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區分大白菜EIFISO4G基因野生型和突變體的分子標記及其應用.pdf

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區分 大白菜 EIFISO4G 基因 野生型 突變體 分子 標記 及其 應用
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摘要
申請專利號:

CN201310207751.6

申請日:

2013.05.29

公開號:

CN103290126B

公開日:

2014.12.24

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12Q 1/68申請日:20130529|||公開
IPC分類號: C12Q1/68; C12N15/11; A01H1/04 主分類號: C12Q1/68
申請人: 山東省農業科學院蔬菜研究所
發明人: 劉栓桃; 王淑芬; 趙智中; 張志剛; 張曉燕; 崔莎莎; 田煥煥; 李巧云; 盧金東; 徐文玲; 劉賢嫻; 付衛民
地址: 250100 山東省濟南市歷城區工業北路202號
優先權:
專利代理機構: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221 代理人: 彭成
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310207751.6

授權公告號:

103290126B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.24|||2013.10.16|||2013.09.11

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種區分大白菜eIF(iso)4G野生型和突變體的位點特異性顯性ASM標記:與野生型位點檢測相關的標記命名為ASM-I4E.G,片段大小1526bp,如SEQIDNo.1所示。用于鑒別上述特異性顯性分子標記的引物是:正向引物PF1:5'-TTTTTTGGTTGTTGGAGATTTTG-3';反向引物PR1:5'-GGTACTTCAGCTTTGACGAGGAC-3';如SEQIDNO.2、3所示。所述標記可以應用于大白菜種質資源鑒定和育種輔助選育:利用ASM標記的一對引物對待測個體的基因組DNA進行PCR擴增,檢測擴增片段的有無,如果能擴出條帶,則為純合野生型或雜合體,擴不出則為突變型。本發明的應用可大大簡化篩選手段、縮短轉育年限,避免了常規育種方法中選擇的盲目性。

權利要求書

權利要求書
1.   一種區分大白菜eIF(iso)4G野生型和突變體的位點特異性顯性分子標記,其特征在于:與野生型位點檢測相關的標記命名為ASM?I4E.G,片段大小1526bp,如SEQIDNo.1所示。

2.   用于鑒別權利要求1所述的特異性顯性分子標記的引物,其特征在于:
正向引物PF1:5'?TTTTTTGGTTGTTGGAGATTTTG?3';
反向引物PR1:5'?GGTACTTCAGCTTTGACGAGGAC?3';如SEQIDNO.2、3所示。

3.   權利要求1所述的特異性顯性分子標記在大白菜種質資源鑒定和育種輔助選育中的應用。

4.   權利要求2所述的引物在大白菜種質資源鑒定和育種輔助選育中的應用。

5.   根據權利要求3或4所述的應用,其特征在于:具體應用方式為:利用SEQIDNO.2、3所示的引物對待測個體的基因組DNA進行PCR擴增,檢測擴增片段的有無,如果能擴出條帶,則為純合野生型或雜合體,擴不出則為突變型。

6.   根據權利要求5所述的應用,其特征在于:所述PCR擴增的條件為:在20μl反應體系中,包含1×TransStart FastPfu buffer;20ng的基因組DNA;0.4μM正反向引物;0.25mMdNTPmix;1個單位的TransStart FastPfu DNA聚合酶。PCR循環條件:95℃預變性5分鐘;接著是95℃變性30秒,57.5℃退火30秒,72℃延伸40秒,35?38個循環,最后72℃延伸10分鐘。

說明書

說明書區分大白菜eIF(iso)4G基因野生型和突變體的分子標記及其應用
技術領域
本發明涉及一種基因的突變體及其相關位點特異性分子標記的開發,尤其涉及一種大白菜真核生物翻譯起始因子eIF(iso)4G的突變及其位點特異性分子標記的開發和應用。突變體能夠為選育含該突變位點的抗病毒大白菜種質提供變異源,位點特異分子標記能夠直接應用于分子標記輔助育種來選擇含有該突變位點的大白菜材料,提高eIF(iso)4G突變體的選擇效率,屬于生物技術領域。
背景技術
大白菜(Brassica rapa L.ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物,原產于中國,目前在世界各地均有種植。尤其在我國蔬菜的常年供應和淡季蔬菜調劑中已經成為蔬菜產品供給的重要組成部分,因而對人們生活具有重要影響。在大白菜生產過程中,常遭病毒病、霜霉病和軟腐病等病害的威脅。就整體而言病毒病的危害最為嚴重,且沒有普遍適用的抗病毒病藥劑或其它行之有效的控制技術。培育抗病毒大白菜新品種是應對病毒病危害的首選途徑[王雪,劉玉梅,李漢霞,張揚勇,方智遠.蕓薹屬作物抗蕪菁花葉病毒育種研究進展.園藝學報.2005,32(5):939?946]。苗立強等[苗立強,張耀偉,崔崇士.我國白菜抗病育種研究進展.東北農業大學學報.2008,37(4):529?533]研究發現,我國大白菜病毒病的病原分離物中70%是蕪菁花葉病毒(Turnip Mosaic Virus,TuMV)、還有少量黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic Virus,CMV)和其它病毒。因此我國大白菜抗病毒病育種的主攻目標是抗TuMV。
培育抗TuMV大白菜新品種的兩個關鍵要素是擁有豐富的抗TuMV種質資源和高效的育種效率。我國是大白菜原產地,種質資源非常豐富,其中不乏抗TuMV的優良資源,同時也有更多品質優良但不抗病毒的資源。在常規育種實踐中,常通過回交轉育的手段獲得更多遺傳背景豐富的抗性材料。隨著分子標記技術的興起及研究的深入,標記輔助選擇在常規育種操作中已經成為提高選擇效率、縮短育種年限的主要手段。一些跨國的育種集團更是不惜重金把創新資源和開發與重要農藝性狀緊密連鎖的分子標記作為育種攻關的主要內容。
一般而言,要尋找與某農藝性狀緊密連鎖的分子標記,往往需要先選擇在目標性狀方面存在顯著差異的親本,并構建分離群體(F2,RI,BC1,DH等),采用混合分群(BSA)和傳統的分子標記(如RAPD,SRAP,AFLP,SSR等)技術進行分析,用相應的軟件分析所得標記與性狀的連鎖距離,最終得到與目標性狀連鎖的分子標記。目前報道的與大白菜抗蕪菁花葉病毒(TuMV)性狀連鎖的分子標記正是采用上述方法得到的。由于不同研究者所用材料和所選擇的標記類型不同,所得到的與抗病毒特性連鎖的標記距離亦不同,介于3.8?15.36cM。由于這些標記與性狀的連鎖程度不夠緊密,因而其用于大白菜抗TuMV輔助育種尚有一定的距離。
另一方面,由于擬南芥與大白菜同屬十字花科,其抗病毒相關功能基因已有較深入的研究;同時大白菜的全基因組序列已經公布(Wang et al.,2011,the genome of the mesopolyploid crop species Brassica rapa.Nature Genetics.43(10):1035?1039)。所以可以將擬南芥功能基因研究的結果和大白菜基因組序列信息結合,直接以抗病毒相關功能基因為潛在的候選功能基因,通過對大白菜自然群體在這些候選功能基因的篩查入手,有可能找到抗病毒相關功能基因的突變體;針對突變位點開發位點特異性分子標記(Allele specific marker,ASM),則這種標記本身與性狀直接相關,這無疑會使標記輔助選擇更加精準。
在抗病毒功能基因研究方面近年來發現,由隱性單基因控制的抗病毒性狀多與真核生物翻譯起始因子4E、4G及其異構體iso4E、iso4G的突變有關。Ryder在生菜[RyderEJ.1970.Inheritance of resistance to common lettuce mosaic.Am Soc Horticult Sci.95:378–379]、Ruffel在辣椒[RuffelS,Dussault MH,Palloix A,Moury B,Bendahmane A,Robaglia C,Caranta C.2002.A natural recessive resistance gene against potato virus Y in peper corresponds to the eukaryotic initiation factor 4E(eIF4E).Plant J.2002Dec;32(6):1067?75]、Nieto在甜瓜[Nieto C,Piron F,Dalmais M,Marco CF,Moriones E,Gomez?Guillamon ML,Truniger V,Gomez P,Garcia?Mas J,Aranda MA,Bendahmane A.2007.EcoTILLING for the identification of allelic variants of melon e IF4E,a factor that controls virus susceptibility.BMCPlant Biology.7,34?42]等重要蔬菜作用中已經發現了不少這樣的突變體資源,Yeam等[YeamI,KangBC,Lindeman W,Frantz JD,Faber N,and Jahn MM.2005.Allele?specific CAPSmarkers based on point mutations in resistance alleles at the pvr1 locus encoding eIF4E in Capsicum.Theor.Appl.Genet.NNO,178?186]在辣椒中針對突變位點開發了相應的位點特異性CAPs標記并用于抗病毒材料轉育時的輔助選擇。其中在模式植物擬南芥中,eIF(iso)4E的功能缺失突變并未影響植株的正常生長,卻導致植株高抗TuMV[Duprat A,Caranta C,Revers F,Menand B,Browning KS,Robaglia C.2002.The Arabidopsis eukaryotic initiation factor(iso)4E is dispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses.The Plant Journal,32:927–934]。而在mRNA翻譯過程中,eIF(iso)4E與eIF(iso)4G結合,參與eIF(iso)4F復合體的形成,是植物特有的一類翻譯起始因子。
我國大白菜種質資源十分豐富,從其他作物的eIF4E和eIF(iso)4E突變及其在抗病毒中的作用推測,大白菜自然群體中也可能存在eIF4E和eIF(iso)4E的突變體,且這種突變可能與大白菜的抗病毒特性有關。目前,Jenner等[Jenner CE,Nellist CF,Barker GC,Walsh JA.Turnip mosaic virus(TuMV)is able to use alleles of both eIF4E and eIF(iso)4E from multiple loci of the diploid Brassica rapa.Mol Plant Microbe Interact.2010,3(11):1498?1505]從病毒敏感材料R?O?18中克隆得到了eIF4E和eIF(iso)4E各三個拷貝,分別命名為BraA.eIF4E.a、BraA.eIF4E.b、BraA.eIF4E.c和BraA.eIF(iso)4E.a、BraA.eIF(iso)4E.b、BraA.eIF(iso)4E.c。除BraA.eIF4E.b和BraA.eIF(iso)4E.b以外,其余4個基因分別轉化擬南芥At.eIF(iso)4E功能缺失突變體[Duprat A,Caranta C,Revers F,Menand B,Browning KS,Robaglia C.2002.The Arabidopsis eukaryotic initiation factor(iso)4E is dispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses.The Plant Journal,32:927–934],然后對所有轉基因株系接種TuMV加拿大株系CDN1,進行病毒敏感性互補實驗。根據病情指數及ELISA結果,發現所轉的四個基因均能使突變體完全或部分恢復對TuMV侵染的敏感性。這表明,在TuMV侵染白菜類蔬菜作物時,eIF4E和eIF(iso)4E都可能參與病毒與寄主的相互作用。同時作者指出,要想在大白菜中獲得與eIF4E和eIF(iso)4E有關的抗病毒材料,則這幾個基因需同時喪失功能。
截止目前,我們已經對大白菜在上述兩個基因位點的突變進行了檢測及相關標記的開發。綜合已有結果發現:除BraA.eIF4E.b為假基因外,其余五個基因在同一份材料中同時發生突變的幾率極低。要想尋找在這一層面的大白菜抗病毒材料,只能另辟蹊徑。eIF4E和eIF(iso)4E是重要的翻譯起始因子,它們與mRNA結合后,必須與eIF4G和eIF(iso)4G及其它翻譯起始因子結合,才能形成翻譯起始復合物eIF4F和eIF(iso)4F。經檢索發現,在大白菜基因組中,這兩個基因均以單拷貝存在,如果它們發生突變,則無論上游多個拷貝的eIF4E和eIF(iso)4E是怎樣的狀態,都不能進行RNA的翻譯。
鑒于此,有必要對我國豐富的大白菜抗/感TuMV材料中eIF4G和eIF(iso)4G兩個位點的多態性進行廣泛篩查,以發現各位點可能存在的突變類型;同時針對突變位點與野生型的序列差異,開發與突變體檢測有關的位點特異性分子標記。有以下幾個方面的潛在益處:①可以將該標記用于篩查大白菜種質資源,提供高效的大白菜突變體檢測手段;②可以用于回交輔助選擇,提高選擇效率,創造遺傳背景豐富的抗病毒材料;③在培育廣譜抗TuMV大白菜新品種時,可以實現標記輔助選擇,提高育種效率。
發明內容
針對上述現有技術,針對目前大白菜在eIF4G和eIF(iso)4G基因位點突變體鑒定方面的空白,本發明首先獲得了一個eIF(iso)4G位點的突變體,其次根據突變位點的序列特點,設計引物,開發了鑒定野生型和突變體的ASM顯性標記并用于標記輔助選擇。
本發明是通過以下技術方案實現的:
一種區分大白菜eIF(iso)4G野生型和突變體的位點特異性顯性ASM標記:與野生型(顯性遺傳)位點檢測相關的標記命名為ASM?I4E.G,片段大小1526bp,如SEQIDNo.1所示。
一種用于鑒別上述特異性顯性分子標記的引物是:
正向引物PF1:5'?TTTTTTGGTTGTTGGAGATTTTG?3';
反向引物PR1:5'?GGTACTTCAGCTTTGACGAGGAC?3';如SEQIDNO.2、3所示。
本發明首先檢索大白菜全基因組數據庫中的eIF(iso)4G基因組序列,發現其全長3392bp,為了方便操作,將該基因分三段克隆,即設計三對引物:PF1/PR1、PF2/PR2、PF3/PR3。選擇了四個大白菜自交系材料即抗病毒材料322和8407、感病毒材料06?247和Guan291。采用分段克隆技術從2份高感TuMV自交系材料中分別克隆到了eIF(iso)4G基因的三個片段,測序后經拼接得到了全序列,將所得序列與大白菜全基因組數據庫中檢索的同源基因比對后發現彼此之間完全一致。而在2份抗病毒材料中只擴增得到了該基因的第三段,第一、二段均未擴出。由此推測,該基因在抗病毒材料中發生了突變。由此可見,用擴增該基因的第一對引物PF1/PR1就可以區分eIF(iso)4G基因的野生型和突變體。
所述ASM標記的篩選過程如下:
(1)以大白菜抗TuMV自交系322、8407和TuMV敏感自交系06?247、Guan291為材料,采用CTAB法,提取兩者的基因組DNA。
(2)依據大白菜全基因組數據庫中檢索的eIF(iso)4G基因組序列信息,設計三對引物對其進行克隆。
(3)三對引物在感病材料中均擴出了條帶,經測序后將序列拼接在了一起,而在感病材料中只有PF3/PR3引物組合擴增出了條帶,而PF1/PR1和PF2/PR2兩對引物均未擴出條帶。這兩對引物都可以用來鑒別eIF(iso)4G的野生型和突變體,本發明申請保護的是PF1/PR1。該標記為顯性標記,只有基因組中有eIF(iso)4G就能檢測出,或者反言之,eIF(iso)4G突變導致的抗病毒性狀為隱性遺傳,只有純合狀態才表現抗性。
所述標記可以作為分子標記應用于大白菜種質資源鑒定和育種輔助選育,選擇不能擴出條帶的基因型,即抗性材料的類型。具體應用方式為:利用ASM標記的一對引物對待測個體的基因組DNA進行PCR擴增,檢測擴增片段的有無,如果能擴出條帶,則為純合野生型或雜合體,擴不出則為突變型。
本發明的有益效果是:本發明利用同源克隆技術發現了eIF(iso)4G位點的一個突變體并開發了鑒定該位點的分子標記。利用該標記可以對回交轉育后代的基因型進行準確選擇。同時該標記還可用于對大白菜種質資源進行篩查,以尋找遺傳背景更加豐富的突變體材料。其優點具體如下:
1.本發明獲得的與eIF(iso)4G位點突變直接相關的標記,結果穩定、準確、操作簡便。適用于不同遺傳背景大白菜材料的篩選,是一個普遍性標記。它能夠準確鑒定大白菜種質資源在該位點的基因型,極大地提高了對大白菜種質資源在eIF(iso)4G位點突變體的篩選效率。
2.在大白菜eIF(iso)4G基因序列及突變型研究方面,國內外未見報道。針對該突變位點的特異標記,可以為種質資源鑒定、通過回交轉育等手段篩選和培育不同遺傳背景的抗病毒材料提供輔助選擇工具。本發明的應用可大大簡化篩選手段、縮短轉育年限,避免了常規育種方法中選擇的盲目性。
附圖說明
圖1:引物PF1/PR1的擴增結果,其中,M是DNA分子量標準DL2000;1、2是抗病毒材料322和8407;3、4是高感病毒病材料06?247和Guan291。
圖2引物PF1/PR1對10份大白菜種質材料的鑒定,其中材料1、2、3、4、6、8、9為抗性突變體材料,5、7、10野生型狀態的病毒敏感材料。M為DNA分子量標準DL2000。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例中的實驗方法,如無特別說明,均為常規方法。
實施例1、不同大白菜自交系材料中eIF(iso)4G的克隆
1.1大白菜基因組DNA提取
(1)將大白菜幼苗葉片放入液氮預冷的研缽中,在液氮中充分研磨成粉末;
(2)待液氮揮發干,立即轉移到2ml的離心管中,每100mg材料約加入0.6ml預熱至65℃的CTAB提取液,融化后,劇烈振蕩混勻樣品,65℃水浴放置40?60分鐘使細胞裂解;
(3)裂解結束后,取出樣品使其完全冷卻至室溫。加入等體積的氯仿(chloroform),輕輕顛倒使混勻,室溫放置10分鐘;
(4)室溫,12000rpm離心15分鐘;
(5)用移液器小心吸出上層水相,加入新的1.5ml的離心管中,加入500μl的異丙醇(1:1體積),充分混勻,室溫沉淀10min;
(6)4℃,12000rpm離心10min,小心棄去上清液;
(7)DNA沉淀用1ml的75%乙醇洗滌。4℃,8000rpm離心10min收集沉淀;
(8)重復用75%乙醇洗滌一次DNA沉淀;
(9)去上清,DNA沉淀于無菌操作臺上晾干約10?15分鐘,DNA略顯透明,加入適當體積(30?50μl)的10mM的Tris.HCl,pH8.0使沉淀溶解(可放于4℃冰箱溶解過夜);
(10)紫外分光光度計及1%Agrose凝膠電泳檢測DNA濃度及質量。
1.2eIF(iso)4G的檢索、克隆及序列分析
(1)檢索大白菜全基因組數據庫,獲得eIF(iso)4G基因全序列,在編碼區上游和下游分別設計正反向引物三對,即PF1/PR1、PF2/PR2、PF3/PR3,后兩對引物序列如下:
PF2:TTTTTTCACTTTTGGCATGGTT;
PR2:TCGTGTTCATTGAGGTGGACTT;
PF3:GAGGTTCCCAGGACAAGGTC;
PR3:ACAAAGAAGACCAAAACTCCCAC;如SeqIDNo.4?7所示。
(2)PCR擴增:在20μl反應體系中,包含1×TransStartFastPfubuffer;20ng的基因組DNA;0.4μM正反向引物;0.25mMdNTPmix;1個單位的TransStartFastPfuDNA聚合酶(TransGenAP221)。PCR循環條件:95℃預變性5分鐘;接著是95℃變性30秒,57.5℃退火30秒,72℃延伸40秒,35?38個循環,最后72℃延伸10分鐘。
(3)PCR產物的電泳檢測:
PCR結束后,取10μlPCR擴增產物加入1μl10×loadingbuffer,在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳,電泳結束后EB染色,自動凝膠成像系統觀察拍照。其中引物PF1/PR1的擴增結果見圖1。圖中M是DNA分子量標準DL2000;1、2是抗病毒材料322和8407;3、4是高感病毒病材料06?247和Guan291。
(4)PCR產物的克隆測序
電泳確認目的條帶被擴增后,取1μlPCR擴增產物加1μlpEasy?Blunt(TransGenCB101)載體室溫連接10分鐘,轉化大腸桿菌感受態細胞Trans1?T1(TransGen:CD501),轉化菌在含Kan50μg/ml的LB固體平板上37℃倒置培養16小時左右。菌液PCR檢測后挑取陽性克隆委托北京博尚生物技術有限公司進行DNA序列的測定。
(5)所克隆的大白菜eIF(iso)4G序列分析
來自TuMV敏感材料06?247和Guan291中的三個片段經測序后拼接在了一起,該序列(Seq ID No.8)與大白菜全基因組數據庫中的序列僅相差一個堿基,但預測的編碼產物完全一致。而在抗病毒材料322和8407中,除了3’末端的800多堿基外(Seq ID No.9),其余序列缺失,導致該基因發生了突變。
(3)據此判定來自抗病毒322和8407的eIF(iso)4G為突變體。
實施例2ASM標記的獲得及對大白菜不同資源的鑒定
2.1ASM標記的獲得
(1)分別利用PF1/PR1引物組合在抗/感材料中擴增:PCR反應液的配制及擴增條件如實施例1的1.2第(2)所述。
(2)擴增結果的檢測如實施例1的1.2第(3)所述。
(3)擴增結果如圖1所示,即PF1/PR1能夠在野生型感病材料06?247和Guan291中擴增出1526bp的條帶,在抗病毒突變體322和8407中擴不出條帶,此即為顯性標記。
2.1ASM標記的應用
(1)不同大白菜資源的基因組DNA提取:隨機選取不同的大白菜材料8份,這些材料基因組DNA提取如1.1所述。
(2)PCR擴增:PCR反應液的配制及擴增條件如實施例1的1.2第(2)所述。
(3)PCR產物的檢測如實施例1的1.2第(3)所述。檢測結果如圖2所示,其中材料1、2、3、4、6、8、9為抗性突變體材料,5、7、10野生型狀態的病毒敏感材料,M為DNA分子量標準DL2000。

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