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脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球及其應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310254150.0

申請日:

2013.06.24

公開號:

CN103383397B

公開日:

2014.12.24

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 33/68申請日:20130624|||公開
IPC分類號: G01N33/68; A23L3/3526 主分類號: G01N33/68
申請人: 西北農林科技大學
發明人: 岳田利; 王周利; 袁亞宏; 蔡瑞; 牛晨; 郭彩霞
地址: 712100 陜西省西安市楊凌示范區邰城路3號
優先權:
專利代理機構: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216 代理人: 史玫
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310254150.0

授權公告號:

103383397B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.24|||2013.12.04|||2013.11.06

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球及其應用,所公開的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球是用胺基化磁性微球包被氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體而得到的;所述氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的制備方法包括:利用高碘酸鈉的PBS溶液對脂環酸芽孢桿菌特異性抗體進行氧化處理,之后收集獲得氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體。利用上述公開的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球可對果汁尤其是蘋果汁中的脂環酸芽孢桿菌進行有效分離。

權利要求書

權利要求書
1.  脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球,其特征在于,該脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球是用胺基化磁性微球包被氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體而得到的;所述氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的制備方法包括:利用含過硫酸鈉的PBS緩沖液對脂環酸芽孢桿菌特異性抗體進行氧化處理,之后收集獲得氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體。

2.  如權利要求1所述的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球,其特征在于,采用Sephadex G-25層析柱收集獲得氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體。

3.  如權利要求1所述的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球,其特征在于,所述氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體制備方法還包括:
所述含過硫酸鈉的PBS緩沖液中過硫酸鈉濃度為10mg/mL,PBS緩沖液的濃度為0.1mol/L、pH值為7.4;
所述脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的濃度為(1-3mg)/mL;所述含過硫酸鈉的PBS緩沖液與脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的體積比為(1-3):1。

4.  如權利要求1所述的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球,其特征在于,所述胺基化磁性微球的制備方法包括:
(1)80-90℃條件下,Fe3O4磁核在硅酸鈉溶液中進行硅烷化反應制備硅烷化磁性微球;所述硅酸鈉溶液的質量濃度為4%-5%、PH大于11;
(2)調節硅烷化磁性微球的PH呈中性;
(3)80-90℃條件下,將PH呈中性的硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基 三乙氧基硅烷、去離子水和甘油混合反應制備胺基化磁性微球;所述硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷、去離子水和甘油的用量為:
硅烷化磁性微球:        (1-2g)/毫升
甲醇:                   150體積,
3-氨丙基三乙氧基硅烷:   10體積,
去離子水:               1體積,
甘油:                   150-161體積。

5.  如權利要求4所述的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球,其特征在于,所述的Fe3O4磁核的粒徑為15-25nm、磁性的飽和磁化強度為(40-80emu)/g。

6.  如權利要求4所述的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球,其特征在于,所述氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的濃度為(1-2mg)/毫升,且每毫升氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體用20mg的胺基化磁性微球包被。

7.  如權利要求1至6任一權利要求所述的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球,其特征在于,利用封閉液封閉所述的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球,所述封閉液的組分量為:每100ml濃度為0.01mol/L的PBS緩沖液中含有1-10克BSA和0.05ml Tween-20。

8.  如權利要求1至6中任一權利要求所述的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球用于分離果汁中的脂環酸芽孢桿菌的應用。

9.  如權利要求7所述的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球用于分離果汁中的脂環酸芽孢桿菌的應用。

10.  如權利要求8或9所述的應用,其特征在于,所述果汁的可溶性固形物含量≤15°Brix。

說明書

說明書脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球及其應用
技術領域
本發明屬于食品微生物檢測技術領域,具體涉及脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球及其應用。
背景技術
脂環酸芽孢桿菌,俗稱嗜酸耐熱菌,屬于革蘭氏陽性芽孢桿菌,桿狀、產芽孢、嚴格需氧,可以在pH2.5~6.0,20~60℃廣泛溫度范圍內存活和生長,是蘋果及其他果汁中常見的污染菌。由于其具有耐熱、耐酸的特性,普通的巴氏殺菌難以將其殺滅。該菌在濃縮果汁中不繁殖,但濃縮果汁稀釋成低濃度果汁時,即可代謝產生具有不愉快風味的物質——愈創木酚和2,6-二溴苯酚,使果汁口感、風味變差,形成白色沉淀或霧狀渾濁,使蘋果汁品質下降。因此,濃縮蘋果汁中脂環酸芽孢桿菌的快速檢測及控制技術已成為食品工業研究的熱點。
目前,對于蘋果汁中脂環酸芽孢桿菌的控制技術,研究較多的有高溫殺滅,歐姆加熱法,脈沖電場殺菌,紫外線照射,輻照,超聲波及超高壓殺滅等。在濃縮蘋果汁工業化生產過程中對于脂環酸芽孢桿菌的控制,主要是高溫瞬時滅菌和膜過濾。高溫處理會對果汁的風味產生一定的影響,而膜過濾方法由于成本高,且使用一定時間后過濾效果下降,需要根據過濾效果周期性的更換濾膜,導致了生產成本的增加。
發明內容
本發明的目的之一是提供脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球,以實現食品中脂環酸芽孢桿菌的快速分離。
為此,本發明提供的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球是用胺基化磁性微球包被氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體而得到的;所述氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的制備方法包括:利用含過硫酸鈉的PBS緩沖液對脂環酸芽孢桿菌特異性抗體進行氧化處理,之后收集獲得氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體。
采用Sephadex G-25層析柱收集獲得氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體。
所述氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體制備方法還包括:
所述含過硫酸鈉的PBS緩沖液中過硫酸鈉濃度為10mg/mL,PBS緩沖液的濃度為0.1mol/L、pH值為7.4;
所述脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的濃度為(1-3mg)/mL;所述含過硫酸鈉的PBS緩沖液與脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的體積比為(1-3):1。
所述胺基化磁性微球的制備方法包括:
(1)80-90℃條件下,Fe3O4磁核在硅酸鈉溶液中進行硅烷化反應制備硅烷化磁性微球;所述硅酸鈉溶液的質量濃度為4%-5%、PH大于11;
(2)調節硅烷化磁性微球的PH呈中性;
(3)80-90℃條件下,將PH呈中性的硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷、去離子水和甘油混合反應制備胺基化磁性微球;所述硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷、去離子水和甘油的用量為:
硅烷化磁性微球:            (1-2g)/毫升
甲醇:                       150體積,
3-氨丙基三乙氧基硅烷:       10體積,
去離子水:                   1體積,
甘油:                       150-161體積。
所述的Fe3O4磁核的粒徑為15-25nm、磁性的飽和磁化強度為在(40-80 emu)/g。
所述氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的濃度為(1-2mg)/毫升,且每毫升氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體用20mg的胺基化磁性微球包被。
進一步地,利用封閉液封閉所述的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球,所述封閉液的組分量為:每100ml PBS中含有1-10克BSA和0.05ml Tween-20。
本發明提供脂環酸芽孢桿菌的免疫磁微球優點在于:
(1)本發明中的胺基化磁性微球具有特異性結合位點,可以實現對抗體的高效及特異性固定化,有效保留了抗體-抗原反應結合位點。
(2)本發明的脂環酸芽孢桿菌特異性抗體氧化處理方法中抗體的Fc區域的糖鏈羥基部分被氧化為醛基,且保留了抗體的識別位點;處理后的抗體可與磁性微球的胺基部分高效結合,并保留了抗體的Fab活性區域,保證對目標菌體的有效識別和分離。
(3)本發明的制備方法中抗體有效結合到磁性微球表面,并保留了對脂環酸芽孢桿菌高度特異性分離和富集特性。尤其是經封閉處理后的免疫磁性微球可實現脂環酸芽孢桿菌的有效分離。
(4)采用本發明的胺基化磁性微球的制備方法制備的胺基化磁性微球的粒徑為45-55nm、磁性的飽和磁化強為(40-60emu)/g。
本發明的另一目的是將上述脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球用于分離果汁中的脂環酸芽孢桿菌的應用。
所述的果汁中的可溶性固形物含量≤15°Brix。
利用本發明的脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球分離果汁中的脂環酸芽孢桿菌時,無需特殊試劑和樣品前處理,即可實現檢測樣品中目標菌體的分離和富集,且速度快、成本低、效果好。
附圖說明
圖1為磁性微球的APTES胺基化改性及制備圖;
圖2為免疫磁性微球的制備流程圖;
圖3為不同濃度BSA封閉對免疫磁性微球特異性吸附影響(以Fe3O4磁核吸附抗體獲得的免疫磁珠為對照),該圖的橫坐標為:封閉液中BSA的質量濃度,縱坐標為菌體分離率;
圖4為不同濃度脂環酸芽孢桿菌標準菌株免疫磁分離效果圖,該圖的橫坐標為菌體濃度,縱坐標為菌體分離率。
具體實施方式
利用免疫磁性微球對食品中相應菌體分離與富集的原理是在分離過程中,特異性抗體與目標抗原結合形成抗原-微球復合物,在磁力作用下,該復合物發生力學移動,從而達到抗原分離與富集的目的。
結合圖1和圖2,本發明對脂環酸芽孢桿菌特異性抗體進行氧化處理,將抗體可結晶段(Fc區域)糖鏈部分轉化成醛基,并以APTES胺基化處理的磁性微球為載體,實現了脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的定向固定化。通過這種方式,可以使抗體與磁性微球的結合位點遠離抗原結合區,從而最大程度保留了抗體的活性位點。
本發明使用的脂環酸芽孢桿菌特異性抗體為文獻Zhouli Wang,Tianli Yue,Yahong Yuan,et al.Development of Polyclonal Antibody-Based Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Alicyclobacillus Strains in Apple Juice.Journal of food science,2012,77:M643-M649中公開的脂環酸芽孢桿菌特異性抗體。具體是將脂環酸芽孢桿菌標準菌株活化,搖瓶培養,取培養18~24h的新鮮菌液,充分、離心后倒掉上清液,加入適量生理鹽水,使菌 體重新懸浮,最后調整菌液濃度為108CFU/mL-109CFU/mL,滅活,得到免疫原。對免疫原乳化后按照多點注射法對兔子進行免疫,以7天為周期,采血,用ELISA測定獲得血清的效價。待抗體效價達到要求后,采血、純化、分裝,最終獲得脂環酸芽孢桿菌特異性抗體。
本發明中所述及的抗體均指的是脂環酸芽孢桿菌特異性抗體。
以下是發明人提供的實施例及相關效果試驗,以對本發明的技術方案作進一步解釋說明。
以下實施例中所用的菌株及試劑:
Alicyclobacillus acidoterrestris(DSM-3922)、Alicyclobacillus acidoterrestris (DSM-2498)、Alicyclobacillus pomorum(DSM-14955)、Alicyclobacillus fastidiosus(DSM-17978)和Alicyclobacillus acidiphilus(DSM-14558)購于德國微生物菌種保藏中心;Saccharomyces cerevisiae(CICC-1027)、Bacillus subtilis(CICC-10034)、Enterobacter cloacae(CICC-10017)購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。
質量濃度為36.5%的鹽酸。
以下實施例中采用投射電鏡掃描檢測Fe3O4磁核或胺基化磁性微球的粒徑;采用振動試樣磁力計測定Fe3O4磁核或胺基化磁性微球的磁性的飽和磁化強度。
實施例1:
(1)磁性微球的硅烷化反應
將9.5g硅酸鈉溶解于200mL去離子水中并用鹽酸調整pH值為12-13,向硅酸鈉溶液中加入5g Fe3O4磁核超聲處理30min,在80-90℃水浴條件下用鹽酸調整反應體系pH值為6-7,磁性分離獲得微球并水洗得pH呈中性的硅烷 化磁性微球;
(2)磁性微球的胺基化改性
2克硅烷化磁性微球懸浮液、1mL去離子水和10mL APTES加入150mL甲醇中,超聲處理30min后加入150mL甘油,85-90℃充分反應3h,磁性分離獲得微球,并用甲醇和去離子水分別洗滌三次,冷凍干燥,獲得胺基化磁性微球,并且經檢測得該胺基化磁性微球的粒徑為45-55nm、磁性的飽和磁化強為46.82emu/g;
(3)脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的氧化處理
將1mL濃度為2mg/mL的脂環酸芽孢桿菌特異性抗體溶液加入2ml含有20mg過硫酸鈉的PBS緩沖液中(PBS的濃度為0.1mol/L,pH值7.4),37℃條件下反應30min;氧化反應結束后,采用Sephadex G-25層析柱過濾、除鹽并分離得到氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體,液體流速為0.5mL/min;
(4)脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球的制備:
將制備獲得的2mg胺基化磁性微球與100μL濃度為2mg/mL的氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體于37℃條件下120-180rpm攪拌反應30min,磁性分離并洗滌,得到包被抗體的免疫磁性微球。
實施例2:
該實施例與實施例1不同之處在于,該實施例中所用的Fe3O4磁核是采用下述方法制備的:
將3.4g的FeCl3·6H2O與1.2g的FeCl2·4H2O加入到800mL去離子水中,并加入4g PEG-4000,在氮氣保護下充分攪拌溶解,逐滴加入氨水溶液使反應體系pH大于10;之后反應體系在75-85℃水浴中充分熟化20-40min,磁性分離獲得微球并水洗獲得Fe3O4磁核;經檢測得該Fe3O4磁核粒徑為15-25nm、 磁性的飽和磁化強度為72.18emu/g。
實施例3:
該實施例與實施例1不同之處在于:該實施例的免疫磁性微球經封閉液封閉處理:以每100ml PBS中含有5g BSA和0.05ml Tween-20的混合體系為封閉液,加入吸附抗體的免疫磁性微球于37℃條件下作用60min,然后磁性分離并充分洗滌后得到封閉處理后的免疫磁性微球。
一、利用實施例3制備的免疫磁性微球對脂環酸芽孢桿菌進行分離:
具體操作步驟為:配制表1中所示的濃度梯度樣品各10mL,每個樣品中加入20mg免疫磁性微球進行目標菌體的分離去除:120-180rpm、反應吸附時間60min;磁性分離吸附菌體的免疫磁性微珠,無菌水洗滌免疫磁性微珠并懸浮于200μL PBS緩沖液中,采用涂布法計算分離前后菌體濃度變化,評價菌體分離效果。結果如表1所示:
表1
菌體濃度(CFU/mL)102103104105106菌體分離率(%)98.9896.8181.3768.7935.38
試驗結果:結合圖4,當細菌的濃度小于104CFU/mL時,微球對細菌的吸附率大于95%;當脂環酸芽孢桿菌的濃度為104CFU/mL,微球對細菌的吸附率大于80%;繼續增大細菌濃度(超過104CFU/mL)時,吸附率呈現下降趨勢。
二、利用實施例3中制備的免疫磁性微球分離不同來源細菌,研究免疫磁性微球對菌體分離的特異性:
具體操作步驟為:將脂環酸芽孢桿菌標準菌株(DSM3922、DSM2498、DSM14955、DSM17978、DSM14558)與非脂環酸芽孢桿菌標準菌株(CICC 1027、CICC10034、CICC10017)培養液分別加入到稀釋后的蘋果汁樣品中(15°Brix),最終樣品中菌體濃度約為104CFU/mL。將5mg的免疫磁性微球加入到2mL果汁樣品中,吸附反應60min,然后進行菌體分離,洗滌。將吸附菌體的微球重新懸浮于200μL PBS緩沖液中,采用涂布法計算分離前后菌體濃度變化,評價菌體分離效果。結果如表2所示:
表2

表2所示結果表明,獲得的免疫磁性微球對脂環酸芽孢桿菌有非常好的特異性,對脂環酸芽孢桿菌的分離率達到80%以上;而對其余三個菌株培養液(CICC-1027、CICC-10034、CICC-10017)分離效果較差,菌體分離率不足10%,說明該實施例制備的免疫磁性微球對脂環酸芽孢桿菌有好的特異性。
三、利用實施例3中制備的免疫磁性微球對不同可溶性固形物濃度的蘋果果汁樣品中菌體進行免疫分離:
具體操作步驟為:將濃縮蘋果汁(68°Brix)梯度稀釋,可溶性固形物分別為5,10,15,20°Brix,并加入一定量培養好的脂環酸芽孢桿菌標準菌株培養液,最終樣品中菌體濃度約為104CFU/mL。然后將免疫磁性微球加入到各加標果汁樣品中(2.5g/L),按照前述條件進行菌體分離,洗滌。將吸附菌體的微球重新懸浮于200μL PBS緩沖液中,采用涂布法計算分離前后菌體濃度變化。結果如表3所示:
表3
可溶性固形物含量(°Brix)5101520菌體分離率(%)85.4387.8683.17不能分離
表3所示結果表明,當果汁的可溶性固形物≤15°Brix時,免疫磁性微球對菌體分離效果好,沒有顯著影響;當可溶性固形物含量為20°Brix時,由于果汁黏度太多,磁性微球在果汁體系中不能有效分離,因而對菌體分離效果差。
實施例4:
該實施例與實施例3不同之處在于,以每100ml PBS中含有1g BSA和0.05ml Tween-20的混合體系為封閉液。
實施例5:
該實施例與實施例3不同之處在于,以每100ml PBS中含有10g BSA和0.05ml Tween-20的混合體系為封閉液。
以下是發明人提供的關于磁性微球胺基化、脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的氧化處理、封閉處理對脂環酸芽孢桿菌免疫磁性微球吸附性能的影響試驗研究。
試驗方法:
(1)以氧化處理前后的抗體分別與Fe3O4磁核、胺基化磁性微球反應,制備獲得不同試驗樣品,分別為:
氧化前抗體與Fe3O4磁核反應制備的試驗樣品標記為IMPs1;
氧化前抗體與胺基化磁性微球反應制備的試驗樣品標記為IMPs2;
氧化后抗體與Fe3O4磁核反應制備的試驗樣品標記為IMPs3;
氧化后抗體與胺基化微球反應制備的免疫磁性微球標記為IMPs4;
利用IMPs1、IMPs2、IMPs3、IMPs4各試驗樣品對菌體濃度為104CFU/mL脂環酸芽孢桿菌(DSM3922)培養液中的脂環酸芽孢桿菌進行吸附分離,之后采用涂布法計算各樣品分離前后菌體濃度變化,并計算各試驗樣品對脂環酸芽孢桿菌的吸附率。試驗結果如表1所示。
該實驗中所用Fe3O4磁核為實施例2制備的Fe3O4磁核;胺基化磁性微球和氧化抗體為實施例1制備。
(2)利用實施例1、3、4、5制備的免疫磁性微球對菌體濃度為104CFU/mL脂環酸芽孢桿菌(DSM3922)培養液中的脂環酸芽孢桿菌進行吸附分離,之后采用涂布法計算各樣品分離前后菌體濃度變化,并計算各試驗樣品對脂環酸芽孢桿菌的吸附率。試驗結果如表1所示。
(3)利用實施例3中所用封閉液,對IMPs1、IMPs2、IMPs3、IMPs4各試驗樣品進行封閉處理,得到相應的試驗樣品,之后進行菌體(DSM3922)分離處理并計算各試驗樣品對脂環酸芽孢桿菌的吸附率。試驗結果如表4所示。
表4
微球類型IMPs1IMPs2IMPs3IMPs4封閉前菌體吸附率32.96%51.62%47.18%86.38%封閉后菌體吸附率18.92%37.29%23.61%80.07%非特異性吸附率14.04%14.33%23.57%6.31%
表4中的非特異性吸附率指的是相應磁性微球封閉處理前對菌體的吸附率與封閉后菌體吸附率的差值。
試驗結果:研究結果表明,抗體氧化處理后與胺基化磁性微球反應,制備的免疫磁性微球對菌體的吸附率最高;封閉液中BSA含量對菌體的非特異性吸附有顯著影響。
(1)抗體氧化前后與胺基化磁性微球反應,制備的免疫磁性微球對菌體的有效吸附率分別為37.29%和80.07%,說明抗體氧化對菌體吸附有重要影響。氧化后抗體與胺基化磁性微球反應過程中,保留了抗體的活性位點,因此有利用菌體的吸附。
(2)Fe3O4磁核與氧化后抗體反應制備的免疫磁性微球對菌體的有效吸 附率為23.61%,而胺基化磁性微球與氧化后抗體反應制備的免疫磁性微球對菌體的有效吸附率為80.07%。
(3)當封閉液中BSA濃度由1%增大到5%時,免疫磁性微球對菌體的非特異性吸附明顯減小。封閉液中BSA質量濃度為5%時,Fe3O4磁核和胺基化微球制備的免疫微球的非特異性吸附率為6.31%和23.57%;參考圖3,隨著BSA濃度繼續增大到10%時,封閉效果變化不明顯。
實施例6:
該實施例與實施例2不同之處在于:將5mg胺基化磁性微球與250μL濃度為0.4mg/mL的氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體于37℃條件下攪拌反應60min(150rpm),磁性分離并洗滌,得到包被抗體的免疫磁性微球。
實施例7:
該實施例與實施例6不同之處在于:氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的濃度為0.8mg/mL。
實施例8:
該實施例與實施例6不同之處在于:氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的濃度為1.2mg/mL。
實施例9:
該實施例與實施例6不同之處在于:氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的濃度為1.6mg/mL。
實施例10:
該實施例與實施例6不同之處在于:氧化脂環酸芽孢桿菌特異性抗體的濃度為2.0mg/mL。
分別采用BCA試劑盒法測定實施例6至10固定化前后抗體濃度。結果如 表5所示:
表5
實施例實施例6實施例7實施例8實施例9實施例10抗體初始濃度(mg/mL)0.40.81.21.62抗體固定化量(μg/mg)19.4838.7658.6571.8675.6
表5所示結果表明:隨著抗體初始濃度的增大,胺基化磁性微球對抗體固定化量增加。在初始濃度為2.0mg/mL時,吸附率為75.6μg/mg。
實施例11:
該實施例中利用實施例3制備的免疫磁性微球對蘋果汁樣品中的脂環酸芽孢桿菌進行分離,菌體濃度為102CFU/mL、蘋果汁的可溶性固定物含量為15°Brix。
實施例12:
該實施例與實施例11不同之處在于:蘋果汁樣品中脂環酸芽孢桿菌的菌體濃度為103CFU/mL。
實施例13:
該實施例與實施例11不同之處在于:蘋果汁樣品中脂環酸芽孢桿菌的菌體濃度為104CFU/mL。
實施例14:
該實施例與實施例11不同之處在于:蘋果汁樣品中脂環酸芽孢桿菌的菌體濃度為105CFU/mL。
實施例15:
該實施例與實施例11不同之處在于:蘋果汁樣品中脂環酸芽孢桿菌的菌體濃度為106CFU/mL。
對實施例11至實施例15中吸附菌體的免疫磁性微球進行磁性分離(每個 樣品準確移取2mL,并加入5mg免疫磁性微球,吸附反應60min)、洗滌,并將微球重新懸浮于200μL PBS緩沖液中;采用涂布法計算磁性分離前后菌體濃度變化。結果如表6所示:
表6
實施例實施例11實施例12實施例13實施例14實施例15菌體濃度(CFU/mL)102103104105106菌體分離率(%)96.5897.3282.9671.7638.63
對比實施例11-實施例的分離效果:對濃度小于104CFU/mL的菌體樣品,免疫磁性微球對其分離率大于95%;當樣品中菌體濃度為104CFU/mL時,免疫磁性微球對其分離率大于80%;繼續增加菌體濃度,免疫磁性微球對目標菌體的分離比例下降,但是分離獲得的菌體總量是增加的。
一般來說,蘋果汁樣品中自然污染的脂環酸芽孢桿菌的濃度遠低于104CFU/mL,因此,本發明的免疫磁性分離方法可以用于蘋果汁樣品中脂環酸芽孢桿菌的分離。

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脂環酸 芽孢 桿菌 免疫 磁性 及其 應用
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本文標題:脂環酸芽孢桿菌的免疫磁性微球及其應用.pdf
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