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止瀉木生物堿衍生物及其用途.pdf

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止瀉 生物堿 衍生物 及其 用途
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摘要
申請專利號:

CN201310110844.7

申請日:

2013.03.31

公開號:

CN103193857B

公開日:

2014.12.24

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07J 71/00申請日:20130331|||公開
IPC分類號: C07J71/00; A61P25/28 主分類號: C07J71/00
申請人: 蘭州理工大學
發明人: 楊中鐸; 靳國斐; 盛捷; 舒宗美; 張新國
地址: 730050 甘肅省蘭州市蘭工坪287號
優先權:
專利代理機構: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102 代理人: 董斌
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310110844.7

授權公告號:

103193857B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.24|||2013.08.07|||2013.07.10

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

止瀉木生物堿衍生物及其用途,通式(Ⅰ)的止瀉木生物堿衍生物,其中R為取代苯基,或取代萘基,具體為如下基團:苯基、對硝基苯基、對甲基苯基、對甲氧基苯基、2,4二氯苯基、對氯苯基、2,4二硝基苯基、2-萘基、1-萘基、4-氯-1-萘基、鄰甲氧基苯基;所述的止瀉木生物堿衍生物在制備預防、治療老年癡呆癥藥物或提高智力藥物中的用途。

權利要求書

權利要求書
1.   通式(Ⅰ)的止瀉木生物堿衍生物,

其中R為取代苯基,或取代萘基,具體為如下基團:苯基、對硝基苯基、對甲基苯基、對甲氧基苯基、2,4二氯苯基、對氯苯基、2,4二硝基苯基、2?萘基、1?萘基、4?氯?1?萘基、鄰甲氧基苯基。

2.   權利要求1所述的止瀉木生物堿衍生物在制備預防、治療老年癡呆癥藥物或提高智力藥物中的用途。

說明書

說明書止瀉木生物堿衍生物及其用途 
技術領域
本發明屬于藥物化學和藥物治療學領域,具體涉及N?3取代的止瀉木生物堿衍生物的合成及其在制備預防、治療老年癡呆癥藥物或提高智力藥物中的用途。 
背景技術
阿爾茨海默病(Alzheimer2.isease,即老年性癡呆,簡稱AD)是一種慢性進行性腦變性疾病,臨床上以認知功能減退為核心癥狀。 
AD的發病率與年齡呈正相關,是老年癡呆的主要類型。 
近年來,國內外臨床研究表明,乙酰膽堿酯酶抑制劑是治療AD最有效的藥物,另外對青光眼、重癥肌無力、腸梗阻等癥的治療也有較好的作用(金有豫.藥理學(第五版),2001;54?55.)。 
目前FDA批準的乙酰膽堿酯酶抑制劑(acetylocholinesterase inhibitor, ACEhI)有他克林(tacrine)多奈哌齊(donepezil)、加蘭他敏(galanthamine)和石杉堿甲,這類藥物通過抑制乙酰膽堿酯酶的活性,提高乙酰膽堿水平,增強中樞乙酰膽堿神經的功能,在一定程度上改善AD早期患者的病情。 
但上述抑制劑仍存在一定缺陷,主要是對肝臟的毒性較大,有惡心和嘔吐的副作用及體內乙酰膽堿利用度低等,因此開發新一代藥理活性高,毒副作用小的乙酰膽堿酯酶抑制劑作為治療AD的藥物顯得非常必要。 
我們在從植物提取物中篩選用于老年癡呆癥治療的乙酰膽堿酯酶抑制劑時,發現止瀉木生物堿:錐絲堿(1),異錐絲明(2)、錐絲明(3)、conarrhimin(4)、錐絲亞胺(5)(結構如下式)具有較好的乙酰膽堿酯酶抑制活性,可以用于治療老年癡呆癥藥物的制備(楊中鐸等,止瀉木總生物堿提取物的有效單體制備方法及其用途,ZL201110074795.7) 

止瀉木中分離的乙酰膽堿酯酶抑制劑的結構
上述止瀉木總生物堿雖然具有一定的乙酰膽堿酯酶抑制作用,可以用于制備抗老年癡呆癥藥物,但比市場上使用的藥物如石杉堿甲作用要弱,且用藥量大。
本發明提供系列N?3位取代的止瀉木生物堿,作為強效乙酰膽堿膽堿酯酶抑制劑,用于制備老年癡呆癥藥物或提高智力藥物。 
發明內容
    本發明的目的之一就是提供一系列N?3位取代的止瀉木生物堿及其合成方法;本發明的另一目的是公開所述衍生物作為強效乙酰膽堿酯酶抑制劑在制備老年癡呆癥藥物或提高智力藥物的用途。 
為實現上述目的,本發明提供了有下述化學結構式Ⅰ表示的N?3取代的止瀉木生物堿衍生物。 
  

其中R為取代苯基,或取代萘基,具體為如下基團:苯基、對硝基苯基、對甲基苯基、對甲氧基苯基、2,4二氯苯基、對氯苯基、2,4二硝基苯基、2?萘基、1?萘基、4?氯?1?萘基、鄰甲氧基苯基。
根據本發明的另一方面,提供一種制備化學式Ⅰ所示的N?3取代的止瀉木生物堿衍生物的方法,該方法包括的步驟及相關結構式如下: 
a、 將先導化合物錐絲堿(1)在雙氧水氧化和Fe2SO4還原轉變為N?3脫甲基異錐絲明(2);

b、酚類化合物與1,2?二溴乙烷進行親核取代反應,得到化合物6a?6k,

c、化合物2與化合物6a?6k在乙腈中碳酸鉀存在下回流反應,制得N?3取代的止瀉木生物堿衍生物7a?7k

本發明提供的N?3取代的止瀉木生物堿衍生物7a?7k為強效乙酰膽堿酯酶的抑制劑,可以作為有效成分用于老年癡呆癥藥物或提高智力藥物的制備。
本發明提供了的N?3取代的止瀉木生物堿7a?7k作為藥物的應用,可為注射劑、片劑、丸劑、膠囊、懸乳劑或乳劑等。 
本發明提供的N?3取代的止瀉木生物堿衍生物具有以下優點: 
1.在體外生物活性測試中,本發明提供的3?N取代的止瀉木生物堿衍生物具有強效的乙酰膽堿酯酶抑制活性,其中部分衍生物抑制活性比母體化合物2高100?1000倍,接近陽性藥石杉堿甲的水平。
2. 在體內生物活性測試中,部分止瀉木生物堿衍生物對藥物誘導的癡呆小鼠的學習記憶能力有明顯的提高,效果接近陽性藥石杉堿甲。 
具體實施方式
     本發明是通過下面的具體實施例進行描述,通過具體實施例可以更好的理解本發明,但本發明的范圍不受這些實施例的限制。
實施例1:錐絲堿(化合物1)的制備 
將粉碎的止瀉木(粉末)2kg裝入20L圓底燒瓶中,然后用13L 90%乙醇回流提取3h,過濾,將濾渣再用12L 90%乙醇回流提取2h,過濾,合并兩次的濾液并濃縮。
將所得固形物用水溶解,然后轉入5L燒杯中,用4M HCl 調PH至2,靜止過夜后過濾,再用4M NaOH 調PH至11,然后用等體積的氯仿萃取,減壓蒸餾,得止瀉木總生物堿200g。 
用重蒸乙醇將止瀉木總生物堿加熱溶解,然后用大孔樹脂進行分離純化。 
以20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液進行梯度洗脫。 
將含有錐絲堿(化合物1)的組分合并,然后用硅膠柱反復進行分離純化,洗脫劑為氯仿:甲醇:氨水=15:1:0.1,最終得錐絲堿(化合物1)3g。 
錐絲堿(化合物1),白色粉末狀固體,無色片狀結晶,mp 127.0?128.5℃; 與Dragendorff試劑顯橙紅色。 
ESI?MS m/z: 357[M+H]+. 1H?NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 0.93 (3H, s, H?19), 1.04 (3H, d, J=5.2 Hz, H?21), 1.93 (1H, m, H?18a), 2.21 (3H, s, H?22), 2.33 (6H, s, H?23, 24), 2.98 (1H, d, J=10.7 Hz, H?18b), 5.34 (1H, Br s, H?6); 13C?NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 38.3 (C?1), 25.1 (C?2), 64.9 (C?3), 35.1 (C?4), 141.8 (C?5), 120.8 (C?6), 32.0 (C?7), 33.4 (C?8), 49.9 (C?9), 36.9 (C?10), 22.0 (C?11), 38.7 (C?12), 50.4 (C?13), 55.8 (C?14), 24.6 (C?15), 27.6 (C?16), 53.5 (C?17), 64.6 (C?18), 19.4 (C?19), 63.2 (C?20), 14.6 (C?21), 41.2 (C?22), 41.6 (C?23), 41.6 (C?24); 以上光譜數據與錐絲堿的文獻值(Zirihi G N, et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2005, 15: 2637?2640)一致。 
     實施例2: 止瀉木生物堿N?3脫甲基衍生物(化合物2)的制備 
     a步反應:
     將2g(6mmol)干燥的止瀉木生物堿(化合物1)加入50mL圓底燒瓶中,用20mL無水甲醇溶解,然后滴加5mL30%雙氧水,在室溫下反應過夜。
之后反應液中加入10mL蒸餾水,攪拌均勻,用氯仿萃取3次,萃取液用硫酸鈉干燥后過濾濃縮,硅膠柱層析純化得化合物1的3位N氧化物。 
b步反應: 
將上述化合物1的3位N氧化物加入到50mL圓底燒瓶中,用20mL無水甲醇溶解,加入FeSO4·7H20 3.3g(12mmol),常溫下氮氣保護反應過夜。
然后向反應液中加入10mL飽和NaHCO3,反應20min后加入10mL蒸餾水,用氯仿萃取3次,萃取液硫酸鈉干燥,過濾,濃縮。 
硅膠柱層析純化,得化合物2(954mg)。 
化合物2(異錐絲明),白色粉末狀固體,mp 70?72℃,與Dragendorff試劑顯橙紅色。 
ESI?MS m/z: 343[M+H]+. 1H?NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 0.94 (3H, s, H?19), 1.04 (3H, d, J=5.2 Hz, H?21), 2.21 (3H, s, H?22), 2.33 (3H, s, H?23), 2.98 (1H, d, J=10.2 Hz, H?18b), 5.36 (1H, Br s, H?6); 13C?NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 38.7 (C?1), 28.9 (C?2), 59.8 (C?3), 37.9 (C?4), 141.4 (C?5), 120.7 (C?6), 32.0 (C?7), 33.4 (C?8), 49.9 (C?9), 37.1 (C?10), 22.0 (C?11), 39.5 (C?12), 50.3 (C?13), 55.8 (C?14), 24.5 (C?15), 27.6 (C?16), 53.5 (C?17), 64.6 (C?18), 19.4 (C?19), 63.1 (C?20), 14.8 (C?21), 41.2 (C?22), 33.4 (C?23); 以上光譜數據與異錐絲明(isoconessimine)文獻值(Zirihi G N, et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2005, 15: 2637?2640)一致。 
實施例3: 2?溴乙基酚醚6a?6k的制備。 
將0.01mol酚、0.5g(0.012mol)NaOH、0.05g TBAB、0.05g KI,一并加入三口瓶中,加入20mL蒸餾水。 
加熱使原料完全溶解。 
當溫度達到90℃時,開始滴加1,2?二溴乙烷1.3mL(0.015mol),控制反應在100℃左右,反應5h。 
反應結束后,冷卻,水層除去,有機層加入2% NaOH水溶液洗滌2次,飽和氯化鈉洗滌1次,硫酸鈉干燥,過濾,濃縮。 
硅膠柱層析純化。 
得2?溴乙基酚醚6a?6k (產率80%——90%)。 
實施例4:制備N?3取代的止瀉木生物堿衍生物7a?7k
    將30mg(0.09mmol)化合物2、0.24mmol的2?溴乙基酚醚6a?6k、0.45mmol的K2CO3,2mg 的KI,置于25ml圓底燒瓶中,用10mL無水乙腈溶解, 85℃反應12h,反應結束后冷卻,過濾,濃縮。
硅膠柱層析純化,得化合物7a?7k(產率70%——90%)。 
化合物7a?7k的波譜數據如下:
化合物7a(N?苯氧乙基異錐絲明),無色片狀結晶。
1HNMR(CDCl3, 400 MHz): ESI?MS m/z: 463.4[M+H]+. 1H?NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 0.93 (3H, s), 1.06 (3H, d, J=6.4 Hz), 2.20 (3H, s, N?CH3), 2.40 (3H, s, N?CH3), 3.02 (1H, d, J=10.4 Hz), 2.89 (2H, t, J=6.4 Hz), 4.04 (2H, t, J=6.4 Hz), 5.35 (1H, Br s), 6.93 (3H, m), 7.29 (2H, t, J=8.4 Hz); 13C?NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 38.5, 27.4, 55.7, 34.6, 141.8, 120.7, 31.9, 33.4, 41.1, 37.0, 19.5, 38.5, 50.5, 53.4, 24.4, 24.7, 49.9, 66.5, 19.5, 64.2, 14.6, 38.9, 64.2, 66.5 , 52.3, 114.5(2個C), 129.3(2個C), 141.8, 158.8. 
化合物7b(N?(4?硝基苯)氧乙基異錐絲明),淡黃色粉末狀固體。
ESI?MS m/z: 508.2[M+H]+. 1H?NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 0.93 (3H, s), 1.15 (3H, d, J=6.4 Hz), 2.46 (6H, s, N?CH3), 3.18 (1H, d, J=10.4 Hz), 2.93 (2H, t, J=6.4 Hz), 4.14 (2H, t, J=6.4 Hz), 5.35 (1H, Br s), 6.96 (2H, d, J=8.0 Hz), 8.19 (2H, d, J=8.0Hz); 13C?NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 38.4, 29.0, 55.6, 34.6, 141.4, 120.8, 31.9, 33.5, 41.2, 37.0, 22.0, 38.4, 50.8, 53.4, 24.8, 24.9, 49.8, 67.7, 19.6, 64.3, 14.5, 39.0, 64.3, 67.7 , 52.0, 114.4(2個C), 125.9(2個C), 141.6, 163.9. 
化合物7c(N?(4?甲基苯)氧乙基異錐絲明),白色粉末狀固體。
ESI?MS m/z: 477.3[M+H]+. 1H?NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 0.93 (3H, s), 1.05 (3H, d, J=6.0 Hz), 2.44 (3H, s, N?CH3), 2.28 (3H, s, N?CH3), 2.22 (3H, s, 芳環CH3), 3.00 (1H, d, J=10.4 Hz), 2.87 (2H, t, J=6.0 Hz), 4.01 (2H, t, J=6.0 Hz), 5.35 (1H, Br s), 6.80 (2H, d, J=8.0 Hz), 7.06 (2H, d, J=8.0Hz); 13C?NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 38.7, 27.6, 55.8, 34.6, 141.9, 120.7, 32.0, 33.5, 41.2, 37.0, 22.0, 38.4, 50.4, 53.5, 24.5, 24.7, 50.0, 64.6, 19.5, 64.2, 14.8, 38.4, 63.2, 66.7 , 52.3, 114.3 (2個C), 129.8(2個C), 141.9, 156.7. 
化合物7d(N?(4?甲氧基苯)氧乙基異錐絲明),白色粉末狀固體。
ESI?MS m/z: 493.4[M+H]+. 1H?NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 0.93 (3H, s), 1.04 (3H, d, J=6.0 Hz), 2.43 (3H, s, N?CH3), 2.21 (3H, s, N?CH3), 3.76 (3H, s, 芳環OCH3), 2.99 (1H, d, J=10.4 Hz), 2.92 (2H, t, J=6.0 Hz), 3.99 (2H, t, J=6.0 Hz), 5.35 (1H, Br s), 6.82 (4H, m); 13C?NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 38.6, 27.5, 55.7, 34.6, 141.9, 120.7, 32.0, 33.5, 41.1, 37.0, 22.0, 38.4, 50.5, 53.5, 24.5, 24.7, 50.0, 64.4, 19.5, 64.2, 14.7, 38.9, 63.3, 55.8 (OMe), 67.3 , 52.4, 114.5 (2個C), 120.7 (2個C), 153.7, 153.0. 
化合物7e(N?(2, 4?二氯苯)氧乙基異錐絲明),黃色油狀液體。
ESI?MS m/z: 531.2[M+H]+. 1H?NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 0.94 (3H, s), 1.04 (3H, d, J=6.4 Hz), 2.43 (3H, s, N?CH3), 2.21 (3H, s, N?CH3), 2.99 (1H, d, J=10.4 Hz), 2.93 (2H, t, J=6.0 Hz), 4.06 (2H, t, J=6.0 Hz), 5.35 (1H, Br s), 6.84 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.16 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.34 (1H, d, J=2.0 Hz);13C?NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 38.7, 27.6, 55.8, 34.8, 141.8, 120.8, 32.0, 33.5, 41.1, 37.0, 22.0, 38.4, 50.4, 53.5, 24.5, 24.8, 50.0, 64.6, 19.5, 64.3, 14.8, 39.2, 63.2, 68.7, 52.1, 113.9, 123.6, 125.6, 127.5, 129.9, 153.3. 
化合物7f (N?(4?氯苯氧)乙基異錐絲明),無色塊狀結晶。
ESI?MS m/z: 497.3[M+H]+. 1H?NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 0.93 (3H, s), 1.04 (3H, d, J=6.0 Hz), 2.42 (3H, s, N?CH3), 2.22 (3H, s, N?CH3), 2.99 (1H, d, J=10.4 Hz), 2.88 (2H, t, J=6.0 Hz), 4.00 (2H, t, J=6.0 Hz), 5.35 (1H, Br s), 6.82 (2H, d, J=8.8 Hz), 7.21 (1H, d, J=8.8 Hz);13C?NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 38.7, 27.6, 55.8, 34.6, 141.8, 120.8, 32.0, 33.5, 41.1, 37.0, 22.0, 38.4, 50.4, 53.5, 24.5, 24.7, 50.0, 64.5, 19.5, 64.2, 14.8, 38.9, 63.2, 67.1, 52.2, 115.7 (2個C), 129.2 (2個C), 125.4, 157.4. 
化合物7g (N?(2, 4?二硝基苯)氧乙基異錐絲明),黃色粉末狀固體。
ESI?MS m/z: 553.4[M+H]+. 1H?NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 0.93 (3H, s), 1.05 (3H, d, J=6.0 Hz), 2.37 (3H, s, N?CH3), 2.25 (3H, s, N?CH3), 3.12 (1H, d, J=10.4 Hz), 2.97 (2H, t, J=6.0 Hz), 4.27 (2H, t, J=6.0 Hz), 5.35 (1H, Br s), 7.23 (1H, d, J=8.8 Hz), 8.42 (1H, d, J=8.8 Hz), 8.76 (1H, d, J=2.0 Hz);13C?NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 38.3, 27.3, 55.6, 34.7, 141.5, 120.9, 32.0, 33.5, 41.1, 37.0, 22.0, 38.3, 50.7, 53.4, 24.1, 24.8, 49.9, 64.4, 19.5, 63.8, 14.2, 39.0, 63.8, 70.3, 51.9, 114.5, 121.9, 129.0, 134.2, 140.0, 157.2. 
化合物7h (N?(2?萘)氧乙基異錐絲明),白色粉末狀固體。
ESI?MS m/z: 513.2[M+H]+. 1H?NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 0.94 (3H, s), 1.19 (3H, d, J=6.4 Hz), 2.44 (3H, s, N?CH3), 2.28 (3H, s, N?CH3), 3.21 (1H, d, J=10.4 Hz), 2.97 (2H, t, J=6.0 Hz), 4.18 (2H, t, J=6.0 Hz), 5.35 (1H, Br s), 7.14 (1H, s), 7.15 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.32 (1H, t, J=8.0 Hz), 7.43 (1H, t, J=8.0 Hz), 7.70?7.76(3H, m); 13C?NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 38.4, 27.1, 55.5, 34.6, 141.7, 120.6, 31.9, 33.5, 41.1, 37.0, 22.0, 38.1, 50.9, 53.3, 23.9, 24.8, 49.8, 64.1, 19.5, 63.3, 13.9, 38.9, 63.3, 66.6, 52.3, 106.6, 119.0, 123.5, 126.3, 126.7, 127.6, 128.9, 129.3, 134.5, 156.8. 
化合物7i(N?(1?萘)氧乙基異錐絲明),白色粉末狀固體。
ESI?MS m/z: 513.2[M+H]+. 1H?NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 0.95 (3H, s), 1.04 (3H, d, J=6.0 Hz), 2.45 (3H, s, N?CH3), 2.22 (3H, s, N?CH3), 3.00 (1H, d, J=10.4 Hz), 3.06 (2H, t, J=6.0 Hz), 4.21 (2H, t, J=6.0 Hz), 5.37 (1H, Br s), 6.80 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.34?7.49 (4H, m), 7.78 (1H, d, J=8.0 Hz), 8.26 (1H, d, J=8.0 Hz); 13C?NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 38.6, 27.5, 55.7, 34.8, 141.8, 120.8, 32.0, 33.4, 41.1, 37.0, 22.0, 38.4, 50.5, 53.5, 24.4, 24.9, 49.9, 64.4, 19.5, 64.1, 14.6, 39.1, 63.3, 67.2, 52.4, 104.5, 120.1, 122.1, 125.0, 125.6, 125.8, 126.3, 127.3, 134.4, 154.6. 
化合物7j(N?(4?氯?1?萘)氧乙基異錐絲明),黃色油狀液體。
ESI?MS m/z: 547.4[M+H]+. 1H?NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 0.95 (3H, s), 1.05 (3H, d, J=6.0 Hz), 2.47 (3H, s, N?CH3), 2.23 (3H, s, N?CH3), 3.00 (1H, d, J=10.4 Hz), 3.05 (2H, t, J=6.0 Hz), 4.19 (2H, t, J=6.0 Hz), 5.36 (1H, Br s), 6.71 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.43 (1H, d, J=8.0 Hz), 7.51 (1H, t, J=8.0 Hz), 7.60 (1H, t, J=8.0 Hz), 8.18 (1H, d, J=8.0 Hz), 8.29 (1H, d, J=8.0 Hz); 13C?NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 38.5, 27.4, 55.7, 34.8, 141.8, 120.8, 32.0, 33.5, 41.1, 37.0, 22.0, 38.4, 50.5, 53.5, 24.3, 24.9, 49.9, 64.2, 19.5, 64.2, 14.5, 39.0, 63.5, 67.5, 52.3, 104.6, 122.5, 123.1, 124.2, 125.7, 125.7, 126.6, 127.4, 131.3, 153.8. 
化合物7k(N?(2?甲氧基苯)氧乙基異錐絲明),黃色油狀液體。
ESI?MS m/z: 493.4[M+H]+. 1H?NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 0.93 (3H, s), 1.05 (3H, d, J=6.0 Hz), 2.41 (3H, s, N?CH3), 2.22 (3H, s, N?CH3), 3.00 (1H, d, J=10.4 Hz), 2.96 (2H, t, J=6.0 Hz), 4.10 (2H, t, J=6.0 Hz), 5.34 (1H, Br s), 6.89 (4H,m). 13C?NMR (125 MHz, CDCl3) δppm: 38.6, 27.5, 55.8, 34.6, 141.8, 120.7, 32.0, 33.4, 41.1, 37.0, 22.0, 38.4, 50.4, 53.5, 24.4, 24.6, 49.9, 64.4, 19.5, 64.2, 14.7, 38.9, 63.3, 67.3, 52.1, 55.8 (OMe), 111.7, 112.9, 120.8, 121.0, 148.3, 149.3. 
實施例5:Ellman法測定止瀉木生物堿衍生物7a?7k的抗乙酰膽堿酯酶活性
利用經典的Ellman方法(Ellman G.L,Biochemical Pharmacology,1961;7:88?95)分別測定了化合物2、7a?7k對乙酰膽堿酯酶的半數抑制濃度,石杉堿甲作為陽性對照藥。
具體實驗過程如下: 
運用96孔酶標板測定樣品對酶的抑制活性,樣品組中每孔加入140μL 0.1M的磷酸緩沖液(pH =8.0),然后加入20 μL的樣品,空白孔中加入160μL磷酸緩沖液不加任何樣品,陽性對照控制組中加入20 μL 0.1 mg/mL的石杉堿甲和140μL的磷酸緩沖液,樣品本底孔中20 μL的樣品和155 μL的磷酸緩沖液,除了樣品本底以外的其它孔中均加15μL的乙酰膽堿酯酶,混勻在4℃下培養20min,然后每孔加10 μL 0.01mM 的DTNB(5,5?二硫代雙(2?硝基苯甲酸))和10 μL 0.075 mM 的ATCI(碘化硫代乙酰膽堿),混勻在37℃下培養20min,立即在405nm下測定各孔OD值。
每組實驗重復三次。 
并以下面公式計算樣品對乙酰膽堿酯酶的抑制率。 

根據量效關系和直線回歸法可以計算出樣品對酶的半數抑制濃度值(IC50)。 
結果表明11個樣品均對乙酰膽堿酯酶均強的抑制作用。 
其IC50介于0.11 μM—4.0 μM。 
其中化合物7b活性最好,其IC50為110 nM, 與陽性藥石杉堿甲接近(IC50為70 nM)。 
結果見表1. 
表1. 止瀉木生物堿衍生物7a?7k的乙酰膽堿酯酶抑制活性

實施例6.  Morris水迷宮實驗
健康昆明系雄性小鼠150只,體重±2g,隨機分成15組:正常對照組、模型對照組、化合物7a?7k治療組(0.25 mg/kg)、化合物2治療組(2 mg/kg)和石杉堿甲對照組(0.1 mg/kg)。
小鼠用1%戊巴比妥鈉(80mg/kg)麻醉后,將其頭部手術區減去毛發,置于手術臺上固定,手術區用碘伏消毒,沿矢狀縫切開頭皮,找到前鹵位置。 
從前鹵左/右/1mm,向后3mm,注射針向下插入3mm,即為海馬區。 
緩慢注入2.5μL凝聚態Aβ25?35,注射時間為30s,留針30 S,緩慢起針。 
縫合傷口。 
試驗中涉及到的手術器械、微量進樣器等均需在手術前消毒。 
造模手術后3d開始灌胃給藥,藥物溶解在無菌生理鹽水中,在?20℃保存,使用前解凍。 
正常組和模型組給同體積生理鹽水,連續給藥14d后開始Morris水迷宮行為學評價,測試120s內達到終點平臺的潛伏期。 
結果表明,化合物7a?7k都可明顯縮短Aβ25?35致癡呆小鼠120s內到達終點平臺的潛伏期,即都能明顯改善癡呆小鼠的學習記憶能力,其中化合物7b的效果與陽性藥石杉堿甲的相當。 
而化合物 2 能在一定程度上改善癡呆小鼠的學習記憶能力,但作用很弱。 
實驗數據見表 2。 
表 2化合物7a?7k 對Aβ25?35致癡呆小鼠Morris水迷宮空間學習記憶能力的影響 
**:與模型對照組比較P<0.01,*:與模型對照組比較P<0.05。

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