拌提取三次,每次1小時,過濾收集提取液;
酸的水溶液的重量用量為黑果枸杞果實的12倍;
(2)吸附:將步驟(1)中得到的提取液,通過裝有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔樹脂的層析柱,使黑果枸杞提取液得到選擇性吸附;
(3)洗脫:先用水洗脫步驟(2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱,直至洗脫液為中性或檢測無糖反應,再用洗脫液洗脫,收集層析柱流出的洗脫液;
洗脫液由如下重量百分比的組分組成:
酸                          0.1‰
體積濃度為75%的乙醇水溶液    余量
洗脫液的重量用量為步驟(1)中黑果枸杞果實的15倍;
所述的酸為檸檬酸;
(4)濃縮:將步驟(3)中所得洗脫液于60℃條件下減壓濃縮回收乙醇,直至25℃時的溶液密度為1.2,得黑果枸杞果實提取物浸膏;
(5)干燥:將步驟(4)中所得黑果枸杞果實提取物浸膏進行冷凍干燥,獲得黑果枸杞果實提取物,其中:矮牽牛單寧的重量含量為:15.5%。

12.  根據權利要求1~9任一項所述的黑果枸杞果實提取物,其特征在于,含有矮牽牛單寧,重量含量為14%~18%。

13.  一種藥物組合物,其特征在于,包括治療有效量的權利要求1~12任一項所述的黑果枸杞果實提取物和醫藥學上可接受的載體。

14.  權利要求1~12任一項所述的黑果枸杞果實提取物在制備治療人體白細胞降低疾病藥物中的應用。

15.  根據權利要求14所述的應用,其特征在于,所述白細胞降低疾病,是繼發性白細胞降低疾病或原發性白細胞降低疾病。

16.  根據權利要求15所述的應用,其特征在于,所述繼發性白細胞降低疾病為細菌 感染、病毒感染、化學藥品、抗腫瘤藥物或電離輻射引起的白細胞降低,或者是血液病、脾功能亢進或結締組織疾病;所述原發性疾病為遺傳性疾病以及細胞毒類藥物引起的白細胞降低。

說明書

說明書黑果枸杞果實提取物及制備方法和應用
技術領域
本發明涉及一種黑果枸杞果實提取物及其應用,具體涉及黑果枸杞果實提取物在制備治療因細胞毒性藥物(如環磷酰胺)和有毒化學品(如苯)誘導的白細胞降低藥物中的應用。 
背景技術
很多情況可導致人體的白細胞降低,病因可以是繼發性,某些感染例如細菌、病毒等,化學或物理因素例如一定劑量的藥物(抗腫瘤藥物)、有毒化學品(苯)、電離輻射等以及血液病、脾功能亢進,結締組織疾病等,原發性疾病例如某些少見的原發性疾病、遺傳性疾病以及細胞毒性藥物,包括環磷酰胺、白消安、氟尿嘧啶等。此外,許多藥物都可以偶致某些病人患白細胞減少癥,白細胞減少癥的最主要合并癥是造成感染,感染嚴重者可以致死。而一般的白細胞減少癥患者常致疲乏、無力、易感染等。 
目前,為了減輕人體的白細胞降低,目前國內外臨床均廣泛使用粒-單細胞刺激因子(GM-CSF)和粒細胞刺激因子(G-CSF),已證明有肯定療效。但是,由于此二藥物半衰期短,只有2~3h,最好每12h皮下注射1次(口服無效),而且是蛋白多肽藥物,穩定性差,儲存條件嚴格,給病人治療帶來很大的不便。 
黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)系茄科枸杞屬多年生耐鹽抗旱灌木植物,主要生長于我國西北高原地區的鹽堿荒漠地帶,藏藥稱其果實為“旁瑪”,據《四部醫典》和《晶珠本草》等藏醫藥經典著作記載,可用于治療心熱病、心臟病、月經不調和停經等病癥。天然花青素類化合物由于可清除人體內代謝過程中產生的過多自由基,具有較強的防止活性氧危害及抗氧化活性,對于疾病的防治起著重要作用。 
目前,針對黑果枸杞果實中花青素的提取,趙曉輝等公布了一種采用膜分離技術制備黑果枸杞原花青素產品的方法(黑果枸杞原花青素產品及其制備方法,申請號:201010525734.3),該方法包括以下步驟:黑果枸杞鮮果榨汁→陶瓷膜過濾→濾液過非極性大孔樹脂柱→水洗→乙醇洗脫得含原花青素的洗脫液→有機膜處理洗脫液得原花青素精提液→噴霧干燥得產品。該方法主要是通過不同粒度的有機膜來處理樣品,得到的原花青素樣品中必然含有大量與黑果枸杞中花青素類化合物分子量接近的其他成分,同時,果渣中的花青素成分被浪費了,資源沒有得到充分利用;最后的干燥工藝用的是噴 霧干燥,由于其溫度較高,花青素成分易被氧化破壞;并且申請者沒有公布這些原花青素產品主要包括哪些花青素化合物,也沒有公布其含量測定的方法,很難保證產品的質量。另外,丁晨旭等也公布了一種從黑果枸杞果實中提取花色苷的方法(申請號:201010571739.X),該方法通過以下步驟完成:黑果枸杞果實用pH=1~4的乙醇溶液浸提,過濾,得浸提液→減壓濃縮至固形物濃度大于40%的濃縮液→聚苯乙烯大孔樹脂吸附濃縮液,用乙醇水溶液洗脫,當顏色變深時開始收集,得純化的黑果枸杞果實花色苷提取液→減壓濃縮得固形物大于60%的濃縮液,然后冷凍干燥的黑果枸杞果實花色苷產品。該方法提取時用的是酸性乙醇溶液,在上樹脂前需要濃縮除去乙醇,需要耗能,同時,會將很多非花色苷的醇溶性成分帶入產品中;另外,提取濃縮液用大孔樹脂吸附后,直接用乙醇水溶液洗脫,會使得其大量的糖類成分沒有被除去而帶入產品中,影響產品花色苷的純度,且會有較多花青素成分洗脫不下來,造成不必要的浪費。最為主要的是這兩個提取方法得到的產品成分不清楚,也沒有質量控制方法,產品質量難以保證。發明內容 
本發明的目的是公開一種黑果枸杞果實提取物及制備方法和應用,以滿足臨床應用的需要。 
所述的黑果枸杞果實提取物,是采用包括如下步驟的方法制備的: 
(1)提取:將黑果枸杞果實,加入重量濃度為1~2‰酸的水溶液,溫度10~60℃攪拌提取,提取時間為1~3小時,優選提取1~3次,每次0.5~1小時,過濾收集提取液; 
酸的水溶液的重量用量為黑果枸杞果實的8~12倍; 
所述的酸選自鹽酸、醋酸、甲酸、檸檬酸、草酸或磷酸; 
(2)吸附:將步驟(1)中得到的提取液,通過裝有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔樹脂的層析柱,使黑果枸杞果實提取液得到選擇性充分吸附; 
(3)洗脫:先用水洗脫步驟(2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱,直至洗脫液為中性或檢測無糖反應,再用洗脫液洗脫,收集層析柱流出的洗脫液; 
所述洗脫液由如下重量百分比的組分組成: 
酸                          0.1~2‰ 
體積濃度為75%的乙醇水溶液    余量 
洗脫液的重量用量為步驟(1)中黑果枸杞果實重量的15~20倍; 
所述的酸為鹽酸、醋酸或檸檬酸; 
(4)濃縮:將步驟(3)中所得洗脫液于50~60℃條件下減壓濃縮回收乙醇,直至25℃時的溶液密度為1.1~1.2,得黑果枸杞果實提取物浸膏; 
(5)干燥:將步驟(4)中所得黑果枸杞果實提取物浸膏進行冷凍干燥,獲得所述黑果枸杞果實提取物。 
上述的黑果枸杞果實提取物,含有:矮牽牛單寧(petanin)的重量含量為14%~18%。 
結構式見下式: 

優選的,是采用包括如下步驟的方法制備的: 
(1)提取:將黑果枸杞果實,加入重量濃度為2‰鹽酸的水溶液,在溫度60℃攪拌提取三次,每次0.5小時,過濾收集提取液; 
鹽酸的水溶液的重量用量為黑果枸杞果實的8倍; 
(2)吸附:將步驟(1)中得到的提取液,通過裝有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔樹脂的層析柱,使黑果枸杞果實提取液得到選擇性吸附; 
(3)洗脫:先用水洗脫步驟(2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱,直至洗脫液為中性或檢測無糖反應,再用洗脫液洗脫,收集層析柱流出的洗脫液; 
洗脫液由如下重量百分比的組分組成: 
酸                          2‰ 
體積濃度為75%的乙醇水溶液    余量 
洗脫液的重量用量為步驟(1)中黑果果實的20倍; 
所述的酸為鹽酸; 
(4)濃縮:將步驟(3)中所得洗脫液于60℃條件下減壓濃縮回收乙醇,直至25 ℃時的溶液密度為1.1,得黑果枸杞果實提取物浸膏; 
(5)干燥:將步驟(4)中所得黑果枸杞果實提取物浸膏進行冷凍干燥,獲得黑果枸杞果實提取物;其中:矮牽牛單寧(petanin)的重量含量為16.33%。 
進一步優選的,是采用包括如下步驟的方法制備的: 
(1)提取:將黑果枸杞果實,加入重量濃度為1‰檸檬酸的水溶液,在溫度10℃攪拌提取三次,每次1小時,過濾收集提取液; 
酸的水溶液的重量用量為黑果枸杞果實的12倍; 
(2)吸附:將步驟(1)中得到的提取液,通過裝有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔樹脂的層析柱,使黑果枸杞提取液得到選擇性吸附; 
(3)洗脫:先用水洗脫步驟(2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱,直至洗脫液為中性或檢測無糖反應,再用洗脫液洗脫,收集層析柱流出的洗脫液; 
洗脫液由如下重量百分比的組分組成: 
酸                          0.1‰ 
體積濃度為75%的乙醇水溶液    余量 
洗脫液的重量用量為步驟(1)中黑果枸杞果實的15倍; 
所述的酸為檸檬酸; 
(4)濃縮:將步驟(3)中所得洗脫液于60℃條件下減壓濃縮回收乙醇,直至25℃時的溶液密度為1.2,得黑果枸杞果實提取物浸膏; 
(5)干燥:將步驟(4)中所得黑果枸杞果實提取物浸膏進行冷凍干燥,獲得黑果枸杞果實提取物,其中:矮牽牛單寧的重量含量為:15.5%。 
動物試驗證明:上述的黑果枸杞果實提取物,對改善細胞毒性藥物如環磷酰胺和有毒化學品如苯誘導的小鼠白細胞降低有顯著療效,可以用于制備治療人體的白細胞降低的藥物。 
所述白細胞降低可以是繼發性,某些感染例如細菌、病毒等,化學或物理因素例如一定劑量的藥物(抗腫瘤藥物)、有毒化學品(苯)、電離輻射等以及血液病、脾功能亢進,結締組織疾病等,原發性疾病例如某些少見的原發性疾病、遺傳性疾病以及細胞毒性藥物,包括環磷酰胺、白消安、氟尿嘧啶等。此外,許多藥物都可以偶致某些病人患白細胞減少癥,白細胞減少癥的最主要合并癥是造成感染,感染嚴重者可以致死。而一般的白細胞減少癥患者常致疲乏、無力、易感染等; 
本發明還涉及一種藥物組合物,包括治療有效量的所述的黑果枸杞果提取物和醫藥 學上可接受的載體,所述載體如:稀釋劑、賦形劑(比如水)等,填充劑如淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纖維素等,粘合劑如纖維素衍生物、明膠和聚乙烯吡咯烷酮等,潤濕劑如甘油等,表面活性劑如十六烷醇等,崩解劑如碳酸鈣、交聚維酮、羥基乙酸淀粉鈉等,潤滑劑如滑石粉、硬脂酰富馬酸鈉、硬脂酸鈣和鎂等。 
可采用本領域公知的方法,將治療有效量的黑果枸杞果實提取物與一種或多種藥學上可接受的載體相混合,制備成常規的固體制劑如片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、滴丸、軟膠囊、口服液、注射液、針劑、乳劑(含微乳、亞微乳)、軟膏、栓劑、貼劑、巴布劑等,其中活性成分的含量為0.1%~99.5%(重量比)。 
本發明可通過口服途徑施加于需要治療的患者,劑量為50-200mg/kg·體重·天; 
毒性試驗證明,所述黑果枸杞果實提取物毒性小鼠口服給藥5g/kg·體重·天未見明顯毒性,即使長期使用,也對人體無害; 
本發明與現有技術相比具有下列優點: 
找到了一種填料MCIgel(一種聚苯乙烯—二乙烯苯大孔樹脂)能對黑果枸杞果實的酸性水提取液進行選擇性吸附,不需濃縮其提取液,能有效降低能耗,適合工業化生產。通過動物體內的藥效學實驗,黑果枸杞果實提取物對改善細胞毒性藥物如環磷酰胺和有毒化學品如苯誘導的小鼠白細胞降低有顯著療效,可以用于制備治療人體的白細胞降低的藥物。 
附圖說明
圖1.矮牽牛單寧(petanin)對照品液相圖譜 
圖2.黑果枸杞果實提取物中矮牽牛單寧含量測定液相圖譜 
圖3.空白溶液液相圖譜 
圖4.矮牽牛單寧對照品液相色譜(HPLC)含測標準曲線 
具體實施方式
實施例1 
黑果枸杞果實提取物的檢測方法 
1.1黑果枸杞果實提取物中矮牽牛單寧(petanin)的含量測定照高效液相色譜法(中華人民共和國藥典附錄VID)測定 
1.1.1儀器和試藥 
Waterse2695高效液相色譜儀,配Waters2998PAD二極管陣列紫外檢測器,乙腈為 色譜純,甲酸為分析純(97%,Alfa Aesar公司),水為純凈水(娃哈哈公司)。對照品矮牽牛單寧(petanin)為從黑果枸杞果實提取物中分離制備,其理化數據如下: 
紫紅色粉末,1H-NMR(CD3OD+CF3COOD,9:1):矮牽牛花苷元部分8.89(s,H-4),6.97(d,J=1.5Hz,H-6),6.98(d,J=1.5Hz,H-8),7.89(d,J=2.0Hz,H-2′),7.73(d,J=2.0Hz,H-6′),3.95(3H,s,OMe);3-O-β-葡萄糖部分5.51(d,J=7.5Hz,H-1),3.77(dd,J=7.5,9.0Hz,H-2),3.67(t-like,J=9.0Hz,H-3),3.53(dd,J=9.0,9.5Hz,H-4),3.89(m,H-5),4.04(dd,J=11.5,2.0Hz,H-6a),3.77(dd,J=11.5,5.8Hz,H-6b);鼠李糖部分4.71(brs,H-1),3.85(brs,H-2),3.86(d,J=9.5Hz,H-3),4.89(t-like,J=9.5Hz,H-4),3.78(dd,J=9.5,6.5Hz,H-5),1.09(d,J=6.5Hz,H-6);5-O-β-葡萄糖部分5.18(d,J=8.0Hz,H-1),3.74(m,H-2),3.63(m,H-3),3.57(m,H-4),3.64(m,H-5),3.98(d,J=12.0Hz,H-6a),3.84(dd,J=12.0,6.0Hz,H-6b);反式香豆酰部分7.38(2H,d,J=8.5Hz,H-2andH-6),6.78(2H,d,J=8.5Hz,H-3andH-5),6.19(d,J=16.0Hz,H-7),7.52(d,J=16.0Hz,H-8). 13C-NMR(CD3OD+CF3COOD,9:1):矮牽牛花苷元部分164.4(s,C-2),146.4(s,C-3),134.5(d,C-4),157.3(s,C-5),105.9(d,C-6),170.1(s,C-7),97.8(d,C-8),157.0(s,C-9),113.4(s,C-10),119.9(s,C-1′),109.9(d,C-2′),150.1(s,C-3′),147.9(s,C-4′),146.5(s,C-5′),114.4(d,C-6′);3-O-β-葡萄糖部分103.0(d,C-1),75.0(d,C-2),78.6(d,C-3),71.6(d,C-4),78.0(d,C-5),67.6(t,C-6);鼠李糖部分102.4(d,C-1),72.4(d,C-2),70.7(d,C-3),75.7(d,C-4),68.2(d,C-5),18.1(q,C-6);5-O-β-葡萄糖部分103.1(d,C-1),75.1(d,C-2),78.2(d,C-3),71.3(d,C-4),79.0(d,C-5),62.4(t,C-6);反式香豆酰部分127.5(s,C-1),131.6(2C,d,C-2andC-6),117.2(2C,d,C-3andC-5),161.6(s,C-4),147.4(d,C-7),115.3(d,C-8),169.4(s,C-9).LC-ESI-MS(positive):933(M+).以上數據與文獻(Slimestad R.,AabergA.,Andersen Ф.M.,Acylated anthocyanins from petunia flowers,Phytochemistry,1999,50,1084-1086)的petanin數據一致。 
1.1.2色譜條件和系統適應性 
色譜柱:AlltimaTMC18 5μ 250*4.6mm;流動相:溶劑A為10%HCOOH–H2O,溶劑B為10%HCOOH–CH3CN,A:B=84:16;柱溫:35℃;流速:1.0ml/min;檢測波長:525nm;理論塔板數按petanin計不應低于3000,供試品中petanin與相鄰峰的分離度符合要求。 
1.1.3對照品溶液的制備 
精密稱取對照品petanin適量,加流動相溶液配制成每1ml中約含800μg的溶液, 搖勻,用0.45μm膜濾過,取續濾液,即得。 
1.1.4供試品溶液的制備 
精密稱取黑果枸杞果實提取物適量,加流動相溶液配制成每1ml中約含5.0mg的溶液,搖勻,用0.45μm膜濾過,取續濾液,即得。 
1.1.5測定法 
分別精密吸取對照品和供試品溶液20μl,注入高效液相色譜儀(見圖1和圖2),測定,按外標法以峰面積計算,即得。此方法可用于測定黑果枸杞果實提取物中petanin的含量,對該黑果枸杞果實提取物進行質量控制。 
1.2方法學考察 
1.2.1色譜條件的考察 
分別對Kromasil C18 5μ 250*4.6mm、Dikma C18 5μ 250*4.6mm和AlltimaTMC18 5μ250*4.6mm三種十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱進行研究,AlltimaTMC18柱的峰型和分離度最好,其次是Kromasil C18柱,Dikma C18柱最差。故選擇AlltimaTM C18 5μ250*4.6mm作為含量測定用色譜柱。 
1.2.2檢測波長的選擇 
取對照品溶液于190~600nm波長范圍進行紫外掃描,其在515~535nm波長范圍吸收較強,在530nm附近吸收最強,考慮到供試品中含有大量的花青素類成分,其紫外也都在515~535nm波長范圍吸收較強,為了能保證其它干擾成分盡量能檢測到,我們選擇了525nm作為含量測定的檢測波長。 
1.2.3流動相選擇 
實驗過程中選擇了三組流動相:(1)流動相I:A為1%HCOOH-H2O,溶劑B為1%HCOOH-CH3CN,A:B=80:20.(2)流動相II:A為5%HCOOH-H2O,溶劑B為5%HCOOH-CH3CN,A:B=82:18.(3)流動相III:A為10%HCOOH-H2O,溶劑B為10%HCOOH-CH3CN,A:B=84:16. 
研究結果表明:采用流動相I時,峰型極差,無分離效果。采用流動相II時,拖尾嚴重。采用流動相III時,峰型和分離度都很好,符合分析要求,故以流動相體系III為最終條件。 
1.2.4空白試驗 
為了進一步考察實驗設計的合理性,按照對照品和供試品溶液一樣的制備方法,不加任何樣品,配制一份空白溶液,按樣品測定方法進行測定,記錄色譜圖(見圖3),結 果表明,在與對照品petanin相應的保留時間處無干擾峰出現,從而證明本方法是合理可行的。 
1.2.5標準曲線 
精密稱取對照品petanin樣品16.95mg,置于10ml容量瓶中,加流動相定容至刻度,搖勻,用0.45μm膜濾過,取續濾液,分別精密吸取2,4,6,8,10,15,20μl對照品溶液注入高效液相色譜儀,按照前述色譜條件測定。以峰面積Y為縱坐標,進樣量(μg)為橫坐標,繪制標準曲線(見圖4),得線性方程為:Y=1.51×106X–1.58×106,R2=0.9998,表明在進樣量為3.390μg~33.900μg范圍內,線性關系良好。 
1.2.6穩定性試驗 
精密稱取供試品49.44mg,置于10ml容量瓶中,加流動相溶液溶解并定容至刻度,搖勻,用0.45μm膜濾過,取續濾液,于0,1,2,4,6,8小時,分別精密吸取20μl注入高效液相色譜儀,按照前述色譜條件測定,記錄化合物petanin的峰面積,計算含量,測定結果見表1,RSD(%)為0.59,表明供試品溶液在8小時內穩定。 
表1.穩定性試驗樣品含量(μg/ml)測定結果 

1.2.7重復性實驗 
精密稱取同一批次的黑果枸杞果實提取物樣品6份,按照供試樣品溶液的制備方法配制溶液,搖勻,用0.45μm膜濾過,取續濾液,分別精密吸取20μl注入高效液相色譜儀,按照前述色譜條件測定,記錄化合物petanin的峰面積,計算含量(%),測定結果見表2,RSD(%)為1.02,表明該實驗方法重復良好,符合含量測定要求。 
表2.重復性實驗樣品中化合物petanin含量(%)測定結果 

3.2.8回收率試驗 
精密稱取已知含量(16.33%)的黑果枸杞果實提取物樣品6份,置于10ml容量瓶 中,分別加入對照品溶液5ml(1.652mg/ml),然后加流動相溶液定容至刻度,搖勻,用0.45μm膜濾過,取續濾液,分別精密吸取20μl注入高效液相色譜儀,按照前述色譜條件測定,計算回收率,結果表明該方法回收率較高(99.61%),方法準確度高,結果見表3. 
表3.加樣回收率試驗測定結果 

1.2.9含量測定 
按照研究最后確定的黑果枸杞果實提取物中化合物petanin含量測定方法(色譜柱:AlltimaTM C18 5μ 250*4.6mm;流動相:溶劑A為10%HCOOH-H2O,溶劑B為10%HCOOH-CH3CN,A:B=84:16;柱溫:35℃;流速:1.0ml/min;檢測波長:525nm)對制備所得樣品進行含量測定,其結果見實施例,考慮到黑果枸杞果實批次間的差異,將黑果枸杞果實提取物中矮牽牛單寧(petanin)含量范圍定為14%~18%。 
實施例2 
黑果枸杞果實提取物的提取方法: 
(1)提取:將黑果枸杞果實,加入重量濃度為2‰鹽酸的水溶液,在溫度60℃攪拌提取三次,每次0.5小時,過濾收集提取液; 
鹽酸的水溶液的重量用量為黑果枸杞果實的8倍; 
(2)吸附:將步驟(1)中得到的提取液,通過裝有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔樹脂的層析柱,使黑果枸杞果實提取液得到選擇性充分吸附; 
(3)洗脫:先用水洗脫步驟(2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱,直至洗脫液為中性或檢測無糖反應,再用洗脫液洗脫,收集層析柱流出的洗脫液; 
洗脫液由如下重量百分比的組分組成: 
酸                          2‰ 
體積濃度為75%的乙醇水溶液    余量 
洗脫液的重量用量為步驟(1)中黑果果實的20倍; 
所述的酸為鹽酸; 
(4)濃縮:將步驟(3)中所得洗脫液于60℃條件下減壓濃縮回收乙醇,直至25℃時的溶液密度為1.1,得黑果枸杞果實提取物浸膏; 
(5)干燥:將步驟(4)中所得黑果枸杞果實提取物浸膏進行冷凍干燥,獲得黑果枸杞果實提取物。 
采用上述方法獲得的黑果枸杞果實提取物,含有: 
矮牽牛單寧(petanin)的重量含量為16.33%。 
檢測方法:采用實施例1的檢測方法,其中: 
以黑果枸杞果實提取物中所含化合物矮牽牛單寧(petanin)為指標性成分。 
色譜條件:色譜系統,Waterse2695+2998PAD檢測器;色譜柱,AlltimaTMC18 5μ250*4.6mm;流動相,溶劑A為10%HCOOH–H2O,溶劑B為10%HCOOH–CH3CN,A:B=84:16;柱溫35℃;流速,1.0ml/min;檢測波長,525nm。 
圖1為矮牽牛單寧(petanin)對照品液相圖譜,圖2為黑果枸杞果實提取物中矮牽牛單寧含量測定液相圖譜,圖3為空白溶液液相圖譜,圖4為矮牽牛單寧對照品液相色譜(HPLC)含測標準曲線。 
其中:矮牽牛單寧(petanin)對照品為從黑果枸杞果實提取物中分離制備得到。 
實施例3 
黑果枸杞果實提取物的提取方法: 
(1)提取:將黑果枸杞果實,加入重量濃度為1‰檸檬酸的水溶液,在溫度10℃攪拌提取三次,每次1小時,過濾收集提取液; 
酸的水溶液的重量用量為黑果枸杞果實的12倍; 
(2)吸附:將步驟(1)中得到的提取液,通過裝有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔樹脂的層析柱,使黑果枸杞果實提取液得到選擇性充分吸附; 
(3)洗脫:先用水洗脫步驟(2)中吸附了黑果枸杞果實提取液的層析柱,直至洗脫液為中性或檢測無糖反應,再用洗脫液洗脫,收集層析柱流出的洗脫液; 
洗脫液由如下重量百分比的組分組成: 
酸                          0.1‰ 
體積濃度為75%的乙醇水溶液    余量 
洗脫液的重量用量為步驟(1)中黑果枸杞果實的15倍; 
所述的酸為檸檬酸; 
(4)濃縮:將步驟(3)中所得洗脫液于50℃條件下減壓濃縮回收乙醇,直至25℃時的溶液密度為1.2,得黑果枸杞果實提取物浸膏; 
(5)干燥:將步驟(4)中所得黑果枸杞果實提取物浸膏進行冷凍干燥,獲得黑果枸杞果實提取物。 
采用上述方法獲得的黑果枸杞果實提取物,含有: 
矮牽牛單寧(petanin)的重量含量為:15.5%。 
檢測方法同實施例1。 
實施例4 
黑果枸杞果實提取物(HGGQ)對CTX誘導白細胞減少模型小鼠外周血白細胞的影響 
1.試驗目的 
觀察黑果枸杞果實提取物(HGGQ)對環磷酰胺CTX誘導白細胞減少模型小鼠外周血白細胞的影響。 
1.1試驗內容 
1.1.1試驗樣品 
樣品:HGGQ(實施例2中得到的黑果枸杞果實提取物) 
環磷酰胺(CTX):江蘇恒瑞醫藥股份有限公司,200mg/瓶,批號:10110621。 
1.1.2配制方法 
樣品:HGGQ,配制時用生理鹽水溶解。 
CTX:用生理鹽水配制。 
1.1.3動物 
BALB/c小鼠60只,雌性,體重18-20g,由中科院上海實驗動物中心提供。 
1.1.4試驗方法 
取BALB/c小鼠60只,隨機分為6組,分別為空白對照組、HGGQ(100mg/kg)+CTX(預防)、HGGQ(200mg/kg)+CTX(預防)、HGGQ(100mg/kg)+CTX(治療)、HGGQ(200mg/kg)+CTX(治療)、CTX模型組,每組10只。空白對照組未做任何處理,其他五組均給予CTX腹腔注射(100mg/kg),每天一次,連續給藥3天后于第四天用動物血液分析儀測定各組小鼠的白細胞總數,結果均低于空白對照組(均P<0.01),提示CTX誘導小鼠造血功能障礙模型建立成功。HGGQ+CTX(預防) 組于造模當天同時給藥HGGQ 100mg/kg、200mg/kg(口服給藥)每天一次,HGGQ+CTX(治療)在第四天開始給予HGGQ 100mg/kg、200mg/kg(口服給藥)每天一次。模型組和空白對照組小鼠于第四天始灌服等量0.5%CMC-Na溶液。 
分別于給藥前和給藥后的第4、6、8、11、13、15天,按常規方法小鼠眼眶靜脈取血,測外周血白細胞總數,分析HGGQ對模型小鼠外周血白細胞的影響情況。 
1.1.5結果 
HGGQ對CTX誘導的小鼠白細胞減少的影響結果見表4。在HGGQ+CTX(預防)組和HGGQ+CTX(治療)組兩種給藥方案上與模型組比較,小鼠白細胞數最低點均要略高,白細胞恢復時間快,提示黑果枸杞果實提取物(HGGQ)有升高小鼠外周血白細胞,從而能緩解CTX誘導的小鼠白細胞減少的作用。 
表4:小鼠外周血白細胞數的變化表(單位×109/L) 


結果表明:黑果枸杞果實提取物在100mg/kg時,在預防(造模同時給藥)和治療(造模后三天給藥)兩種給藥方案上與模型組比較,小鼠白細胞數最低點均要略高,白細胞恢復時間快,提示黑果枸杞果實提取物有升高小鼠外周血白細胞,從而能緩解CTX誘導的小鼠白細胞減少的作用。以上結果表明,所述黑果枸杞果實提取物可以用于細胞毒性藥物引起的白細胞減少的治療。 
實施例5 
黑果枸杞果實提取物(HGGQ)對苯中毒小鼠白細胞(WBC)減少的治療作用。 
1.試驗目的 
觀察黑果枸杞果實提取物(HGGQ)對苯中毒白細胞(WBC)減少的治療作用。 
1.1試驗內容 
樣品:HGGQ(實施例2中得到的黑果枸杞果實提取物) 
苯(分析純、批號030701-2)購于廣州化學試劑廠。 
1.2動物 
BALB/c小鼠共60只,雌性,體重18-20g,由中科院上海實驗動物中心提供。 
2.方法 
2.1藥品及試劑配制 
2.1.1HGGQ,配制時用生理鹽水溶解。 
2.1.2200mg/ml苯-花生油混懸液:20.0g苯加花生油至100ml。 
2.2實驗分組及處理 
將50只小鼠按WBC水平隨機分為5組,每組10只,其中4組作為苯中毒組,給苯劑量為2000mg/kg,按10ml/kg灌胃200mg/ml苯-花生油混懸液,每天1次,6d/w,連續灌胃2周。一組作為正常對照組,灌服生理鹽水,灌胃量及時間同苯中毒組。在實驗第0、1、2周,分別剪尾采血檢測白細胞數(WBC)。染苯2周后,選取白細胞數降至4.0×109/L以下的20只小鼠作為苯中毒致白細胞減少小鼠模型。 
模型制備實驗結束后,按WBC水平將模型小鼠隨機分為3組,每組10只。其中設HGGQ兩個處理組,即50mg/kg、100mg/kg(口服給藥)劑量組,每天1次,6d/w,連續2周;設模型對照組一組,與未經苯處理的正常對照組一樣,口服灌胃生理鹽水,每 天1次,6d/w。為防治停止染苯后可能出現的WBC自發恢復,在治療第2周的最后3d,除正常對照組不予處理外,其余3組均同時予以灌胃染苯,方法同復模階段。 
2.3檢測指標 
在實驗第0、1、2、3、4周(后3周是給藥治療的第0、1、2周),分別用剪尾采血法取血20μl加入到血球稀釋液中,在血球分析儀上測定白細胞(WBC)。 
3.結果 
3.1苯2000mg/kg灌胃對小鼠白細胞的影響 
染苯前,兩組小鼠白細胞數無顯著性差異(P>0.05)。染苯1周后,造模小鼠白細胞數下降,明顯低于正常對照組(P<0.01)。染苯2周后,造模小鼠白細胞數繼續下降,其中30只小鼠WBC降至4.0×109/L以下,而正常對照組小鼠WBC的變化經檢驗無顯著性差異(P>0.05)。以上結果表明,以2000mg/kg苯灌胃2周可使多數小鼠WBC<4.0×109/L而達到造模要求。見表5。 
表5 苯灌胃對小鼠白細胞(WBC)數的影響 
組別 劑量(mg/kg) n 0w(109/L) 1w(109/L) 2w(109/L) 正常對照組 0 10 7.62±0.81 8.15±1.98 7.29±1.00 染苯組 2000 30 8.54±1.33 4.32±1.05** 2.38±1.25**
與正常對照組比較,**P<0.01。 
3.2HGGQ對苯中毒小鼠白細胞的影響 
給藥前,各組造模小鼠白細胞數均明顯低于正常對照組(P<0.01),造模小鼠各組間無顯著性差異(P>0.05)。給藥1周后,各組造模小鼠白細胞數均有所回升,但仍明顯低于正常對照組(P<0.01)。給藥2周后,HGGQ(50mg/kg、100mg/kg)組小鼠白細胞數明顯高于模型對照組(P<0.01),與正常對照組差異無顯著性(P>0.05)。而正常對照組WBC的變化經檢驗無顯著性差異。以上結果表明,HGGQ(50mg/kg、100mg/kg)灌胃治療2周可對抗苯中毒引起的白細胞減少。見表6。 
表6 HGGQ灌胃對苯中毒小鼠白細胞(WBC)的影響 


與模型對照組比較,**:P<0.01;與正常對照組比較,▲▲:P<0.01。 
4.結論 
苯2000mg/kg灌胃小鼠2周后可使WBC降至4.0×109/L以下而復制出苯中毒白細胞減少小鼠模型,而黑果枸杞果實提取物(HGGQ)灌胃50mg/kg、100mg/kg對苯中毒小鼠有明顯的升高白細胞的作用。以上結果表明:所述黑果枸杞果實提取物可以用于有毒化學品引起的白細胞減少的治療。 

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