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一種抗腫瘤生物活性物質及其制備方法.pdf

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一種 腫瘤 生物 活性 物質 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310308948.9

申請日:

2013.07.23

公開號:

CN103340905B

公開日:

2014.12.24

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 35/34申請日:20130723|||公開
IPC分類號: A61K35/34; A61K9/08; A61K9/19; A61P35/00 主分類號: A61K35/34
申請人: 吳敬波
發明人: 吳敬波
地址: 646000 四川省瀘州市江陽區后興隆街2號樓1單元18號
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310308948.9

授權公告號:

103340905B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.24|||2013.11.06|||2013.10.09

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種具有抑瘤活性的小分子生物活性物質心肌組織裂解物,該裂解物由不同年齡、不同種屬來源的未荷瘤健康動物的心肌組織經勻漿、反復凍融裂解及超濾而成,分為液體制劑和真空凍干粉劑兩種劑型;該心肌組織裂解物抑瘤作用確切,并具有放射增敏作用,且無治療的毒副作用;并且在抑瘤能力、應用范圍和毒副作用方面較傳統生物制劑更具前景,可望廣泛用于惡性腫瘤的臨床治療。

權利要求書

權利要求書
1.  一種抗腫瘤生物活性物質,其特征在于:所述活性物質為心肌組織裂解物。

2.  根據權利要求1所述的抗腫瘤生物活性物質,其特征在于:所述心肌組織裂解物劑型分為液體制劑或真空凍干粉劑。

3.  一種抗腫瘤生物活性物質的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:
a、將心肌組織剪成1mm3的組織塊,加入生理鹽水混勻,制得心肌組織混懸液;
b、將心肌組織混懸液在2000轉/分的條件下勻漿30分鐘,得到心肌組織勻漿液;
c、將步驟b制得的勻漿液置于-70℃環境中凍存,24小時后取出置于室溫融解,待完全融解后,再次置于-70℃環境中凍存,如此反復三次,制得凍融裂解的心肌組織勻漿液;
d、將步驟c制得的心肌組織勻漿液過200目篩,取濾液在4000轉/分的條件下離心30分鐘,將上清液用截留量10KD的超濾離心管再在4000轉/分的條件下離心10分鐘,收集分子量小于10KD的濾液,再用0.22um濾膜過濾,取濾液,制得心肌組織裂解物的液體制劑,即心肌組織裂解液。

4.  根據權利要求3所述的抗腫瘤生物活性物質的制備方法,其特征在于:將步驟d制得的心肌組織裂解液置于-20℃凍實,再進行真空冷凍干燥處理,即得心肌組織裂解物的真空凍干粉劑。

5.  根據權利要求3所述的抗腫瘤生物活性物質的制備方法,其特征在于:所述心肌組織為來自不同年齡、不同種屬來源的未荷瘤動物的心肌組織。

6.  權利要求1至5任一所述的抗腫瘤生物活性物質在抗腫瘤生長和放射增敏中的應用。

說明書

說明書一種抗腫瘤生物活性物質及其制備方法
技術領域
本發明涉及生物醫藥領域,具體涉及將健康動物心肌組織制成具有抑瘤活性和放射增敏性的心肌組織裂解產物及其制備方法。
背景技術
腫瘤是影響人類健康、危害人民生命的常見多發病。目前,治療腫瘤的藥物一般有烷化劑、抗代謝類、抗腫瘤抗生素、植物堿、雜類、激素類以及單克隆抗體、小分子靶向藥物等。
近幾年生物制劑的發展特別迅速,對生物制劑中的活性物質的研究也蓬勃發展,這些活性物質一般包括:
1、干擾素:主要應用于毛細胞白細胞、Kaposi肉瘤、低度惡性淋巴瘤;
2、白細胞介素:IL-2與LAK細胞聯合使用,對癌細胞產生非特異性殺傷作用,IL-11升高血小板,用于化療藥物導致的血小板降低的臨床治療;
3、單克隆抗體如抗CD20單抗美羅華用于治療B細胞淋巴瘤;
4、生長因子GM-CSF、G-CSF:促進粒細胞、巨噬細胞分化成熟,用于抗腫瘤的輔助治療用藥以及用于化療藥物使用導致的白細胞降低的臨床治療;
5、腫瘤壞死因子:局部應用,瘤內注射可以起到一定的局部抗腫瘤作用。
由上述可知,生物制劑活性物質種類繁多,目前尚無任何藥物有效的治療各類惡性腫瘤,其臨床應用受到限制的常見原因為:
1、大部分生物制劑均有發熱、乏力、骨髓功能抑制等毒副作用;
2、抗腫瘤作用通常為非特異性,其抗腫瘤作用較弱,部分生物制劑僅有增強或調解免疫力從而起到抗腫瘤輔助作用;
3、大部分生物制劑由于受到制備工藝復雜,生產成本高等因素影響,其生 物制劑價格昂貴,從而應用于臨床受到較大限制。
專利號為CN200710050378.2的專利公開了一種抗腫瘤生物活性物質及其制備工藝,在上述專利中,所述的抗腫瘤生物活性物質為心肌細胞裂解液,該心肌細胞裂解液在制備上需先將心臟組織制成細胞懸液,操作繁瑣、生產成本較高、制作時間較長,由于細胞抵抗力弱,對外界環境條件要求苛刻,加之細胞操作為微觀操作,肉眼無法很好的對整個操作進行調控,制作過程中難免有許多細胞會由于酶過度消化、機械損傷等原因死亡,因此材料利用率低,藥物效果不穩定。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中抗腫瘤生物活性物質制備工藝復雜、副作用大及抗腫瘤效果差等問題,提供一種無毒、廣譜、療效穩定確切且易于獲得的抗腫瘤生物活性物質即心肌組織裂解物,該物質抑瘤作用確切且同時具有放射增敏作用,具有很大的應用價值。
本發明的另一目的是提供一種上述抗腫瘤生物活性物質的制備方法。
為了實現上述發明目的,本發明采用的技術方案如下:
提供一種抗腫瘤生物活性物質,其為心肌組織裂解物。
所述心肌組織裂解物分為液體制劑和真空凍干粉劑兩種劑型;使用時,若為心肌組織裂解產物的液體制劑則可直接經靜脈注射;若為真空凍干粉劑,則可溶解于注射用水或生理鹽水后經靜脈注射給藥。
上述抗腫瘤生物活性物質的制備方法,包括以下步驟:
a、將心肌組織剪成1mm3的組織塊,加入生理鹽水混勻,制得心肌組織混懸液;
b、將心肌組織混懸液在2000轉/分的條件下勻漿30分鐘,得到心肌組織勻 漿液;
c、將步驟b制得的勻漿液置于-70℃環境中凍存,24小時后取出置于室溫融解,待完全融解后,再次置于-70℃環境中凍存,如此反復三次,制得凍融裂解的心肌組織勻漿液;
d、將步驟c制得的心肌組織勻漿液過200目篩,取濾液在4000轉/分的條件下離心30分鐘,將上清液用截留量10KD的超濾離心管再在4000轉/分的條件下離心10分鐘,收集分子量小于10KD的濾液,再用0.22um濾膜過濾后,取濾液,制得心肌組織裂解物的液體制劑,即心肌組織裂解液。
將步驟d制得的心肌組織裂解液置于-20℃冷凍至完全凍實,再進行真空冷凍干燥處理,即得心肌組織裂解物的真空凍干粉劑。
所述心肌組織為來自不同年齡、不同種屬來源的未荷瘤動物的心肌組織。
上述抗腫瘤生物活性物質在抗腫瘤生長和放射增敏中的應用。
綜上所述,本發明的抗腫瘤生物活性物質心肌組織裂解物無需制備細胞懸液,操作過程不需嚴格無菌,無毒副作用,復現性好,制備成功率高,制備所需材料來源廣泛且易于獲得,制備方法簡單易行,更利于大規模生產;并且能夠有效抑制腫瘤生長,抑瘤作用確切,效果更穩定,同時具有放射增敏作用,具有更廣泛的應用范圍、更大的使用價值及應用前景。
附圖說明
圖1為2Gy照射情況下,單純照射組、拓撲替康+照射組及心肌組織裂解液+照射組的細胞克隆生長情況。
圖2為本發明實驗例中單純照射組、拓撲替康+照射組及心肌組織裂解液+照射組照射后CNE-2細胞存活曲線。
圖3為發明實驗例中經照射后空白組、拓撲替康+照射組、心肌組織裂解液 +照射組、拓撲替康組、心肌組織裂解液組的細胞所處細胞周期比例比較。
圖4為發明實驗例中經照射后,空白組、拓撲替康+照射組、心肌組織裂解液+照射組、拓撲替康組、心肌組織裂解液組的細胞凋亡率比較。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明進行詳細的描述,但它們不是對本發明的進一步限制。
實施例
本發明的抗腫瘤生物活性物質心肌組織裂解物由以下步驟制得:
1)制備心肌組織混懸液:取健康未荷瘤動物,經碘酒、酒精消毒后,用剪剖開動物胸腔,剪取動物心尖,去除心臟表面包膜等組織,獲得較為單純的心肌組織,用生理鹽水反復洗滌心肌組織,洗去心腔中殘留的血細胞,于電子天平上稱重,然后將其剪成1mm3大小的組織塊,按20%(W/V)比例加入生理鹽水混勻;上述心肌組織來源于不同年齡、不同種屬的未荷瘤動物。
2)勻漿:將上述心肌組織混懸液置于勻漿瓶內,于勻漿機上以2000轉/分的速度勻漿30分鐘制成心肌組織勻漿液。
3)反復凍融:將得到的勻漿液置于-70℃冰箱中凍存24小時后取出,室溫完全融解后,再次放入-70℃冰箱中凍存,反復三次,得到凍融裂解的心肌組織勻漿液;
4)離心超濾:將上述凍融裂解的心肌組織勻漿液用200目的紗布過濾以去除組織碎片,取過濾后的勻漿液在4℃、4000轉/分的條件下離心30min,吸取上清液(不含細沉淀)于離心管中,用截留量10KD的超濾離心管在4℃、4000轉/分的條件下離心10min,收集分子量小于10KD的濾液,再用0.22um的濾膜過濾后取濾液即得粉紅色的心肌組織裂解產物的液體制劑,即心肌組織裂解液。 該液體制劑可于4℃短期保存或于-20℃長期保存備用。
5)制備心肌組織裂解物的真空凍干粉劑:將上述心肌組織裂解液置于-20℃冰箱中進行預凍直至裂解液完全凍實并保持一段時間,將預凍好的裂解液取出,放入冷凍干燥機中,進行真空冷凍干燥處理,即可收集到淡粉紅色的疏松干燥粉末狀物,此為心肌組織裂解產物的真空凍干粉劑,該真空凍干粉劑可以在-20℃下于普通密封瓶中低溫長期保存備用。
實驗例
下面以心肌組織裂解液為例,結合附圖與具體實驗對本發明的效果做更詳細的敘述。
實驗1 心肌組織裂解液對CNE-2體外抑瘤實驗
1.1、不同種屬心肌組織裂解液對CNE-2體外抑瘤實驗
采用上述實施例所述方法制得魚、蛙、雞、鼠、豬、人流胚胎的心肌組織裂解液,用MTT法觀察分析上述不同種屬來源的心肌組織裂解液對鼻咽癌(CNE-2)細胞株體外生長的影響;其中:

實驗結果顯示(參見表1):魚、蛙、雞、鼠、豬、人流胚胎心肌組織裂解液對CNE-2存活率與陰性對照組比較顯示出明顯的抑瘤活性;而魚、蛙、雞、鼠、豬、人心肌組織裂解液對CNE-2存活率的相互比較則無統計上的差別,說明心肌組織裂解液的作用不具種屬特異性。
表1不同種屬心肌組織裂解液對CNE-2存活率的影響

注:★表示與陰性組相比差異具有統計學意義,檢驗水準α=0.05;*表示與DDP組相比差異具有統計學意義,檢驗水準α=0.05。
1.2、不同年齡大鼠心肌組織裂解液對CNE-2體外抑瘤實驗
用MTT法觀察分析胎鼠、新生鼠、成年鼠的心肌組織制得的心肌組織裂解液對CNE-2體外生長的影響。實驗結果顯示(參見表2):胎鼠、新生鼠、成年鼠的心肌組織裂解液對CNE-2存活率的影響與陰性對照組比較有明顯的抑瘤活性;而胎鼠、新生鼠、成年鼠心肌組織裂解液對CNE-2存活率的相互比較則無統計上的差別;此實驗再次證實心肌組織裂解液對CNE-2腫瘤細胞的抗腫瘤生長(抑瘤)作用,并說明其抑瘤效果與取材動物年齡無關。
表2不同年齡大鼠心肌組織裂解液對CNE-2存活率的影響

注:★表示與陰性組相比差異具有統計學意義,檢驗水準α=0.05;*表示與DDP組相比 差異具有統計學意義,檢驗水準α=0.05。
實驗2 心肌組織裂解液對鼻咽癌CNE-2細胞株的放射增敏作用
2.1、心肌組織裂解液和拓撲替康對CNE-2細胞株放射敏感性的影響
實驗分為空白對照組、單純照射(RT)組、單純藥物組、藥物+照射組,其中藥物+照射組分為兩個亞組:心肌組織裂解液+照射組(CMTL+RT)、拓撲替康+照射組(TPT+RT)。通過計數培養皿中的細胞克隆數,得出該生長狀態下的細胞經各處理后的克隆形成率及CNE-2細胞集落形成率;結果顯示:細胞克隆形成率隨著放射劑量的增加而減小(如表3所示),同一照射劑量下,心肌組織裂解液+照射組的CNE-2細胞集落形成率較單純照射組明顯減少(如圖1所示),心肌組織裂解液+照射組相較單純照射組的CNE-2細胞D0值、Dq值、N值均降低,SF2亦降低(如表4和圖2所示),以上結果表明心肌組織裂解液對鼻咽癌細胞具有放射增敏作用。
表3各實驗組校正后的CNE-2細胞克隆形成率(%)

表4單擊多靶擬合后計算的增敏比結果

2.2、心肌組織裂解液和拓撲替康對細胞凋亡率及細胞周期的影響
實驗分為空白組、拓撲替康藥物(TPT)組、心肌組織裂解液(CMTL)藥物組、照射組(RT)、拓撲替康增敏組(TPT+RT)及心肌組織裂解液增敏組(CMTL+RT),流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率及細胞周期情況;結果顯示:CMTL+RT組與RT組比較,細胞凋亡率明顯增加,S期比例增高,G2/M比較下降(如表5、圖3和圖4所示)。
表5各組細胞調亡及細胞周期比較

該實驗2證實了心肌組織裂解液對CNE-2細胞株的放射增敏作用,放射增敏比為1.153,其放射增敏機制與誘導細胞凋亡及S期細胞周期阻滯有關。
綜上所述,上述實驗1及實驗2證實了本發明所獲的心肌組織裂解液對鼻咽癌細胞(CNE-2)的抑瘤作用,同時證明了該心肌組織裂解液具有放射增敏作用,且無治療的毒副作用;另外,本發明的心肌組織裂解液原材料來源廣泛,可取自不同種屬動物的心肌(魚、蛙、雞、鼠、豬、人流胚胎等)組織,對動物年齡不具嚴格限制(如本實驗證實成年鼠、胎鼠、新生鼠來源的心肌組織裂解液都具抗腫瘤生物活性),且在抗腫瘤能力、應用范圍和毒副作用方面相較傳統生物制劑可能更具前景。
雖然結合具體實施例對本發明的具體實施方式進行了詳細地描述,但并非 是對本專利保護范圍的限定。在權利要求書所限定的范圍內,本領域的技術人員不經創造性勞動即可做出的各種修改或調整仍受本專利的保護。

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