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一種具有甘露糖化修飾的溶菌酶及其應用.pdf

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一種 具有 甘露 糖化 修飾 溶菌酶 及其 應用
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摘要
申請專利號:

CN201310141820.8

申請日:

2013.04.22

公開號:

CN103374557B

公開日:

2014.12.24

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 9/36申請日:20130422|||公開
IPC分類號: C12N9/36; C12N15/56; C12N15/81; C12N1/19; A61K38/47; A61P31/04; A61P31/06; C12R1/84(2006.01)N 主分類號: C12N9/36
申請人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
發明人: 吳軍; 劉波; 鞏新; 唱韶紅; 左小虎; 馬清鈞
地址: 100071 北京市豐臺區東大街20號
優先權: 2012.04.23 CN 201210121052.5
專利代理機構: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002 代理人: 王朋飛
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310141820.8

授權公告號:

103374557B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.24|||2013.11.27|||2013.10.30

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種具有甘露糖化修飾溶菌酶及其應用,所述溶菌酶經過N-糖基化修飾,具體這種糖化為甘露糖化修飾,修飾位點為N-X-S/T,其中X為除脯氨酸外的氨基酸。本發明還提供了所述甘露糖化修飾溶菌酶的制備方法,其是通過人工添加N-糖基化修飾位點,并利用畢赤酵母表達獲得,使不發生糖基化修飾的天然溶菌酶經改造后,進而發生N-糖基化修飾。本發明獲得的溶菌酶具有殺菌活性,能夠利用巨噬細胞膜上甘露糖受體的介導作用內吞進入胞內,進而殺死胞內菌,具有潛在的藥用價值。

權利要求書

權利要求書
1.  一種糖基化溶菌酶,該溶菌酶經甘露糖基化修飾。

2.  根據權利要求1所述的溶菌酶,其特征在于,所述溶菌酶為哺乳動物溶菌酶。

3.  根據權利要求2所述的溶菌酶,其特征在于,所述溶菌酶為人源溶菌酶。

4.  根據權利要求1所述的溶菌酶,其含有如下(a)、(b)或(c)所示的氨基酸序列:
(a)如序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列;
(b)將序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列;
(c)與(a)或(b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的氨基酸序列;
或含有如下(d)、(e)或(f)所示的氨基酸序列:
(d)如序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列;
(e)將序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列;
(f)與(d)或(e)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的氨基酸序列;
所述氨基酸序列至少含有一個N-糖基化修飾位點N-X-S/T,且發生甘露糖基化修飾,其中X為除脯氨酸外的氨基酸。

5.  編碼權利要求1-4任一所述溶菌酶的基因。

6.  根據權利要求5所述的基因,其特征在于核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。

7.  含有權利要求5或6所述基因的重組載體。

8.  根據權利要求7所述的重組載體,其特征為所述重組載體為pPICZαA-hLYZ,具有1所示的圖譜。

9.  包含權利要求5或6所述基因或權利要求7或8所述重組載體的重組菌。

10.  根據權利要求9所述的重組菌,其特征在于所述重組菌為酵母。

11.  一種制備權利要求1~4任一項所述溶菌酶的方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)用權利要求7或8所述的重組載體轉化宿主菌,得到重組菌株;
(2)培養重組菌株,誘導糖基化修飾溶菌酶的表達;
(3)回收并純化所表達的溶菌酶。

12.  權利要求1~4任一項所述的溶菌酶在殺死胞內菌中的應用。

說明書

說明書一種具有甘露糖化修飾的溶菌酶及其應用
技術領域
本發明涉及基因工程領域,尤其涉及一種具有甘露糖化修飾的溶菌酶及其應用。
背景技術
溶菌酶是一類抗菌能力強大、抗菌譜廣、種類多樣、可供選擇范圍廣、靶菌株不易產生抗性突變的堿性蛋白質。溶菌酶一般由129個氨基酸殘基組成,分子量在14kDa左右,在酸性條件(pH=4~7)下,100℃處理1min后仍能保持原活性,但在堿性環境下熱穩定性較差,溶菌酶最適pH值為6.6,等電點為10.5~11。人溶菌酶(humanlysozyme)屬于c型溶菌酶,由130個氨基酸組成,分子量為14.7kD,含有4個二硫鍵。人溶菌酶具有高生物活性和熱穩定性,其殺菌活性是目前市場常用的雞蛋清溶菌酶的3倍,同時,人溶菌酶還具有抗病毒、增強免疫力以及抗腫瘤的功效,在臨床中具有較高的應用價值。
溶菌酶的作用及其機理與傳統的抗生素不同,溶菌酶不僅具有廣譜抗細菌能力,且對病毒及癌細胞也有一定的抑殺作用。同時,在體外與傳統抗生素一樣通過試管或平皿法可觀察到殺菌作用。目前,關于人溶菌酶的作用機理的研究大都集中在人溶菌酶與細菌細胞壁作用方面。溶菌酶的生物化學功能是催化某些細菌細胞壁多糖的水解,從而溶解這些細菌的細胞壁,研究表明,由于革蘭氏陽性細菌外部沒有由脂多糖、磷脂、糖脂組成的外膜覆蓋,所以溶菌酶對它們的作用較強。然而溶菌酶自身的特點決定了溶菌酶的使用均只能針對細胞外的細菌產生直接作用。目前研究發現的細胞內病原體所致感染是危害人類健康的頑疾之一。結合分枝桿菌、傷寒沙門 氏菌等常見胞內菌入侵機體后,已演化出不同機制來逃避機體的免疫:如結合分枝桿菌在被巨噬細胞吞噬后能改變所在吞噬泡的特征,使吞噬泡不能與溶酶體融合而避開了溶酶體中為數眾多的水解酶類(包含溶菌酶)的降解作用而長期寄生在胞內;反使巨噬細胞成為其庇護所又躲過體液免疫,在機體免疫力下降時進行繁殖形成慢性持續性的感染。又因大多數抗生素及抗菌藥在巨噬細胞內濃度低難以殺死寄生菌,致使臨床治療胞內菌存在一定困難,而至今無有效治療手段。人溶菌酶能殺死革蘭氏陽性菌對革蘭氏陰性菌也有一定的抑菌作用,但至今也沒有利用溶菌酶等有效的方法來治療胞內菌。
發明內容
本發明第一個目的是提供一種甘露糖化修飾的溶菌酶;第二個目的在于提供編碼所述溶菌酶的基因;第三個目的在于提供包含所述溶菌酶基因的重組載體;第四個目的在于提供包含所述溶菌酶基因或重組載體的重組菌株;第五個目的在于提供制備所述溶菌酶的方法;第六個目的在于提供所述溶菌酶在殺死胞內菌中的應用。
本發明所述甘露糖化修飾的溶菌酶,其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示;或將序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列;或與上述限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的氨基酸序列。或其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示;或將序列表中SEQID No.2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的氨基酸序列;或與上述限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的氨基酸序列。所述氨基酸序列經過N-糖基化修飾位點N-X-S/T修飾,其中X為除脯氨酸外的氨基酸。所述SEQ ID No.1所示的氨基酸序列是在修飾前氨基酸序列(SEQ IDNo.3)的C端增加一段具有2個N-糖基化修飾位點的氨基酸序列NGTGNASG,在未改變抑菌活性的前提下,得到具有甘露糖化修飾 的溶菌酶。
所述SEQ ID No.2所示的氨基酸序列是將修飾前氨基酸序列(SEQID No.3)的第116位和第120位發生突變,序列NRCQNRD中的C突變為T,D突變為S,從而獲得具有2個N-糖基化修飾位點的序列NRTQNRS,在未改變抑菌活性的前提下,得到了具有甘露糖化修飾的溶菌酶突變體。
優選地,所述溶菌酶的修飾位點位于氨基酸序列的C端。
本發明還提供了編碼所述溶菌酶的基因。
優選地,核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
優選地,核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
本發明還提供了包含上述溶菌酶基因的重組載體。
優選地,重組載體為pPICZαA-hLYZ重組載體,在載體pPICZaA中AOX啟動子下游Xho I和Xba I位點間插入hLYZ基因,其中所述hLYZ基因3’端引入包含2個N-糖基化位點序列的一段連接序列:AACGGTACTGGTAACGCTTCTGGT(劃線部分為糖基化位點序列)。
本發明還提供包含上述溶菌酶基因或重組載體的重組菌株,優選重組菌株是酵母菌株,更優選為畢赤酵母。
本發明還提供了一種制備溶菌酶的方法。包括以下步驟:
(1)用所述重組載體轉化宿主菌,得到重組菌株;
(2)培養重組菌株,誘導糖基化修飾溶菌酶的表達;
(3)回收并純化所表達的溶菌酶。
本發明所述溶菌酶可用于殺死胞內菌。甘露糖化溶菌酶在巨噬細胞膜上甘露糖受體(MR)的介導作用內吞進入細胞內,發揮其殺菌活性,從而實現溶菌酶在巨噬細胞寄生菌引起的慢性感染性疾病的應用。
本發明利用酵母表達系統能高效表達正確折疊的外源蛋白,并 具有翻譯后修飾和加工能力的特點,通過對溶菌酶進行改造,如人工添加糖基化修飾位點——N-X-S/T(X為脯氨酸除外的氨基酸),或者突變原有氨基酸使其產生糖基化修飾位點,進而在酵母中表達時發生糖基化修飾,產生高甘露糖型糖鏈結構。N-X-S/T修飾是是蛋白進行糖基化修飾的一種方式。在N-糖基化過程中,N連接糖鏈通過N-乙酰葡糖胺與蛋白質肽鏈中保守序列N-X-S/T(X為脯氨酸除外的氨基酸)結構的天冬酰胺以β-1,4糖苷鍵連接。因此在N-糖基化中N-X-S/T被認為是N位糖基化的先決條件。
本發明所述酵母表達系統是目前應用最廣泛的外源蛋白真核表達系統之一。一方面,酵母表達系統具有分泌效率高,表達菌株穩定,表達質粒不易丟失,蛋白抗原性低等,另一方面,酵母表達系統易于進行實驗操作、成本低廉、易于大量生產,亦是溶菌酶的理想表達工具。它具有真核細胞的大部分特征,能夠對表達產物蛋白質進行一定程度的翻譯后修飾和加工。然而天然溶菌酶為非糖蛋白,所以即使在酵母中表達時也不會發生糖基化修飾。
本發明獲得甘露糖化修飾的方法可以通過人工設計方法添加N-糖基化修飾位點,其中所述人工方法指人為設計添加N-糖基化修飾位點使溶菌酶表達時發生N-糖基化修飾,或者突變原有氨基酸使溶菌酶氨基酸序列中具有N-糖基化修飾位點,而使溶菌酶表達時發生N-糖基化修飾。編碼基因的特異性位點突變的方法為本領域公知的方法,包括寡核苷酸介導的定向突變、PCR方法、盒式突變等。
本發明所述的溶菌酶來自于哺乳動物,優選人溶菌酶,這些溶菌酶的氨基酸序列及編碼這些氨基酸序列的核酸序列可以從各種公開的文獻、書籍和公共數據庫中獲得,如可以從公開的美國國立生物技術信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者歐洲分子生物實驗室EMBL(http://www.embl.org)公開的數據庫中獲得,編碼這些信號肽的DNA,可以采用PCR(Saiki等Science.239:487-491, 1988)、酶切等方法從相應物種的cDNA或其文庫等獲得,也可以采用人工合成的方法獲得,用作PCR模板和用于構建cDNA文庫的mRNA或cDNA可以來源于任何含有相應mRNA或cDNA的病毒、細胞及文庫等,這些病毒、細胞可以從各種菌、毒種庫獲得,細胞和文庫也可以從公司購得。這些DNA序列可以是天然序列,也可以用同義密碼子替換的序列,優化mRNA二級結構等方法優化設計相應蛋白的編碼序列,尤其是采用酵母偏愛密碼子替換原密碼子往往有利于溶菌酶的表達。溶菌酶基因也可以是來源于各物種的基因組,通過物種間重組、突變、缺失等獲得的變異體。這些變異體是指與溶菌酶同源性大于50%,并具有溶菌酶的功能,即殺菌活性,較優的是同源性大于80%、最優的是同源性大于95%的多肽。這些變異體的構建可以采用定點突變、隨機突變、致錯PCR、DNA重排等本領域已知的各種方法。
本發明所述的N-糖基化修飾序列,為——N-X-S/T,X為脯氨酸除外的氨基酸,這些編碼氨基酸的核酸序列可以采用PCR、酶切等方法從相應物種的cDNA或其文庫等獲得,也可以采用人工合成的方法獲得,這些DNA序列可以是天然序列,也可以用同義密碼子替換的序列,尤其是采用酵母偏愛密碼子替換原密碼子往往有利于實現表達。這段N-糖基化修飾序列可以與溶菌酶進行融合,既可以在溶菌酶基因的C端融合,也可以在溶菌酶基因的N-端融合;也可以在信號肽編碼序列與基因之間加入接頭序列。這段N-糖基化修飾序列也可以在不改變溶菌酶活性的前提下利用突變其自身核苷酸序列等方法獲得。
若需要可用本領域公知的方法對多聚核苷酸進行突變、缺失、插入和與其它多聚核苷酸連接等。如果需要可在編碼基因的兩側引入多聚核苷酸,引入的多聚核苷酸可有限制性內切酶識別位點。可用本領域公知的方法將含編碼序列的核酸克隆到各種表達載體中 去。所用標準的分子克隆過程見J.薩姆布魯克等(J.薩姆布魯克等,《分子克隆實驗指南》第二版,科學出版社,1995.)的敘述。
用于獲得本發明的甘露糖化的溶菌酶的出發菌株可以是為漢遜酵母屬、球擬酵母屬、克魯維酵母屬或畢赤酵母屬。而其中克魯維屬酵母可以為乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母、保加利亞克魯維酵母等,畢赤酵母屬可以為巴斯德畢赤酵母。畢赤酵母被認為是一種安全,易于遺傳操作,基因組序列清楚,能高效表達異源蛋白并且具備工業規模的發酵特性,已成為用于藥用蛋白生產的最佳宿主酵母之一。
本發明的畢赤酵母酵母菌也可為任何畢赤酵母的突變菌株,如畢赤酵母改構體為編號CGMCC No.1853的GJK0601菌株。本發明用GJK0601(α-1,6-甘露糖轉移酶基因滅活)重組畢赤酵母生產糖蛋白,即具有畢赤酵母生長快,適合于規模化生產,產業化成本低等優點,又避免了普通畢赤酵母存在的對蛋白進行過度糖基化修飾的問題。普通畢赤酵母表達的過度糖基化修飾的糖蛋白常表現為分子量不均一,SDS-PAGE分析出現明顯“拖尾”,且其中大部分蛋白的分子量明顯大于根據其氨基酸序列計算的理論分子量,糖含量常大于30%。每個糖基可以含30至上百個甘露糖,分子量為4000至數萬。而用α-1,6-甘露糖轉移酶基因滅活的重組畢赤酵母表達的糖蛋白,為低糖基化修飾的糖蛋白,分子量基本均一。SDS-PAGE分析“拖尾”現象消失。
本發明構建的甘露糖化溶菌酶有兩個優點:一是溶菌酶不同于天然的溶菌酶,本發明獲得的溶菌酶發生了N-糖基化修飾現象,且N-糖基為甘露糖型糖基,無論是野生型畢赤酵母表達獲得的高甘露糖型糖基的溶菌酶,還是畢赤酵母改構體表達獲得的低甘露糖型糖基的溶菌酶,都具有殺菌活性;二是這種具有甘露糖型糖基修飾溶菌酶,能夠利用巨噬細胞膜上甘露糖受體(MR)的介導作用內吞進 入胞內,進而殺死胞內菌,具有潛在的藥用價值,而無甘露糖化修飾的溶菌酶無此特性。因而本發明具有明顯的應用前景。
附圖說明
圖1是pPICZαA-hLYZ重組載體圖譜。
圖2是hLYZ基因的釣取電泳圖1.hLYZ基因;M.DNA標志物。
圖3是pPICZαA-hLYZ載體表達蛋白鎳和親純化后SDS-PAGE電泳圖。
圖4是pPICZαA-hLYZ載體表達蛋白的WB鑒定圖。
圖5是pPICZαA-hLYZ載體表達蛋白糖型分析SDS-PAGE電泳圖
1.蛋白樣品;2.蛋白PNGaseF酶切;3.PNGaseF;M.蛋白分子量標志物。
圖6是ConA檢測人溶菌酶的甘露糖修飾的鑒定圖。
泳道1:GS115表達溶菌酶hLYZ;泳道2:人血清白蛋白HSA。
圖7是pPICZαA-hLYZ/eGFP重組載體圖譜。
圖8是hLYZ、eGFP基因的釣取電泳圖
1.hLYZ基因;2.eGFP基因;M.DNA標志物。
圖9是pPICZαA-hLYZ/eGFP重組質粒的酶切鑒定電泳圖
1.pPICZαΑ-hLYZ/eGFP質粒酶切結果;M.DNA標志物。
圖10是hLYZ-eGFP融合蛋白鎳親和層析后SDS-PAGE電泳圖
M.蛋白分子量標準;1.0.2mol/L咪唑洗脫的融合蛋白。
圖11是hLYZ-eGFP融合蛋白糖型分析SDS-PAGE電泳圖
M.蛋白分子量標志物;1.蛋白樣品;2.蛋白PNGaseF酶切;3.PNGaseF。
圖12是RAW264.7中hLYZ-eGFP融合蛋白熒光顯影圖。
圖13是pPICZαA-hLYZ載體表達蛋白N-糖基化分析SDS-PAGE電泳圖
1.HLYZ;2.HLYZ經PNGaseF酶切;3.PNGaseF;M.蛋白分子 量標準97,66,43,30,21,14。
圖14是培養板中hLYZ抑菌活性結果圖。
圖15是ConA檢測人溶菌酶的甘露糖修飾的鑒定圖
1:GJK0601表達溶菌酶hLYZ;2:人血清白蛋白HSA。
圖16是HLYZ WB鑒定圖
圖17三種甘露糖化修飾的溶菌酶對結合分枝桿菌的抑制曲線圖
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明,但不用來限制本發明的范圍。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業途徑得到。
下述的序列均可人工合成。
下述百分量如無特殊說明均為質量百分含量。
本發明中使用的Pyrobest酶、LA Taq酶、dNTPs、限制性內切酶、T4連接酶、去磷酸化酶等購自大連寶生物工程有限公司,pfu酶、試劑盒、DH5α感受態細胞、TRIzol、引物合成、測序等由上海生工生物工程技術服務有限公司提供和北京博大泰克生物基因技術有限公司提供,PNGF糖苷酶購自New England BioLabs(NEB,Ipswich,MA),pPIC9、pAO815、pPICZaA購自美國Invitrogen公司(Invitrogenlife technologies,USA)。畢赤酵母GS115菌購自美國Invitrogen公司、巨噬細胞RAW264.7購自南方細胞技術有限公司(貨號:TIB-71),人肝癌細胞HepG2、酵母裂解酶Lyticase、酵母表達菌株GJK0601、生物素、PBST、YNB、胎牛血清,青霉素,鏈霉素、氨芐青霉素、酵母提取物、蛋白胨、瓊脂、10×NP40、10×G7、鎳親和層析柱、Sephadex-G25柱。
實施例1畢赤酵母表達甘露糖化人溶菌酶突變體
天然溶菌酶(hLYZ)是非糖蛋白,本身沒有糖基化位點,為了 能讓其靶向巨噬細胞,在其C端設計兩個N-糖基化的位點,本發明將不同于天然溶菌酶的均稱之為溶菌酶突變體。通過巴斯德畢赤酵母表達后會在N-糖基化位點處發生甘露糖化修飾,從而實現甘露糖受體靶向的可能。本實施例公開了一種利用巴斯德畢赤酵母表達制備甘露糖化人溶菌酶的方法。
1.1pPICZαA-hLYZ載體構建
根據GenBank中登錄的人溶菌酶基因cDNA序列(NM_000239.2)設計引物:正向引物p1:atcctcgagaaaagagaggctaaggtctttgaaaggtgtgag反向引物P2:tgttctagaccAgaagcgttaccagtaccgttcactccacaaccttgaac
(由上海Sangon公司合成)。通過TRIzol法從人肝癌細胞HepG2中提取總RNA,逆轉錄成cDNA通過PCR釣取人溶菌酶基因。人溶菌酶基因的3’端引入包含2個N-糖基化位點序列的一段連接序列:AACGGTACTGGTAACGCTTCTGGT(劃線部分為糖基化位點序列);P1,P2為引物,用Pyrobest DNA聚合酶擴增人溶菌酶基因。反應條件為:95℃預變性5min、94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、共25個循環。基因片段經過酶切、瓊脂糖凝膠回收圖(2)。由圖中可以看出,擴增出約bp左右的條帶,大小與預期的結果相互一致,可以用于下一步試驗。
為了將hLYZ以甘露糖化修飾形式從畢赤酵母分泌表達,我們選擇pPICZaA質粒作為載體(Invitrogen life technologies,USA)。在該載體AOX啟動子下游Xho I和Xba I位點間插入hLYZ基因,因pPICZaA載體上有兩個Xho I位點,為了表達蛋白的N端無多余的氨基酸和操作方便,將Kex2及Stel3識別序列aaaagagaggct合成在引物中Xho I酶切位點與人溶菌酶基因間。為了便于表達蛋白的純化,去除基因末端的終止密碼子,利用pPICZaA載體上的myc-His標簽。利用T4連接酶催化連接,轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α,涂布于含氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂平皿,挑選陽性克隆DH5 α(pPICZaA-hLYZ),抽提質粒,酶切鑒定,測序正確,獲得hLYZ表達質粒pPICZaA-hLYZ,該質粒的結構見(圖1)。其編碼蛋白的核苷酸序列見SEQ ID NO.4及對應的氨基酸序列見SEQ ID NO.1。
1.2酵母感受態細胞制備
挑取畢赤酵母GS115菌單克隆接于2.5mL YPD(配方:酵母提取物1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%,瓊脂1.5%)培養基,置28℃搖床200r/min培養12h。取500μL菌液接于100mL YPD,200r/min過夜培養。待菌濃度吸光值達1.2OD,4500r/min離心5min,取菌體用冰冷的去離子水重懸同樣條件離心,重復一次然后1M冷山梨醇洗一次備用。
1.3目的基因的轉化
取新制備的酵母感受態細胞80μL,限制性內切酶SacⅠ線性化的pPICZαA-hLYZ質粒20μL,2KV電擊轉化感受態細胞。將轉化的菌液于涂布于含Zeocin抗性(100μg/mL)的YPD培養基,28℃溫箱培養。
1.4酵母基因組鑒定
待YPD+Zeocin平板長出菌落。取20μL蒸餾水,從平板挑入部分菌落,加入2.5μL酵母裂解酶Lyticase,置于37℃溫箱2小時,取8μL作為模板進行PCR鑒定融合基因。反應條件為:95℃預變性5min、94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、共30循環。
1.5重組菌的誘導表達
挑取陽性的單克隆接種到2.5mL YPD培養基中,28℃培養過夜,取菌液按5%的量接種到BMGY(配方:酵母提取物1%,蛋白胨2%,甘油1%,YNB1.34%,生物素4×10-5,100mM PB pH6.0)培養基中,28℃、200r/min培養12h后加入0.5%甲醇誘導表達。每12h補加1次,誘導72h后離心取上清。
1.6蛋白的純化及濃縮
取酵母誘導表達上清加入硫酸銨達80%飽和度沉淀4℃靜置1h, 10000r/min,25min;蛋白沉淀用去離子水溶解,Sephadex-G25柱脫去硫酸銨及小分子色素;鎳親和層析柱純化帶有His標簽的融合蛋白。純化步驟如下:平衡液(20mM tris-HCl pH7.0,0.5M NaCl)平衡柱子,以2mL/min流速上樣,5倍柱體積的平衡液洗柱,洗脫液(20mMtris-HCl pH7.0,0.5M NaCl,0.5M咪唑)階段洗脫,SDS-PAGE鑒定純化結果;Sephadex-G25柱以蒸餾水為流動相脫去NaCl及咪唑,收取洗脫峰凍干法濃縮備用(圖3)。
1.7蛋白的WB鑒定
取純化的蛋白進行SDS-PAGE電泳后,通過半干電轉儀將蛋白轉移到PVDF膜上。將PVDF膜置于一平皿中,加入封閉液(PBST、5%脫脂牛奶)室溫震蕩2h或4℃過夜。封閉結束后用漂洗液(PBST)洗滌2次,加入鼠抗人溶菌酶抗體(abcam公司)(1:2000)反應,室溫震蕩結合2h。用漂洗液洗滌5次,每次5min,再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠抗體溶液(1:3000)(欣金科生物有限公司)室溫震蕩結合1h;漂洗液洗滌5次,每次5min;取出PVDF膜,鋪在潔凈的保鮮膜上,用濾紙吸去膜上液體,將顯色液(康威生物科技有限公司)A液與B液等體積混合,均勻涂布于PVDF膜上,室溫反應1min,用濾紙吸取多余液體,保鮮膜包好,置于暗盒于暗室X膠片(柯達)曝光(圖4)。
1.8蛋白糖基化分析
取融合蛋白30μL,加入10×變性緩沖液3.3μL【成分】,置于沸水10分鐘;待冷卻至室溫后分別加入4.5μL10×NP40、4.5μL10×G7、3μLPNGaseF,置于37℃水浴鍋16小時;10%SDS-PAGE檢測酶切結果(圖5)。
1.9目的蛋白甘露糖基化分析
利用豆蛋白A(ConA)能特異性識別糖基化蛋白糖鏈末端的甘露糖殘基的特性,用conA檢測畢赤酵母表達的人溶菌酶是否發生了 甘露糖殘基修飾。
分別取GS115及低糖基化酵母表達菌株GJK0601表達蛋白樣品適量進行15%SDS-PAGE。
將該膠在45v、4℃條件下轉膜過夜,(轉膜緩沖液:2.9克甘氨酸、5.8克Tris0.37克SDS、加人200ml甲醇定容到1升。PVDF膜用甲醇浸泡5分鐘);取出電轉好的PVDF膜用PBST(PBST中加入0.5mM的Ca2+、Mg2+),用0.1%BSA封閉2小時,加入終濃度為5ug/mlHRP標記conA室溫結合2小時,用PBST洗5次,每次5分鐘。加入ECL顯色液顯色用化學發光成像儀(美國UVP500)曝光。
GS115酵母表達目的蛋白hLYZ均能結合HRP標記的ConA、而陰性對照人血清白蛋白(HSA)未能結合HRP標記的ConA(圖6)。這一結果說明GS115酵母表達的目的蛋白hLYZ發生了甘露糖化修飾。
實施例2畢赤酵母表達甘露糖化人溶菌酶(hLYZ)與增強型綠色熒光蛋白(eGFP)的融合蛋白
2.1pPICZαA-hLYZ/eGFP載體構建
根據人溶菌酶基因序列(NM-000239.2)、增強型綠色熒光蛋白基因序列(AAK15492.1)的兩端序列,以及已知pPICZαΑ-hLYZ質粒上人溶菌酶基因的3’端已引入包含2個N-糖基化位點序列的一段連接序列:AACGGTACTGGTAACGCTTCTGGT(劃線部分為糖基化位點序列);pCAR-EGFP質粒上增強型綠色熒光蛋白基因的5’端也已引入了一段連接序列:GGTACCGGTAGCGCGGGCAGTGCTGCGGGTTCTGGCGGTGTCGAC。設計引物構建融合基因載體:pPICZαA-hLYZ/eGFP,除去eGFP的終止密碼把pPICZαA載體上的myc-His標簽引入融合蛋白C端(圖7)。引物序列見下表1,由上海Sangon公司合成。
表1引物序列表


首先,以pPICZαΑ-hLYZ質粒為模板,P1,P2為引物,用PyrobestDNA聚合酶擴增人溶菌酶基因(圖8)。反應條件為:95℃預變性5min、94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、共25個循環。基因片段經過酶切、瓊脂糖凝膠回收后從XhoⅠ、SacⅡ位點連接到pPICZαA載體;其次,以pCAR-eGFP質粒為模板,P3、P4為引物擴增eGFP基因(圖8)。反應條件為:95℃預變性5min、94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min、共25循環。同樣方法將eGFP基因從SacⅡ、Not1酶切位點連接到上一步測序正確的包含人溶菌酶基因的載體,構建成人溶菌酶與增強型綠色熒光蛋白的融合基因載體:pPICZαA-hLYZ/eGFP(圖7)載體的酶切鑒定(圖9)。由圖9可以看出重組質粒。。。經。。。酶切后分成兩個片段,一是。。bp片段,另一是。。bp片段?
2.2酵母感受態細胞制備(方法同實施例1.2)
2.3目的基因的轉化(方法同實施例1.3)
2.4酵母基因組鑒定(方法同實施例1.4)
2.5重組菌的誘導表達(方法同實施例1.5)
2.6蛋白的純化(方法同實施例1.6)(圖10)
2.7蛋白糖基化分析(方法同實施例1.8)(圖11)
2.8細胞培養
RAW264.7用含有10%的胎牛血清和100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的RPMI1640,在37℃、5%CO2培養箱中進行培養,采用胰酶消化法進行細胞傳代。
2.9融合蛋白在巨噬細胞RAW264.7中的熒光檢測
取適量RAW264.7細胞接種于蓋玻片,待細胞長到蓋玻片的80%左右(48h),吸去板孔中培養基,加入融合蛋白100μl(1mg/ml)補加 新培養基至1ml,置37℃、5%CO2的培養箱孵育2h,棄去培養基,生理鹽水洗3遍;用Hoechst33258室溫避光孵育細胞(5min)進行細胞核染色,生理鹽水洗去未結合的染料。從板孔中取出蓋玻片,滴適量封固液,把含細胞面扣在載玻片上,用指甲油封片備用(圖12)。可以檢測到亮綠色熒光,而陰性對照。。。無熒光反應,說明甘露糖化的人溶菌酶可進入巨噬細胞RAW264.7?
實施例3:糖基改造畢赤酵母工程菌GJK0601表達甘露糖化人溶菌酶
3.1pPICZαA-hLYZ載體構建(方法同實施例1)
3.2酵母感受態細胞制備(方法同實施例1)
3.3目的基因的轉化(方法同實施例1)
3.4酵母基因組鑒定(方法同實施例1)
3.5重組菌的誘導表達(方法同實施例1)
3.6蛋白的純化及濃縮(方法同實施例1)
3.7蛋白糖基化分析(方法同實施例1)(圖13)
3.8蛋白活性分析(方法同實施例2)
挑取枯草桿菌或溶壁微球菌單克隆于LB培養基37℃搖床200r/min過夜培養,吸取1ml鋪LB營養瓊脂平板,取10ul(1mg/ml)hLYZ滴于平板,37℃培養箱過夜培養,可見GJK0601表達hLYZ有明顯的抑菌圈出現(圖14),表明其具有殺菌活性。
3.9目的蛋白甘露糖基化分析
方法同實施例1.9
糖基改造畢赤酵母工程酵母表達目的蛋白hLYZ均能結合HRP標記的conA、而陰性對照HSA未能結合HRP標記的conA(圖15)。這一結果說明糖基改造畢赤酵母工程酵母表達的目的蛋白hLYZ發生了甘露糖化修飾。
實施例4:畢赤酵母表達甘露糖化人溶菌酶突變體
天然溶菌酶(hLYZ)是非糖蛋白,本身沒有糖基化位點,本實施例為突變原有溶菌酶氨基酸編碼序列使其編碼的溶菌酶氨基酸序列中出現N-X-S/T序列,從而使溶菌酶表達時發生N-糖基化修飾。
hLYZ突變體的氨基酸序列見SEQ ID No.2。
pPICZαA-hLYZ載體構建、酵母感受態細胞制備、目的基因的轉化、重組菌的誘導表達、蛋白的純化及濃縮、蛋白的WB鑒定(圖16)、糖基化分析、活性分析等方法同實施例1。
實施例5:不同修飾的甘露糖化溶菌酶的胞內抑菌作用
選擇結核分枝桿菌(ATCC27294)(國家菌種保藏中心),用生理鹽水調整菌濃度為105個/mL,然后分別與無抗性1640培養基培養的巨噬細胞RAW264.7孵育2h。生理鹽水清洗3次,然后換新鮮培養基分別加入等量濃度為1mg/mL的GS115表達的甘露糖化hLYZ(實施例1),GJK0601表達的甘露糖化hLYZ(實施例3)和GJK0601表達的甘露糖化hLYZ突變體(實施例4),以無糖基化修飾的溶菌酶(購自sigma公司)作為陰性對照,在37℃孵育,每隔30min取一孔進行細胞裂解后,用羅氏平板培養和菌落計數,并根據計數結果制備抑菌曲線,結果見圖17。由圖中可以看出,具有甘露糖基化修飾的溶菌酶都可以抑制結合分枝桿菌的生長。

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