一種無激素的玉米愈傷組織再生方法.pdf

(10)申請公布號 CN 103444525 A (43)申請公布日 2013.12.18 CN 103444525 A *CN103444525A* (21)申請號 201310357188.0 (22)申請日 2013.08.15 A01H 4/00(2006.01) (71)申請人 廣東省農業科學院作物研究所 地址 510640 廣東省廣州市天河區五山路金 穎西二街 18 號 (72)發明人 祁喜濤 胡建廣 吳景 (74)專利代理機構 廣州市華學知識產權代理有 限公司 44245 代理人 蘇運貞 裘暉 (54) 發明名稱 一種無激素的玉米愈傷組織再生方法 (57) 摘要 本發明公開一種無激素的玉米愈傷組織再生 方法。 將長勢良好、 呈顆粒狀的玉米愈傷組織培養 在無激素的胚狀體誘導培養基上， 于24～26℃培 養 20 ～ 23 天， 誘導產生胚狀體 ； 將胚狀體轉接到 無激素的再生培養基上， 培養溫度為 24 ～ 26℃， 光照度為 12000 ～ 18000lux， 每天的光照時間為 16h， 培養至生出根和芽， 得到再生植株 ； 將再生 植株于如下條件下繼續培養 6 ～ 7 天進行壯苗即 可 ： 26 ～ 28℃、 24000 ～ 30000lux， 每天光照時間 為 16h。本發明通過改變蔗糖用量來調控再生培 養階段的滲透壓， 從而實現愈傷組織的高效再生， 全程不需要植物激素。這一方法不但節約了實驗 成本， 而且避免了長期使用激素對組織材料的毒 害。 (51)Int.Cl. 權利要求書 1 頁 說明書 6 頁 附圖 2 頁 (19)中華人民共和國國家知識產權局 (12)發明專利申請 權利要求書1頁 說明書6頁 附圖2頁 (10)申請公布號 CN 103444525 A CN 103444525 A *CN103444525A* 1/1 頁 2 1. 一種無激素的玉米愈傷組織再生方法， 其特征在于包含如下步驟 ： （1） 將長勢良好、 呈顆粒狀的玉米愈傷組織培養在胚狀體誘導培養基上， 于 24 ～ 26℃ 培養 20 ～ 23 天， 誘導產生胚狀體 ； （2） 將步驟 （1） 得到的胚狀體轉接到無激素的再生培養基上， 培養溫度為 24 ～ 26℃， 光照度為 12000 ～ 18000lux， 每天的光照時間為 16h， 培養至生出根和芽， 得到再生植株 ； （3） 將步驟 （2） 得到再生植株于如下條件下繼續培養 6 ～ 7 天進行壯苗即可 ： 26 ～ 28℃、 24000 ～ 30000lux， 每天的光照時間為 16h ； 步驟 （1） 中所述的胚狀體誘導培養基的成分如下 ： MS 大量元素 +MS 微量元素 + 肌醇 250mg/L+鹽酸硫胺素3.5mg/L+煙酸吡哆醇1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖 40～80g/L+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白100mg/L+MES500mg/L+植物凝膠2500mg/L， pH值 為 5.8 ； 步驟 （2） 中所述的無激素的再生培養基的成分如下 ： MS 大量元素 +MS 微量元素 + 肌醇 250mg/L+鹽酸硫胺素3.5mg/L+煙酸吡哆醇1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖 20 ～ 40g/L+MES500mg/L+ 植物凝膠 2500mg/L， pH 值為 5.8。 2.根據權利要求1所述的無激素的玉米愈傷組織再生方法， 其特征在于 ： 步驟 （1） 中所 述的玉米愈傷組織為超甜玉米自交系 1132、 超甜玉米自交系日超 -1 或 HiII 雜交種的玉米 愈傷組織。 3.根據權利要求1所述的無激素的玉米愈傷組織再生方法， 其特征在于 ： 步驟 （1） 中所 述的胚狀體誘導培養基中的蔗糖含量為 60g/L。 4.根據權利要求1所述的無激素的玉米愈傷組織再生方法， 其特征在于 ： 步驟 （2） 中所 述的無激素的再生培養基中的蔗糖含量為 30g/L。 5.根據權利要求1所述的無激素的玉米愈傷組織再生方法， 其特征在于 ： 步驟 （2） 中所 述的光照度為 16000lux。 6.根據權利要求1所述的無激素的玉米愈傷組織再生方法， 其特征在于 ： 步驟 （2） 中所 述的培養至生出根和芽的時間為 4 ～ 7 天。 7.根據權利要求1所述的無激素的玉米愈傷組織再生方法， 其特征在于 ： 步驟 （3） 中所 述的光照度為 30000lux。 權 利 要 求 書 CN 103444525 A 2 1/6 頁 3 一種無激素的玉米愈傷組織再生方法 技術領域 [0001] 本發明屬于植物組織培養技術領域， 特別涉及一種無激素的玉米愈傷組織再生方 法。 背景技術 [0002] 高效再生系統的建立是玉米基因工程育種的關鍵。現有的玉米再生技術無不依 賴生長素和細胞分裂素， 這些植物激素主要包括萘乙酸 （NAA） 、 6- 芐基腺嘌呤 （6-BA） 、 吲哚 丁酸 （IBA） 、 脫落酸 （ABA） 等。現有的玉米再生方法通常為 ： 首先在含生長素的誘導培養 基上誘導出松脆、 呈顆粒狀且生長旺盛的愈傷組織， 將這些愈傷組織轉移到含 NAA（0.1 ～ 0.3mg/L） +6-BA（2 ～ 4mg/L） 或其它激素組合的再生培養基上誘導植株再生， 然后將再生 植株轉移到含 NAA（0.1 ～ 0.3mg/L） 或 NAA（0.1 ～ 0.3mg/L） +IBA（0.3 ～ 0.5mg/L） 的生 根培養基誘導根再生 ； 也有部分方法為在再生培養之前進行預處理， 在這個階段通常需要 添加 ABA（3 ～ 6mg/L） 。 [0003] 此類再生方法不僅操作步驟多且耗時長， 而且常常造成以下不良后果 ： 1） 長時間 在含激素的培養基上誘導生長， 玉米基因組變異頻率增加， 再生植株畸形率較高， 甚至因激 素中毒而死亡 ； 2） 這種先再生植株后生根的方式， 生根時間長， 經常出現根系膨大， 根毛少， 生根率低， 影響后期的田間生長。利用現有再生植株再生技術嚴重束縛基因工程育種技術 在玉米育種生產中的應用。 發明內容 [0004] 本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足， 提供一種無激素的玉米愈傷組織 再生方法。 [0005] 本發明的目的通過下述技術方案實現 ： 一種無激素的玉米愈傷組織再生方法， 包 含如下步驟 ： [0006] （1） 將長勢良好、 呈顆粒狀的玉米愈傷組織培養在胚狀體誘導培養基上， 于 24 ～ 26℃培養 20 ～ 23 天， 誘導產生胚狀體 ； [0007] （2） 將步驟 （1） 得到的胚狀體轉接到無激素的再生培養基上， 培養溫度為 24 ～ 26℃， 光照度為12000～18000lux， 每天的光照時間為16h， 培養至生出根和芽， 得到再生植 株 ； [0008] （3）將步驟 （2）得到再生植株于如下條件下繼續培養 6 ～ 7 天進行壯苗 ： 26 ～ 28℃、 24000 ～ 30000lux， 每天的光照時間為 16h ； 即可煉苗移栽至田間 ； [0009] 步驟 （1） 中所述的玉米愈傷組織為任何可繼代的長勢良好的玉米愈傷組織， 優選 為超甜玉米自交系 1132、 超甜玉米自交系日超 -1 或 HiII 雜交種的玉米愈傷組織 ； [0010] 步驟 （1）中所述的胚狀體誘導培養基的成分如下 ： MS 大量元素 +MS 微量元素 + 肌醇 250mg/L+ 鹽酸硫胺素 （維生素 B1） 3.5mg/L+ 煙酸吡哆醇 （維生素 B6） 1.0mg/L+ 煙酸 0.5mg/L+ 甘氨酸 4.0mg/L+ 蔗糖 40 ～ 80g/L+ 脯氨酸 300mg/L+ 水解酪蛋白 100mg/L+MES 說 明 書 CN 103444525 A 3 2/6 頁 4 （2- 嗎啉乙磺酸） 500mg/L+ 植物凝膠 2500mg/L， pH 值為 5.8 ； [0011] 所述的蔗糖的含量優選為 60g/L ； [0012] 步驟 （2） 中所述的無激素的再生培養基的成分如下 ： MS 大量元素 +MS 微量元素 + 肌醇 250mg/L+ 鹽酸硫胺素 （維生素 B1） 3.5mg/L+ 煙酸吡哆醇 （維生素 B6） 1.0mg/L+ 煙酸 0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖20～40g/L+MES500mg/L+植物凝膠2500mg/L， pH值為5.8 ； [0013] 所述的蔗糖的含量優選為 30g/L ； [0014] 步驟 （2） 中所述的光照度優選為 16000lux ； [0015] 步驟 （2） 中所述的培養至生出根和芽的時間優選為 4 ～ 7 天 ； [0016] 步驟 （3） 中所述的光照度優選為 30000lux ； [0017] 步驟 （3） 中所述的煉苗的方法優選為 ： 將再生植株小心從培養基中取出， 清水沖 洗靜根部培養基， 然后移栽到裝有花肥土的小花盆中， 澆水后用大小適合的玻璃燒杯倒扣 在花盆上， 此舉目的在于防止剛移栽的植株過度蒸發脫水致死 ； 然后在溫度 26 ～ 28℃、 光 照 30,000lux、 光照 16h/d， 濕度 90 ～ 95% 的培養條件下培養 4 ～ 5 天。 [0018] 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果 ： [0019] （1） 本發明通過改變蔗糖用量來調控組織材料再生培養階段的滲透壓， 從而實現 愈傷組織的高效再生， 全程不需要植物激素。 這一方法不但節約了實驗成本， 而且避免了長 期使用激素對組織材料的毒害， 獲得的再生植株有下列特點 ： ①幼苗株型正常， 根和芽長勢 旺盛， 易于移栽成活， 畸形植株頻率低 ； ②周期短， 從胚壯體誘導到再生植株移到大田僅需 不到 5 周， 現有的再生技術通常需要至少 6 周， 顯著縮短了再生時間。 [0020] （2） 本發明可實現愈傷組織先再生出根， 然后分化再生出芽， 部分實現根芽同步再 生， 再生周期縮短到僅 5 周時間 ； 而且顯著降低再生植株畸形率， 植株可育率明顯提高。 附圖說明 [0021] 圖1為本發明所述的方法誘導出的玉米胚狀體的照片圖 ； 其中 ： a為超甜玉米自交 系 1132 愈傷組織形成的胚狀體 ； b 為 HiII 雜交種愈傷組織形成胚狀體 ； c 為超甜玉米自交 系日超 -1 愈傷組織形成的胚狀體。 [0022] 圖 2 為再生培養基上形成的幼苗的照片圖 ； 其中 ： a 為超甜玉米自交系 1132 胚狀 體再生的幼苗 ； b 為 HiII 雜交種胚狀體再生的幼苗 ； c 為超甜玉米自交系日超 -1 胚狀體再 生的幼苗。 [0023] 圖 3 為再生培養 2 周時的再生植株的照片圖， 其中 ： a 為超甜玉米自交系 1132 再 生植株 ； b 為 HiII 雜交種再生植株 ； c 為超甜玉米自交系日超 -1 再生植株。 [0024] 圖 4 為使用現有技術即含激素的愈傷組織再生方法得到的胚狀體和再生植株的 照片圖， 其中 ： a 為 ABA 作用下誘導出的胚狀體 ； b 為 6-BA 和 NAA 作用下再生的植株 ； c 為 IBA 和 NAA 作用下誘導根再生 ； d 為誘導出的再生根。 具體實施方式 [0025] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述， 但本發明的實施方式不限 于此。 [0026] 實施例 1 ： 再生培養基中蔗糖含量對超甜玉米自交系 1132 分化再生的影響 說 明 書 CN 103444525 A 4 3/6 頁 5 [0027] （1） 挑選松脆、 顆粒狀長勢良好的超甜玉米自交系 1132（已在 “李余良， 多個抗蟲 基因轉化超甜玉米的研究 [D]. 華南農業大學 ； 2004 年” 公開） 愈傷組織， 將其分別轉接到 含蔗糖 20,000mg/L、 40,000mg/L、 60,000mg/L、 80,000mg/L 的胚狀體誘導培養基上培養。胚 狀體誘導培養基成分為 ： MS 大量元素 （即 MS 培養基中的大量元素） +MS 微量元素 （即 MS 培 養基中的微量元素） + 肌醇 250mg/L+ 鹽酸硫胺素 （維生素 B1） 3.5mg/L+ 煙酸吡哆醇 （維生 素 B6） 1.0mg/L+ 煙酸 0.5mg/L+ 甘氨酸 4.0mg/L+ 蔗糖 （濃度分別為 20,000mg/L、 40,000mg/ L、 60,000mg/L 和 80,000mg/L） + 脯氨酸 300mg/L+ 水解酪蛋白 100mg/L+MES500mg/L+ 植 物凝膠 2500mg/L， pH5.8。培養溫度 24 ～ 26℃， 培養到第三周 （第 20 天） 時觀察發現 ： 在 含蔗糖 20,000mg/L 的培養基上， 有少量胚狀體形成， 且再生出少量的根， 但無芽點再生出 來 ； 在含蔗糖 40,000mg/L 的培養基上， 胚狀體較 20,000mg/L 的培養基上多， 同樣只再生 出根而無芽再生 ； 在含蔗糖 60,000mg/L 的培養基上， 有大量胚狀體形成， 布滿每塊愈傷組 織， 并且每塊愈傷組織上均再生出根和少量芽點 ； 在含蔗糖 80,000mg/L 的培養基上， 胚狀 體較 60,000mg/L 的培養基上少， 與 40,000mg/L 的培養基上的相當， 但是胚狀體的長勢較 40000mg/L 的培養基的差， 同樣只再生出根而無芽再生。綜合考慮胚狀體多少、 是否分化出 根和芽等情況， 可見蔗糖含量為 60,000mg/L 的胚狀體誘導培養基分化出根和芽的情況明 顯優于其他蔗糖濃度的胚狀體誘導培養基。 [0028] （2） 將步驟 （1） 中在含蔗糖 60,000mg/L 的胚狀體培養基上的胚狀體轉接到分別 含蔗糖 20,000mg/L、 30,000mg/L、 40,000mg/L 的再生培養基培養。再生培養基成分 ： MS 大 量元素 +MS 微量元素 + 肌醇 250mg/L+ 鹽酸硫胺素 （維生素 B1） 3.5mg/L+ 煙酸吡哆醇 （維生 素 B6） 1.0mg/L+ 煙酸 0.5mg/L+ 甘氨酸 4.0mg/L+ 蔗糖 （濃度分別為 20,000mg/L、 30,000mg/ L、 40,000mg/L） +MES500mg/L+ 植物凝膠 2500mg/L， pH5.8。培養溫度 24 ～ 26℃， 光照度 12,000 ～ 18,000lux（分設 12,000lux、 14,000lux、 16,000lux、 18,000lux 四個光強度梯 度） ， 光照 16h/d， 培養到第 4 天時觀察發現 ： 1） 蔗糖濃度一定 （30,000mg/L） ， 胚狀體在四個 光照度條件下均可誘導芽的分化再生， 但是隨著光照強度的增加， 再生出芽點的時間逐漸 延長， 如在 12,000lux 條件下再生出芽點時間比 18,000lux 條件下提前 1 ～ 2 天， 但芽的綠 色較18,000lux淡， 長勢也較弱。 綜合考慮芽再生時間和長勢， 16,000lux的光照度較理想 ； 2） 光照強度一定 （16,000lux） ， 在含蔗糖 20,000mg/L 的培養基上， 組織塊分化出根和芽， 芽 的長勢比根旺盛， 芽長約 3.5cm， 而根少 （只有 2 條） ； 在含蔗糖 30,000mg/L 的培養基上， 組 織塊也分化出根和芽， 且根和芽的長勢均很旺盛， 芽長約 2.5cm， 根有 5 ～ 7 條 ； 在含蔗糖 40,000mg/L的培養基上， 組織塊分化出茂密的根， 未見明顯的芽長出。 綜合考慮根和芽的長 勢及根的多少， 可見蔗糖含量為 30,000mg/L 的再生培養基得到的再生植株的根和芽是最 優的。 [0029] （3） 將步驟 （2） 中含蔗糖 30,000mg/L 的再生培養基連同再生植株一起轉移到溫 度 26 ～ 28℃、 光照度 24,000 ～ 30,000lux、 光照 16h/d 的培養條件下繼續培養， 5 天后 觀察發現 ： 光照度在 24,000 ～ 30,000lux 區間， 均可實現壯苗、 壯根培養， 但是光照度為 30,000lux 條件下， 再生苗的顏色濃綠， 最為理想 ； 本發明所用人工氣候箱為寧波江南儀器 廠的 RXZ-500。經此階段培養的再生植株即可煉苗移栽。此時再生植株根系發達， 苗株健 壯。 [0030] 實施例 2 ： 以超甜玉米自交系 1132 愈傷組織進行再生培養 說 明 書 CN 103444525 A 5 4/6 頁 6 [0031] （1） 挑選松脆、 呈顆粒狀長勢良好愈傷組織 72 塊， 將其轉接到倒有胚狀體誘導培 養基的培養皿上培養， 每個培養皿 （直徑 10cm） 上放置 6 塊愈傷組織。胚狀體誘導培養基 成分為 ： MS 大量元素 +MS 微量元素 + 肌醇 250mg/L+ 鹽酸硫胺素 （維生素 B1） 3.5mg/L+ 煙 酸吡哆醇 （維生素 B6） 1.0mg/L+ 煙酸 0.5mg/L+ 甘氨酸 4.0mg/L+ 蔗糖 60,000mg/L+ 脯氨酸 300mg/L+ 水解酪蛋白 100mg/L+MES500mg/L+ 植物凝膠 2500mg/L， pH5.8， 培養溫度 25℃， 培 養 3 周時所有愈傷組織上全誘導出胚狀體， 胚狀體的形態如圖 1a 所示。 [0032] （2） 將步驟 （1） 中得到的 72 塊胚狀體轉接到含再生培養基的玻璃培養瓶中培養再 生幼苗， 每瓶 1 ～ 2 塊組織。再生培養基成分 ： MS 大量元素 +MS 微量元素 + 肌醇 250mg/L+ 鹽酸硫胺素 （維生素 B1） 3.5mg/L+ 煙酸吡哆醇 （維生素 B6） 1.0mg/L+ 煙酸 0.5mg/L+ 甘氨酸 4.0mg/L+ 蔗糖 30,000mg/L+MES500mg/L+ 植物凝膠 2500mg/L， pH5.8， 培養溫度 25℃， 光照 度 16,000lux， 光照 16h/d， 約 1 周 （第 5 天） 有 70 塊組織上再生出根和芽 （圖 2a） 。再生效 率 97%（再生效率 = 再生出根和芽的組織塊數 / 再生培養的組織總塊數） ， 每個組織塊上分 化出 1 ～ 3 個幼芽， 但多數為 1 個幼芽。 [0033] （3） 將步驟 （2） 得到的再生植株轉移到溫度 26 ～ 28℃、 光照 30,000lux、 光照 16h/ d 的培養條件下 （培養基相同） 繼續培養 1 周， 此時再生植株根系繁茂， 移栽成活率高 （如圖 3a所示） 。 接著移栽煉苗， 移栽煉苗的方法和條件是 ： 將再生植株小心從培養基中取出， 清水 沖洗靜根部培養基， 然后移栽到裝有花肥土的小花盆中， 澆水后用大小適合的玻璃燒杯倒 扣在花盆上 （此舉目的在于防止剛移栽的植株過度蒸發脫水致死） ， 然后在溫度 26 ～ 28℃、 光照 30,000lux、 光照 16h/d， 濕度 90 ～ 95% 的培養條件下培養 4 ～ 5 天即可移栽到田間。 本實施例中， 煉苗移栽 68 株， 田間成活 67 株， 株型正常， 移栽成活率 98%（移栽成活率 = 田 間成活株數 / 煉苗移栽株數） 。 [0034] 實施例 3 ： 以 HiII 愈傷組織進行再生培養 [0035] （1） 挑選松脆、 呈顆粒狀長勢良好的 HiII（已在 “馬云霞等 . 農桿菌介導的抗草甘 膦基因 （sxglr-11） 的玉米遺傳轉化 , 山西農業科學 ,2009,6” 公開） 愈傷組織 90 塊， 將其 轉接到倒有胚狀體誘導培養基的培養皿上培養， 每個培養皿 （直徑 10cm） 上放置 6 塊愈傷組 織。胚狀體誘導培養基成分為 ： MS 大量元素 +MS 微量元素 + 肌醇 250mg/L+ 鹽酸硫胺素 （維 生素 B1） 3.5mg/L+ 煙酸吡哆醇 （維生素 B6） 1.0mg/L+ 煙酸 0.5mg/L+ 甘氨酸 4.0mg/L+ 蔗 糖 60,000mg/L+ 脯氨酸 300mg/L+ 水解酪蛋白 100mg/L+MES500mg/L+ 植物凝膠 2500mg/L， pH5.8， 培養溫度 25℃， 培養 3 周 （20 天） 時所有愈傷組織上全誘導出胚狀體， 胚狀體的形態 如圖 1b 所示。 [0036] （2） 將步驟 （1） 得到的 90 塊胚狀體轉接到含再生培養基的玻璃培養瓶中培養再 生幼苗， 每瓶 1 ～ 2 塊組織。再生培養基成分 ： MS 大量元素 +MS 微量元素 + 肌醇 250mg/L+ 鹽酸硫胺素 （維生素 B1） 3.5mg/L+ 煙酸吡哆醇 （維生素 B6） 1.0mg/L+ 煙酸 0.5mg/L+ 甘氨酸 4.0mg/L+ 蔗糖 30,000mg/L+MES500mg/L+ 植物凝膠 2500mg/L， pH5.8， 培養溫度 25℃， 光照 度 16,000lux， 光照 16h/d， 培養約 1 周 （第 5 天） 有 90 塊組織上再生出根和芽 （圖 2b） 。再 生效率 100% （再生效率 = 再生出根和芽的組織塊數 / 再生培養的組織總塊數） ， 每個組織塊 上分化出 1 ～ 3 個幼芽， 但多數為 1 個幼芽。 [0037] （3）將步驟 （2）得到的再生植株連同培養基轉移到溫度 26 ～ 28℃、 光照 30,000lux、 光照 16h/d 的培養條件下繼續培養 1 周， 如圖 3b 所示， 此時再生植株根系繁茂， 說 明 書 CN 103444525 A 6 5/6 頁 7 移栽成活率高。接著移栽煉苗， 操作同實施例 2。本實施例中， 煉苗移栽 90 株， 田間成活 90 株， 株型正常， 移栽成活率 100%（移栽成活率 = 田間成活株數 / 煉苗移栽株數） 。 [0038] 實施例 4 ： 以超甜玉米自交系日超 -1 愈傷組織進行再生培養 [0039] （1） 挑選松脆、 呈顆粒狀長勢良好的日超 -1（已在 “李高科等 . 優質、 抗逆甜玉米 群體配合力及遺傳潛勢分析 , 中國農學通報 ,2008,9” 公開） 愈傷組織 60 塊， 將其轉接到倒 有胚狀體誘導培養基的培養皿上培養， 每個培養皿 （直徑 10cm） 上放置 6 塊愈傷組織。胚狀 體誘導培養基成分為 ： MS 大量元素 +MS 微量元素 + 肌醇 250mg/L+ 鹽酸硫胺素 （維生素 B1） 3.5mg/L+煙酸吡哆醇 （維生素B6） 1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖60,000mg/ L+ 脯氨酸 300mg/L+ 水解酪蛋白 100mg/L+MES500mg/L+ 植物凝膠 2500mg/L， pH5.8， 培養溫 度 25℃， 培養約 4 周 （第 23 天） 時 59 塊愈傷組織上誘導出胚狀體， 胚狀體的形態如圖 1c 所 示。 [0040] （2） 將步驟 （1） 得到的 59 塊胚狀體轉接到含再生培養基的玻璃培養瓶中培養再 生幼苗， 每瓶 1 ～ 2 塊組織。再生培養基成分 ： MS 大量元素 +MS 微量元素 + 肌醇 250mg/L+ 鹽酸硫胺素 （維生素 B1） 3.5mg/L+ 煙酸吡哆醇 （維生素 B6） 1.0mg/L+ 煙酸 0.5mg/L+ 甘氨酸 4.0mg/L+ 蔗糖 30,000mg/L+MES500mg/L+ 植物凝膠 2500mg/L， pH5.8， 培養溫度 25℃， 光照 度 16,000lux， 光照 16h/d， 培養 1 周 （第 7 天） 有 56 塊組織上再生出根和芽 （圖 2c） 。再生 效率 95%（再生效率 = 再生出根和芽的組織塊數 / 再生培養的組織總塊數） ， 每個組織塊上 分化出 1 ～ 3 個幼芽， 但多數為 1 個幼芽。 [0041] （3） 將 （2） 中再生植株連同培養基轉移到溫度 26 ～ 28℃、 光照 30,000lux、 光照 16h/d 的培養條件下繼續培養 1 周， 如圖 3c 所示， 此時再生植株根系繁茂， 移栽成活率高。 接著移栽煉苗， 操作同實施例 2。本實施例中， 煉苗移栽 55 株， 成活 55 株， 株型正常。移栽 成活率 100%（移栽成活率 = 田間成活株數 / 煉苗移栽株數） 。 [0042] 對比例 1 ： 原有方法再生培養超甜玉米自交系 1132 愈傷組織 [0043] （1） 挑選松脆、 呈顆粒狀長勢良好的愈傷組織 60 塊， 將其轉接到含脫落酸 （ABA） 的繼代培養基誘導胚狀體， 每個培養皿 （直徑 10cm） 上放置 6 塊愈傷組織。繼代培養基成 分為 ： N6 大量元素 （N6 培養基中的大量元素） +B5 維生素 + 谷氨酰胺 300mg/L+ 水解酪蛋白 500mg/L+脯氨酸700mg/L+蔗糖20,000mg/L+AgNO3900mg/L+ABA3.0mg/L+植物凝膠2700mg/ L， pH5.8， 培養溫度 26 ～ 28℃， 培養 3 周后 （第 23 天） 有 58 塊愈傷組織上誘導出胚狀體。但 此種方法誘導的胚狀體與本發明方法相比， 出現第一個胚狀體的時間延遲 1 周左右， 且長 出幼芽的組織均無根長出， 如圖 4a 所示為胚狀體。 [0044] （2） 將步驟 （1） 得到的 58 塊胚狀體轉接到含激素的再生培養基上再生幼苗。含激 素再生培養基成分 ： MS 大量元素 +MS 微量元素 +B5 維生素 + 谷氨酰胺 300mg/L+ 水解酪蛋 白 500mg/L+ 蔗糖 20,000mg/L+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+ 植物凝膠 2700mg/L， pH5.8， 培養溫 度 26 ～ 28℃， 光照度 16,000lux， 光照 16h/d， 培養 2 周 （第 14 天） 有 47 塊組織上再生出幼 苗， 其余均變成無芽的綠色組織， 有芽或無芽的分化組織均無根長出 （圖 4b） 。再生效率 81% （再生效率 = 再生出根或芽的組織塊數 / 再生培養的組織總塊數） 。 [0045] （3） 將 （2） 中再生植株轉移到生根培養基， 溫度 26 ～ 28℃、 光照 16h/d， 30,000lux 的培養條件下誘導根再生。 生根培養基成分 ： 1/2MS基本培養基 （MS培養基中各物質的濃度 減少一半） + 蔗糖 10,000mg/L+IBA3.0mg/L+NAA0.1mg/L+ 植物凝膠 2700mg/L， pH5.8。第一 說 明 書 CN 103444525 A 7 6/6 頁 8 周再生植株均無根長出 （圖 4c） ， 第 2 周開始相繼有根長出， 但此種方法再生出的根根毛稀 少， 而且由于根部畸形膨大使得根系脆而易斷 （圖 4d） ， 難以成功移栽。另外， 此種方法進行 根再生培養， 植株基部與培養基接觸部位易褐化， 導致極難再生根。本實施例中， 煉苗移栽 22 株， 成活 16 株， 14 株株型正常。移栽成活率 73%（移栽成活率 = 田間成活株數 / 煉苗移 栽株數） 。 [0046] 上述實施例為本發明較佳的實施方式， 但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制， 其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、 修飾、 替代、 組合、 簡化， 均應為等效的置換方式， 都包含在本發明的保護范圍之內。 說 明 書 CN 103444525 A 8 1/2 頁 9 圖 1 圖 2 圖 3 說 明 書 附 圖 CN 103444525 A 9 2/2 頁 10 圖 4 說 明 書 附 圖 CN 103444525 A 10