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一種北五味子人工種子制備和育苗方法.pdf

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一種 五味子 人工 種子 制備 育苗 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310207635.4

申請日:

2013.05.30

公開號:

CN103299904B

公開日:

2014.12.24

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A01H 4/00申請日:20130530|||公開
IPC分類號: A01H4/00; A01G1/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 遼寧萬畝五味子科技產業園區有限公司
發明人: 于繼鴻
地址: 110121 遼寧省沈陽市沈北新區新城子鄉新臺子村
優先權:
專利代理機構: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207 代理人: 李宇彤
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310207635.4

授權公告號:

103299904B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.24|||2013.10.23|||2013.09.18

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明屬于醫藥技術領域,涉及一種北五味子(Schisandra?chinensis)人工種子制備和育苗方法,該方法能夠在有菌栽培基質中正常萌發五味子人工種子。該人工種子可由下述過程制備獲得:將良種五味子外植體接種到愈傷組織誘導培養基中得到愈傷組織,將愈傷組織進行胚型愈傷組織的誘導,將胚型愈傷組織進行體細胞胚誘導,將誘導得到的體細胞胚同步化培養和繼代培養,將子葉期體細胞胚經離子交換過程形成海藻酸鈉-CaCl2水凝膠小球,將得到的凝膠小球用脫乙酰殼聚糖和多菌靈微粉包裹,即可得到包裹人工種皮的人工種子;將人工種子萌發,即得。本方法既可在短時間內得到大量種苗,又可以節約人力物力。

權利要求書

權利要求書
1.   一種北五味子人工種子的制備方法,其特征在于:
(1)將良種五味子外植體接種到愈傷組織誘導培養基中得到愈傷組織,將愈傷組織在液體培養條件下建立懸浮培養體系,進行胚型愈傷組織的誘導;
(2)將胚型愈傷組織進行體細胞胚誘導,將誘導得到的體細胞胚接種到1/2MS培養基中進行同步化培養;.
(3)子葉期體細胞胚重懸于含有殼寡糖200?1000mg/L、0.1~0.5%活性炭、0.5?2%木薯淀粉、海藻酸鈉2?5%的1/2MS培養基中,然后經離子交換過程形成海藻酸鈉?CaCl2水凝膠小球,將得到的凝膠小球與脫乙酰殼聚糖和多菌靈微粉進行反應,即可得到包裹有脫乙酰殼聚糖和多菌靈微粉人工種皮的人工種子。

2.   根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于:步驟(1)中的愈傷組織誘導培養基為含2,4?二氯苯氧乙酸0.5~2mg/L和6?芐氨基嘌呤1.0~3.0mg/L,蔗糖15~30g/L,瓊脂0.5~1%,最終pH調至5.5~6.5之間的無菌MS固體培養基。

3.   根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)中建立懸浮培養體系后得到足夠量的細胞懸液,將其在無菌條件下過濾得到細胞,用除去激素的MS培養基洗滌后,接種于含有0.2~2.0mg/L噻重氮苯基脲和0.5~3mg/L脫落酸的MS培養基中,進行體細胞胚的誘導。

4.   根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(2)中將得到的體細胞胚用不同目數的篩網過濾,得到大小相近的體細胞胚,再將體細胞胚接種到去除了磷元素的1/2MS液體培養基中處理2~7天,進行體細胞胚的同步化,然后再進行正常培養,當有70%以上體細胞胚處于子葉胚階段時,即可進行包埋處理。

5.   根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,將步驟(3)得到的懸液滴至10~20%的氯化鈣溶液中,優選12~15%,離子交換時間為10分鐘,控制液滴大小,使每滴中含有1~2個體細胞胚。

6.   根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(3)中脫乙酰殼聚糖和多菌靈混合微粉的混合比例為1∶1~4∶1。

7.   根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(3)的培養基為含有殼寡糖500?1000mg/L、0.5?2%木薯淀粉、0.1~0.5%活性炭、海藻酸鈉2?5%的1/2MS培養基;優選含有800~1000mg/L殼寡糖、1~2%木薯淀粉、0.2~0.4%活性炭、3~5%海藻酸鈉的1/2MS培養基。

8.   一種北五味子人工種子的育苗方法,其特征在于:將權利要求1中步驟(3)得到的人工種子在人工栽培基質中進行萌發,即可得到快繁種苗,所述的人工栽培基質為泥炭土∶土壤1∶5~1∶20的混合物,優選1∶7~1∶10。

9.   根據權利要求8所述的育苗方法,其特征在于,將泥炭土和土壤均勻混合后,按重量比1000∶1加入多菌靈可濕性粉劑,攪拌均勻后,暴曬至干得基質粉末,裝袋,使用時,將基質粉末加水至含水量40~60%,再裝入育苗容器育苗。

10.   根據權利要求9所述的育苗方法,其特征在于,育苗條件如下:基質含水量40~60%,育苗溫度為18~22℃。

說明書

說明書一種北五味子人工種子制備和育苗方法
技術領域
本發明屬于醫藥技術領域,涉及一種北五味子人工種子的制備和育苗方法。
背景技術
北五味子為東北地區道地藥材,其中又以遼寧省產量最大,質量最佳,但目前幾乎所有的五味子種植基地中均存在嚴重的品種混雜現象,主要體現在果實顏色、果穗形狀、產量、有效成分含量、葉片質地和大小等方面的差異,該現象造成了五味子藥材品質嚴重參差不齊的現象。目前,五味子栽培基地中所使用的繁殖方法均為種子繁殖,但該方法不可避免地會造成生殖分離與農藝性狀退化等問題,即使通過取樣得到了品質和產量均較優的五味子品系,但通過種子繁殖得到的子代中又會出現母代品質差異較大的現象,此外,種子育苗還存在過程繁瑣,有嚴格的時間限制等缺點。因此,有必要對五味子進行無性繁殖研究。
已有專利CN101904302A和CN1817106公開了一種五味子體細胞胚的誘導方法,將得到的體細胞胚在無菌條件下進行萌發得到五味子種苗,該方法繁殖系數較高,所需原材料較少,但是該方法中,得到組培苗的全過程均是在無菌條件下進行的,操作周期長,勞動強度大,這就大大提高了種苗繁育過程所投入的人力物力,提高了其繁育和栽培面積擴大化的成本。
已有專利CN101485293和CN101878737A公開了一種五味子種苗繁育的方法,即通過組織培養技術誘導得到叢生芽,再將叢生芽進行生根處理,最后將生根后的五味子種苗移栽到田間。該方法具有技術難度低,成功率高的優點,但是繁殖系數低,繁殖速度慢,無菌操作過程長,勞動強度高,也需要耗費大量人力物力。因此有待于開發一種具有繁殖系數高,人力物力需求少,繁殖速度快,萌發率高,成活率高的制備方法,以克服現有技術的缺陷。
發明內容
本發明所解決的技術問題是:提供一種能夠在有菌栽培基質中正常萌發的五味子人工種子,該人工種子可由下述過程制備獲得:將五味子外植體進行表面消毒,接種到愈傷組織誘導培養基中得到愈傷組織,將愈傷組織在液體培養條件下建立懸浮培養體系,進行胚型愈傷組織的誘導,將胚型愈傷組織進行體細胞胚誘導,將誘導得到的體細胞胚接種到1/2MS培養基中進行同步化培養,將子葉期體細胞胚重懸于含有殼寡糖200?1000mg/L、0.1~0.5%活性炭、0.5?2%木薯淀粉、海藻酸鈉2?5%的1/2MS培養基中(其中各組分的百分比濃度均為重量體積百分濃度)。然后經離子交換過程形成海藻酸鈉?CaCl2水凝膠小球,將得到的凝膠小球與脫乙酰殼聚糖和多菌靈微粉進行反應,即可得到包裹有脫乙酰殼聚糖和多菌靈微粉人工種皮的人工種子;將此人工種子在人工栽培基質(泥炭土與土壤混合物)中按照一定的栽培條件進行萌發,即可得到快繁種苗。
本發明提供了一種五味子人工種子的制備和種苗繁育方法,該方法包括下述順序的步驟:
(1)以良種五味子外植體為起始材料,經75%酒精和飽和次氯酸鈉溶液依次表面消毒后,切成小塊,在超凈工作臺內接種到含有2,4?二氯苯氧乙酸0.5~2mg/L,6?芐氨基嘌呤1.0~3.0mg/L,蔗糖15~30g/L,瓊脂0.5~1%,最終pH調至5.5~6.5之間的無菌MS固體培養基(愈傷組織誘導培養基)中,于25±1℃、暗培養條件下進行愈傷組織的誘導。
(2)選取淡黃綠色,質地疏松,生長旺盛的愈傷組織,接種到除去瓊脂的愈傷組織誘導培養基中,建立其懸浮培養條件,得到旺盛生長,大小均勻的細胞懸液。
(3)在得到足夠量的細胞懸液后,將其在無菌條件下過濾得到細胞,用除去激素的MS培養基洗滌后,接種于含有0.2~2.0mg/L噻重氮苯基脲和0.5~3mg/L脫落酸的MS培養基中,進行體細胞胚的誘導。
(4)將得到的體細胞胚用不同目數的篩網過濾,得到大小相近的體細胞胚,再將體細胞胚接種到去除了磷元素的1/2MS液體培養基中處理2~7天,進行體細胞胚的同步化,然后再進行正常培養,當有70%以上體細胞胚處于子葉胚階段時,即可進行包埋處理。
(5)將同步化后的體細胞胚懸浮于含有殼寡糖200?1000mg/L、0.5?2%木薯淀粉、0.1~0.5%活性炭、海藻酸鈉2?5%的1/2MS培養基中,將上述懸液滴至10~20%的氯化鈣溶液中,離子交換時間為10分鐘,控制液滴大小,使每滴中含有1個最多2個體細胞胚,將得到的凝膠小球用蒸餾水略洗滌。
(6)將得到的凝膠小球在脫乙酰殼聚糖和多菌靈混合微粉中進行包被,混合比例1∶1~4∶1,即可得到具有抗菌特性和一定韌度的人工種皮,至此,五味子人工種子制備完成。
(7)在制備好人工種子后,本發明還設計了一種能夠使其在人工育苗圃中萌發為種苗的方法。栽培基質為泥炭土∶土壤(1∶5~1∶20)的混合物,均勻混合后,要求無明顯大顆粒,按重量比1000∶1加入多菌靈可濕性粉劑,攪拌均勻后,塑料布覆蓋過夜,之后攤成薄層,陽光下暴曬至干,裝袋備用。使用時,將基質粉末加水至含水量40~60%,再裝入育苗容器,鋪成Scm厚的薄層,打淺眼,每孔一粒人工種子,覆土,調整育苗溫度為18~22℃,每隔3天,澆水1次,使土壤含水量維持30~60%,10~20天小苗可萌發出土,萌發率可達到20~55%。
步驟(5)的培養基優選為含有500~1000mg/L殼寡糖、1~2%木薯淀粉、0.2~0.4%活性炭、3~5%海藻酸鈉的1/2MS培養基,更優選含有800~1000mg/L殼寡糖、1.5~2%木薯淀粉、0.3~0.4%活性炭、4~5%海藻酸鈉的1/2MS培養基。
步驟(6)中,脫乙酰殼聚糖∶多菌靈混合微粉優選3∶1~4∶1
步驟(7)中泥炭土∶土壤優選1∶7~1∶10。
本發明的人工胚乳(步驟5)制備過程中,使用了近年來發現的對植物生長有促進作用且抗菌譜廣的水溶性殼寡糖,在人工胚乳中使用可顯著提高萌發后植株的抗菌能力,其價格便宜,制備方便,具有可生物降解性;還加入了木薯淀粉和活性炭,旨在提高人工胚乳的保水性,使胚乳中的營養成分不易流失,增強體細胞胚萌發機率。人工種皮制備(步驟6)中,我們使用了脫乙酰殼聚糖,該成分具有抗菌和昆蟲拒食特性,材料帶有正電荷,在包被人工種皮過程中可以與海藻酸鈉?氯化鈣水凝膠中的負電荷結合,使得其結合較緊密,不易脫落,因為該成分具有此特性,所以也可附帶的將多菌靈粉末結合到人工種皮中,最終形成具有雙重抗菌能力,昆蟲拒食性和一定機械強度的人工種皮。
此外,本發明還涉及一種人工種子的繁育方法,該繁育方法通過對栽培基質進行一定的消毒處理和保濕操作,將人工種子播種到基質中,通過培養溫度和土壤濕度的控制,即可在10~20天內得到萌發出土的五味子種苗,萌發率可達20~55%,萌發后種苗成活率為82~90%。
與傳統的五味子快繁技術相比,本發明在體細胞胚基礎上進行了人工種子的制備,并建立了育苗方法,由于體細胞胚可以在搖瓶或生物反應器中進行培養,制備的人工種子又可以在栽培基質上進行萌發,從而得到大量快繁苗,該流程在很大程度上擺脫了快繁過程中勞動強度大,人力物力需求高的問題。鑒于目前人工種子保藏的難題尚未攻克,因此,在不適宜戶外作業的條件下,需要人工暖棚或栽培室來進行育苗工作。
具體實施方式
實例1:
1?4步操作參考發明內容部分(1)~(4),即以良種五味子外植體為起始材料,經75%酒精和飽和次氯酸鈉溶液依次表面消毒后,切成小塊,在超凈工作臺內接種到含有2,4?二氯苯氧乙酸0.5~2mg/L,6?芐氨基嘌呤1.0~3.0mg/L,蔗糖15~30g/L,瓊脂0.5~1%,最終pH調至5.5~6.5之間的無菌MS固體培養基(愈傷組織誘導培養基)中,于25±1℃、暗培養條件下進行愈傷組織的誘導。
選取淡黃綠色,質地疏松,生長旺盛的愈傷組織,接種到除去瓊脂的愈傷組織誘導培養基中,建立其懸浮培養條件,得到旺盛生長,大小均勻的細胞懸液。
在得到足夠量的細胞懸液后,將其在無菌條件下過濾得到細胞,用除去激素的MS培養基洗滌后,接種于含有0.2~2.0mg/L噻重氮苯基脲和0.5~3mg/L脫落酸的MS培養基中,進行體細胞胚的誘導。
將得到的體細胞胚用不同目數的篩網過濾,得到大小相近的體細胞胚,再將體細胞胚接種到去除了磷元素的1/2MS液體培養基中處理2~7天,進行體細胞胚的同步化,然后再進行正常培養,當有70%以上體細胞胚處于子葉胚階段時,即可進行包埋處理。
將得到的子葉期體細胞胚懸浮于含有殼寡糖500mg/L、1%木薯淀粉、0.2%活性炭、海藻酸鈉3.5%的1/2MS培養基中,將上述懸液滴至15%的氯化鈣溶液中,離子交換時間為10分鐘,將得到的凝膠小球用蒸餾水略洗滌。將得到的凝膠小球在脫乙酰殼聚糖和多菌靈混合微粉(混合比例3∶1)中進行包被,即可得到具有抗菌特性和一定韌度的人工種皮。所制備得到的人工種子直徑為0.5~0.7cm,外層白色,內層灰色,每粒人工種子含有1~2個子葉期體細胞胚。在進行人工種子育苗時,栽培基質為泥炭土∶土壤(1∶8)的混合物,均勻混合后,要求無明顯大顆粒,按重量比1000∶1加入多菌靈可濕性粉劑,攪拌均勻后,塑料布覆蓋過夜,之后攤成薄層,陽光下暴曬至干,裝袋備用。使用時,將基質粉末加水至含水量45%,再裝入育苗容器,鋪成5cm厚的薄層,打淺眼,每孔一粒人工種子,覆土1cm左右,調整育苗溫度為21℃,每隔3天澆水1次,12天小苗可萌發出土,萌發率可達到45%左右,成活率可達86%。
實例2~5:
參考實施例1步驟,改變各變量濃度/比例進行人工種子的制備和育苗實驗,結果如下:

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