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一種無激素的玉米愈傷組織再生方法.pdf

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一種 激素 玉米 組織 再生 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310357188.0

申請日:

2013.08.15

公開號:

CN103444525B

公開日:

2014.12.24

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A01H 4/00申請日:20130815|||公開
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 廣東省農業科學院作物研究所
發明人: 祁喜濤; 胡建廣; 吳景
地址: 510640 廣東省廣州市天河區五山路金穎西二街18號
優先權:
專利代理機構: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245 代理人: 蘇運貞;裘暉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310357188.0

授權公告號:

103444525B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.24|||2014.01.15|||2013.12.18

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開一種無激素的玉米愈傷組織再生方法。將長勢良好、呈顆粒狀的玉米愈傷組織培養在無激素的胚狀體誘導培養基上,于24~26℃培養20~23天,誘導產生胚狀體;將胚狀體轉接到無激素的再生培養基上,培養溫度為24~26℃,光照度為12000~18000lux,每天的光照時間為16h,培養至生出根和芽,得到再生植株;將再生植株于如下條件下繼續培養6~7天進行壯苗即可:26~28℃、24000~30000lux,每天光照時間為16h。本發明通過改變蔗糖用量來調控再生培養階段的滲透壓,從而實現愈傷組織的高效再生,全程不需要植物激素。這一方法不但節約了實驗成本,而且避免了長期使用激素對組織材料的毒害。

權利要求書

權利要求書
1.  一種無激素的玉米愈傷組織再生方法,其特征在于包含如下步驟:
(1)將長勢良好、呈顆粒狀的玉米愈傷組織培養在胚狀體誘導培養基上,于24~26℃培養20~23天,誘導產生胚狀體;
(2)將步驟(1)得到的胚狀體轉接到無激素的再生培養基上,培養溫度為24~26℃,光照度為12000~18000lux,每天的光照時間為16h,培養至生出根和芽,得到再生植株;
(3)將步驟(2)得到再生植株于如下條件下繼續培養6~7天進行壯苗即可:26~28℃、24000~30000lux,每天的光照時間為16h;
步驟(1)中所述的胚狀體誘導培養基的成分如下:MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+鹽酸硫胺素3.5mg/L+煙酸吡哆醇1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖40~80g/L+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白100mg/L+MES500mg/L+植物凝膠2500mg/L,pH值為5.8;
步驟(2)中所述的無激素的再生培養基的成分如下:MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+鹽酸硫胺素3.5mg/L+煙酸吡哆醇1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖20~40g/L+MES500mg/L+植物凝膠2500mg/L,pH值為5.8。

2.  根據權利要求1所述的無激素的玉米愈傷組織再生方法,其特征在于:步驟(1)中所述的玉米愈傷組織為超甜玉米自交系1132、超甜玉米自交系日超-1或HiII雜交種的玉米愈傷組織。

3.  根據權利要求1所述的無激素的玉米愈傷組織再生方法,其特征在于:步驟(1)中所述的胚狀體誘導培養基中的蔗糖含量為60g/L。

4.  根據權利要求1所述的無激素的玉米愈傷組織再生方法,其特征在于:步驟(2)中所述的無激素的再生培養基中的蔗糖含量為30g/L。

5.  根據權利要求1所述的無激素的玉米愈傷組織再生方法,其特征在于:步驟(2)中所述的光照度為16000lux。

6.  根據權利要求1所述的無激素的玉米愈傷組織再生方法,其特征在于:步驟(2)中所述的培養至生出根和芽的時間為4~7天。

7.  根據權利要求1所述的無激素的玉米愈傷組織再生方法,其特征在于:步驟(3)中所述的光照度為30000lux。

說明書

說明書一種無激素的玉米愈傷組織再生方法
技術領域
本發明屬于植物組織培養技術領域,特別涉及一種無激素的玉米愈傷組織再生方法。
背景技術
高效再生系統的建立是玉米基因工程育種的關鍵。現有的玉米再生技術無不依賴生長素和細胞分裂素,這些植物激素主要包括萘乙酸(NAA)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、脫落酸(ABA)等。現有的玉米再生方法通常為:首先在含生長素的誘導培養基上誘導出松脆、呈顆粒狀且生長旺盛的愈傷組織,將這些愈傷組織轉移到含NAA(0.1~0.3mg/L)+6-BA(2~4mg/L)或其它激素組合的再生培養基上誘導植株再生,然后將再生植株轉移到含NAA(0.1~0.3mg/L)或NAA(0.1~0.3mg/L)+IBA(0.3~0.5mg/L)的生根培養基誘導根再生;也有部分方法為在再生培養之前進行預處理,在這個階段通常需要添加ABA(3~6mg/L)。
此類再生方法不僅操作步驟多且耗時長,而且常常造成以下不良后果:1)長時間在含激素的培養基上誘導生長,玉米基因組變異頻率增加,再生植株畸形率較高,甚至因激素中毒而死亡;2)這種先再生植株后生根的方式,生根時間長,經常出現根系膨大,根毛少,生根率低,影響后期的田間生長。利用現有再生植株再生技術嚴重束縛基因工程育種技術在玉米育種生產中的應用。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足,提供一種無激素的玉米愈傷組織再生方法。
本發明的目的通過下述技術方案實現:一種無激素的玉米愈傷組織再生方法,包含如下步驟:
(1)將長勢良好、呈顆粒狀的玉米愈傷組織培養在胚狀體誘導培養基上,于24~26℃培養20~23天,誘導產生胚狀體;
(2)將步驟(1)得到的胚狀體轉接到無激素的再生培養基上,培養溫度 為24~26℃,光照度為12000~18000lux,每天的光照時間為16h,培養至生出根和芽,得到再生植株;
(3)將步驟(2)得到再生植株于如下條件下繼續培養6~7天進行壯苗:26~28℃、24000~30000lux,每天的光照時間為16h;即可煉苗移栽至田間;
步驟(1)中所述的玉米愈傷組織為任何可繼代的長勢良好的玉米愈傷組織,優選為超甜玉米自交系1132、超甜玉米自交系日超-1或HiII雜交種的玉米愈傷組織;
步驟(1)中所述的胚狀體誘導培養基的成分如下:MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+鹽酸硫胺素(維生素B1)3.5mg/L+煙酸吡哆醇(維生素B6)1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖40~80g/L+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白100mg/L+MES(2-嗎啉乙磺酸)500mg/L+植物凝膠2500mg/L,pH值為5.8;
所述的蔗糖的含量優選為60g/L;
步驟(2)中所述的無激素的再生培養基的成分如下:MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+鹽酸硫胺素(維生素B1)3.5mg/L+煙酸吡哆醇(維生素B6)1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖20~40g/L+MES500mg/L+植物凝膠2500mg/L,pH值為5.8;
所述的蔗糖的含量優選為30g/L;
步驟(2)中所述的光照度優選為16000lux;
步驟(2)中所述的培養至生出根和芽的時間優選為4~7天;
步驟(3)中所述的光照度優選為30000lux;
步驟(3)中所述的煉苗的方法優選為:將再生植株小心從培養基中取出,清水沖洗靜根部培養基,然后移栽到裝有花肥土的小花盆中,澆水后用大小適合的玻璃燒杯倒扣在花盆上,此舉目的在于防止剛移栽的植株過度蒸發脫水致死;然后在溫度26~28℃、光照30,000lux、光照16h/d,濕度90~95%的培養條件下培養4~5天。
本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:
(1)本發明通過改變蔗糖用量來調控組織材料再生培養階段的滲透壓,從而實現愈傷組織的高效再生,全程不需要植物激素。這一方法不但節約了實驗成本,而且避免了長期使用激素對組織材料的毒害,獲得的再生植株有下列特點:①幼苗株型正常,根和芽長勢旺盛,易于移栽成活,畸形植株頻率低;②周期短,從胚壯體誘導到再生植株移到大田僅需不到5周,現有的再生技術通 常需要至少6周,顯著縮短了再生時間。
(2)本發明可實現愈傷組織先再生出根,然后分化再生出芽,部分實現根芽同步再生,再生周期縮短到僅5周時間;而且顯著降低再生植株畸形率,植株可育率明顯提高。
附圖說明
圖1為本發明所述的方法誘導出的玉米胚狀體的照片圖;其中:a為超甜玉米自交系1132愈傷組織形成的胚狀體;b為HiII雜交種愈傷組織形成胚狀體;c為超甜玉米自交系日超-1愈傷組織形成的胚狀體。
圖2為再生培養基上形成的幼苗的照片圖;其中:a為超甜玉米自交系1132胚狀體再生的幼苗;b為HiII雜交種胚狀體再生的幼苗;c為超甜玉米自交系日超-1胚狀體再生的幼苗。
圖3為再生培養2周時的再生植株的照片圖,其中:a為超甜玉米自交系1132再生植株;b為HiII雜交種再生植株;c為超甜玉米自交系日超-1再生植株。
圖4為使用現有技術即含激素的愈傷組織再生方法得到的胚狀體和再生植株的照片圖,其中:a為ABA作用下誘導出的胚狀體;b為6-BA和NAA作用下再生的植株;c為IBA和NAA作用下誘導根再生;d為誘導出的再生根。
具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述,但本發明的實施方式不限于此。
實施例1:再生培養基中蔗糖含量對超甜玉米自交系1132分化再生的影響
(1)挑選松脆、顆粒狀長勢良好的超甜玉米自交系1132(已在“李余良,多個抗蟲基因轉化超甜玉米的研究[D].華南農業大學;2004年”公開)愈傷組織,將其分別轉接到含蔗糖20,000mg/L、40,000mg/L、60,000mg/L、80,000mg/L的胚狀體誘導培養基上培養。胚狀體誘導培養基成分為:MS大量元素(即MS培養基中的大量元素)+MS微量元素(即MS培養基中的微量元素)+肌醇250mg/L+鹽酸硫胺素(維生素B1)3.5mg/L+煙酸吡哆醇(維生素B6)1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖(濃度分別為20,000mg/L、40,000mg/L、60,000mg/L和80,000mg/L)+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白100mg/L+MES500mg/L+植物凝膠2500mg/L,pH5.8。培養溫度24~26℃,培養到第三周(第20天)時觀察發現:在含蔗糖20,000mg/L的培養基上,有少量胚狀體形成,且再生出少量的根, 但無芽點再生出來;在含蔗糖40,000mg/L的培養基上,胚狀體較20,000mg/L的培養基上多,同樣只再生出根而無芽再生;在含蔗糖60,000mg/L的培養基上,有大量胚狀體形成,布滿每塊愈傷組織,并且每塊愈傷組織上均再生出根和少量芽點;在含蔗糖80,000mg/L的培養基上,胚狀體較60,000mg/L的培養基上少,與40,000mg/L的培養基上的相當,但是胚狀體的長勢較40000mg/L的培養基的差,同樣只再生出根而無芽再生。綜合考慮胚狀體多少、是否分化出根和芽等情況,可見蔗糖含量為60,000mg/L的胚狀體誘導培養基分化出根和芽的情況明顯優于其他蔗糖濃度的胚狀體誘導培養基。
(2)將步驟(1)中在含蔗糖60,000mg/L的胚狀體培養基上的胚狀體轉接到分別含蔗糖20,000mg/L、30,000mg/L、40,000mg/L的再生培養基培養。再生培養基成分:MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+鹽酸硫胺素(維生素B1)3.5mg/L+煙酸吡哆醇(維生素B6)1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖(濃度分別為20,000mg/L、30,000mg/L、40,000mg/L)+MES500mg/L+植物凝膠2500mg/L,pH5.8。培養溫度24~26℃,光照度12,000~18,000lux(分設12,000lux、14,000lux、16,000lux、18,000lux四個光強度梯度),光照16h/d,培養到第4天時觀察發現:1)蔗糖濃度一定(30,000mg/L),胚狀體在四個光照度條件下均可誘導芽的分化再生,但是隨著光照強度的增加,再生出芽點的時間逐漸延長,如在12,000lux條件下再生出芽點時間比18,000lux條件下提前1~2天,但芽的綠色較18,000lux淡,長勢也較弱。綜合考慮芽再生時間和長勢,16,000lux的光照度較理想;2)光照強度一定(16,000lux),在含蔗糖20,000mg/L的培養基上,組織塊分化出根和芽,芽的長勢比根旺盛,芽長約3.5cm,而根少(只有2條);在含蔗糖30,000mg/L的培養基上,組織塊也分化出根和芽,且根和芽的長勢均很旺盛,芽長約2.5cm,根有5~7條;在含蔗糖40,000mg/L的培養基上,組織塊分化出茂密的根,未見明顯的芽長出。綜合考慮根和芽的長勢及根的多少,可見蔗糖含量為30,000mg/L的再生培養基得到的再生植株的根和芽是最優的。
(3)將步驟(2)中含蔗糖30,000mg/L的再生培養基連同再生植株一起轉移到溫度26~28℃、光照度24,000~30,000lux、光照16h/d的培養條件下繼續培養,5天后觀察發現:光照度在24,000~30,000lux區間,均可實現壯苗、壯根培養,但是光照度為30,000lux條件下,再生苗的顏色濃綠,最為理想;本發明所用人工氣候箱為寧波江南儀器廠的RXZ-500。經此階段培養的再生植株即可煉苗移栽。此時再生植株根系發達,苗株健壯。
實施例2:以超甜玉米自交系1132愈傷組織進行再生培養
(1)挑選松脆、呈顆粒狀長勢良好愈傷組織72塊,將其轉接到倒有胚狀體誘導培養基的培養皿上培養,每個培養皿(直徑10cm)上放置6塊愈傷組織。胚狀體誘導培養基成分為:MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+鹽酸硫胺素(維生素B1)3.5mg/L+煙酸吡哆醇(維生素B6)1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖60,000mg/L+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白100mg/L+MES500mg/L+植物凝膠2500mg/L,pH5.8,培養溫度25℃,培養3周時所有愈傷組織上全誘導出胚狀體,胚狀體的形態如圖1a所示。
(2)將步驟(1)中得到的72塊胚狀體轉接到含再生培養基的玻璃培養瓶中培養再生幼苗,每瓶1~2塊組織。再生培養基成分:MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+鹽酸硫胺素(維生素B1)3.5mg/L+煙酸吡哆醇(維生素B6)1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖30,000mg/L+MES500mg/L+植物凝膠2500mg/L,pH5.8,培養溫度25℃,光照度16,000lux,光照16h/d,約1周(第5天)有70塊組織上再生出根和芽(圖2a)。再生效率97%(再生效率=再生出根和芽的組織塊數/再生培養的組織總塊數),每個組織塊上分化出1~3個幼芽,但多數為1個幼芽。
(3)將步驟(2)得到的再生植株轉移到溫度26~28℃、光照30,000lux、光照16h/d的培養條件下(培養基相同)繼續培養1周,此時再生植株根系繁茂,移栽成活率高(如圖3a所示)。接著移栽煉苗,移栽煉苗的方法和條件是:將再生植株小心從培養基中取出,清水沖洗靜根部培養基,然后移栽到裝有花肥土的小花盆中,澆水后用大小適合的玻璃燒杯倒扣在花盆上(此舉目的在于防止剛移栽的植株過度蒸發脫水致死),然后在溫度26~28℃、光照30,000lux、光照16h/d,濕度90~95%的培養條件下培養4~5天即可移栽到田間。本實施例中,煉苗移栽68株,田間成活67株,株型正常,移栽成活率98%(移栽成活率=田間成活株數/煉苗移栽株數)。
實施例3:以HiII愈傷組織進行再生培養
(1)挑選松脆、呈顆粒狀長勢良好的HiII(已在“馬云霞等.農桿菌介導的抗草甘膦基因(sxglr-11)的玉米遺傳轉化,山西農業科學,2009,6”公開)愈傷組織90塊,將其轉接到倒有胚狀體誘導培養基的培養皿上培養,每個培養皿(直徑10cm)上放置6塊愈傷組織。胚狀體誘導培養基成分為:MS大量元素+MS 微量元素+肌醇250mg/L+鹽酸硫胺素(維生素B1)3.5mg/L+煙酸吡哆醇(維生素B6)1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖60,000mg/L+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白100mg/L+MES500mg/L+植物凝膠2500mg/L,pH5.8,培養溫度25℃,培養3周(20天)時所有愈傷組織上全誘導出胚狀體,胚狀體的形態如圖1b所示。
(2)將步驟(1)得到的90塊胚狀體轉接到含再生培養基的玻璃培養瓶中培養再生幼苗,每瓶1~2塊組織。再生培養基成分:MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+鹽酸硫胺素(維生素B1)3.5mg/L+煙酸吡哆醇(維生素B6)1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖30,000mg/L+MES500mg/L+植物凝膠2500mg/L,pH5.8,培養溫度25℃,光照度16,000lux,光照16h/d,培養約1周(第5天)有90塊組織上再生出根和芽(圖2b)。再生效率100%(再生效率=再生出根和芽的組織塊數/再生培養的組織總塊數),每個組織塊上分化出1~3個幼芽,但多數為1個幼芽。
(3)將步驟(2)得到的再生植株連同培養基轉移到溫度26~28℃、光照30,000lux、光照16h/d的培養條件下繼續培養1周,如圖3b所示,此時再生植株根系繁茂,移栽成活率高。接著移栽煉苗,操作同實施例2。本實施例中,煉苗移栽90株,田間成活90株,株型正常,移栽成活率100%(移栽成活率=田間成活株數/煉苗移栽株數)。
實施例4:以超甜玉米自交系日超-1愈傷組織進行再生培養
(1)挑選松脆、呈顆粒狀長勢良好的日超-1(已在“李高科等.優質、抗逆甜玉米群體配合力及遺傳潛勢分析,中國農學通報,2008,9”公開)愈傷組織60塊,將其轉接到倒有胚狀體誘導培養基的培養皿上培養,每個培養皿(直徑10cm)上放置6塊愈傷組織。胚狀體誘導培養基成分為:MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+鹽酸硫胺素(維生素B1)3.5mg/L+煙酸吡哆醇(維生素B6)1.0mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖60,000mg/L+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白100mg/L+MES500mg/L+植物凝膠2500mg/L,pH5.8,培養溫度25℃,培養約4周(第23天)時59塊愈傷組織上誘導出胚狀體,胚狀體的形態如圖1c所示。
(2)將步驟(1)得到的59塊胚狀體轉接到含再生培養基的玻璃培養瓶中培養再生幼苗,每瓶1~2塊組織。再生培養基成分:MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+鹽酸硫胺素(維生素B1)3.5mg/L+煙酸吡哆醇(維生素B6)1.0 mg/L+煙酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖30,000mg/L+MES500mg/L+植物凝膠2500mg/L,pH5.8,培養溫度25℃,光照度16,000lux,光照16h/d,培養1周(第7天)有56塊組織上再生出根和芽(圖2c)。再生效率95%(再生效率=再生出根和芽的組織塊數/再生培養的組織總塊數),每個組織塊上分化出1~3個幼芽,但多數為1個幼芽。
(3)將(2)中再生植株連同培養基轉移到溫度26~28℃、光照30,000lux、光照16h/d的培養條件下繼續培養1周,如圖3c所示,此時再生植株根系繁茂,移栽成活率高。接著移栽煉苗,操作同實施例2。本實施例中,煉苗移栽55株,成活55株,株型正常。移栽成活率100%(移栽成活率=田間成活株數/煉苗移栽株數)。
對比例1:原有方法再生培養超甜玉米自交系1132愈傷組織
(1)挑選松脆、呈顆粒狀長勢良好的愈傷組織60塊,將其轉接到含脫落酸(ABA)的繼代培養基誘導胚狀體,每個培養皿(直徑10cm)上放置6塊愈傷組織。繼代培養基成分為:N6大量元素(N6培養基中的大量元素)+B5維生素+谷氨酰胺300mg/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸700mg/L+蔗糖20,000mg/L+AgNO3900mg/L+ABA3.0mg/L+植物凝膠2700mg/L,pH5.8,培養溫度26~28℃,培養3周后(第23天)有58塊愈傷組織上誘導出胚狀體。但此種方法誘導的胚狀體與本發明方法相比,出現第一個胚狀體的時間延遲1周左右,且長出幼芽的組織均無根長出,如圖4a所示為胚狀體。
(2)將步驟(1)得到的58塊胚狀體轉接到含激素的再生培養基上再生幼苗。含激素再生培養基成分:MS大量元素+MS微量元素+B5維生素+谷氨酰胺300mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖20,000mg/L+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+植物凝膠2700mg/L,pH5.8,培養溫度26~28℃,光照度16,000lux,光照16h/d,培養2周(第14天)有47塊組織上再生出幼苗,其余均變成無芽的綠色組織,有芽或無芽的分化組織均無根長出(圖4b)。再生效率81%(再生效率=再生出根或芽的組織塊數/再生培養的組織總塊數)。
(3)將(2)中再生植株轉移到生根培養基,溫度26~28℃、光照16h/d,30,000lux的培養條件下誘導根再生。生根培養基成分:1/2MS基本培養基(MS培養基中各物質的濃度減少一半)+蔗糖10,000mg/L+IBA3.0mg/L+NAA0.1mg/L+植物凝膠2700mg/L,pH5.8。第一周再生植株均無根長出(圖4c),第2周開始相繼有根長出,但此種方法再生出的根根毛稀少,而且由于根部畸形膨大 使得根系脆而易斷(圖4d),難以成功移栽。另外,此種方法進行根再生培養,植株基部與培養基接觸部位易褐化,導致極難再生根。本實施例中,煉苗移栽22株,成活16株,14株株型正常。移栽成活率73%(移栽成活率=田間成活株數/煉苗移栽株數)。
上述實施例為本發明較佳的實施方式,但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制,其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應為等效的置換方式,都包含在本發明的保護范圍之內。

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鬼佬大哥大 6652280292149848782551769530063258523075369568286492524526647617714059175465653011620294526379998 (function(){ var bp = document.createElement('script'); var curProtocol = window.location.protocol.split(':')[0]; if (curProtocol === 'https') { bp.src = 'https://zz.bdstatic.com/linksubmit/push.js'; } else { bp.src = 'http://push.zhanzhang.baidu.com/push.js'; } var s = document.getElementsByTagName("script")[0]; s.parentNode.insertBefore(bp, s); })();