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一株6氯苯并惡唑酮降解菌及其應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310228247.4

申請日:

2013.06.08

公開號:

CN103333821B

公開日:

2014.12.10

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):C12N 1/20申請日:20130608授權公告日:20141210終止日期:20160608|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 1/20申請日:20130608|||公開
IPC分類號: C12N1/20; A62D3/02(2007.01)I; C12R1/01(2006.01)N; A62D101/28(2007.01)N 主分類號: C12N1/20
申請人: 吳旭平; 南京市第二醫院
發明人: 吳旭平; 楊永峰; 易永祥; 趙偉; 董維亮
地址: 210003 江蘇省南京市鼓樓區鐘阜路1-1號
優先權:
專利代理機構: 南京天華專利代理有限責任公司 32218 代理人: 徐冬濤;傅婷婷
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310228247.4

授權公告號:

|||103333821B||||||

法律狀態公告日:

2017.07.28|||2014.12.10|||2013.11.06|||2013.10.02

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明屬于微生物領域,涉及一株6-氯苯并惡唑酮降解菌及其應用。一株6-氯苯并惡唑酮降解菌Acinetobacter?sp.DL-3,保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏日期為2013年5月21日,保藏號為CCTCC?M2013227。該菌可以在48h內降解20mg·L‐1的6-氯苯并惡唑酮達到95%,有望用于處理醫院廢棄的6-氯苯并惡唑酮藥品,為生物降解處理廢棄藥品提供有用的備選菌。

權利要求書

權利要求書
1.   一株6?氯苯并惡唑酮降解菌Acinetobacter sp.DL?2,保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏日期為2013年5月21日,保藏號為CCTCC M2013227。

2.   權利要求1所述的6?氯苯并惡唑酮降解菌Acinetobacter sp.DL?2在降解6?氯苯并惡唑酮中的應用。

說明書

說明書一株6?氯苯并惡唑酮降解菌及其應用
技術領域
本發明屬于微生物領域,涉及一株6?氯苯并惡唑酮降解菌及其應用。
背景技術
現階段廢棄藥品集中處理主要通過化學方法處理,處理成本較高,處理方法較繁瑣,并且難以避免產生二次污染物。生物降解是利用微生物對藥品進行降解的方法,可將廢棄藥品降解為對環境無害的物質。較之化學處理法,生物降解法具有操作簡單、成本低廉的優點。隨著環保意識的逐漸強化,以及微生物技術的迅猛發展,生物降解集中處理廢棄藥品將成為化學處理方法的一個可替代方法。
6‐氯苯并惡唑酮(氯唑沙宗)為鎮痛類藥品,用于各種急慢性軟組織(肌肉、韌帶)扭傷、挫傷、運動后肌肉酸痛、中樞神經病變引起的肌肉痙攣及慢性筋膜炎,目前尚未發現生物降解6‐氯苯并惡唑酮的報道,因此篩選能夠高效降解6‐氯苯并惡唑酮的菌株,對該類廢棄藥品的生物處理有望提供新的思路。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足,提供一株6?氯苯并惡唑酮降解菌。
本發明的另一目的是提供該降解菌的應用。
本發明的目的可通過如下技術方案實現:
一株6?氯苯并惡唑酮降解菌Acinetobacter sp.DL?2,保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏日期為2013年5月21日,保藏號為CCTCC M2013227。
DL?2(CCTCC M2013227)的形態學特征:Acinetobacter sp.DL?2(CCTCC M2013227)屬于革蘭氏陰性菌,固體LB培養基上菌落呈淡黃色,圓形、光滑、邊緣整齊、凸起。生長周期很快(12h),有多種抗性,能利用五碳糖生長,在臨床上為條件致病菌。
菌株DL?2的生理生化特性見表1:
表1菌株DL?2的生理生化特性

菌株DL?2的培養學特性:
DL?2(CCTCC M2013227)可使用LB培養基培養。DL?2(CCTCC M2013227)在pH5.0‐10.0范圍內生長良好,當pH低于4.0菌株的生長明顯受到抑制(圖9);生長溫度較廣,較低溫度(20℃)對其生長也沒有表現出明顯的抑制作用(圖8)。菌株DL‐2的最適生長NaCl濃度是0‐10g/L,當NaCl濃度大于12g/L時,菌體生長受到抑制(圖7);在以阿拉伯糖為碳源,以有機氮為氮源的培養基中生長較好(圖5、6、10)。對紅霉素比較敏感(圖11)。
所述的6?氯苯并惡唑酮降解菌Acinetobacter sp.DL?2在降解6?氯苯并惡唑酮中的應用。
有益效果:
本發明提供了一株6?氯苯并惡唑酮降解菌Acinetobacter sp.DL?2,該菌可以在48h內降解20mg·L‐1的6?氯苯并惡唑酮達到90%以上,有望用于處理醫院廢棄的6?氯苯并惡唑酮藥品,為生物降解處理廢棄藥品提供有用的備選菌。
附圖說明
圖1菌株DL?2對6?氯苯并噁唑酮的轉化情況紫外掃描圖
圖2DL?2降解6?氯苯并惡唑酮過程中的HPLC圖譜(RT:4.879為母體6?氯苯并惡唑酮,4.493為新產物1,6.249為新產物2)
圖3DL?2的基因組DNA及16SrDNA PCR產物
A圖:DL?2的基因組DNA,其中,M:λ?HindⅢmarker1:DL?2基因組DNA;
B圖:菌株DL?2的16SrDNA PCR產物,其中1:maker,2:陰性對照,3:菌株DL?3的16S rRNA基因擴增產物
圖4菌株DL?2的系統發育樹
圖5降解菌DL?2的碳源利用情況
圖6降解菌DL?2的氮源利用情況
圖7NaCl對菌株DL?2生長的影響
圖8溫度對菌株DL?2生長的影響
圖9初始pH對菌株DL?2的生長的影響
圖10不同C/N對菌株DL?2生長的影響
圖11降解菌株DL?2對抗生素的耐受性
生物材料保藏信息
Acinetobacter sp.DL?2,保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏地址中國武漢武漢大學,保藏日期為2013年5月21日,保藏號為CCTCC M2013227。
具體實施方式
實施例1DL?2的篩選
取5g土樣(采自鎮江市)置于100mL含10mg·L?16?氯苯并惡唑酮的富集培養基(g·L?1:NH4NO31.0g,KH2PO40.5g,K2HPO41.5g,NaCl1.0g,MgSO4·7H2O0.1g,酵母汁0.02g,6?氯苯并惡唑酮0.01g,pH7.0)中,于30℃、180r·min?1培養5d。用紫外掃描儀測定富集液中6?氯苯并惡唑酮的降解情況,發現6?氯苯并惡唑酮被降解后,以10%的接種量接入到20mg·L?16?氯苯并惡唑酮培養基中,繼續富集并測定降解情況,按此方法直至6?氯苯并惡唑酮濃度提高至50mg·L?1,并傳代3次。將6?氯苯并惡唑酮富集液經梯度稀釋后分別涂布于LB平板和以50mg·L?16?氯苯并惡唑酮為唯一碳源的MSM平板(g·L?1:NH4NO31.0g,KH2PO40.5g,K2HPO41.5g,NaCl1.0g,MgSO4·7H2O0.1g,6?氯苯并惡唑酮0.05g,瓊脂1.8g,pH7.0)上,于30℃培養箱中分別培養2d和7d。將兩種平板上長出的菌落形態不同的單菌落分別劃線于LB平板純化,并接種于以20mg·L?16?氯苯并惡唑酮為唯一碳源的液體無機鹽培養基(無機鹽培養基,g·L?1:NH4NO31.0g,KH2PO40.5g,K2HPO41.5g,NaCl1.0g,MgSO4·7H2O0.1g,6?氯苯并惡唑酮0.02g,pH7.0)中,于30℃、180r·min?1搖床培養2d后,在待測定的樣品中加入等體積的二氯甲烷,劇烈振蕩1min,靜置分層后吸出水相,加足量無水硫酸鈉去除二氯甲烷中殘余的水分,在波長200?350nm范圍內進行紫外掃描,6?氯苯并惡唑酮最大吸收峰為238nm,根據特征吸收峰的變化情況來確定富集液和菌株對6?氯苯并惡唑酮的降解能力。通過紫外掃描發現,編號為DL?2的菌株可以使6?氯苯并惡唑酮的紫外吸收圖譜發生細微變化,如圖1所示。利用HPLC對菌株DL?2降解6?氯苯并惡唑酮前后培養液的二氯甲烷抽提物進行分析發現,未接菌的對照培養液中6?氯苯并惡唑酮的保留時間為4.897min(圖2)。而接種DL?2菌株并培養24h后,培養液中6?氯苯并惡唑酮的含量明顯下降,并在保留時間為4.493min和6.249min處有新的吸收峰出現(圖2)。
采用DNA小量提取方法提取細菌總DNA,利用16SrDNA對其進行鑒定。通過鑒定,該菌株為Acinetobacter sp.命名為Acinetobacter sp.DL?2,基因登錄號為JX294357,該菌的生理生化特性以及系統進化樹見圖3圖4。
將菌株DL?2送交中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏日期為2013.5.21,保藏號為CCTCC M2013227。
實施例2
將Acinetobacter sp.DL?2(CCTCC M2013227)單菌落接種于3mL液體LB培養基(g·L?1:酵母粉5.0,胰蛋白胨10.0,NaCl10.0,pH7.0。)中,37℃、180r·min?1培養12h,以5%接種量轉接至50mL液體LB培養基中37℃、180r·min?1培養12h制成種子液。在6?氯苯并惡唑酮終濃度為20mg·L?1的無機鹽培養基(g·L?1:NH4NO31.0g,KH2PO40.5g,K2HPO41.5g,NaCl1.0g,MgSO4·7H2O0.1g,6?氯苯并惡唑酮0.02g,pH7.0)中,按5%接種量接入OD600nm=1.0菌株Acinetobacter sp.DL?2(CCTCC M2013227)種子液,于30℃、180r·min?1搖床培養,每隔2h取樣一次,測定6?氯苯并惡唑酮及其產物的濃度,菌株DL?2可以在48h內降解20mg·L?1的6?氯苯并惡唑酮達到95%。

關 鍵 詞:
氯苯 惡唑酮 降解 及其 應用
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