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針對 過敏原 去敏化
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摘要
申請專利號:

CN201310140326.X

申請日:

2008.08.15

公開號:

CN103272227B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 39/00申請日:20080815|||公開
IPC分類號: A61K39/00; A61K38/17; A61K38/10; A61K38/08; A61P33/14; A61P37/08; C12N15/63; C12N15/12; C07K19/00; C12Q1/02 主分類號: A61K39/00
申請人: 切爾卡西亞有限公司
發明人: 羅德里克·彼得·哈夫納; 保羅·萊德勒; 馬克·拉爾什
地址: 英國牛津
優先權: 2007.08.15 GB 0715949.4; 2007.08.20 GB 0716224.1; 2007.11.28 GB 0723337.2
專利代理機構: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262 代理人: 高瑜;鄭霞
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310140326.X

授權公告號:

103272227B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.10|||2013.10.09|||2013.09.04

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及包括用于預防或治療房塵螨過敏癥的肽的組合物,并且特別涉及用于預防或治療所述過敏癥的肽的最佳組合。

權利要求書

權利要求書
1.   一種用于通過免疫耐受作用預防或治療房塵螨過敏癥的組合物,該組合物包括至少四種多肽,其中所述多肽獨立地選自以下任一種:
(i)HDM203B(SEQ ID83)、HDM201(SEQ ID80)、HDM205(SEQ ID85)、HDM203A(SEQ ID82)、HDM202(SEQ ID81)、SEQ ID NO1至79、84、或86至104中任一個的多肽(即SEQ ID NO1至104的任一個);或
(ii)根據(i)的多肽的變體,其中所述變體是長度9至30個氨基酸的多肽,包含由以下所組成的區域:
?(i)的任何序列;或
?與(i)的任何序列具有至少65%同源性的序列,所述序列能夠使得個體免疫耐受(i)的任何序列,或
(iii)根據(i)的多肽的變體,其中所述變體是長度9至30個氨基酸的多肽,包含由表示以下任一個的序列所組成的區域:
?(i)的任何序列的片段;或
?(i)的任何序列的片段的同系物,
所述序列能夠使得個體免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9個氨基酸的長度,而且其中所述同系物與(i)的任何序列中任何9個連續氨基酸具有至少65%的同源性。

2.   根據權利要求1所述的組合物,其中所述組合物:
a)能夠使得一組塵螨過敏個體的群體中至少50%或至少60%免疫耐受;和/或
b)包括至少四種選自權利要求1(i)的多肽或權利要求1(ii)或(iii)中定義的其變體,和/或
c)包括至少一種另外的多肽,最多總共十三種獨特的/不同的多肽,其中所述另外的多肽:
?包含與以上SEQ ID NO:1至104中任一個的至少9個或更多個連續氨基酸具有至少65%的序列同一性、在(a)中未被選擇的序列;且
?長度是9至30個氨基酸;
和/或
d)包括最多達十三種多肽。

3.   根據權利要求1或2所述的組合物,包括至少一種根據權利要求2(c)的多肽,所述多肽長度是9至20或13至17個氨基酸,和/或其中所述多肽與SEQ ID NO:1至104中任一個的至少9個或更多個連續氨基酸具有至少70%的序列同一性。

4.   根據前述權利要求任一項所述的組合物,包括選自SEQ ID NO:80、81、82、83和85的多肽或權利要求1(ii)或(iii)定義的其變體的至少一種多肽。

5.   根據權利要求4所述的組合物,包括獨立地選自SEQ ID NO:80、81、82、83和85的多肽或權利要求1(ii)或(iii)定義的其變體的至少兩種、三種或四種多肽,條件是SEQ ID NO:82和83的多肽或變體中不多于一種被選擇。

6.   根據前述權利要求任一項所述的組合物,包括選自SEQ ID NO:5、51、52、100、101、72、73和74中任一個的多肽或權利要求1(ii)或(iii)定義的其變體的至少一種另外的多肽。

7.   根據權利要求6所述的組合物,其中所述至少一種另外的肽選自SEQ ID NO:51、73、100和101中任一個的多肽或權利要求1(ii)或(iii)定義的其變體。

8.   根據權利要求6或7所述的組合物,包括選自SEQ ID NO:1、9、21、24、48、54、56、57、62、63、65、76、84和86中任一個的多肽或權利要求1(ii)或(iii)定義的其變體的至少一種另外的多肽。

9.   根據權利要求8所述的組合物,其中所述至少一種另外的肽選自SEQ ID NO:63和65中任一個的多肽或權利要求1(ii)或(iii)定義的其變體。

10.   根據前述權利要求任一項所述的組合物,由以下組成:
a)SEQ ID NO.83和82的多肽或權利要求1(ii)或(iii)定義的其變體的至少一種;和
b)SEQ ID NO.80、81和85的多肽或權利要求1(ii)或(iii)定義的其變體的至少兩種;和任選地
c)SEQ ID NO:51、73、100和101的多肽或權利要求1(ii)或(iii)定義的其變體的至少一種;和
d)SEQ ID NO:63和65的多肽或權利要求1(ii)或(iii)定義的其變體的至少一種。

11.   根據權利要求10所述的組合物,其中(c)的至少一種多肽是SEQ ID NO.101的多肽。

12.   根據前述權利要求任一項所述的組合物,其中一種或多種所述多肽具有選自以下的一種或多種修飾:
(i)N末端乙酰化;
(ii)C末端酰胺化;
(iii)精氨酸和/或賴氨酸側鏈胺上的一個或多個氫被亞甲基代替;
(iv)糖基化;和
(v)磷酸化。

13.   根據前述權利要求任一項所述的組合物,其中所述肽的至少一種已被改造為可溶以使其包含:
i)所述肽的T細胞表位側翼的殘基的N末端:與剛好在衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的N末端的兩個至六個連續氨基酸相對應的一個至六個連續氨基酸;和/或
ii)所述肽的T細胞表位側翼的殘基的C末端:與剛好在衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的C末端的一個至六個連續氨基酸相對應的一個至六個連續氨基酸;或
iii)所述肽的T細胞表位側翼的殘基的N末端和C末端,選自精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一個氨基酸,
其中所述多肽具有至少3.5mg/ml的溶解度,而且所述T細胞表位具有少于3.5mg/ml的溶解度。

14.   根據前述權利要求任一項所述的組合物,其中所述肽的至少一種已被改造為可溶以使另外地:
i)所述肽天然序列中的任何半胱氨酸殘基被絲氨酸或2?氨基丁酸代替;和/或
ii)缺失了在所述肽天然序列的N末端或C末端的最多三個氨基酸中、不包含在T細胞表位中的任何疏水殘基;和/或
iii)缺失了在所述肽天然序列的N末端或C末端的最多四個氨基酸中包含序列Asp?Gly的、不包含在T細胞表位中的任何兩個連續氨基酸。

15.   根據前述權利要求任一項所述的組合物,其中每種多肽具有在0.03至200nmol/ml、0.3至200nmol/ml或30至120nmol/ml的范圍內的濃度。

16.   一種用于通過免疫耐受作用預防或治療塵螨過敏癥的組合物,包括至少三種多核苷酸序列,所述多核苷酸序列在被表達時導致權利要求1至14任一項定義的組合物的產生。

17.   根據權利要求16所述的組合物,其中能夠表達不同多肽的每種多核苷酸序列存在于相同或不同的多核苷酸載體中。

18.   一種用于通過免疫耐受作用預防或治療塵螨過敏癥的載體,所述載體包括各自編碼權利要求1定義的不同多肽的至少三種多核苷酸序列和任選地編碼權利要求2定義的不同多肽的一種或多種另外的多核苷酸序列。

19.   一種用于通過免疫耐受作用預防或治療塵螨過敏癥的載體,所述載體包括各自編碼權利要求1或2定義的不同多肽的四種到十三種不同的多核苷酸序列,其中至少四種所述多核苷酸序列各自編碼選自SEQ ID NO80、81、82、83和85的不同多肽,條件是SEQ ID NO:82和83的多肽中不多于一種被選擇。

20.   一種包括四種到十三種多肽的產物,其中至少一種、兩種、三種或四種多肽獨立地選自SEQ ID NO:80、81、82、83和85的多肽或權利要求1(ii)或(iii)定義的其變體,條件是SEQ ID NO:82和83的多肽或變體中不多于一種被選擇,其中每種不同多肽將同時、分別或順序地用于通過免疫耐受作用預防或治療房塵螨過敏癥。

21.   一種包括各自編碼權利要求1或2定義的不同多肽的四種到十三種多核苷酸序列的產物,其中至少四種所述多核苷酸序列各自編碼選自SEQ ID NO:80、81、82、83和85的不同多肽,條件是SEQ ID NO:82和83的多肽中不多于一種被選擇,而且其中每種不同多肽將同時、分別或順序地用于預防或治療人類塵螨過敏癥。

22.   一種用于通過免疫耐受作用預防或治療塵螨過敏癥的藥物制劑,所述藥物制劑包括根據權利要求1至17任一項的組合物;根據權利要求18或19任一項的載體;或根據權利要求20或21任一項的產物;和藥學上可接受的運載體或稀釋劑。

23.   根據權利要求22的組合物、載體或產物,被配制為用于口服施用、鼻內施用、表皮施用、皮下施用、舌下施用、皮內施用、口腔施用或用于通過吸入或通過注射施用。

24.   如權利要求1至17任一項定義的組合物或如權利要求20或21定義的產物,另外地包括另外的多肽過敏原,用于使得個體免疫耐受所述另外的多肽過敏原。

25.   一種確定T細胞是否識別權利要求1定義的多肽的體外方法,所述方法包括將所述T細胞與所述多肽接觸并檢測所述T細胞是否被所述多肽刺激。

26.   一種確定個體是否患有疾患或處于疾患風險中的體外方法,其中所述疾患以響應于房塵螨過敏原的過敏癥狀為特征,所述方法包括測試個體是否具有對權利要求1至17任一項定義的組合物響應的T細胞,從而確定所述個體是否患有疾患或處于疾患風險中。

27.   根據權利要求26所述的方法,其中針對所述組合物的T細胞免疫應答通過如下來測量:在允許所述組合物與所述T細胞相互作用的條件下將所述組合物與從受治療者獲取的樣品中的T細胞接觸;并確定是否有任何T細胞被刺激了,從而確定是否存在T細胞免疫應答。

說明書

說明書針對過敏原去敏化的肽
發明領域
本發明涉及包括用于預防或治療房塵螨過敏癥的肽的組合物,并且特別涉及用于預防或治療所述過敏癥的肽的最佳組合。
發明背景
T細胞抗原識別需要抗原呈遞細胞(APC)在其細胞表面上呈遞與主要組織相容性復合物(MHC)的分子締合的抗原片段(肽)。T細胞使用其抗原特異性T細胞受體(TCR)來識別由APC呈遞的抗原片段。這樣的識別作為免疫系統的觸發器起作用來產生一系列應答以根除已被識別的抗原。
生物體如人類的免疫系統對外部抗原的識別可在某些情況下造成疾病,其被稱作特應性疾患。后者的實例是過敏性疾病,包括哮喘、特應性皮炎和過敏性鼻炎。在這一組疾病中,B淋巴細胞產生對外源產生的抗原結合的IgE類抗體(在人類中),所述抗原在本文稱為過敏原,因為這些分子引發過敏響應。過敏原特異性IgE的產生依賴于也被過敏原活化(并對其有特異性)的T淋巴細胞。借助于諸如嗜堿性細胞和肥大細胞等細胞對IgE表面受體的表達,過敏原特異性的IgE抗體結合到這些細胞表面。
過敏原對結合在表面的IgE分子的交聯造成這些效應細胞脫粒,導致炎癥介質諸如組胺、5?羥色胺和脂質介質如硫橋白三烯(sulphidoleukotriene)的釋放。除了IgE依賴性事件,某些過敏性疾病諸如哮喘的特征為IgE獨立性事件。
目前用提供癥狀緩解或預防的劑來治療IgE介導的過敏性疾病。這種劑的實例是抗組胺劑、β2激動劑和糖皮質類固醇。此外,通過包括過敏原成分或提取物的定期注射的去敏化程序來治療一些IgE介導的疾病。去敏化治療可誘導與IgE競爭過敏原的IgG響應,或可誘導阻斷針對過敏原的IgE的合成的特定抑制性T細胞。這種形式的治療不是總有效,并且具有激起嚴重副作用特別是一般過敏性休克的風險。這可以是致命的,除非立即意識到并用腎上腺素治療。將減少或消除針對特定過敏原的不想要的過敏?免疫應答而不改變對其它外來抗原的免疫反應性或觸發本身過敏響應的治療性處理將對過敏個體大有益處。
普遍認為,房塵螨是包括哮喘、過敏性鼻炎和過敏性皮炎在內的人類和動物過敏性疾病的主要原因。兩種近親種類的螨在全世界造成大多數的房塵螨過敏癥。這兩種是屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)(主要在歐洲)和粉塵螨(Dermatophagoides farinae)(主要在美洲)。房塵螨過敏原主要衍生自螨腸道內壁的蛋白,該蛋白存在于排泄物中,并通常被稱為Der p(對于屋塵螨)或Der f(對于粉塵螨)蛋白。普通的螨在其生命中的每天將產生大約20個糞粒:其為自身體重的兩倍。一克塵土通常可包含多達500只螨,而床墊可容納多于兩百萬只。存在的螨物質的量隨著時間增加。六年的枕頭的十分之一重量可由螨和螨殘骸構成。地毯中,每平方米通常將有1,000至10,000只螨。
過敏性疾病尤其是哮喘,在世界的工業化國家中是個巨大的并正在擴大的問題。已計算獲得,主要工業化國家的5?10%人群患有哮喘。其中大約五分之一具有嚴重哮喘,需要經常住院。據計算,美國的哮喘費用為每年126億美元(79億英鎊)。歐洲的數字更高。加拿大的一項研究估計,主要工業化國家人群的每個成員的哮喘費用是每年平均21英鎊。僅在英國,每年因為哮喘死亡2,000人。
哮喘是由過敏反應和呼吸系統中的刺激造成的慢性疾病。對空氣傳播物質有反應的哮喘患者的50%至90%對塵螨過敏原敏感,而且在英國的一項研究中,10%的普通人群對塵螨過敏原有反應。大約兩億美國人居住在被房塵螨侵染嚴重影響的區域。對這種物質的敏化發生在幼年,主要在三個月到六個月之間的年齡,但哮喘是終生的。
因此,治療性或預防性治療對于患有房塵螨過敏癥或處于患房塵螨過敏癥風險中的人們將大有益處。
發明概述
本發明人已經發現,衍生自第1組塵螨過敏原(Der p1、Der f1)、第2組塵螨過敏原(Der p2、Der f2)和第3組塵螨過敏原(Der p7、Der f7)的某些肽片段組合對于去除個體對這些過敏原的敏感性特別有用。已經篩選了本發明的多肽組合在來自一組房塵螨過敏個體的受治療者中高比例地誘導細胞因子響應的能力。
本發明的多肽最初被選擇為T細胞表位,其經由使用肽?MHC結合特征的計算機模擬和體外評估。參見例如表3,其顯示在II類MHC結合測定中衍生自上述過敏原的一系列肽結合多個DR類型的能力。通過同源性來鑒定另外的表位。隨后進一步篩選這些候選多肽在免疫耐受作用(tolerisation)方面的潛在應用。
與基于肽免疫的去敏化方法相關的困難在于如何選擇過敏原的合適的大小和區域作為用于免疫的肽的基礎。所選擇的肽的大小是關鍵的。如果肽太小,疫苗將不能有效引起免疫應答。如果肽太大,或如果將完整抗原引入個體,則存在引起副作用諸如過敏反應的風險,這可能是致命的。
已經選擇本發明的多肽以保持T細胞特異性,同時所述多肽的尺寸足夠小以不具備將使其保留完整分子的IgE結合表位的構象的顯著三級結構。因此,本發明的多肽不引起細胞諸如肥大細胞和嗜堿性細胞上相鄰的特異性IgE分子的顯著交聯,并因此不導致顯著的組胺釋放。
本發明的優勢是肽廣泛地靶向主要組織相容性復合物(MHC)分子的能力。T細胞受體(TCR)在其特異性方面是高度可變的。如同抗體分子一樣,經由細胞中的基因重組事件產生差異性。TCR識別結合到由主要組織相容性復合物(MHC)的基因所編碼的分子的短肽形式的抗原。這些基因產物是產生用于移植中的“組織型”的相同分子,并且還被稱為人類白細胞抗原分子(HLA),該術語可被互換地使用。單獨的MHC分子具備肽結合溝,由于它們的形狀和電荷其只能夠結合有限的一組肽。被一個MHC分子結合的肽可能不一定被其它MHC分子結合。
當蛋白分子諸如抗原或過敏原被抗原呈遞細胞諸如B淋巴細胞、樹突細胞、單核細胞和巨噬細胞吸收時,該分子在細胞中被酶促降解。降解過程產生所述分子的肽片段,如果它們具有合適的大小、電荷和形狀,則可能結合到某些MHC分子的肽結合溝之內,并隨后展示在抗原呈遞細胞表面上。如果肽/MHC復合物以足夠數量呈遞在抗原呈遞細胞表面上,則它們可能活化帶有合適的肽/MHC特異性T細胞受體的T細胞。
由于MHC的多態性質,遠系繁殖群體諸如人類中的個體將在其細胞表面上表達不同組合的MHC分子。由于不同MHC分子可基于肽的大小、電荷和形狀而結合來自同一分子的不同肽,不同個體將展示與其MHC分子結合的不同庫的肽。鑒定遠系繁殖群體諸如人類中的通用MHC?結合肽表位比在近親繁殖的動物(諸如實驗小鼠的某些品系)中更困難。基于個體之間MHC的差異表達以及其帶來的肽結合與呈遞的固有差異,不太可能鑒定可用于人類去敏化治療的單種肽。
然而,本發明的肽組合通過靶向多種不同MHC分子而提供對人類群體覆蓋面廣泛的效力。因此,以本發明的肽配制的疫苗將具有廣泛的應用。
本發明人的工作產生了具有以下特征的肽組合:
?該組合在來自一組房塵螨過敏個體的受治療者中高比例誘導細胞因子響應;
?組合中的肽是可溶的。
因此,本發明提供用于通過免疫耐受作用預防或治療房塵螨過敏癥的組合物,包括選自HDM203B(SEQ ID83)、HDM201(SEQ ID80)、HDM205(SEQ ID85)、HDM203A(SEQ ID82)、HDM202(SEQ ID81)、SEQ ID NO1至79、84、或86至104(即SEQ ID NO1至104的任一個)或其變體的至少一種多肽。通常,該組合物包括至少四種多肽,其中所述多肽獨立地選自以下任一種:
(i)SEQ ID NO1至104的多肽;或
(ii)根據(i)的多肽的變體,其中所述變體是長度9至30個氨基酸的多肽,包含由以下組成的區域:
?(i)的任何序列;或
?與(i)的任何序列具有至少65%同源性的序列,該序列能夠使得個體免疫耐受(i)的任何序列,或
(iii)根據(i)的多肽的變體,其中所述變體是長度9至30個氨基酸的多肽,包含由表示以下任一個的序列組成的區域:
?(i)的任何序列的片段;或
?(i)的任何序列的片段的同系物,
該序列能夠使得個體免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9個氨基酸的長度,而且其中所述同系物與(i)的任何序列中任何9個連續氨基酸具有至少65%的同源性。

附圖描述
圖1?Der p1相對Der f1(圖1A)、Der p2相對Der f2(圖1B)和Der p7相對Der f7(圖1C)的序列比較。包含表位的區域以灰色突出顯示。本發明的特定肽的位置以序列之上或之下的線條表示。Der p1的序列是具有NCBI登記號P08176的公眾可獲得的序列。Der p2和Der p7(表6)的相應序列分別是NCBI登記號P49278和P49273。Der f1的序列從NCBI登記號P16311獲得,Der f2的序列從NCBI登記號Q00855獲得,而Der f7從NCBI登記號Q26456獲得。
圖2顯示由IL13或IFN?γ的產生測量的對本發明的不同肽響應的個體百分比。
圖3和4顯示由IL13或IFN?γ的產生測量的對本發明的不同肽組合響應的個體百分比。
本文提及的序列的描述
SEQ ID NO:1至104提供如表3至8列出的本發明的多肽序列。SEQ ID NO.105及其后提供另外的序列。
發明詳述
本發明涉及可用于免疫耐受作用的肽和肽組合。這樣的肽可包括以下顯示的序列、由以下顯示的序列組成或基本上由以下顯示的序列組成:HDM203B(SEQ ID83)、HDM201(SEQ ID80)、HDM205(SEQ ID85)、HDM203A(SEQ ID82)、HDM202(SEQ ID81)、SEQ ID NO1至79、84、或86至104的任一個(即SEQ ID NO1至104的任一個)。還可使用這些特定肽的變體。所述變體可包括序列、由序列組成或基本上由序列組成,所述序列是SEQ ID NO1至104任一個的片段或SEQ ID NO1至104任一個的同系物的片段。
在一個實施方案中,本發明涉及用于預防或治療房塵螨過敏癥的組合物。組合物通常包括至少四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種或十二種、最多達十三種多肽,或由其組成。換言之,組合物包括四種至十三種多肽。多肽獨立地選自以下任一種:
(i)SEQ ID NO1至104的多肽;或
(ii)根據(i)的多肽的變體,其中所述變體是長度9至30個氨基酸的多肽,包含由以下組成的區域:
?(i)的任何序列;或
?與(i)的任何序列具有至少65%同源性的序列,該序列能夠使得個體免疫耐受(i)的任何序列,或
(iii)根據(i)的多肽的變體,其中所述變體是長度9至30個氨基酸的多肽,包含由表示以下的序列組成的區域:
?(i)的任何序列的片段;或
?(i)的任何序列的片段的同系物,
該序列能夠使得個體免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9個氨基酸的長度,而且其中所述同系物與(i)的任何序列中任何9個連續氨基酸具有至少65%的同源性。
本發明還提供包括本發明的多肽的產物和制劑以及包括能夠表達用于通過免疫耐受作用預防或治療房塵螨過敏癥的本發明的多肽的多核苷酸的組合物、產物和載體。這種免疫耐受作用通常將是針對存在于SEQ ID NO 1至104任一個中的表位(例如II類MHC表位)。
第1組、第2組和第7組塵螨過敏原的肽片段
房塵螨的主要過敏原包括第1組塵螨過敏原(Der p1、Der f1)、第2組塵螨過敏原(Der p2、Der f2)和第3組塵螨過敏原(Der p7、Der f7),其中Der p“X”和Der f“X”分別表示蛋白“X”是衍生自屋塵螨和粉塵螨的同系物。如圖1所示,每種Der p蛋白與其相應的Der f蛋白高度同源。
包含結合II類MHC的T細胞表位的區域在給定蛋白的Der p和Der f同系物之間是尤其高度保守的。因此,衍生自例如屋塵螨或粉塵螨的蛋白1的相關區域的肽適于用于通過對第1組塵螨過敏原的免疫耐受作用來預防或治療房塵螨過敏癥。類似地,衍生自屋塵螨或粉塵螨的蛋白2的相關區域的肽適于用于通過對第2組塵螨過敏原的免疫耐受作用來預防或治療房塵螨過敏癥,而且衍生自屋塵螨或粉塵螨的蛋白7的相關區域的肽適于用于通過對第7組塵螨過敏原的免疫耐受作用來預防或治療房塵螨過敏癥。
第1組過敏原是與木瓜蛋白酶同源的半胱氨酸蛋白酶。已發現這種酶裂解閉合蛋白(occludin),即細胞間緊密連接的一種蛋白成分。這揭示了某些酶的變應原性的一種可能原因。通過破壞上皮細胞之間的緊密連接的完整性,Der p1和Der f1可能獲得對上皮下的抗原呈遞細胞、居留肥大細胞和嗜曙紅細胞的異常進入。
第2組過敏原的功能未知,雖然Der p2和Der f2顯示與脂結合蛋白家族的遠的同源性。已經顯示對體內Der p2刺激響應的血清IgE水平代表對完整螨提取物刺激的總血清IgE響應的大約三分之一。
第7組過敏原的功能也未知。已經顯示對體內Der p7刺激響應的血清IgE水平代表對完整螨提取物刺激的總血清IgE響應的大約五分之一。
本發明的肽衍生自第1組、第2組和第3組塵螨過敏原,如表3至8所示。術語“肽”和“多肽”在本文互換地使用。以上蛋白在本文還稱為“過敏原”。
表3至8列出本發明的肽的序列,指出了每種肽所衍生自的親本蛋白。表4至6中的序列成對排列。在每對中,上方的序列已經通過使用肽?MHC結合測定被選作T細胞表位。已經通過在給定的塵螨過敏原組中可選擇的蛋白的序列中的同源性搜索選擇了下方的序列。例如,表4中的肽HDM01衍生自Der p1,它下方的同源序列衍生自Der f1。
肽組合
組合物通常包括本發明的至少四種、最多達十三種不同多肽的組合。因此,本發明的組合物可由四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或十三種肽組成。
本發明的組合物通常可包括選自衍生自每種Der p1、Der p2和Der p7(或Der f等價物)的肽的至少一種多肽或其變體(例如功能變體)。選擇本發明的組合物中的多肽組合以提供對人類群體盡可能廣泛的覆蓋面,即,本發明的組合物將在塵螨過敏個體中高比例地產生免疫應答,優選地一組或一群這樣的個體中的多于30%、40%、45%、50%、60%或70%塵螨過敏個體。塵螨過敏個體的群體中的個體數目可以是任何適當的數目,通常為至少20、30、40、50、60、70、80或至少100個體。優選地該群體具有在白種人群體中有代表性的頻率范圍內的MHC等位基因頻率。11個常見DRB1等位基因家族的參考群體等位基因頻率顯示在表1中(數據來自HLA Facts Book,Parham和Barber)。
本發明的組合物通常包括選自HDM203B(SEQ ID83)、HDM202(SEQ ID81)、HDM201(SEQ ID80)、HDM205(SEQ ID85)、HDM203A(SEQ ID82)的多肽或其變體的至少一種多肽。組合物優選地包括獨立地選自HDM203B(SEQ ID83)、HDM202(SEQ ID81)、HDM201(SEQ ID80)、HDM205(SEQ ID85)、HDM203A(SEQ ID82)的多肽或其變體的至少兩種、三種或四種多肽,條件是SEQ ID NO:82和83的多肽或變體中不多于一種被選擇。
HDM202(SEQ ID81)的具體變體是HDM202D(SEQ ID102;FKNRFLMSAEA)、HDM202E(SEQ ID103;FKNRFLMSAE)和HDM202H(SEQ ID104;EFKNRFLMSAE),它們是HDM202序列的截短形式。預料這些序列的每種可被修飾以在N和/或C末端添加選自R、K、H、E和D的至少一個(并且最多6個)殘基。
任選地,組合物可另外包括選自SEQ ID NO:5、51、52、100、101、72、73、74的任何多肽或其變體的至少一種另外的多肽。所述至少一種另外的多肽優選地是SEQ ID NO:51、73、100和101的任何多肽。
任選地,組合物可另外包括選自SEQ ID NO:1、9、21、24、48、54、56、57、62、63、65、76、84和86的任何多肽或其變體的至少一種另外的多肽。所述至少一種另外的多肽優選地是SEQ ID NO:63和65的任何多肽或其變體。
更具體地,在一個實施方案中,本發明因此提供包括四種至十三種多肽的組合物,該多肽由以下組成:
a)SEQ ID NO.83和82的多肽或其變體的至少一種,優選地SEQ ID NO.83;
b)SEQ ID NO.80、81和85的多肽或其變體的至少兩種;和任選地
c)SEQ ID NO:5、51、52、100、101、72、73和74的任何多肽或其變體的至少一種,優選地SEQ ID NO:51、73、100和104或其變體;和/或
d)SEQ ID NO:1、9、21、24、48、54、56、57、62、63、65、76、84和86的任何多肽或其變體的至少一種,優選地SEQ ID NO:63和65或其變體。
換言之,本發明的一個具體的實施方案提供用于通過免疫耐受作用來預防或治療塵螨過敏癥的包括四種至十三種肽序列的組合物,其中該組合物由以下組成:
a)至少一種具有以下序列的多肽:
HDM203B DLRQMRTVTPIRMQGGSGS(SEQ ID NO.83)和
HDM203A DLRQMRTVTPIRMQGGCGS(SEQ ID NO.82);或其變體,和;
b)至少兩種具有以下序列的多肽:
HDM201 ESVKYVQSNGGAI(SEQ ID NO.80);
HDM202 DEFKNRFLMSAEAFE(SEQ ID NO.81);和
HDM205 SYYRYVAREQS(SEQ ID NO.85)
或其變體,和任選地;
c)至少一種具有以下序列的多肽:
HDM09A REALAQTHSAIAVI(SEQ ID NO,5);
HDM03D RNQSLDLAEQELVDSASQH(SEQ ID NO.51);
HDM03E RNQSLDLAEQELVDБASQH*(SEQ ID NO.52);
HDM03V EQELVDSASQHG(SEQ ID NO.100);
HDM03W ELVDSASQHG(SEQ ID NO.101);
HDM101 NYCQIPPNVNKIREA(SEQ ID NO.72);
HDM101A NYSQIYPPNVNKIREA(SEQ ID NO.73);和
HDM101B NYБQIYPPNVNKIREA*(SEQ ID NO.74)
或其變體,和/或;
d)至少一種具有以下序列的多肽:
HDM01   IDLRQMRTVTPIR(SEQ ID NO.1);
HDM21A  KPFQLEAVFEANQNTK(SEQ ID NO.9);
HDM48   TAIFQDTVRAEMTK(SEQ ID NO.21);
HDM51A  VDFKGELAMRNIEAR(SEQ ID NO.24);
HDM01A  IDLRQMRTVTPIRMQGGSG(SEQ ID NO.48);
HDM06A  RYVAIEQSSRRP(SEQ ID NO.54);
HDM07   PNVNKIREALAQT(SEQ ID NO.56);
HDM19A  DQVDVKDSANHEIKK(SEQ ID NO.57);
HDM23C  GLEVDVPGIDPNASH(SEQ ID NO.62);
HDM26B   GVLASAIATHAKIR(SEQ ID NO.63);
HDM35A   RGLKQMKRVGDANV(SEQ ID NO.65);
HDM102A NAQRFGISNYSQI(SEQ ID NO.76);
HDM204  SAYLAYRNQSLDLA(SEQ ID NO.84);和
HDM206  DNGYGYFAANIDLMMIEE(SEQ ID NO.86)
或其變體。                      *Б=氨基丁酸。
將理解的是,以上的(a)到(d)代表用于鑒定本發明的合適組合的嚴格性和高度選擇性標準。例如,如果想要從本發明序列隨機地選擇八種肽,將有將近1000億個可能組合可以選擇。相比之下,考慮在其中應用上述標準的八種多肽的組合的一種實例是有用的。例如,考慮一種組合,其中選擇以下多肽:
i)SEQ ID NO.80、81和85的多肽的任何兩種和SEQ ID NO.82和83的多肽的至少一種;和
ii)選自SEQ ID NO:5、51、52、72、73、74、100和101的任何多肽的兩種另外多肽;以及最后
iii)選自SEQ ID NO:1、9、21、24、48、54、56、57、62、63、65、76、84和86的任何多肽的兩種另外多肽。
基于這樣的選擇,可能的組合的數目占不應用本發明人確定的標準的情況下總的可能組合的少于0.0006%。
基于上述,本發明特別優選的組合包括HDM201(SEQ ID80)、HDM203B(SEQ ID83)、HDM205(SEQ ID85)、HDM03W(SEQ ID101)、HDM101A(SEQ ID73)、HDM26B(SEQ ID63)、HDM35A(SEQ ID65)和任選地SEQ ID NO.24的多肽或其變體,或者由其組成。
本發明的另一優選組合包括HDM201(SEQ ID80)、HDM203B(SEQ ID83)、HDM205(SEQ ID85)和HDM03W(SEQ ID101)的多肽,或者由其組成。
取決于上述,組合物可任選地包括另外的多肽,最多總共十三種獨特多肽。這些另外的多肽與其它序列相關(即,通常是所述其他序列的同系物和/或片段),其中所述其他序列即不在已經選擇的多肽中的SEQ ID NO:1至104。另外的肽通常是SEQ ID NO1至104的肽之一的功能變體。另外的多肽可以與SEQ ID NO:1至104任一個相同。因此,組合物可包括多達十三種不同的、SEQ ID NO:1至104中任一個提供的多肽。然而,任選的另外的多肽不必與SEQ ID NO:1至104任一個100%相同。它們優選地與未在此前選擇的多肽中選擇的SEQ ID NO:1至104任一個中至少9個(例如至少10、11、12或13)或更多個連續氨基酸至少65%相同。這些連續的氨基酸可包括II類MHC表位,例如結合于本文提及的任何MHC分子的II類MHC表位。換言之,該組合物可任選地包括另外的多肽,最多總共十三種獨特多肽,其中所述另外的多肽:
(i)包括與在以上(a)至(d)中未被選擇的以上SEQ ID NO:1至104任一個中至少9個或更多個連續氨基酸具有至少65%的序列同一性的序列;并且
(ii)長度是9至30個氨基酸。
其中每種不同多肽是為了同時、分別或順序地用于通過免疫耐受作用預防或治療塵螨過敏癥。
1至104
因此更具體地,為了同時、分別或順序地用于通過免疫耐受作用預防或治療塵螨過敏癥,本發明提供含有如以上(a)至(d)定義的四種至十三種多肽的產物;和任選地:
(e)一種多肽:
(i)包含與在以上a)至d)中未被選擇的SEQ ID NO:1至104任一個中至少9個或更多個連續氨基酸具有至少65%序列同一性的序列;并且
(ii)長度是9至30個氨基酸;和任選地
(f)如e)中定義,但另外地在d)中未被選擇的多肽;和任選地
(g)如e)中定義,但另外地在以上e)至f)中未被選擇的多肽;和任選地
(h)如e)中定義,但另外地在以上e)至g)中未被選擇的多肽;和任選地
(i)如e)中定義,但另外地在以上e)至h)中未被選擇的多肽;和任選地
(j)如e)中定義,但另外地在以上e)至i)中未被選擇的多肽;和任選地
(k)如e)中定義,但另外地在以上e)至j)中未被選擇的多肽;和任選地
(l)如e)中定義,但另外地在以上e)至k)中未被選擇的多肽;和任選地
(m)如e)中定義,但另外地在以上e)至l)中未被選擇的多肽;和任選地
(n)如e)中定義,但另外地在以上e)至m)中未被選擇的多肽;和任選地
(o)如e)中定義,但另外地在以上e)至n)中未被選擇的多肽;和任選地
(p)如e)中定義,但另外地在以上e)至o)中未被選擇的多肽。
本發明的另一實施方案是用于通過免疫耐受作用預防或治療房塵螨過敏癥的,包括一種或多種多肽的組合物,其中所述多肽選自以下任一種:
(i)HDM203B(SEQ ID83)、HDM202(SEQ ID81)、HDM201(SEQ ID 80)、HDM205(SEQ ID85)、HDM203A(SEQ ID82)、SEQ ID NO1至79、84、或86至104的任一個(即SEQ ID NO1至104的任一個)多肽;或
(ii)根據(i)的多肽的變體,其中所述變體是長度9至30個氨基酸的多肽,其包含由以下組成的區域:
?(i)的任何序列;或
?與(i)的任何序列具有至少65%同源性的序列,該序列能夠使得個體免疫耐受(i)的任何序列,或
(iii)根據(i)的多肽的變體,其中所述變體是長度9至30個氨基酸的多肽,所述多肽包含由表示以下任一個的序列組成的區域:
?(i)的任何序列的片段;或
?(i)的任何序列的片段的同系物,
該序列能夠使得個體免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9個氨基酸的長度,而且其中所述同系物與(i)的任何序列中任何9個連續氨基酸具有至少65%的同源性。
本發明的組合物或產物可包括以上定義的任何序列的變體。所述變體通常包括SEQ ID NO:1至104的相應肽中存在的1、2、3或更多個II類MHC表位。
本文提及了功能變體。這樣的變體可能能夠使個體免疫耐受SEQ ID NO:1至104的相應肽中存在的II類MHC表位,并因此通常將包括結合到相同II類MHC分子的和/或被識別SEQ ID NO:1至104的多肽中相應的表位的T細胞所識別的序列。
SEQ ID NO1至104的變體可以是由截短所衍生的片段。截短是指從SEQ ID NO.1至104的多肽的N和/或C?末端除去一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個氨基酸。為了示意的目的,在實施例5中提供了適合的截短的實例。特別地,SEQ ID NO.81的截短被提供為SEQ ID NO:102至104。類似地,HDM03的若干優選變體(SEQ ID NO:89至101)是截短形式。HDM03的特別優選的截短形式是HDM03V和HDM03W(SEQ ID100和101)。
還可通過一個或多個內部缺失來產生片段,條件是構成T細胞表位的核心9個氨基酸基本未被破壞。
例如,SEQ ID NO:1的變體可包括SEQ ID NO:1的片段,即較短的序列。這可包括從SEQ ID NO:1的N?末端或從SEQ ID NO:1的C?末端缺失一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個氨基酸。這樣的缺失可從SEQ ID NO:1的兩端進行。SEQ ID NO:1的變體可包括延伸超出SEQ ID NO:1的末端的另外的氨基酸(例如來自衍生肽的親本蛋白的序列)。變體可包括以上討論的缺失和添加的組合。例如,可從SEQ ID NO:1的一端缺失氨基酸,但可在SEQ ID NO:1的另一端添加來自全長親本蛋白序列的另外的氨基酸。以上變體的相同討論還適用于SEQ ID NO:2至104。
變體肽可包括SEQ ID NO:1至104任一個或其片段的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸取代。變體肽可包括與SEQ ID NO:1至104任一個中至少9個或更多個連續氨基酸具有至少65%序列同一性的序列。更優選地,合適的變體可包括與SEQ ID NO:1至104任一個的至少9個連續氨基酸至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的氨基酸同一性。這一水平的氨基酸同一性可見于肽的任何區段,盡管它優選地是核心區域。氨基酸同一性的水平是超出至少9個連續氨基酸,但它可以是至少10、11、12、13、14、15或至少16或17個氨基酸,這取決于比較的肽的大小。因此,任何以上指明的同一性水平可跨越序列的完整長度。
關于氨基酸序列,“序列同一性”是指當使用ClustalW(Thompson等人,Nucleic Acids Res.1994Nov11;22(22):4673?80)用以下參數評價時具有指定值的序列:成對的比對參數?方法:準確,矩陣:PAM,缺口開放罰分:10.00,缺口延伸罰分:0.10;多比對參數?矩陣:PAM,缺口開放罰分:10.00,%延遲同一性:30,處罰末端缺口:開,缺口間距:0,負矩陣:不,缺口延伸罰分:0.20,殘基特異性缺口罰分:開,親水缺口罰分:開,親水殘基:GPSNDQEKR。在特定殘基的序列同一性意在包括僅僅被衍生化的相同殘基。
變體肽可包括SEQ ID NO:1至104任一個中的1、2、3、4、5或更多個或者多達10個氨基酸取代。取代變體優選地包括用相同數目的氨基酸代替一個或多個氨基酸并進行保守的氨基酸取代。例如,可用具有相似特征的替代性氨基酸例如,另一堿性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一帶電荷氨基酸、另一親水氨基酸、另一疏水氨基酸、另一極性氨基酸、另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸來取代氨基酸。可用于選擇合適的取代基的20種主要氨基酸的一些特征如下:
Ala脂肪族、疏水、中性Met疏水、中性Cys極性、疏水、中性Asn極性、親水、中性Asp極性、親水、帶電荷(?)Pro疏水、中性Glu極性、親水、帶電荷(?)Gln極性、親水、中性Phe芳香族、疏水、中性Arg極性、親水、帶電荷(+)Gly脂肪族、中性Ser極性、親水、中性His芳香族、極性、親水、帶電荷(+)Thr極性、親水、中性Ile脂肪族、疏水、中性Val脂肪族、疏水、中性Lys極性、親水、帶電荷(+)Trp芳香族、疏水、中性Leu脂肪族、疏水、中性Tyr芳香族、極性、疏水
另外的變體包括在其中出現在序列中的氨基酸而非天然存在的氨基酸是其結構類似物的那些。用于序列中的氨基酸還可被修飾例如被標記,條件是肽的功能未顯著地受到不利影響。當肽具有與SEQ ID NO:1至104任一個或其片段的序列不同的序列時,取代可沿著序列的全長發生,其在SEQ ID NO:1至104的任何序列之內或SEQ ID NO:1至104的任何序列之外。例如,本文所述的變化諸如添加、缺失、取代和修飾可發生在SEQ ID NO:1至104的任何序列之內。變體肽可包括在其中已經進行了一個、兩個、三個、四個或更多個氨基酸取代的SEQ ID NO:1至104的任何氨基酸序列,或者基本上由其組成。變體肽可包括比SEQ ID NO:1至104任一個大的親本蛋白片段。在該實施方案中,本文所述的變化諸如取代和修飾可發生在SEQ ID NO:1至104的任何序列之內和/或之外。
本發明的變體肽長度是9至30個(含)氨基酸。優選地,它們的長度可以是9至20個氨基酸或更優選地13至17個氨基酸。所述肽可與SEQ ID NO:1至20的任何一種中的肽序列具有相同的長度。
所述肽可化學地例如通過蛋白水解裂解衍生自多肽過敏原,或者可以有意方式從多肽過敏原衍生,例如通過利用多肽過敏原的氨基酸序列并基于該序列合成肽。可使用本領域公知方法合成肽。
當多肽包括通常難以在制造過程中保留的殘基時,這些殘基可被代替。例如,谷氨酸在溶液中自發地形成焦谷氨酸,特別是當存在于肽的N末端時。因此,對應于天然過敏原蛋白序列的序列中的谷氨酸的本發明的肽的殘基可被本發明的肽中的焦谷氨酸代替,當這樣的殘基存在于肽的N末端時。
術語“肽”不僅包括在其中氨基酸殘基被肽(?CO?NH?)鍵連接的分子,還包括在其中肽鍵被倒轉的分子。這樣的逆反(retro?inverso)模擬肽可使用本領域已知的方法制備,例如諸如Meziere等人(1997)J.Immunol.159,3230?3237中描述的那些。該方法包括制備包含骨架變化而非側鏈定向的擬肽。Meziere等人(1997)顯示,至少對于II類MHC和T輔助細胞響應,這些擬肽是有用的。包含NH?CO鍵而非CO?NH肽鍵的逆反肽對蛋白水解的抵抗要多得多。
類似地,可完全不需要肽鍵,條件是使用保持氨基酸殘基的碳原子之間間距的合適的連接部分;如果所述連接部分具有與肽鍵大致上相同的電荷分布和大致上相同的平面性,它是特別優選的。還應理解的是,可方便地在其N?或C?末端封閉所述肽,以幫助減少對外蛋白水解消化的敏感性。例如,可通過與羧酸反應而保護肽的N?末端氨基,而且可通過與胺反應而保護肽的C?末端羧基。修飾的其它實例包括糖基化和磷酸化。另外的潛在修飾是R或K側鏈胺上的氫可被亞甲基代替(?NH2→?NH(Me)或?N(Me)2)。
根據本發明的肽的類似物還可包括增加或減少肽的體內半衰期的肽變體。能夠增長按照本發明使用的肽的半衰期的類似物的實例包括肽的類肽類似物、肽的D?氨基酸衍生物和肽?類肽雜合體。按照本發明使用的變體多肽的另外的實施方案包括多肽的D?氨基酸形式。使用D?氨基酸而非L?氨基酸制備多肽大大減少正常代謝過程對這種藥劑的任何不想要的破壞,減少待施用的藥劑的量以及施用頻率。
本發明提供的肽可衍生自由編碼親本蛋白鏈的原始轉錄子的可變剪接產生的mRNA所編碼的親本蛋白的剪接變體。肽還可衍生自親本蛋白的保持過敏原的至少MHC結合性質的氨基酸突變體、糖基化變體和其它共價衍生物。示例性衍生物包括這樣的分子,其中本發明的肽通過取代、化學、酶促或其它合適手段被除了天然存在的氨基酸以外的部分共價修飾。還包括不同螨中發現的親本蛋白的天然存在的變體。這樣的變體可被等位變體編碼或代表可變剪接變體。
可在肽的合成期間或通過生產后修飾,或當肽是重組形式時,使用定點誘變、隨機誘變或酶促裂解和/或核酸連接的已知技術來制備如上所述的變體。
根據本發明,組合物可包括的另外的肽優選地是SEQ ID NO:1至104任一個的功能變體。也就是說,肽優選地能夠引起免疫應答。特別地,肽優選地能夠在房塵螨過敏個體中誘發細胞因子的產生。因此,通常本發明的組合物將包括在房塵螨過敏個體群體中超過30%、35%、40%,優選地45%或50%的個體中產生細胞因子響應的至少一種多肽或其變體。一組塵螨過敏個體中的個體數目可以是超過1的任何數目,例如至少20、30、40、50、80或至少100個體。優選地,組合物包括至少兩種、三種或最優選地四種這樣的肽。優選地,細胞因子響應是產生IL13或IFN?γ。可通過任何合適的方法測量細胞因子的產生。如果在肽存在時產生的細胞因子水平比刺激物不存在時產生的所述細胞因子背景水平(即,不存在肽或任何其它刺激物時相同個體產生的水平)高至少2、3、4或5倍,通常認為發生了響應于肽的細胞因子的產生。可選地,通常在250μl中大約1.25×106個細胞的樣品中,如果產生細胞因子的量超過通常是90、95或優選地100pg/ml的公認限值,則可以認為發生了細胞因子的產生。
用于測量細胞因子產生的合適的方法通常包括測量從受治療者獲取的樣品中外周血單核細胞(PBMC)的細胞因子釋放。樣品通常是血液或血清。在給定肽存在時孵化細胞之后,測量PBMC的細胞因子釋放。隨后使用任何合適的測定例如ELISA、ELISPOT測定或流式細胞測定來檢驗來自孵化混合物的上清液中細胞因子的存在。特別優選的方法包括在例如de Jager等人;Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology(臨床和診斷性實驗免疫學),2003,第10(1)卷第133?139頁中描述的多重微珠陣列測定。通常,組合物可包括不在已經選擇的多肽中的、在房塵螨過敏個體群體中超過20%、25%、優選地30%、35%或40%的個體中產生細胞因子響應的至少一種另外的肽或其變體,最多總共十三種不同肽。
組合物還可包括不在已經選擇的多肽中的、在房塵螨過敏個體群體中多于10%、15%、優選地10%的個體中產生細胞因子響應的一種或多種另外的肽或其變體,最多總共十三種不同肽。
能夠結合TCR的合適的變體可根據經驗衍生或根據已知標準選擇。在單個肽中,存在有助于MHC抗原結合溝中的結合的某些殘基,以及與T細胞受體的高變區相互作用的其它殘基(Allen等人(1987)Nature327:713?5)。
在有助于T細胞受體相互作用的殘基中,已經證明了與取代指定肽殘基時T細胞活化的依賴性的相關的層次(hierarchy)。使用已經含有用不同氨基酸取代的一個或多個T細胞受體接觸殘基的肽,多個研究組已經證明了對T細胞活化過程的深遠作用。Evavold&Allen(1991)Nature252:1308?10證明了T細胞增殖和細胞因子產生之間不相關。在該體外模型中,用其中已經進行了天冬氨酸保守取代谷氨酸的肽類似物來攻擊對血紅蛋白的殘基64?76(在I?Ek環境中)有特異性的T細胞克隆。該取代不顯著影響類似物結合I?Ek的能力。
用該類似物體外攻擊T細胞克隆后,未檢測到增殖,盡管保持了IL?4分泌,也保持了該克隆輔助B細胞響應的能力。在隨后的研究中,同一組證明了T細胞介導的細胞溶解與細胞因子產生之間的分離。該情況中,前者保持不變而后者受損。McDevitt和同事最初在EAE(實驗性過敏性腦脊髓炎)的鼠模型中證明了改變的肽配體在體內的效力(Smilek等人(1991)Proc Natl Acad Sci USA88:9633?9637)。在這一模型中通過用MBP(髓磷脂堿性蛋白)的致腦炎的肽Acl?11免疫來誘發EAE。在位置四(賴氨酸)用丙氨酸殘基的取代產生了與其限制性元件(AαuAβu)結合良好的肽,但其在易感的PL/JxSJLF1品系中是非免疫原性的,而且其在用致腦炎的肽免疫之前或之后施用時還阻止EAE發作。因此,可鑒定肽中影響該肽誘發T細胞各種功能的能力的殘基。
有利地,可設計肽以利于T細胞增殖和誘發去敏化。Metzler和Wraith已經證明了在其中已經進行了增加肽?MHC親和力的取代的肽的致耐受能力提高(Metzler&Wraith(1993)Int Immunol~:1159?65)。Sloan?Lancaster等人(1993)Nature363:156?9證明,改變的肽配體可在克隆的T細胞導致長期和深遠的無反應性。
本發明的組合物能夠在對過敏原敏感的個體中誘發晚期響應。術語“晚期響應”包括列在Allergy and Allergic Disease(過敏癥和過敏性疾病)(1997)A.B.Kay(編輯),Blackwell Science,第1113?1130頁中的含義。晚期響應可以是任何晚期響應(LPR)。優選地,肽能夠引起晚期哮喘性響應(LAR)或晚期鼻炎性響應或晚期皮膚響應或晚期眼部響應。可使用本領域公知方法確定特定的肽是否能夠產生LPR;特別優選的方法被描述于Cromwell O,Durham SR,Shaw RJ,Mackay J和Kay AB.Provocation tests and measurements of mediators from mast cells and basophils in asthma and allergic rhinitis(哮喘和過敏性鼻炎中來自肥大細胞和嗜堿性細胞的介質的激發測試和測量).于Handbook of Experimental Immunology(實驗免疫學手冊)(4)第127章,編輯:Weir DM,Blackwell Scientific Publications,1986。
因此,優選地,本發明的單獨肽能夠在已經對過敏原敏感的個體中誘發LPR。可通過公知程序確定個體是否已經對過敏原敏感,諸如使用過敏原提取物的溶液的皮膚穿刺測試、皮膚LPR的誘發、臨床史、過敏原攻擊和用于測量過敏原特異性的IgE的放射性過敏原吸附測試(RAST)。可由醫師基于例如這樣的測試來確定特定個體是否被預期得益于治療。
使得個體去敏化或免疫耐受過敏原表示在適當地敏化的個體中抑制或阻撓由過敏原誘發的過敏組織反應。已顯示,可選擇性地活化T細胞,并隨后使之無響應性。此外,使這些T細胞無應答或將其消除導致患者對特定的過敏原去敏化。去敏化表現為在第二次或進一步施用該過敏原或過敏原衍生的肽時減少或優選地消除對過敏原或過敏原衍生的肽的響應。第二次施用可在經過允許去敏化發生的合適時間段后進行;這優選地為一天到數周之間的任何期間。大約兩周的間隔是優選的。
盡管本發明的組合物能夠在塵螨過敏個體中誘發LPR,應理解的是,當組合物被用于治療患者時,優選地使用足夠低濃度的組合物以致不發生可觀察到的LPR,但響應將足以部分地將T細胞去敏化以致可給予下一(優選地更高的)劑量,如此繼續。以這種方式,建立劑量以提供完全的去敏化但通常從來不在患者中誘發LPR。然而,該組合物或肽能夠在比所施用的較高的濃度下這樣做。
本發明的組合物優選地能夠在群體的一組塵螨過敏個體的50%或更多中誘發晚期響應。更優選地,組合物能夠在一組敏化的個體的55%或更多、60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多或者90%或更多中誘發LPR。可通過本領域公知方法確定組合物是否能夠在一組受治療者的某一百分比中誘發LPR。
將理解的是,本發明的肽包括由作為II類MHC結合所需要的最少必需序列的核心的9個氨基酸所組成的T細胞表位。然而,該肽還可包括在核心的9個氨基酸側翼的另外殘基。因此該肽可包括包含T細胞表位的區域,其中一些殘基可被修飾而不影響表位的功能。因此,如上定義的肽的功能變體包括被改進以相對于肽的天然序列提高溶解度的肽。提高的溶解度對于受治療者對衍生本發明的肽的過敏原的免疫耐受作用是有益的,因為對受治療者施用難溶劑導致不期望的、非免疫耐受的炎性響應。通過改變在包含T細胞表位的區域側翼的殘基,可提高肽的溶解度。可改造本發明的肽以使其可溶性更高,以致其包括:
i)T細胞表位側翼的肽的殘基的N末端:與剛好在衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的N末端的兩個至六個連續氨基酸相對應的一個至六個連續氨基酸;和/或
ii)T細胞表位側翼的肽的殘基的C末端:與剛好在衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的C末端的一個至六個連續氨基酸相對應的一個至六個連續氨基酸;或
iii)T細胞表位側翼的肽的殘基的N末端和C末端,選自精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一個氨基酸。
任選地,可另外地改造該肽為可溶性更高的,以使:
i)所述肽天然序列中的任何半胱氨酸殘基被絲氨酸或2?氨基丁酸代替;和/或
ii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的、不包含在T細胞表位中的任何殘基;和/或
iii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的最多四個氨基酸中包含序列Asp?Gly的、不包含在T細胞表位中的任何兩個連續氨基酸。
核酸和載體
組成本發明的組合物和產物的單獨肽可被直接施用,或可通過從編碼序列來表達而被間接施用。例如,可提供編碼本發明的肽諸如上述任何肽的多核苷酸。因此本發明的肽可從編碼并能夠表達它的多核苷酸產生或以該形式遞送。本文對使用、遞送或施用本發明的肽的任何提及意在包括經由從編碼它的多核苷酸表達而間接使用、遞送或施用這樣的肽。
術語“核酸分子”和“多核苷酸”在本文可互換使用,并且指的是任何長度的核苷酸即脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物的聚合形式。多核苷酸的非限制性實例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重組多核苷酸、質粒、載體、分離的任何序列的DNA、分離的任何序列的RNA、核酸探針和引物。本發明的多核苷酸可以以分離的或純化的形式被提供。“編碼”所選擇的多肽的核酸序列是當被置于合適的調節序列控制下時,在體內被轉錄(在DNA的情形下)和翻譯(在mRNA的情形下)為多肽的核酸分子。編碼序列的邊界是由在5’(氨基)末端的起始密碼子和在3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子所決定的。為了本發明的目的,這樣的核酸序列可包括但不限于來自病毒、原核或真核mRNA的cDNA,來自病毒或原核DNA或RNA的基因組序列,和甚至合成的DNA序列。轉錄終止序列可位于編碼序列的3’。
可根據本領域公知的方法合成本發明的多核苷酸,如例如在Sambrook等人(19104,Molecular Cloning?a laboratory manual(分子克隆實驗手冊);Cold Spring Harbor Press)中描述的方法。
可以以表達盒的形式提供本發明的多核苷酸分子,其包括可操作地連接于插入序列的控制序列,從而允許本發明的肽在目標受治療者中體內表達。反過來,這些表達盒通常在適于用作核酸免疫的試劑的載體(如,質粒或重組病毒載體)中被提供。這樣的表達盒可被直接施用于宿主受治療者。可選地,包含本發明的多核苷酸的載體可被施用于宿主受治療者。優選地,使用遺傳載體制備和/或施用該多核苷酸。合適的載體可以是能夠攜帶足夠量的遺傳信息并允許本發明的肽的表達的任何載體。
因此,本發明包括包含這樣的多核苷酸序列的表達載體。因此,本發明提供用于通過免疫耐受作用預防或治療塵螨過敏癥的載體,其包含編碼本發明的不同多肽的四種或更多種多核苷酸序列以及任選地編碼本文定義的不同多肽的一種或多種另外的多核苷酸序列。載體可包含編碼本發明的不同多肽的4、5、6或7種多核苷酸序列。
此外,將理解的是,本發明的組合物和產物可包括多肽和多核苷酸的混合物。因此,本發明提供本文所定義的組合物或產物,其中代替任何一種多肽的是能夠表達所述多肽的多核苷酸。
以分子生物學技術常規地構建表達載體,而且其可例如包括使用質粒DNA和可能是必要的并以正確方向放置的合適的起始因子、啟動子、增強子和其它元件,諸如例如多聚腺苷酸化信號,以允許表達本發明的肽。其它合適的載體對于本領域技術人員是明顯的。在這一方面作為另外的實例,我們參考Sambrook等人。
因此,通過將這樣的載體遞送到細胞并允許發生從載體的轉錄,可提供本發明的多肽。優選地,載體中本發明的或用于本發明的多核苷酸被可操作地連接于能夠提供宿主細胞對編碼序列的表達的控制序列,即,該載體是表達載體。
“可操作地連接”是指元件的排列,其中如此描述的組分被設置以進行其通常的功能。因此,當存在適當的酶時,可操作地連接于核酸序列的指定的調節序列諸如啟動子能夠實現該序列的表達。啟動子不必與序列連續,只要它起作用來指導序列表達。因此,例如,未翻譯但被轉錄的干預序列可存在于啟動子序列和核酸序列之間,并且仍可認為該啟動子序列被“可操作地連接”于編碼序列。
本領域中已描述了若干表達系統,其中每一種通常由包含可操作地連接于表達控制序列的目標基因或核苷酸序列的載體所組成。這些控制序列包括轉錄啟動子序列以及轉錄起始和終止序列。本發明的載體可以是例如擁有復制起點即任選地用于表達所述多核苷酸的啟動子和任選地啟動子的調節子的質粒、病毒或噬菌體載體。“質粒”是染色體外遺傳元件形式的載體。載體可包含一種或多種可選擇的標記基因,例如在細菌質粒情況下的氨芐西林抗性基因或用于真菌載體的抗性基因。載體可被用于體外例如產生DNA或RNA,或者用于轉染或轉化宿主細胞例如哺乳動物宿主細胞。載體還可適于體內使用,例如以允許多肽的體內表達。
“啟動子”是起始并調節編碼多肽的多核苷酸的轉錄的核苷酸序列。啟動子可包括誘導型啟動子(其中可操作地連接于啟動子的多核苷酸序列的表達由分析物、輔因子、調節蛋白等所誘發)、阻抑型啟動子(其中可操作地連接于啟動子的多核苷酸序列的表達由分析物、輔因子、調節蛋白等所阻抑)和組成型啟動子。術語“啟動子”或“控制元件”預期包括全長啟動子區域和這些區域的功能(如,控制轉錄或翻譯的)區段。
根據本發明的多核苷酸、表達盒或載體可另外地包括信號肽序列。信號肽序列通常被插入到與啟動子可操作地連接以使信號肽被表達并促進還與啟動子可操作地連接的編碼序列所編碼的多肽的分泌。
通常,信號肽序列編碼10至30個氨基酸例如15至20個氨基酸的肽。通常這些氨基酸主要是疏水的。在典型情況下,信號肽將帶有信號肽的生長中的多肽鏈靶向于表達細胞的內質網。信號肽在內質網中被切除,允許經高爾基體分泌多肽。因此,通過從個體中的細胞表達并從這些細胞分泌,可向個體提供本發明的肽。
可選地,本發明的多核苷酸可以以合適的方式表達以允許本發明的肽被II類MHC分子呈遞在抗原呈遞細胞表面。例如,本發明的多核苷酸、表達盒或載體可靶向于抗原呈遞細胞,或在這樣的細胞中可優先刺激或誘發被編碼的肽的表達。
目標多核苷酸可用于在體外、活體外或體內產生本發明的肽。可施用這樣的多核苷酸或通過免疫耐受作用將其用于過敏癥的預防或治療。
用于基因遞送的方法是本領域已知的。參見例如美國專利第5,399,346、5,580,859和5,5104,466號。核酸分子可直接引入接受的受治療者,諸如通過標準的肌內或皮內注射;經皮的顆粒遞送;吸入;局部,或通過口服、鼻內或粘膜施用方式。可選地,分子可活體外引入已從受治療者取出的細胞。例如,本發明的多核苷酸、表達盒或載體可活體外引入個體的APC。將包含目標核酸分子的細胞再次引入受治療者以致可針對核酸分子編碼的肽建立免疫應答。用于這種免疫的核酸分子在本文通常稱為“核酸疫苗”。
本發明的多肽、多核苷酸、載體或細胞可以以基本上分離的形式存在。它們可以與不干擾其預期用途的運載體或稀釋劑混合,并仍被認為是基本上分離的。它們還可以是基本上純化的形式,在該情況下它們通常將占制劑的蛋白、多核苷酸、細胞或干物質的至少90%,如至少95%、98%或99%。
抗原呈遞細胞(APC)
本發明包括產生在其表面上呈遞本發明的肽的APC群體的方法的體外使用,該APC群體隨后可用于治療。可對從患者獲得的細胞樣品在活體外進行這樣的方法。因此以這種方式產生的APC形成可用于通過免疫耐受作用治療或預防塵螨過敏癥的藥劑。細胞應被個體的免疫系統接受,因為它們衍生于該個體。將以這種方式產生的細胞遞送到最初獲得細胞的個體,從而形成本發明的治療實施方案。
制劑和組合物
本發明的肽、多核苷酸、載體和細胞可單獨或組合地提供給個體。本發明的每種分子或細胞可以以分離的、基本上分離的、純化的或基本上純化的形式提供給個體。例如,可對個體提供基本上不含其它肽的本發明的肽。
盡管根據本發明的肽、多核苷酸或組合物可能以原料形式被呈現,但優選地作為藥物制劑將它們呈現。因此,根據本發明的另一方面,本發明提供用于通過免疫耐受作用預防或治療塵螨過敏癥的藥物制劑,其包含根據本發明的組合物、載體或產物連同一種或多種藥學上可接受的運載體或稀釋劑和任選地一種或多種其它治療成分。運載體必須在與制劑的其它成分相容且不危害其接受者的意義上是“可接受的”。通常,用于注射和最終制劑的運載體是無菌和無熱原的。
配制包含本發明的肽、多核苷酸或細胞的組合物可使用標準的藥物配制化學和方法學進行,所有這些對于普通技術人員都易于獲得。
例如,包含本發明的一種或多種分子或細胞的組合物可與一種或多種藥學上可接受的賦形劑或媒介物合并。輔助物質諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質和諸如此類可在賦形劑或媒介物中存在。這些賦形劑、媒介物和輔助物質通常是在接受組合物的個體中不誘發免疫應答的藥劑,而且其可被施用而沒有不當毒性。藥學上可接受的賦形劑包括但不限于液體諸如水、鹽水、聚乙二醇、透明質酸和乙醇。其中還可包括藥學上可接受的鹽,例如,無機酸鹽諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽和諸如此類;以及有機酸鹽諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽和諸如此類。關于藥學上可接受的賦形劑、媒介物和輔助物質的完全討論可在Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷氏藥學原理)(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中獲得。
可以以適于彈丸施用或連續施用的形式制備、包裝或銷售這樣的組合物。可以以單位劑量形式制備、包裝或銷售注射組合物,諸如在安瓿或含有防腐劑的多劑量容器中。組合物包括但不限于懸液、溶液、油性或水性媒介物中的乳劑、糊劑和可植入的緩釋或可生物降解的制劑。這樣的組合物還可包括一種或多種另外的成分,其包括但不限于懸浮劑、穩定劑或分散劑。在用于腸胃外施用的組合物的一個實施方案中,以干燥(如粉末或顆粒)形式提供活性成分以便在腸胃外施用重構的組合物之前用合適的媒介物(如無菌無熱原的水)進行重構。可以以無菌可注射的水性或油性懸液或溶液形式制備、包裝或銷售藥物組合物。這種懸液或溶液可根據已知技術配制,并且除了活性成分以外,可包括另外的成分諸如本文所述的分散劑、潤濕劑或懸浮劑。例如,可使用無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑諸如水或1,3?丁二醇來制備這樣的無菌注射制劑。其它可接受的稀釋劑和溶劑包括但不限于林格氏溶液、等滲氯化鈉溶液和不揮發油諸如合成的單或二甘油酯。有用的其它的可腸胃外施用的組合物包括包含微晶形式的、在脂質體制品中的或作為可生物降解的聚合物系統的組成部分的活性成分的那些。用于緩釋或植入的組合物可包括藥學上可接受的聚合或疏水物質諸如乳液、離子交換樹脂、微溶聚合物或微溶鹽。
可選地,可將本發明的肽或多核苷酸包被,吸附或與連接到微粒運載體。合適的微粒運載體包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些,以及衍生自聚(丙交酯)和丙交酯?乙交酯共聚物的PLG微粒。參見例如,Jeffery等人(1993)Pharm.Res.10:362?368。還可使用其它顆粒系統和聚合物,例如聚合物諸如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸、精胺、亞精胺以及這些分子的軛合物。
本文提到的任何肽、多核苷酸或細胞的制劑將取決于諸如物質的性質和遞送方法等因素。可以以多種劑型施用任何這樣的物質。可以以口服(如,作為片劑、糖錠劑、錠劑、水性或油性懸液、可分散的粉末或顆粒)、腸胃外、表皮、皮下、吸入、靜脈內、肌內、胸骨內、經皮、皮內、舌下、鼻內、含服或輸注技術進行施用。物質還可作為栓劑被施用。醫師將能夠確定每個特定個體需要的施用途徑。
本發明制劑的組合物將包括有效而不導致副作用的合適濃度的每種肽/多核苷酸/細胞。通常,組合物中每種肽的濃度將在0.03至200nmol/ml的范圍中。更優選地在0.3至200nmol/ml、3至180nmol/ml、10至150nmol/ml或30至120nmol/ml的范圍中。組合物或制劑應具有大于95%或98%的純度或至少99%的純度。
因此在一個實施方案中,本發明的肽、多核苷酸、細胞或組合物與一種或多種其它治療劑一起用于治療。這些劑可被分別、同時或順序地施用。它們可以在相同或不同組合物中被施用。因此,在本發明的方法中,還可用另外的治療劑來治療受治療者。
因此,可配制一種組合物,其包括本發明的分子和/或細胞以及一種或多種其它治療分子。可選地,本發明的組合物可與作為組合治療的一部分的一種或多種其它治療組合物同時、順序或分別地使用。
治療方法和待治療的個體
本發明涉及能夠使得人類個體去敏化或免疫耐受上述過敏原并因此可用于預防或治療塵螨過敏癥的肽、多核苷酸、載體和細胞。本發明提供用于通過免疫耐受作用預防或治療塵螨過敏癥的組合物、產物、載體和制劑。本發明還提供使得塵螨過敏個體免疫耐受或去敏化的方法,其包括單獨或組合地施用上述本發明的多肽/多核苷酸/細胞。
將用本發明的組合物或制劑治療或提供的個體優選地是人類。應理解的是,待治療的個體可以是已知對過敏原敏感的個體,即處于被敏化或懷疑被敏化的風險中。可使用本領域公知和本文所述的技術來測試個體的敏化作用。可選地,個體可具有塵螨過敏癥的家族史。可能不必測試個體對塵螨的敏化作用,因為當暴露于塵螨時個體可展現過敏癥的癥狀。暴露表示接近例如未在高于50℃洗滌超過大約1周的衣物、床墊、枕頭、枕套、床單、毯子或其它寢具,或未真空清潔超過大約1周的地毯、窗簾或家具的裝飾覆蓋物(upholstered item)。接近表示距離上述物品10米或更少、5米或更少、2米或更少、1米或更少或者0米。過敏癥的癥狀可包括眼睛癢、流鼻涕、呼吸困難、皮膚紅癢或皮疹。
待治療的個體可以是任何年齡。然而,優選地,該個體可處于1至90、5至60、10至40或更優選地18至35的年齡組。
優選地,待治療的個體來自具有在白種人群體中有代表性的頻率范圍內的MHC等位基因頻率的群體。11個常見DRB1等位基因家族的參考群體等位基因頻率被顯示在表1中(數據來自HLA Facts Book(HLA事件簿),Parham和Barber)。
表1

通過分析報告頻率的多個研究來獲得參照頻率,而所示附圖是平均值。因此優選地,待治療的個體來自具有與表1所指的等位基因(諸如至少1、2、3、4、5種或所有等位基因)的參照群體相等的MHC等位基因頻率的群體,例如在圖中范圍加或減1、2、3、5、10、15或20%的范圍內。
優選地,個體來自這樣的群體,其中如下DRB1等位基因的等位基因頻率是:
4?至少9%
7?至少10%
11?至少8%。
個體可能已具有塵螨過敏癥達至少2周、1月、6月、1年或5年。個體可患有過敏癥導致的皮疹、鼻充血、流鼻涕和/或咳嗽。個體可能已被或未被施用治療塵螨過敏癥的其它組合物/化合物。個體可能生活在每天經歷大于50%、優選地55%、60%、65%、70%、75%、80%或90%的平均相對濕度的地理區域中。個體可能生活在已知滋生塵螨群體的地理區域中,例如美國東半部(和美國的主要西海岸城市)、加拿大的人口密集區、西歐、日本、韓國以及南美、澳大利亞和南非的海岸區。
組合免疫療法
因為許多個體對多種多肽抗原過敏或可能需要對多種多肽抗原去敏化,本發明還提供為對多種抗原過敏的個體去敏化的手段。在個體中誘發的對第一多肽抗原或過敏原的“耐受”可在個體中產生“致耐受環境”,其中可下調對其它抗原不適當的免疫應答以提供對其它抗原的耐受。
該發現是指,對多種過敏原過敏的個體可以在大大減少的時間段中被治療,而且對一些過敏原(如花生)嚴重過敏但對其它過敏原(如貓皮屑)中度過敏的個體可從這樣的治療受益,在所述治療中建立對較溫和的過敏原的耐受,并隨后將這種致耐受環境用于提供對其它更極端過敏原的耐受。此外,患有自身免疫性疾病且另外地對無關抗原或過敏原過敏(或以其他方式免疫)的個體可從這樣的治療方案受益,在所述治療方案中首先建立對無關抗原或過敏原的耐受,并隨后將這種致耐受環境用于提供對與自身免疫性疾病相關的自身抗原的耐受。
因此提供了用于使塵螨過敏個體對上述塵螨過敏原和一種或多種另外的不同多肽抗原去敏化的方法。該方法要求,在第一步中向個體施用上述的根據本發明的組合物/產物/制劑(主要組合物),其中所述施用是以足以產生針對塵螨過敏原的低反應狀態的方式進行。一旦建立了針對塵螨過敏原的低反應狀態,或至少發生朝向去敏化的轉變,該方法要求施用包含個體將對其敏化的第二不同的多肽抗原的第二組合物。以這樣的方式進行第二組合物的施用以利用通過使用主要組合物建立的致耐受環境,其中現在可能建立對第二不同多肽抗原的耐受性。將第二組合物與第一主要組合物或Feld1的較大片段共施用。“共施用”是指同時或共同施用,例如,當兩種物質存在于同一組合物中,或在不同組合物中以幾乎相同時間但在不同部位施用,以及在不同時間不同組合物中的多肽抗原遞送。例如,可在遞送第一組合物之前或之后在相同或不同部位遞送第二組合物。遞送之間的時間安排可以從間隔約數秒變化到間隔約數分鐘、間隔數小時或甚至間隔數天。此外,可采用不同的遞送方法。
第二多肽抗原優選地是與塵螨過敏原不同的過敏原。當然,用于本發明方法的合適的過敏原可使用已知方法獲得和/或產生。合適的過敏原的類別包括但不限于其它塵螨過敏原、花粉、動物皮屑(尤其是貓皮屑)、草、霉菌、灰塵、抗生素、針昆蟲毒液和多種環境(包括化學品和金屬)、藥物和食物過敏原。常見的樹過敏原包括來自三角葉楊、楊樹、白蠟樹、樺樹、楓樹、橡樹、榆樹、山核桃樹和美國山核桃樹的花粉;常見的植物過敏原包括來自艾蒿、豕草、英國車前草、酸模和藜的那些;植物接觸性過敏原包括來自毒櫟、毒葉藤和蕁麻的那些;常見的草過敏原包括黑麥草、梯牧草、約翰遜草、百慕大草、羊茅草和藍草過敏原;常見的過敏原還可從霉菌或真菌獲得,諸如鏈格孢屬、鐮孢菌屬、著色芽生菌屬、曲霉屬、小多孢菌屬、毛霉屬和嗜熱放線菌;表皮過敏原可從房屋或有機灰塵(通常來源于真菌)獲得或從動物來源諸如羽毛和狗皮屑獲得;常見的食品過敏原包括牛奶和奶酪(乳制品)、雞蛋、小麥、果仁(如花生)、海產品(如貝殼)、豌豆、大豆和麩質過敏原;常見的環境過敏原包括金屬(鎳和金)、化學品(甲醛、三硝基苯酚和松節油)、乳膠、橡膠、纖維(棉或羊毛)、粗麻布、染發劑、化妝品、去垢劑和香料過敏原;常見的藥物過敏原包括局部麻醉和水楊酸鹽過敏原;抗生素過敏原包括青霉素、四環素和磺胺過敏原;而常見的昆蟲過敏原包括蜜蜂、黃蜂和螞蟻毒液以及蟑螂萼器過敏原。特別充分表征的過敏原包括但不限于主要的貓過敏原Fel d1、蜜蜂毒液磷脂酶A2(PLA)(Akdis等人(1996)J.Clin.Invest.98:1676?1683)、樺樹花粉過敏原Bet v1(Bauer等人(1997)Clin.Exp.Immunol.107:536?541)和多表位的重組的草過敏原rKBG8.3(Cao等人(1997)Immunologgy90:46?51)。這些和其它合適的過敏原是商業上可獲得的和/或可作為提取物按照已知技術容易地制備。
優選地,第二多肽過敏原選自以下過敏原序列和數據庫登記號(NCBI Entrez登記號)列表。NCBI是美國國家生物技術信息中心并且是美國國家衛生研究院的分支機構。可獲取進入數據庫的NCBI網址是www.ncbi.nlm.nih.gov/。過敏原序列和數據庫登記號(NCBI Entrez登記號):
房塵螨
屋塵螨
Derp1
MKIVLAIASLLALSAVYARPSSIKTFEEYKKAFNKSYATFEDEEAARKNFLESVKYVQSNGGAINHLSDLSLDEFKNRFLMSAEAFEHLKTQFDLNAETNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL
Derp2
MMYKILCLSLLVAAVARDQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKVMGDDGVLACALATHAKIRD
Derp3
MIIYNILIVLLLAINTLANPILPASPNATIVGGEKALAGECPYQISLQSSSHFCGGTILDEYWILTAAHCVAGQTASKLSIRYNSLKHSLGGEKISVAKIFAHEKYDSYQIDNDIALIKLKSPMKLNQKNAKAVGLPAKGSDVKVGDQVRVSGWGYLEEGSYSLPSELRRVDIAVVSRKECNELYSKANAEVTDNMICGGDVANGGKDSCQGDSGGPVVDVKNNQVVGIVSWGYGCARKGYPGVYTRVGNFIDWIESKRSQ
Derp4
KYXNPHFIGXRSVITXLME
Derp5
MKFIIAFFVATLAVMTVSGEDKKHDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQEQINHFEEKPTKEMKDKIVAEMDTIIAMIDGVRGVLDRLMQRKDLDIFEQYNLEMAKKS GDILERDLKKEEARVKKIEV
Derp6
AIGXQPAAEAEAPFQISLMK
Derp7
MMKLLLIAAAAFVAVSADPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDPMKVPDHSDKFERHIGIIDLKGELDMRNIQVRGLKQMKRVGDANVKSEDGVVKAHLLVGVHDDVVSMEYDLAYKLGDLHPNTHVISDIQDFVVELSLEVSEEGNMTLTSFEVRQFANVVNHIGGLSILDPIFAVLSDVLTAIFQDTVRAEMTKVLAPAFKKELERNNQ
Derp9
IVGGSNASPGDAVYQIAL
粉塵螨
Derf1
MKFVLAIASLLVLTVYARPASIKTFEFKKAFNKNYATVEEEEVARKNFLESLKYVEANKGAINHLSDLSLDEFKNRYLMSAEAFEQLKTQFDLNAETSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVEERSYPYVAREQRCRRPNSQHYGISNYCQIYPPDVKQIREALTQTHTAIAVIIGIKDLRAFQHYDGRTIIQHDNGYQPNYHAVNIVGYGSTQGDDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIM
Derf2
MISKILCLSLLVAAVVADQVDVKDCANNEIKKVMVDGCHGSDPCIIHRGKPFTLEALFDANQNTKTAKIEIKASLDGLEIDVPGIDTNACHFMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKLIGDNGVLACALATHGKIRD
Derf3
MMILTIVVLLAANILATPILPSSPNATIVGGVKAQAGDCPYQISLQSSSHFCGGSILDEYWILTAAHCVNGQSAKKLSIRYNTLKHASGGEKIQVAEIYQHENYDSMTIDNDVALIKLKTPMTLDQTNAKPVPLPAQGSDVKVGDKIRVSGWGYLQEGSYSLPSELQRVDIDVVSREQCDQLYSKAGADVSENMICGGDVANGGVDSCQGDSGGPVVDVATKQIVGIVSWGYGCARKGYPGVYTRVGNFVDWIESKRSQ
Derf4
AVGGQDADLAEAPFQISLLK
Derf7
MMKFLLIAAVAFVAVSADPIHYDKITEEINKAIDDAIAAIEQSETIDPMKVPDHADKFERHVGIVDFKGELAMRNIEARGLKQMKRQGDANVKGEEGIVKAHLLIGVHDDIVSMEYDLAYKLGDLHPTTHVISDIQDFVVALSLEISDEGNITMTSFEVRQFANVVNHIGGLSILDPIFGVLSDVLTAIFQDTVRKEMTKVLAPAFKRELEKN
另外的螨過敏原序列(NCBI entrez登記號):
1170095;1359436;2440053;666007;487661;1545803;84702;84699;625532;404370;1091577;1460058;7413;9072;387592。

貓(felis)序列(NCBI entrez登記號):
539716;539715;423193;423192;423191;423190;1364213;1364212;395407;163827;163823;163825;1169665;232086;1169666。
乳膠
三葉膠樹(hevea)序列:
Hevb1
MAEDEDNQQGQGEGLKYLGFVQDAATYAVTTFSNVYLFAKDKSGPLQPGVDIIEGPVKNVAVPLYNRFSYIPNGALKFVDSTVVASVTIIDRSLPPIVKDASIQVVSAIRAAPEAARSLASSLPGQTKILAKVFYGEN
Hevb3
MAEEVEEERLKYLDFVRAAGVYAVDSFSTLYLYAKDISGPLKPGVDTIENVVKTVVTPVYYIPLEAVKFVDKTVDVSVTSLDGVVPPVIKQVSAQTYSVAQDAPRIVLDVASSVFNTGVQEGAKALYANLEPKAEQYAVITWRALNKLPLVPQVANVVVPTAVYFSEKYNDVVRGTTEQGYRVSSYLPLLPTEKITKVFGDEAS
另外的三葉膠樹序列(NCBI entrez登記號):
3319923;3319921;3087805;1493836;1480457;1223884;3452147;3451147;1916805;232267;123335;2501578;3319662;3288200;1942537;2392631;2392630;1421554;1311006;494093;3183706;3172534;283243;1170248;1708278;1706547;464775;2661042;231586;123337;116359;123062;2213877;542013;2144920;1070656;2129914;2129913;2129912;100135;82026;1076559;82028;82027;282933;280399;100138;1086972;108697;1086976;1086978;1086978;1086976;1086974;1086972;913758;913757;913756;234388;1092500;228691;1177405;18839;18837;18835;18833;18831;1209317;1184668;168217;168215;168213;168211;168209;348137。
黑麥草(rye grass)
黑麥草屬(lolium)序列:
126385Lolp1
MASSSSVLLVVALFAVFLGSAHGIAKVPPGPNITAEYGDKWLDAKSTWYGKPTGAGPKDNGGACGYKNVDKAPFNGMTGCGNTPIFKDGRGCGSCFEIKCTKPESCSGEAVTVTITDDNEEPIAPYHFDLSGHAFGSMAKKGEEQNVRSAGELELQFRRVKCKYPDDTKPTFHVEKASNPNYLAILVKYVDGDGDVVAVDIKEKGKDKWIELKESWGAVWRIDTPDKLTGPFTVRYTTEGGTKSEFEDVIPEGWKADTSYSAK
126386Lolp2a
AAPVEFTVEKGSDEKNLALSIKYNKEGDSMAEVELKEHGSNEWLALKKNGDGVWEIKSDKPLKGPFNFRFVSEKGMRNVFDDVVPADFKVGTTYKPE
126387Lolp3
TKVDLTVEKGSDAKTLVLNIKYTRPGDTLAEVELRQHGSEEWEPMTKKGNLWEVKSAKPLTGPMNFRFLSKGGMKNVFDEVIPTAFTVGKTYTPEYN
2498581Lolp5a
MAVQKYTVALFLRRGPRGGPGRSYAADAGYTPAAAATPATPAATPAGGWREGDDRRAEAAGGRQRLASRQPWPPLPTPLRRTSSRSSRPPSPSPPRASSPTSAAKAPGLIPKLDTAYDVAYKAAEAHPRGQVRRLRHCPHRSLRVIAGALEVHAVKPATEEVLAAKIPTGELQWDKIDAAFKIAATAANAAPTNDKFTVFESAFNKALNECTGGAMRPTSSSPPSRPRSSRPTPPPSPAAPEVKYAVFEAALTKAITAMTQAQKAGKPAAAAATAAATVATAAATAAAVLPPPLLVVQSLISLLIYY
2498582Lolp5b
MAVQKHTVALFLAVALVAGPAASYAADAGYAPATPATPAAPATAATPATPATPATPAAVPSGKATTEEQKLIEKINAGFKAAVAAAAVVPPADKYKTFVETFGTATNKAFVEGLASGYADQSKNQLTSKLDAALKLAYEAAQGATPEAKYDAYVATLTEALRVIAGTLEVHAVKPAAEEVKVGAIPAAEVQLIDKVDAAYRTAATAANAAPANDKFTVFENTFNNAIKVSLGAAYDSYKFIPTLVAAVKQAYAAKQATAPEVKYTVSETALKKAVTAMSEAEKEATPAAAATATPTPAAATATATPAAAYATATPAAATATATPAAATATPAAAGGYKV
455288Lo1p同種型9
MAVQKHTVALFLAVALVAGPAASYAADAGYAPATPATPAAPATAATPATPATPATPAAVPSGKATTEEQKLIEKINAGFKAAVAAAAVVPPADKYKTFVETFGTATNKAFVEGLASGYADQSKNQLTSKLDAALKLAYEAAQGATPEAKYDAYVATLTEALRVLAGTLEVHAVKPAAEEVKVGAIPAAEVQLIDKVDAAYRTAATAANAAPANDKFTVFENTFNNAIKVSLGAAYDSYKFIPTLVAAVKQAYAAKQATAPEVKYTVSETALKKAVTAMSEAEKEATPAAAATATPTPAAATATATPAAAYATATPAAATATATPAAATATPAAAGGYKV
1582249Lolp11
DKGPGFVVTGRVYCDPCRAGFETNVSHNVEGATVAVDCRPFDGGESKLKAEATTDKDGWYKIEIDQDHQEEICEVVLAKSPDKSCSEIEEFRDRARVPLTSNXGIKQQGIRYANPIAFFRKEPLKECGGILQAY
另外的黑麥草屬序列(NCBI entrez登記號):
135480;417103;687261;687259;1771355;2388662;631955;542131;542130;542129;100636;626029;542132;320616;320615;320614;100638;100634;82450;626028;100639;283345;542133;1771353;1763163;1040877;1040875;250525;551047;515377;510911;939932;439950;2718;168316;168314;485371;2388664;2832717;2828273;548867。
橄欖樹
橄欖序列
416610 Olee1
EDIPQPPVSQFHIQGQVYCDTCRAGFITELSEFIPGASLRLQCKDKENGDVTFTEVGYTRAEGLYSMLVERDHKNEFCEITLISSGRKDCNEIPTEGWAKPSLKFKLNTVNGTTRTVNPLGFFKKEALPKCAQVYNKLGMYPPNM
墻草屬(parietaria)
墻草屬序列:
2497750ParjP2
MRTVSMAALVVIAAALAWTSSAEPAPAPAPGEEACGKVVQDIMPCLHFVKGEEKEPSKECCSGTKKLSEEVKTTEQKREACKCIVRATKGISGIKNELVAEVPKKCDIKTTLPPITADFDCSKIQSTIFRGYY
1352506ParjP5
MVRALMPCLPFVQGKEKEPSKGCCSGAKRLDGETKTGPQRVHACECIQTAMKTYSDIDGKLVSEVPKHCGIVDSKLPPIDVNMDCKTVGVVPRQPQLPVSLRHGPVTGPSDPAHKARLERPQIRVPPPAPEKA
1532056ParjP8
MRTVSMAALVVIAAALAWTSSAELASAPAPGEGPCGKVVHHIMPCLKFVKGEEKEPSKSCCSGTKKLSEEVKTTEQKREACKCIVAATKGISGIKNELVAEVPKKCGITTTLPPITADFDCSKIESTIFRGYY
1532058ParjP9
MRTVSAPSAVALVVIVAAGLAWTSLASVAPPAPAPGSEETCGTVVRALMPCLPFVQGKEKEPSKGCCSGAKRLDGETKTGLQRVHACECIQTAMKTYSDIDGKLVSEVPKHCGIVDSKLPPIDVNMDCKTLGVVPRQPQLPVSLRHGPVTGPSDPAHKARLERPQIRVPPPAPEKA
2497749ParjP9
MRTVSARSSVALVVIVAAVLVWTSSASVAPAPAPGSEETCGTVVGALMPCLPFVQGKEKEPSKGCCSGAKRLDGETKTGPQRVHACECIQTAMKTYSDIDGKLVSEVPKHCGIVDSKLPPIDVNMDCKTLGVLHYKGN
1086003Parj1
MVRALMPCLPFVQGKEKEPSKGCCSGAKRLDGETKTGPQRVHACECIQTAMKTYSDIDGKLVSEVPKHCGIVDSKLPPIDVNMDCKTVGVVPRQPQLPVSLRHGPVTGPSRSRPPTKHGWRDPRLEFRPPHRKKPNPAFSTLG
另外的墻草屬序列(NCBI entrez登記號):
543659;1836011;1836010;1311513;1311512;1311511;1311510;1311509;240971。
梯牧草(timothy grass)
梯牧草屬(phleum)序列:
Phlp1
MASSSSVLLVVVLFAVFLGSAYGIPKVPPGPNITATYGDKWLDAKSTWYGKPTGAGPKDNGGACGYKDVDKPPFSGMTGCGNTPIFKSGRGCGSCFEIKCTKPEACSGEPVVVHITDDNEEPIAPYHFDLSGHAFGAMAKKGDEQKLRSAGELELQFRRVKCKYPEGTKVTFHVEKGSNPNYLALLVKYVNGDGDVVAVDIKEKGKDKWIELKESWGAIWRIDTPDKLTGPFTVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADTSYESK
Phlp1
MASSSSVLLVVALFAVFLGSAHGIPKVPPGPNITATYGDKWLDAKSTWYGKPTAAGPKDNGGACGYKDVDKPPFSGMTGCGNTPIFKSGRGCGSCFEIKCTKPEACSGEPVVVHITDDNEEPIAAYHFDLSGIAFGSMAKKGDEQKLRSAGEVEIQFRRVKCKYPEGTKVTFHVEKGSNPNYLALLVKFSGDGDVVAVDIKEKGKDKWIALKESWGAIWRIDTPEVLKGPFTVRYTTEGGTKARAKDVIPEGWKADTAYESK
Phlp2
MSMASSSSSSLLAMAVLAALFAGAWCVPKVTFTVEKGSNEKHLAVLVKYEGDTMAEVELREHGSDEWVAMTKGEGGVWTFDSEEPLQGPFNFRFLTEKGMKNVFDDVVPEKYTIGATYAPEE
Phlp5
ADLGYGGPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINDGFKAALAAAAGVPPADKYKTFVATFGAASNKAFAEGLSAEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRILAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDSAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNNAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAFTAMSEAQKAAKPATEATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Phlp5
ADLGYGGPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINDGFKAALAAAAGVPPADKYKTFVATFGAASNKAFAEGLSAEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDSAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNNAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPATEATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Phlp5b
AAAAVPRRGPRGGPGRSYTADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAAAAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Phlp5a
ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAGADAAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAGAGVQPADKYRTFVATFGPASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDEIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Phlp5
MAVQKYTVALFLAVALVAGPAASYAADAGYAPATPAAAGAEAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAATAKAPGLVPKLDAAYSVSYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Phlp5
MAVQKYTVALFLAVALVAGPAASYAADAGYAPATPAAAGAEAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAATAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEDPAWPKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTATGAASGAATVAAGGYKV
Phlp5
ADAGYAPATPAAAGAEAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAATAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVLAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Phlp5
SVKRSNGSAEVHRGAVPRRGPRGGPGRSYAADAGYAPATPAAAGAEAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAATAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Phlp5
MAVHQYTVALFLAVALVAGPAGSYAADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAApAGAEPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAAAAGVPPADKYRTFVATFGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATVSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Phlp5
ADLGYGGPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINDGFKAALAAAAGVPPADKYKTFVATFGAASNKAFAEGLSAEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDSAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNNAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAFTAMSEAQKAAKPATEATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Phlp5b
AAAAVPRRGPRGGPGRSYTADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAAAAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Phlp5a
ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAGADAAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAGAGVQPADKYRTFVATFGPASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDEIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
phlp5
AVPRRGPRGGPGRSYAADAGYAPATPAAAGAEAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAAAASVPAGDKFKTFEAAFTSSSKAATAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTATGAASGAATVAAGGYKV
Phlp5b
MAVPRRGPRGGPGRSYTADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAARQRPAADKFKTFEAASPRHPRPLRQGAGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAAEVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Phlp5
MAVHQYTVALFLAVALVAGPAASYAADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAAAAGVQPADKYRTFVATFGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Phlp5
EAPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALARRLQPADKYRTFVATFGPASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRILAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAAELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDEIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPPPLPPPPQPPPLAATGAATAATGGYKV
Phlp5
MAVHQYTVALFLAVALVAGPAASYAADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAAAAGVQPADKYRTFVATFGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Phlp5b
MAVPRRGPRGGPGRSYTADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVGFKAAVAARQRPAADKFKTFEAASPRHPRPLRQGAGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIIDKIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAAEVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV
Phlp5a
ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAGADAAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAGAGVQPADKYRTFVATFGPASNKAFAEGLS GEPKGAAES S SKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDEIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPPPLPPPPQPPPLAATGAATAATGGYKV
Phlp5
MAVHQYTVALFLAVALVAGPAASYAADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAAAAGVQPADKYRTFVATFGAASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATAATGGYKV
Phlp6
MAAHKFMVAMFLAVAVVLGLATSPTAEGGKATTEEQKLIEDVNASFRAAMATTANVPPADKYKTFEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPEDKYEAFVLHFSEALRILAGTPEVHAVKPGA
Phlp6
SKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPEDKYEAFVLHFSEALHIIAGTPEVHAVKpGA
Phlp6
ADKYKTFEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPEDKYEAFVLHFSEALHILAGTPEVHAVKPGA
Phlp6
TEEQKLIEDVNASFRAAMATTANVPPADKYKTLEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPEDKYEAFVLHFSEALRIIAGTPEVHAVKPGA
Phlp6
MAAHKFMVAMFLAVAVVLGLATSPTAEGGKATTEEQKLIEDINASFRAAMATTANVPPADKYKTFEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPEDKYEAFVLHFSEALHIIAGTPEVHAVKPGA
Phlp6
MVAMFLAVAVVLGLATSPTAEGGKATTEEQKLIEDVNASFRAAMATTANVPPADKYKTFEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPEDKYEAFVLHFSEALRIIAGTPEVHAVKPGA
Phlp7
MADDMERIFKRFDTNGDGKISLSELTDALRTLGSTSADEVQRMMAEIDTDGDGFIDFNEFISFCNANPGLMKDVAKVF
Phlp11
MSWQTYVDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEETTGIMKDFDEPGHLAPTGMFVAGAKYMVIQGEPGRVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLVEQGM
另外的梯牧草屬序列(NCBI entrez登記號):
458878;548863;2529314;2529308;2415702;2415700;2415698;542168;542167;626037;542169;541814;542171;253337;253336;453976;439960。
黃蜂(wasp)(和相關的)
黃胡蜂(vespula)序列
465054過敏原VESV5
MEISGLVYLIIIVTIIDLPYGKANNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVVSYGLTKQEKQDILKEHNDFRQKIARGLETRGNPGPQPPAKNMKNLVWNDELAYVAQVWANQCQYGHDTCRDVAKYQVGQNVALTGSTAAKYDDPVKLVKMWEDEVKDYNPKKKFSGNDFLKTGHYTQMVWANTKEVGCGSIKYIQEKWHKHYLVCNYGPSGNFMNEELYQTK
1709545過敏原VESM1
GPKCPFNSDTVSIIIETRENRNRDLYTLQTLQNHPEFKKKTITRPVVFITHGFTSSASEKNFINLAKALVDKDNYMVISIDWQTAACTNEYPGLKYAYYPTAASNTRLVGQYIATITQKLVKDYKISMANIRLIGHSLGAHVSGFAGKRVQELKLGKYSEIIGLDPARPSFDSNHCSERLCETDAEYVQIIHTSNYLGTEKILGTVDFYMNNGKNNPGCGRFFSEVCSHTRAVIYMAECIKHECCLIGIPRSKSSQPISRCTKQECVCVGLNAKKYPSRGSFYVPVESTAPFCNNKGKII
1352699過敏原VESV1
MEENMNLKYLLLFVYFVQVLNCCYGHGDPLSYELDRGPKCPFNSDTVSIIIETRENRNRDLYTLQTLQNHPEFKKKTITRPVVFITHGFTSSASETNFINLAKALVDKDNYMVISIDWQTAACTNEAAGLKYLYYPTAARNTRLVGQYLATITQKLVKHYKISMANIRLIGHSLGAHASGFAGKKVQELKLGKYSEIIGLDPARPSFDSNHCSERLCETDAEYVQIHTSNYLGTEKTLGTVDFYMNNGKNQPGCGRFFSEVCSHSRAVIYMAECIKHECCLIGIPKSKSSQPISSCTKQECVCVGLNAKKYPSRGSFYVPVESTAPFCNNKGKII
1346323過敏原VESV2
SERPKRVFNIYWNVPTFMCHQYDLYFDEVTNFNIKRNSKDDFQGDKIAIFYDPGEFPALLSLKDGKYKKRNGGVPQEGNITIHLQKFIENLDKIYPNRNFSGIGVIDFERWRPIFRQNWGNMKIHKNFSIDLVRNEHPTWNKKMIELEASKRFEKYARFFMEETLKLAKKTRKQADWGYYGYPYCFNMSPNNLVPECDVTAMHENDKMSWLFNNQNVLLPSVYVRQELTPDQRIGLVQGRVKEAVRISNNLKHSPKVLSYWWYVYQDETNTFLTETDVKKTFQEIVINGGDGIIIWGSSSDVNSLSKCKRLQDYLLTVLGPIAINVTEAVN
549194過敏原VES VI
5KVNYCKIKCLKGGVHTACKYGTSTKPNCGKMVVKAYGLTEAEKQEILKVHNDFRQKVAKGLETRGNPGPQPPAKNMNNLVWNDELANIAQVWASQCNYGHDTCKDTEKYPVGQNIAKRSTTAALFDSPGKLVKMWENEVKDFNPNIEWSKNNLKKTGHYTQMVWAKTKEIGCGSVKYVKDEWYTHYLVCNYGPSGNFRNEKLYEKK
另外的黃胡蜂屬序列(NCBI entrez登記號):
549193;549192;549191;549190;5491104;117414;126761;69576;625255;6271104;627188;627187;482382;112561;627186;627185;1923233;1047645;1047647;745570;225764;162551。
樹過敏原序列(主要是樺樹(birch))序列:
114922Betv1
MGVFNYETETTSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIKIVATPDGGSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVKASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAYN
130975Bet v2
MSWQTYVDEHLMCDIDGQASNSLASAIVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQEITGIMKDFEEPGHLAPTGLHLGGIKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITIKKTGQALVFGIYEEPVTPGQCNMVVERLGDYLIDQGL
1168696Bet v3
MPCSTEAMEKAGHGHASTPRKRSLSNSSFRLRSESLNTLRLRRIFDLFDKNSDGIITVDELSRALNLLGLETDLSELESTVKSFTREGNIGLQFEDFISLHQSLNDSYFAYGGEDEDDNEEDMRKSILsQEEADSFGGFKVFDEDGDGYISARELQMVLGKLGFSEGSEIDRVEKMIVSVDSNRDGRVDFFEFKDMMRSVLVRSS
809536Betv4
MADDHPQDKAERERIFKRFDANGDGKISAAELGEALKTLGSITPDEVKHMMAEIDTDGDGFISFQEFTDFGRANRGLLKDVAKIF
543675Que a I?白櫟(Quercus alba)=橡樹(片段)
GVFTXESQETSVIAPAXLFKALFL
543509Car b I?歐洲鵝耳櫟(Carpinus betulus)=鵝耳櫪樹(hornbeam tree)(片段)
GVFNYEAETPSVIPAARLFKSYVLDGDKLIPKVAPQALXK
543491Aln g I?普通赤楊(Alnus glutinosa)=榿木(alder tree)(片段)
GVFNYEAETPSVIPAARLFKAFILDGDKLLPKVAPEAVSSVENI
1204056二磷酸核酮糖羧化酶/氧合酶
VQCMQVWPPLGLKKFETLSYLPPLSSEQLAKEVDYLLRKNLIPCLEFELEHGFVYREHNRSPGYYDGRYWTMWKLPMFGCNDSSQVLKELEECKKAYPSAFIRIIGFDDK
另外的樹過敏原序列(NCBI entrez登記號):
131919;128193;585564;1942360;2554672;2392209;2414158;1321728;1321726;1321724;1321722;1321720;1321718;1321716;1321714;1321712;3015520;2935416;464576;1705843;1168701;1168710;1168709;1168708;1168707;1168706;1168705;1168704;1168703;1168702;1842188;2564228;2564226;2564224;2564222;2564220;2051993;18131041;15368104;534910;534900;5341048;1340000;1339998;2149808;66207;2129477;1076249;1076247;629480;481805;81443;1361968;1361967;1361966;1361965;1361964;1361963;1361962;1361961;1361960;1361959;320546;629483;629482;629481;541804;320545;81444;541814;629484;474911;452742;1834387;298737;298736;1584322;1584321;584320;1542873;1542871;1542869;1542867;1542865;1542863;1542861;1542859;1542857;1483232;1483230;1483228;558561;551640;488605;452746;452744;452740;452738;452736;452734;452732;452730;452728;450885;17938;17927;17925;17921;297538;510951;2104331;2104329;166953。
花生
花生序列
1168391Arah1
MRGRVSPLMLLLGILVLASVSATHAKSSPYQKKTENPCAQRCLQSCQQEPDDLKQKACESRCTKLEYDPRCVYDPRGHTGTTNQRSPPGERTRGRQPGDYDDDRRQPRREEGGRWGPAGPREREREEDWRQPREDWRRPSHQQPRKIRPEGREGEQEWGTPGSHVREETSRNNPFYFPSRRFSTRYGNQNGRIRVLQRFDQRSRQFQNLQNHRIVQIEAKPNTLVLPKHADADNILVIQQGQATVTVANGNNRKSFNLDEGHALRIPSGFISYILNRHDNQNLRVAKISMPVNTPGQFEDFFPASSRDQSSYLQGFSRNTLEAAFNAEFNEIRRVLLEENAGGEQEERGQRRWSTRSSENNEGVIVKVSKEHVEELTKHAKSVSKKGSEEEGDITNPINLREGEPDLSNNFGKLFEVKPDKKNPQLQDLDMMLTCVEIKEGALMLPHFNSKAMVIVVVNKGTGNLELVAVRKEQQQRGRREEEEDEDEEEEGSNREVRRYTARLKEGDVFIMPAAHPVAINASSELHLLGFGINAENNHRIFLAGDKDNVIDQIEKQAKDLAFPGSGEQVEKLIKNQKESHFVSARPQSQSQSPSSPEKESPEKEDQEEENQGGKGPLLSILKAFN
豕草(ragweed)
豕草屬(ambrosia)序列
113478Amba1
MGIKHCCYILYFTLALVTLLQPVRSAEDLQQILPSANETRSLTTCGTYNIIDGCWRGKADWAENRKALADCAQGFAKGTIGGKDGDIYTVTSELDDDVANPKEGTLRFGAAQNRPLWIIFARDMVIRLDRELAINNDKTIDGRGAKVEIINAGFAIYNVKNIIIHNIIMHDIVVNPGGLIKSHDGPPVPRKGSDGDAIGISGGSQIWIDHCSLSKAVDGLIDAKHGSTHFTVSNCLFTQHQYLLLFWDFDERGMLCTVAFNKFTDNVDQRMPNLRHGFVQVVNNNYERWGSYALGGSAGPTILSQGNRFLASDIKKEVVGRYGESAMSESINWNWRSYMDVFENGAIFVPSGVDPVLTPEQNAGMIPAEPGEAVLRLTS SAGVLSCQPGAPC
113479Amba2
MGIKHCCYILYFTLALVTLVQAGRLGEEVDILPSPNDTRRSLQGCEAHNIIDKCWRCKPDWAENRQALGNCAQGFGKATHGGKWGDIYMVTSDQDDDVVNPKEGTLRFGATQDRPLWIIFQRDMIIYLQQEMVVTSDKTIDGRGAKVELVYGGITLMNVKNVIIHNIDIHDVRVLPGGRIKSNGGPAIPRHQSDGDAIHVTGSSDIWIDHCTLSKSFDGLVDVNWGSTGVTISNCKFTHHEKAVLLGASDTHFQDLKMHVTLAYNIFTNTVHERMPRCRFGFFQIVNNFYDRWDKYAIGGSSNPTILSQGNKFVAPDFIYKKNVCLRTGAQEPEWMTWNWRTQNDVLENGAIFVASGSDPVLTAEQNAGMMQAEPGDMVPQLTMNAGVLTCSPGAPC
113477Amba1.3
MGIKQCCYILYFTLALVALLQPVRSAEGVGEILPSVNETRSLQACEALNIIDKCWRGKADWENNRQALADCAQGFAKGTYGGKWGDVYTVTSNLDDDVANPKEGTLRFAAAQNRPLWIIFKNDMVINLNQELVVNSDKTIDGRGVKVEIINGGLTLMNVKNIIIHNINIHDVKVLPGGMIKSNDGPPILRQASDGDTINVAGSSQIWIDHCSLSKSFDGLVDVTLGSTHVTISNCKFTQQSKAILLGADDTHVQDKGMLATVAFNMFTDNVDQRMPRCRFGFFQVVNNNYDRWGTYAIGGSSAPTILCQGNRFLAPDDQIKKNVLARTGTGAAESMAWNWRSDKDLLENGAIFVTSGSDPVLTPVQSAGMIPAEPGEAAIKLTSSAGVFSCHPGAPC
113476Amba1.2
MGIKHCCYILYFTLALVTLLQPVRSAEDVEEFLPSANETRRSLKACEAHNIIDKCWRCKADWANNRQALADCAQGFAKGTYGGKHGDVYTVTSDKDDDVANPKEGTLRFAAAQNRPLWIIFKRNMVIHLNQELVVNSDKTIDGRGVKVNIVNAGLTLMNVKNIIIHNINIHDIKVCPGGMIKSNDGPPILRQQSDGDAINVAGSSQIWIDHCSLSKASDGLLDITLGSSHVTVSNCKFTQHQFVLLLGADDTHYQDKGMLATVAFNMFTDHVDQRMPRCRFGFFQVVNNNYDRWGTYAIGGSSAPTILSQGNRFFAPDDIIKKNVLARTGTGNAESMSWNWRTDRDLLENGAIFLPSGSDPVLTPEQKAGMIPAEPGEAVLRLTSSAGVLSCHQGAPC
113475Amba1.1
MGIKHCCYILYFTLALVTLLQPVRSAEDLQEILPVNETRRLTTSGAYNIIDGCWRGKADWAENRKALADCAQGFGKGTVGGKDGDIYTVTSELDDDVANPKEGTLRFGAAQNRPLWIIFERDMVIRLDKEMVVNSDKTIDGRGAKVEIINAGFTLNGVKNVIIHNINMHDVKVNPGGLIKSNDGPAAPRAGSDGDAISISGSSQIWIDHCSLSKSVDGLVDAKLGTTRLTVSNSLFTQHQFVLLFGAGDENIEDRGMLATVAFNTFTDNVDQRMPRCRHGFFQVVNNNYDKWGSYAIGGSASPTILSQGNRFCAPDERSKKNVLGRHGEAAAESMKWNWRTNKDVLENGAIFVASGVDPVLTPEQSAGMIPAEPGESALSLTSSAGVLSCQPGAPC
雪松(cedar)序列
493634Cryj IB前體
MDSPCLVALLVFSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGSSTMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMNIKLKMPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLYLYGCSTSVLGNVLINESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLTSTGVTISNNLFFNHHKVMSLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGLVHVANNNYDPWTTYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPHLTQNAGVLTCSLSKRC
493632CryjIA前體
MDSPCLVALLVLSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGSSTMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPAPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMNIKLKMPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLHLYGCSTSVLGNVLNESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLSSTGVTISNNLFFNHHKVMLLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGLVHVANNNYDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPQLTKNAGVLTCSLSKRC
1076242Cryj II前體?日本柳杉(japanese cedar)
MAMKLIAPMAFLAMQLIIMAAAEDQSAQIMLDSVVEKYLRSNRSLRKVEHSRHDAINIFNVEKYGAVGDGKHDCTEAFSTAWQAACKNPSAMLLVPGSKKFVVNNLFFNGPCQPHFTFKVDGIIAAYQNPASWKNNRIWLQFAKLTGFTLMGKGVIDGQGKQWWAGQCKWVNGREICNDRDRPTAIKFDFSTGLIIQGLKLMNSPEFHLVFGNCEGVKIIGISITAPRDSPNTDGIDIFASKNFHLQKNTIGTGDDCVAIGTGSSNIVIEDLICGPGHGISIGSLGRENSRAEVSYVHVNGAKFIDTQNGLRIKTWQGGSGMASHIIYENVEMINSENPILINQFYCTSASACQNQRSAVQIQDVTYKNIRGTSATAAAIQLKCSDSMPCKDIKLSDISLKLTSGKIASCLNDNANGYFSGHVIPACKNLSPSAKRKESKSHKHPKTVMVENMRAYDKGNRTRILLGSRPPNCTNKCHGCSPCKAKLVIVHRIMPQEYYPQRWICSCHGKIYHP
1076241CryjII蛋白?日本柳杉
MAMKFIAPMAFVAMQLIIMAAAEDQSAQIMLDSDIEQYLRSNRSLRKVEHSRHDAINIFNVEKYGAVGDGKHDCTEAFSTAWQAACKKPSAMLLVPGNKKFVVNNLFFNGPCQPHFTFKVDGILAAYQNPASWKNNRIWLQFAKLTGFTLMGKGVIDGQGKQWWAGQCKWVNGREICNDRDRPTAIKFDFSTGLIIQGLKLMNSPEFHLVFGNCEGVKIIGISITAPRDSPNTDGIDIFASKNFHLQKNTIGTGDDCVAIGTGSSNIVIEDLICGPGHGISIGSLGRENSRAEVSYVHVNGAKFIDTQNGLRIKTWQGGSGMASHIIYENVEMINSENPILINQFYCTSASACQNQRSAVQIQDVTYKNIRGTSATAAAIQLKCSDSMPCKDIKLSDISLKLTSGKLASCLNDNANGYFSGHVIPACKNLSPSAKRKESKSHKHPKTVMVKNMGAYDKGNRTRILLGSRPPNCTNKCHGCSPCKAKLVIVHRIMPQEYYPQRWMCSRHGKIYHP
541803Cryj I前體?日本柳杉
MDSPCLVALLVLSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGSSTMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMNIKLKMPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLHLYGCSTSVLGNVLINESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLSSTGVTISNNLFFNHHKVMLLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGLVHVANNNYDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPQLTKNAGVLTCSLSKRC
541802Cryj I前體?日本柳杉
MDSPCLVALLVFSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGSSTMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPAPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMNIKLKMPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLYLYGCSTSVLGNVLINESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLTSTGVTISNNLFFNHHKVMSLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGLVHVANNNYDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCSNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPHLTQNAGVLTCSLSKRC

犬屬(canis)序列:
Can f1
MKTLLLTIGFSLLAILQAQDTPALGKDTVAVSGKWYLKAMTADQEVPEKPDSVTPMILKAQKGGNLEAKITMLTNGQCQNITVVLHKTSEPGKYTAYEGQRVVFIQPSPVRDHYILYCEGELHGRQIRMAKLLGRDPEQSQEALEDFREFSRAKGLNQEILELAQSETCSPGGQ
血清白蛋白片段
EAYKSEIAHRYNDLGEEHFRGLVL
血清白蛋白片段
LSSAKERFKCASLQKFGDRAFKAWSVARLSQRFPKADFAEISKVVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYMCENQDSISTKLKECCDKPVLEKSQCLAEVERDELPGDLPSLAADFVEDKEVCKNYQEAKDVFLGTFLYEYSRRHPEYSVSLLLRLAKEYEATLEKCCATDDPPTCYAKVLDEFKPLVDEPQNLVKTNCELFEKLGEYGFQNALLVRYTKKAPQVSTPTLVVEVSRKLGKVGTKCCKKPESERMSCADDFLS
Canf2
MQLLLLTVGLALICGLQAQEGNHEEPQGGLEELSGRWHSVALASNKSDLIKPWGHFRVFIHSMSAKDGNLHGDILIPQDGQCEKVSLTAFKTATSNKFDLEYWGHNDLYLAEVDPKSYLILYMINQYNDDTSLVAHLMVRDLSRQQDFLPAFESVCEDIGLHKDQIVVLSDDDRCQGSRD
另外的狗過敏原蛋白(NCBI entrez登記號):
1731859

馬屬(equus)序列:
1575778Equ c1
MKLLLLCLGLILVCAQQEENSDVAIRNFDISKISGEWYSIFLASDVKEKIEENGSMRVFVDVIRALDNSSLYAEYQTKVNGECTEFPMVFDKTEEDGVYSLNYDGYNVFRISEFENDEHIILYLVNFDKDRPFQLFEFYAREPDVSPEIKEEFVKIVQKRGIVKENIIDLTKIDRCFQLRGNGVAQA
3121755Equc2
SQXPQSETDYSQLSGEWNTIYGAASNLXK
塵螨(螨)
塵螨序列:
Eur m1(變體)
TYACSINSVSLPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVASTESAYLAYRNMSLDLAEQELVDCASQNGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVQEHYYPYVAREQSCHRPNAQRYGLKNYCQISPPDSNKIRQALTQTHTAVAVIIGIKDLNAFRHYDGRTIMQHDNGYQPNYHAVNIVGYGNTQGVDYWIVRNSWDTTWGDNGYGYFAANINL
Eur m1(變體)
TYACSINSVSLPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVASTESAYLAYRNMSLDLAEQELVDCASQNGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVQEHYYPYVAREQSCHRPNAQRYGLKNYCQISPPDSNKIRQALTQTHTAVAVIIGIKDLNAFRHYDGRTIMQHDNGYQPNYHAVNIVGYGNTQGVDYWIVRNSWDTTWGDNGYGYFAANINL
Eur m1(變體)
ETNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNANKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDL
Eur m1(變體)
ETSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVEERSYPYVAREQQCRRPNSQHYGISNYCQIYPPDVKQIREALTQTHTALAVIIGIKDLRAFQHYDGRTIIQHDNGYQPNYEAVNIVGYGSTQGVDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNL
早熟禾屬(poa)(草)序列
113562POLLEN ALLERGEN POA P9
MAVQKYTVALFLVALVVGPAASYAADLSYGAPATPAAPAAGYTPAAPAGAAPKATTDEQKMIEKINVGFKAAVAAAGGVPAANKYKTFVATFGAASNKAFAEALSTEPKGAAVDSSKAALTSKLDAAYKLAYKSAEGATPEAKYDDYVATLSEALRIIAGTLEVHGVKPAAEEVKATPAGELQVIDKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYQSYKFIPALEAAVKQSYAATVATAPAVKYTVFETALKKAITAMSQAQKAAKPAAAATGTATAAVGAATGAATAAAGGYKV
113561POA P9
MAVHQYTVALFLAVALVAGPAASYAADVGYGAPATLATPATPAAPAAGYTPAAPAGAAPKATTDEQKLIEKINAGFKAAVAAAAGVPAVDKYKTFVATFGTASNKAFAEALSTEPKGAAAASSNAVLTSKLDAAYKLAYKSAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAGEEVKAIPAGELQVIDKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYQSYKFIPALEAAVKQSYAATVATAPAVKYTVFETALKKAITAMSQAQKAAKPAAAVTATATGAVGAATGAVGAATGAATAAAGGYKTGAATPTAGGYKV
113560POA P9
MDKANGAYKTALKAASAVAPAEKFPVFQATFDKNLKEGLSGPDAVGFAKKLDAFIQTSYLSTKAAEPKEKFDLFVLSLTEVLRFMAGAVKAPPASKFpAKPAPKVAAYTPAAPAGAAPKATTDEQKLIEKINVGFKAAVAAAAGVPAASKYKTFVATFGAASNKAFAEALSTEPKGAAVASSKAVLTSKLDAAYKLAYKSAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHGVKPAAEEVKAIPAGELQVIDKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYQSYKFIPALEAAVKQSYAATVATAPAVKYTVFETALKKAITAMSQAQKAAKPAAAVTGTATSAVGAATGAATAAAGGYKV
蟑螂(cockroach)序列
2833325Crp1
MKTALVFAAVVAFVAARFPDHKDYKQLADKQFLAKQRDVLRLFHRVHQHNILNDQVEVGIPMTSKQTSATTVPPSGEAVHGVLQEGHARPRGEPFSVNYEKHREQAIMLYDLLYFANDYDTFYKTACWARDRVNEGMFMYSFSIAVFHRDDMQGVMLPPPYEVYPYLFVDHDVIHMAQKYWMKNAGSGEHHSHVIPVNFTLRTQDHLLAYFTSDVNLNAFNTYYRYYYPSWYNTTLYGHNIDRRGEQFYYTYKQIYARYFLERLSNDLPDVYPFYYSKPVKSAYNPNLRYHNGEEMPVRPSNMYVTNFDLYYIADIKNYEKRVEDAIDFGYAFDEHMKPHSLYHDVHGMEYLADMIEGNMDSPNFYFYGSIYHMYHSMIGHIVDPYHKMGLAPSLEHPETVLRDPVFYQLWKRVDHLFQKYKNRLPRYTHDELAFEGVKVENVDVGKLYTYFEQYDMSLDMAVYVNNVDQISNVDVQLAVRLNHKPFTYNIEVSSDKAQDVYVAVFLGPKYDYLGREYDLNDRRHYFVEMDRFPYHVGAGKTVIERNSHDSNIIAPERDSYRTFYKKVQEAYEGKSQYYVDKGHNYCGYPENLLIPKGKKGGQAYTFYVIVTPYVKQDEHDFEPYNYKAFSYCGVGSERKYPDNKPLGYPFDRKIYSNDFYTPNMYFKDVIIFHKKYDEVGVQGH
2231297Crp2
INEIHSIIGLPPFVPPSRRHARRGVGINGLIDDVIAILPVDELKALFQEKLETSPDFKALYDAIRSPEFQSIISTLNAMQRSEHHQNLRDKGVDVDHFIQLIRALFGLSRAARNLQDDLNDFLHSLEPISPRHRHGLPRQRRRSARVSAYLHADDFHKIITTIEALPEFANFYNFLKEHGLDVVDYINEIHSIIGLPPFVPPSRRHARRGVGINGLIDDVLAILPVDELKALFQEKLETSPDFKALYDAIRSPEFQSIISTLNAMPEYQELLQNLRDKGVDVDHFIRVDQGTLRTLSSGQRNLQDDLNDFLALIPTDQILAIAMDYLANDAEVQELVAYLQSDDFHKIITTIEALPEFANFYNFLKEHGLDVVDYINEIHSIIGLPPFVPPSQRHARRGVGINGLIDDVIAILPVDELKALFQEKLETSPDFKALYDAIDLRSSRA
1703445Bla g2
MIGLKLVTVLFAVATITHAAELQRVPLYKLVHVFINTQYAGITKIGNQNFLTVFDSTSCNVVVASQECVGGACVCPNLQKYEKLKPKYISDGNVQVKFFDTGSAVGRGIEDSLTISNLTTSQQDIVLADELSQEVCILSADVVVGLAAPGCPNALKGKTVLENFVEENLIAPVFSIHHARFQDGEHFGEIIFGGSDWKYVDGEFTYVPLVGDDSWKFRLDGVKIGDTTVAPAGTQAIIDTSKAIIVGPKAYVNPINEAIGCVVEKTTTRRICKLDCSKIPSLPDVTFVINGRNFNISSQYYIQQNGNLCYSGFQPCGHSDHFFIGDFFVDHYYSEFNWENKTMGFGRSVE
SV
1705483Bla g4
AVLALCATDTLANEDCFRHESLVPNLDYERFRGSWIIAAGTSEALTQYKCWIDRFSYDDALVSKYTDSQGKNRTTIRGRTKFEGNKFTIDYNDKGKAFSAPYSVLATDYENYAIVEGCPAAANGHVIYVQIRFSVRRFHPKLGDKEMIQHYTLDQVNQHKKAIEEDLKHFNLKYEDLHSTCH
2326190Bla g5
YKLTYCPVKALGEPIRFLLSYGEKDFEDYRFQEGDWPNLKPSMPFGKTPVLEIDGKQTHQSVAISRYLGKQFGLSGKDDWENLEIDMIVDTISDFRAAIANYHYDADENSKQKKWDPLKKETIPYYTKKFDEVVKANGGYLAAGKLTWADFYFVAILDYLNHMAKEDLVANQPNLKALREKVLGLPAIKAWVAKRPPTDL
另外的蟑螂序列(NCBI Entrez登記號):
2580504;1580797;1580794;1362590;544619;544618;15315104;1580792;1166573;1176397;21047849。
過敏原(一般的)序列:
NCBI登記號
2739154;3719257;3703107;3687326;3643813;3087805;1864024;1493836;1480457;25910476;25910474;1575778;763532;746485;163827;163823;3080761;163825;3608493;3581965;2253610;2231297;21047849;3409499;3409498;3409497;3409496;3409495;3409494;3409493;3409492;3409491;3409490;34094104;3409488;3409487;3409486;3409485;3409484;3409483;3409482;3409481;3409480;3409479;3409478;3409477;3409476;3409475;3409474;3409473;3409472;3409471;3409470;3409469;3409468;3409467;3409466;3409465;3409464;3409463;3409462;3409461;3409460;3409459;3409458;3409457;3409456;3318885;3396070;3367732;1916805;3337403;2851457;2851456;1351295;549187;136467;1173367;2499810;2498582;2498581;1346478;1171009;126608;114091;2506771;1706660;1169665;1169531;232086;4161048;114922;2497701;1703232;1703233;1703233;1703232;3287877;3122132;3182907;3121758;3121756;3121755;3121746;3121745;3319925;3319923;3319921;3319651;33187104;3318779;3309647;3309047;3309045;3309043;3309041;3309039;3288200;3288068;2924494;3256212;3256210;3243234;3210053;3210052;3210051;3210050;3210049;3210048;3210047;3210046;3210045;3210044;3210043;3210042;3210041;3210040;3210039;3210038;3210037;3210036;3210035;3210034;3210033;3210032;3210031;3210030;3210029;3210028;3210027;3210026;3210025;3210024;3210023;3210022;3210021;3210020;3210019;3210018;3210017;3210016;3210015;3210014;3210013;3210012;3210011;3210010;3210009;3210008;3210007;3210006;3210005;3210004;3210003;3210002;3210001;3210000;3209999;3201547;2781152;2392605;2392604;2781014;1942360;2554672;2392209;3114481;3114480;2981657;3183706;3152922;3135503;3135501;3135499;3135497;2414158;1321733;1321731;1321728;1321726;1321724;1321722;1321720;1321718;1321716;1321714;1321712;3095075;3062795;3062793;3062791;2266625;2266623;2182106;3044216;2154736;3021324;3004467;3005841;3005839;3004485;3004473;3004471;3004469;3004465;2440053;1805730;2970629;29591048;2935527;2935416;809536;730091;585279;584968;2498195;2833325;2498604;2498317;2498299;2493414;2498586;2498585;2498576;2497749;2493446;2493445;1513216;729944;2498099;548449;465054;465053;465052;548671;548670;548660;548658;548657;2832430;232084;2500822;2498118;2498119;2498119;2498118;1708296;1708793;416607;416608;416608;416607;2499791;2498580;2498579;2498578;2498577;2497750;1705483;1703445;1709542;1709545;17105104;1352699;1346568;1346323;1346322;2507248;|1352240;1352239;1352237;1352229;1351935;1350779;1346806;1346804;1346803;1170095;1168701;1352506;1171011;1171008;1171005;1171004;1171002;1171001;1168710;1168709;1168708;1168707;1168706;1168705;1168704;1168703;1168702;1168696;1168391;1168390;1168348;1173075;1173074;1173071;1169290;11610470;1168402;729764;729320;729979;729970;729315;730050;730049;730048;549194;549193;549192;549191;549190;5491104;549188;549185;549184;549183;549182;549181;549180;549179;464471;585290;416731;1169666;113478;113479;113477;113476;113475;130975;119656;113562;113561;113560;416610;126387;126386;126385;132270;416611;416612;416612;416611;730035;127205;1352238;125887;549186;137395;730036;133174;114090;131112;126949;129293;124757;129501;416636;2801531;2796177;2796175;2677826;2735118;2735116;2735114;2735112;2735110;2735108;2735106;2735104;2735102;2735100;2735098;2735096;2707295;2154730;2154728;1684720;2580504;2465137;2465135;2465133;2465131;2465129;2465127;2564228;2564226;2564224;2564222;2564220;2051993;1313972;1313970;1313968;1313966;2443824;2488684;2488683;2488682;2488681;2488680;2488679;2488678;2326190;2464905;2415702;2415700;2415698;2398759;2398757;2353266;2338288;1167836;414703;2276458;1684718;2293571;1580797;1580794;2245508;2245060;1261972;2190552;1881574;511953;1532058;1532056;1532054;1359436;666007;487661;217308;1731859;217306;217304;1545803;1514943;577696;516728;506858;493634;493632;2154734;2154732;543659;1086046;1086045;2147643;2147642;1086003;1086002;1086001;543675;543623;543509;543491;1364099;2147108;2147107;1364001;1085628;631913;631912;631911;2147092;477301;543482;345521;542131;542130;542129;100636;2146809;480443;2114497;2144915;72355;71728;319828;1082946;1082945;1082944;539716;539715;423193;423192;423191;423190;1079187;627190;6271104;627188;627187;482382;1362656;627186;627185;627182;482381;85299;85298;2133756;2133755;1079186;627181;321044;321043;112559;112558;1362590;2133564;1085122;10710471;627144;627143;627142;627141;280576;102835;102834;102833;102832;84703;84702;84700;84699;84698;84696;477888;477505;102575;102572;478272;2130094;629813;629812;542172;542168;542167;481432;320620;280414;626029;542132;320615;320614;100638;100637;100635;82449;320611;320610;280409;320607;320606;539051;539050;539049;539048;322803;280407;100501;100498;100497;100496;1362137;1362136;1362135;1362134;1362133;1362132;1362131;1362130;1362129;1362128;100478;21291041;1076531;1362049;1076486;2129817;2129816;2129815;2129814;2129813;2129812;2129805;2129804;2129802;2129801;2129800;2129799;479902;479901;2129477;1076247;629480;1076242;1076241;541803;541802;280372;280371;1361968;1361967;1361966;1361965;1361964;1361963;1361962;1361961;1361960;1361959;320546;2119763;543622;541804;478825;478824;478823;421788;320545;81444;626037;6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特別優選的過敏原/抗原包括:貓皮屑蛋白Fel d1;房塵螨蛋白Der P1、Der P2和Der P7;豕草蛋白amb a1.1、a1.2、a1.3或a1.4;黑麥草蛋白lolp1和lol p5;梯牧草蛋白phl p1和phl p5;百慕大草蛋白Cyn d5;交鏈孢霉(Altemaria alternate)蛋白Alt a1、Alt a2和烯醇酶(Alt a6);樺樹蛋白Bet v1和P14;德國蟑螂蛋白Bla g1、Bla g2、Bla g3、Bla g4、Bla g5和Bla g6;艾蒿(mugwort)蛋白Art v1;俄國薊(russian thistle)蛋白Sal k1和Sal k2;花生Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h4、Ara h5、Ara h6、植物抑制蛋白或脂轉移蛋白或人類白細胞抗原。
遞送方法
配制之后,可使用多種已知途徑和技術將本發明的組合物在體內遞送到受治療者。例如,可作為注射溶液、懸液或乳液提供組合物,并使用常規針頭和注射器或使用液體噴射注射系統通過腸胃外、皮下、表皮、皮內、肌內、動脈內、腹膜內、靜脈內注射施用。組合物還可局部施用于皮膚或粘膜組織,諸如鼻內、氣管內、腸內、直腸或陰道,或作為適于呼吸道或肺部施用的細碎的噴霧而被提供。其它施用方式包括口服施用、栓劑、舌下施用、主動或被動的經皮遞送技術。
當將施用本發明的肽時,優選地將肽施用到身體中的部位,在那里該肽將具有接觸合適的抗原呈遞細胞的能力,并且在那里該肽將具有接觸個體的T細胞的能力。當將施用APC時,優選地將APC施用到身體中的部位,在那里APC將具有接觸并活化個體的合適的T細胞的能力。
遞送方案
可通過上述任何合適的方法施用肽/多核苷酸/細胞(諸如包含多種肽的組合物)。可由經驗確定肽的合適量,但其通常是在以下提供的范圍中。單次施用每種肽可足以對患者產生有益的作用,但將理解的是,如果肽施用多于一次那么它可能是有益的,在這種情況下典型的施用方案可以是,例如,每6個月中每周一次或兩次持續2?4周,或每四到六個月中每天一次持續一周。將被理解的是,每種肽或多核苷酸或者肽和/或多核苷酸的組合可被單獨或組合地施用于患者。
用于施用的劑量將取決于若干因素,包括組合物的性質、施用途徑和施用方案的時間表和時間安排。本發明的分子的合適劑量可以在每次施用中多達15μg、多達20μg、多達25μg、多達30μg、多達50μg、多達100μg、多達500μg或更多的量級。合適的劑量可少于15μg,但至少1ng、或至少2ng、或至少5ng、或至少50ng、或至少100ng、或至少500ng、或至少1μg、或至少10μg。對于本發明的一些分子,使用的劑量可更高,例如,多達1mg、多達2mg、多達3mg、多達4mg、多達5mg或更高。這樣的劑量可以以液態制劑提供,其濃度適于允許由所選途徑施用適當體積。
試劑盒
本發明還涉及本文所述的適于用于本發明的治療的成分的組合,其以試劑盒的形式被包裝在容器中。這樣的試劑盒可包括允許本發明的治療的一系列成分。例如,試劑盒可包括本發明的一種或多種不同肽、多核苷酸和/或細胞,或本發明的一種或多種肽、多核苷酸或細胞和適于同時施用或者用于順序或分別施用的一種或多種另外的治療劑。試劑盒可任選地包含其它合適的試劑或說明書和類似物。
本發明由以下實施例闡釋:
實施例1
II類MHC結合搜索
本研究的目的是為了鑒定對七種最常見的人類II類MHC HLA?DRB1*同種異型(覆蓋普通白種人群體中發現的同種異型的總共約63%)具有強親和力的一組獨特的肽。為了鑒定房塵螨(HDM)過敏原Der p1、Der p2和Der p7中的結合肽,對來自這些過敏原性蛋白的一亞組的肽進行體外結合測定。結合測定中用于測試的肽最初由稱作“肽穿線(peptide threading)”的計算機方法來鑒定(由Biovation,Ltd.,Aberdeen,Scotland,UK進行)。這是對來自一條序列的連續肽被II類MHC HLA?DR分子的結合溝容納的潛力的生物信息學分析。預先篩選這一亞組的肽在酸性水環境中的溶解度,并最終選擇具有44條肽的組用于體外II類MHC結合測定中的測試。
方法
采用的測定是競爭性II類MHC結合測定,其中分析每種肽代替來自所研究的每種人類II類MHC同種異型的已知對照結合物的能力。本研究中使用的同種異型和對照肽顯示在表2中:
同種異型對照肽序列DRB1*0101流感血凝素307?319PKYVKQNTLKLATDRB1*0301結核分支桿菌/麻風桿菌hsp652?16AKTIAYDEEARRGLEDRB1*0401流感血凝素307?319PKYVKQNTLKLATDRB1*0701流感血凝素307?319PKYVKQNTLKLATDRB1*1101流感血凝素307?319PKYVKQNTLKLATDRB1*1301HLA?DQB1*060321?36TERVRLVTRHIYNREEDRB1*1501人類髓磷脂堿性蛋白85?99ENPVVHFFKNIVTPRDQB1*0602人類胰島素B1?15FVNQHLCGSHLVEAL
表2.用在體外結合測定中的對照肽
在競爭測定中分析了每種44HDM肽(其被顯示在表3A和3B中)并篩選了與對照肽相比的相對結合。由于競爭性測定的性質,每種肽的數據被表示為其自身的IC50與對照肽的IC50的比值。因此,具有與對照肽類似的IC50值的肽具有相同的結合親和力,而具有少于1的比值的肽具有較高的親和力,而具有大于1的比值的肽具有較低的親和力。
結果
在水溶液中的溶解度是肽作為有效治療劑的基本標準。因此,作為溶解度篩選結果,我們將排除在多個結合記錄(binding registers)中具有高頻率的大疏水氨基酸殘基的非常疏水的肽。這是雜亂的HLA?DRB1*結合物的特征。結合測定的數據顯示在表3B中。顯示了每種肽對研究中的每種同種異型的相對結合。數據顯示,被測試的44種肽中的24種結合到一種或多種II類MHC同種異型。觀察到一定范圍的交叉反應性,即5種肽僅結合一種同種異型,8種肽結合兩種同種異型,9種肽結合三種同種異型,以及兩種肽結合四種不同的II類MHC同種異型(紅色)。還預期這樣的肽將具有對未經由MHC結構的同源性進行測試的相似同種異型結合的能力。這可以在這里若干情況下肽對DRB1*0101、*0401、*0701和*1101的交叉反應性中觀察到。還顯示了最高濃度的肽在結合測定的水溶液中的溶解度狀況。數值表示觀察到不溶白色沉淀的最低濃度。在測定中看上去不存在沉淀形成的顯著的非特異性作用。在高濃度下沉淀的幾種肽還結合于II類MHC;然而,幾種肽還未顯示與對照肽競爭的能力。因為存在許多疏水殘基,預期容易形成沉淀的肽可表現高親和力和雜亂的結合。
肽的%純度被表示在表3A中。這是有意義的,因為觀察到純度從60?90%變化。如果肽相對不純,這將對肽競爭的能力有相當大的影響。例如,HDM23A和HDM32顯示低親和力的結合;然而,與其它HDM肽相比它們具有降低的純度(分別為66.7%和68.7%)。因此,如果考慮到純度,它們實際上可具有與較高純度的肽相等的親和力。
可觀察到,一些II類MHC同種異型比其它結合更多肽;這是很可能預料到的,因為不同II類MHC結合溝中的袋位置之間有差異性。然而,各種對照肽的親和力之間還存在若干充分表征的差異。顯然,高親和力的對照肽將更難被競爭性HDM肽代替,導致更少結合肽的鑒定。這可以由本文呈現的數據闡釋。例如,根據同種異型,流感血凝素307?319對照肽具有不同親和力,其中DRB1*0101>*0401>*0701>*1101。這反映在每種同種異型的結合物數目上,其中DRB1*0101具有最低數目的結合物(5個)而DRB1*1101具有最高數目(14個)。此外,對DRB1*1501的結合測定是非常嚴格的,這是由于髓磷脂堿性蛋白85?99對這種同種異型的高親和力。在高嚴格性篩選中,在此前的研究中被測試的Fel d1肽EQVAQYKALPWLENA給出了0.97的比值,這表示可在這種嚴格性下鑒定高親和力結合物。
此外,為了鑒定較低親和力的結合物,還在較不嚴格的條件下進行測定。觀察到所有Der p結合肽在針對該同種異型被測試時具有高比值,這顯示與對照肽相比它們是低親和力的結合物。DQA1*0102/DQB1*0602結合測定使用來自人類胰島素的B鏈的肽,其與DR測定中使用的那些相比具有較低的親和力。這表示DQ測定是非常敏感的,而且對該II類MHC同種異型的最強結合物趨于產生非常低的比值。這種敏感性還是所篩選的組中DQ結合肽的相對較高數目的原因。最終,在進一步分析時,發現被鑒定為DRB1*0101、*0401、*0701超家族的配體的肽包括對這一同種異型家族的雜亂結合物特有的基序,其中:P1=Y、F、W、L、I、V或M(大的芳香族或疏水殘基),P6=S、T、C、A、P、V、I、M(小的、不帶電荷的殘基)。鑒定為這3種同種異型的所有或組合的結合物的16種肽(如,HDM21B RGKPFQLEAVFEANQNT)中,14(87.5%)種包含這種基序,這說明這些是對1?4?7同種異型具有一定范圍親和力的雜亂結合物。
結論
已顯示一系列的肽具有結合被檢測的II類MHC同種異型的能力,并可測試其刺激CD4+T細胞體外增殖和刺激T細胞分泌細胞因子的能力。
表3A





實施例2
同源性搜索
如上鑒定為II類MHC?結合的24種肽中的每種的序列被用來探測衍生親本序列的塵螨過敏原組中可選蛋白的序列。例如,表3A中的肽HDM01來自Der p1,因此HDM01的序列被用來探測Der f1中的同源性序列。對如上鑒定的所有24種肽進行相同操作。實施例1和實施例2中鑒定的肽被顯示在表4至6中。
表4

表5


表6



在表4中,衍生“親本中的殘基”位置的Der p1的序列是公眾可獲得的序列,其NCBI登記號是P08176。Der p2(表5)和Der p7(表6)的相應序列分別是NCBI登記號P49278和P49273。Der f1的序列從NCBI登記號P16311獲取,Der f2的序列從NCBI登記號Q00855獲取,Der f7的序列從NCBI登記號Q26456獲取。
實施例3
II類MHC結合搜索
本研究的目的是為了鑒定對七種最常見的人類II類MHCHLA?DRB1*同種異型(覆蓋普通白種人群體中發現的同種異型的總共約63%)具有強親和力的一組獨特的肽。為了鑒定主要的房塵螨過敏原Der p1、Der p2和Der p7中的結合肽。使用市場上可獲得的EpiMatrix算法(EpiVax Inc.)通過稱作“肽穿線”的計算機方法對肽進行鑒定。這是對來自一條序列的肽被II類MHC HLA?DR分子的結合溝容納的潛力的生物信息學分析。EpiMatrix是一種基于矩陣的算法,其將長為10個氨基酸的區段進行排序,通過結合于所選擇的每種MHC分子的估計概率而將來自任何多肽序列的9個氨基酸進行重疊。(De Groot等人,AIDS Research and Human Retroviruses13:539?41(1997))。建立矩陣基序的程序被發表在Schafer等人,16Vaccine(疫苗)1998(1998)中。在該實施例中,評價了對HLADR1、DR2、DR3、DR4、DR7、DR8、DR11、DR13和DR15的結合潛力。通過對蛋白序列中每個10聚體框架評分來選擇推定的MHC配體。通過將10聚體的序列與已知結合每種MHC等位基因的10個氨基酸序列的矩陣進行比較來得出這一分數。回顧性研究已證明,EpiMatrix準確地預測了所發表的MHC配體(Jesdale等人,在Vaccines(疫苗)’97中(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1997))。還已證實對結合多種MHC分子的肽的成功預測。
由EpiMatrix如下計算對所選的MHC分子結合的估計概率。通過對與指定MHC等位基因的已知MHC結合物相比之下每個氨基酸對結合的相對促進或抑制進行估計來對肽評分。將橫跨該肽的該信息加和,并將匯總分數(EMX分數)指定給整個肽。在比較EMX分數與已知MHC配體的分數后,EpiMatrix得到“估計結合概率”(縮寫為EBP,但并不嚴格地是概率)。EBP描述具有與將結合指定MHC分子的肽一樣高或更高的EpiMatrix分數的肽的比例。EBP從100%(非常可能結合)變化到少于1%(非常不可能結合)。
對NCBI數據庫中公開的Der p1(NCBI登記號:P08176)的完整序列進行EpiMatrix分析。該分析鑒定了核心肽(和其側翼序列),其衍生自以上被預測為具有良好II類MHC結合的序列。這些序列顯示在下面的表7A中。表7B和7C分別顯示用于等價分析Der p2和Der p7(NCBI登記號P49278和P49273)的已知序列的序列。
表7A?C中:“序列中的殘基”提供被分析的序列中肽的位置。核心肽(中間的粗體氨基酸)界定分析中所鑒定的實際結合序列。包括了穩定化側翼(N?末端和C?末端,非粗體)以與核心序列一起使用,而且通常需要所述穩定化側翼來幫助制造肽。“擊中數(number of hits)”是指序列中預測的對被測試的所有MHC類型的高結合親和力的數目。“EpiMatrix串分數”衍生自對串長度標準化的擊中數。因此串分數是預測的總MHC結合性質相對于隨機肽標準物的過量或不足。10或更高的分數被認為是表示寬的MHC結合性質。Epivax還分析了包含表位的肽的疏水性。大于1的分數被認為不適于施用和/或制造。
表7A?Der p1


表7B?Der p2

表7C?Der p7

實施例4
用于進一步測試的肽的選擇
基于實施例1至3中鑒定的肽和表位,發明人選擇表8中所示的肽用于進一步測試。所選擇的一些肽可被認為是實施例1至3的肽的變體,但也被認為是本發明的肽。特別地,表8中粗體的殘基表示對親本蛋白天然序列中相應殘基的改變。這些改變減少肽二聚體的形成并增進溶解度而不減少肽作為T細胞表位的功能性。所顯示的改變是如所示地用絲氨酸(S)或5?氨基丁酸(Б),或者胱氨酸代替天然序列中的半胱氨酸(C)。
另外,當與實施例1至3的肽序列相比時,一些序列可包括衍生它們的親本蛋白的更多或更少的殘基。因此,可認為這樣的序列代表實施例1至3的肽的截短變體或延伸變體。例如,肽HDM03F對應于Der p1的殘基149?165。HDM03E對應殘基149?167。因此,可認為HDM03F是HDM03E的截短變體,其是通過除去HDM03E的N末端2個殘基而形成的。表8中的“親本中的殘基”位置是指表4至7中所用的Der p1、Der p2和Der p7的序列。表8中表示的具有N末端谷氨酸(E)殘基例如HDM03K、L、V和W的那些肽中,谷氨酸可被焦谷氨酸代替以改進制造過程中的穩定性而不影響肽的功能。通常使用其中已發生這樣的替換的肽來獲得來自對這些肽的進一步測試的數據(實施例5)。
表8


實施例5
細胞因子釋放測淀和肽組合的選擇
使用實施例3的肽來分析PBMC響應于肽刺激的細胞因子分泌概況。使用ELISA測定來測試來自細胞因子釋放測定的上清液中2種細胞因子IFN?γ和IL?13的存在。使用所示的肽來分析PBMC響應于肽刺激的細胞因子分泌概況。使用ELISA測定或多重微珠陣列測定來測試來自細胞因子釋放測定的上清液中2種細胞因子IFN?γ和IL?13的存在。
典型的細胞因子釋放測定需要每個受治療者的40×106個PBMC。更詳細地,將250μl的具有適當抗原或肽濃度的200μg/ml溶液分配到48孔板的適當孔中。將板在37℃下加濕的5%CO2培養箱中孵化最多4小時。隨后向每孔添加250μl的5×106個細胞/ml的PBMC懸液,并將板送回培養箱孵化5天。刺激后,收集培養上清液的樣品以根據標準實驗方案通過ELISA或多重微珠測定來測試。
Il?13和IFN?γ對每種肽的響應被評分為陽性T細胞表位,條件是該肽的孔中產生的細胞因子的量超過100pg/ml,即,100pg/1.25×106個細胞。因此,如果來自某個體的細胞產生超過100pg/ml的Il?13或IFN?γ響應,則認為該個體對肽響應。對每種肽的響應者的百分比顯示在圖2中。
具有超過100pg/ml的Il?13或IFN?γ響應的個體的百分比的前五種肽是HDM203B、HDM201、HDM205、HDM203A和HDM202(SEQ ID NO.83、80、85、82和81)。
HDM203A和203B是與被修飾以使絲氨酸代替半胱氨酸(在C末端的第三個殘基)而實現更好的可制造性和穩定性的203B具有相同序列的變體。因此,肽的優選組合應該包括這些肽或其變體的至少一種。
接下來最有效的肽是HDM09A、HDM03D、HDM03E、HDM101、HDM101A、HDM101B(SEQ ID NO:5、51、52、72、73和74)。優選的肽組合通常可包括選自該組的至少一種另外的肽。該組中HDM03D和HDM03E是彼此的序列變體,其中絲氨酸和氨基丁酸(分別地)代替半胱氨酸(在Der p1天然序列C末端的第五個殘基)以實現更好的可制造性和穩定性。這些序列被認為是等價的。
還認為HDM03的另外變體,即HDM03V和HDM03W(SEQ ID NO.100和101)是合適的。這些變體是包含直到HDM03D的最后11個或10個(分別地)C末端殘基為止的截短的片段。這些肽不包括在上述測定中,但在測試時被認為至少與HDM03D等價(數據未顯示)。
HDM101、HDM101A和HDM101B也是彼此的序列變體,其中HDM101A以絲氨酸而HDM101B以氨基丁酸來代替HDM101中的半胱氨酸(從N末端數的第三個殘基)。所有三種HDM101系列肽被認為是等價的,其中HDM101A或HDM101B因可制造性和穩定性而被優選。
在被測試的其余肽中,下列的在被測試的個體的>25%中具有響應:HDM01[Der p1]、HDM01A[Der p1]、HDM06A[Der p2]、HDM07[Der p1]、HDM19A[Der p2]、HDM21A[Der p2]、HDM23C[Der p2]、HDM26B[Der p2]、HDM35A[Der p7]、HDM48[Der p7]、HDM51A[Der f7]、HDM102A[Der p1]、HDM204[Der p1]和HDM206[Der p1](分別為SEQ ID NO.1、48、54、56、57、9、62、63、65、21、24、76、84和86)。優選的肽組合通常可包括選自該組的至少一種另外的肽。在考慮向混合物中加入哪種另外的肽時,這最后一組的代表應優選地選自取自Der p2和Der p7的表位,因為之前的組主要是Der p1。HDM26B[Der p2]和HDM35A[Der p7]是特別優選的。另外的研究(數據未顯示)證明,這些是分別來自Der p2和Der p7的表現最佳的肽。
圖3顯示對HDM201、HDM202、HDM203B和HDM205的核心混合物響應的個體數目。還顯示了加入HDM03D和HDM101A的增量作用,和加入HDM26B和HDM35A的進一步的增量作用。清楚地顯示了加入來自第二組和第三組肽的表位的益處。
重要地,向核心混合物加入肽03D、26B、35A、101A將4個個體從非響應者轉變為響應者。還明顯的是,從混合物除去肽201、202、203B或205中的一種將不減少針對所提出的混合物的總響應者的數目,因為大多數人對這一組肽具有三種或四種響應。這在圖4中被證明,其對HDM201、HDM203B和HDM205的核心混合物顯示相似的結果。

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