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抗壞血酸修飾的新型腦靶向磁性納米粒的制備.pdf

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抗壞血酸 修飾 新型 靶向 磁性 納米 制備
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摘要
申請專利號:

CN201711220660.0

申請日:

20171129

公開號:

CN107982541A

公開日:

20180504

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K47/54,A61K47/52,A61K47/69,A61K45/00,A61K31/192,A61K31/137,A61K31/13,A61K41/00,A61P25/00,A61P35/00,A61P29/00,A61P25/08,A61P9/10,A61P25/28,A61P25/16 主分類號: A61K47/54,A61K47/52,A61K47/69,A61K45/00,A61K31/192,A61K31/137,A61K31/13,A61K41/00,A61P25/00,A61P35/00,A61P29/00,A61P25/08,A61P9/10,A61P25/28,A61P25/16
申請人: 四川大學
發明人: 吳勇,海俐,管玫,郭麗,肖文嬌,陳洋
地址: 610065 四川省成都市武侯區一環路南一段24號
優先權: CN201711220660A
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201711220660.0

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法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種以抗壞血酸修飾的新型腦靶向磁性納米粒的制備,為通式(I)所示結構或其藥學上可接受的鹽或水合物:,其中:X代表羧基化的聚乙二醇PEG,可以是三甘醇、四甘醇或聚乙二醇PEG分子量為200、400、600、800、1000、1500、2000、4000等;Y代表?(CH2)a?、?C(O)?(CH2)a?C(O)?或?O?(CH2)b?、?NH?(CH2)b?、?C(O)?(CH2)b?、?C(O)?(CH2)b?C(O)?,a表示0~6,b表示1~4;MNPs代表Fe3O4、γ?Fe2O3、MnFe2O4、CoFe2O4和ZnFe2O4等;Drug代表可作用于中樞神經系統的藥物。本發明提供一種以抗壞血酸修飾的新型腦靶向磁性納米粒的制備方法,可作為載體用于中樞神經系統疾病的治療,既有四氧化三鐵納米粒的磁靶向作用,還有抗壞血酸的主動腦靶向作用。

權利要求書

1.一種以抗壞血酸修飾的具有腦靶向的磁性納米粒,為通式(I)所示結構或其藥學上可接受的鹽或水合物:其中:X代表羧基化的聚乙二醇PEG,可以是三甘醇、四甘醇或聚乙二醇PEG分子量為200、400、600、800、1000、1500、2000、4000等;Y代表-(CH)-、-C(O)-(CH)-C(O)-或-(CH)-O-、-(CH)-NH-、-C(O)-(CH)-O-、-C(O)-(CH)-NH-,a表示0~6,b表示1~4;MNPs代表FeO、γ-FeO、MnFeO、CoFeO和ZnFeO等;Drug代表可作用于中樞神經系統的藥物。2.根據權利要求1所述的以抗壞血酸修飾的新型腦靶向磁性納米粒,其特征在于X為羧基化的PEG,一端與多巴胺酰胺鍵相連,另一端與抗壞血酸的C5-O以酯鍵或醚鍵相連;Y的一端以酯鍵或醚鍵與抗壞血酸的C6-O相連,另一端以酯鍵或醚鍵或酰胺鍵同藥物相連。3.根據權利要求1所述的以抗壞血酸修飾的新型腦靶向磁性納米粒,其特征在于將抗壞血酸的腦靶向特性和磁性納米粒的磁靶向特性結合起來,形成雙重腦靶向磁性納米粒。4.根據權利要求1所述的以抗壞血酸修飾的新型腦靶向磁性納米粒,其特征在于MNPs可以是但不限于FeO、γ-FeO、MnFeO、CoFeO和ZnFeO等,優選FeO。5.根據權利要求1所述的以抗壞血酸修飾的新型腦靶向磁性納米粒,其特征在于藥物可以是但不限于萘普生、布洛芬、文拉法辛、美金剛胺等可作用于中樞神經系統的藥物。6.根據權利要求1所述的以抗壞血酸修飾的新型腦靶向磁性納米粒,其特征在于當a=0時,藥物可以直接以其所含游離羧基、羥基等作為開放端同抗壞血酸的C6-O以酯鍵或醚鍵等相連。

說明書

技術領域

本發明涉及一種新型腦靶向磁性納米粒的制備方法,屬于醫藥技術領域。

背景技術

據統計,全球約有1/5的人口患有不同種類和程度的中樞神經系統(CNS)疾病,這些疾病包括腦腫瘤、急性或慢性疼痛綜合癥、癲癇、腦炎、腦缺血以及神經衰退性疾病(如:阿爾茨海默癥、帕金森氏癥等)。隨著世界人口的老齡化,這一趨勢將會更加嚴重,并且會對人類的健康造成嚴重的影響。血腦屏障(BBB)的存在對人類中樞神經系統起到了一定的保護作用,但同時也限制了許多物質從血液中進入腦部。幾乎所有大分子和95%的小分子藥物都不能有效進入大腦及中樞神經系統,這使得對CNS有效的藥物很難進入CNS病灶部位并呈現有效的藥物濃度從而達到治療效果。

據報道非甾體抗炎藥(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs,NSAIDs)如布洛芬、萘普生等神經保護劑已經被廣泛用于治療CNS疾病,也可用作慢性攝入型非甾體抗炎藥。例如,布洛芬能夠降低CNS疾病的風險,甚至能夠延緩CNS疾病的發病,所以布洛芬在治療CNS紊亂方面具有廣闊發展前景。但是,由于布洛芬的低滲透性,在CNS中的分布有限,有效的治療濃度低,為了達到較好的治療效果需要增加藥物的劑量,使藥物在體內達到一個較高的濃度,但與此同時其它器官的藥物濃度也會增加,毒副反應也隨之增加,對身體產生更大的危害。長期使用這些藥物,便會產生不同程度的胃腸道不適,頭暈,頭痛,甚至腎毒性等的不良反應。這些不良反應主要是由于藥物在體內的分布,當藥物在外周器官分布較多時,容易產生各種毒副反應,同時也降低了其在腦組織中的分布比例,所以布洛芬的臨床應用受到了很大限制。因此,為了治療CNS疾病,需要找到一種有效的策略以提高布洛芬的在大腦中的輸運能力。

血-腦屏障(blood-brain barrier, BBB)是存在于血-腦,血-腦脊液(BCB)及腦-腦脊液之間選擇性控制進入腦脊液和腦的物質,作為血液與中樞神經系統之間的調節界面,對維持中樞神經系統內的環境恒定有至關重要的作用。這使得對CNS有效的藥物很難進入CNS病灶部位并呈現有效的藥物濃度從而達到治療效果。因此對跨BBB給藥方式的研究已經成為治療CNS疾病的關鍵。研究表明,這些特異性轉運蛋白具有較高的選擇性,通常特定的載體蛋白只能轉運特定的底物。

抗壞血酸(ascorbic acid),又名維生素C(Vitamin C),具有許多生物學功能,包括:參與氨基酸代謝;神經遞質、膠原蛋白和組織細胞間質的合成;增加對感染的抵抗能力;降低毛細血管的通透性,加速血液凝固;并有抗組胺及阻止致癌物質生成的作用等。抗壞血酸在腦內的濃度是其它器官的10倍以上,這源于大腦中GLUT1、SVCT2和少量的SVCT1可以充當抗壞血酸通過血腦屏障的轉送體,從而使抗壞血酸在腦內可以維持在一個相對較高的水平。因此,可以將抗壞血酸作為藥物腦靶向給藥的載體。Christopher P. Corpe等人提到抗壞血酸的C2-OH、C3-OH對于抗壞血酸的轉運至關重要,C2和C3中烯二醇上的羥基是抗壞血酸在氧化還原過程中起到還原能力所必須的重要的反應位點,而抗壞血酸中C5和C6上的羥基在轉運過程中所起到的作用很小,因此對抗壞血酸的修飾主要集中在這兩個位置上。

磁靶向給藥系統(magnetic targeting drug delivery system,MTDDS)是指將藥物和磁性物質共同包裹于聚合物載體中制成的,應用于體內后利用外加磁場的效應引導藥物在體內定向移動和定位集中,在磁場區釋放藥物,從而起到靶區局部濃集作用或靶區截流作用的藥物制劑。20世紀70年代Widder等提出磁控靶向藥物傳遞系統的概念,并首先開展了載藥磁性微粒的研究。1994年,德國Lǜbbe等第一次將磁性靶向治療應用于臨床。磁性材料如鐵、鐵氧化物、鎳、鈷等通過有機或無機材料的表面修飾、包覆等作用,形成了具有特定功能的復合粒子并廣泛用于生物醫學領域。氧化鐵納米粒,因具有良好的生物相容性和簡易的合成方法,目前已被廣泛的研究并應用于生物醫學領域,如細胞標記、細胞分離和凈化、靶向藥物傳輸、核磁共振成像、腫瘤細胞的磁熱治療等,最具有代表性的氧化鐵納米粒為Fe3O4和γ-Fe2O3,可以在人體組織中通過降解貯存或排出體外,具有良好的生物安全性,是目前臨床應用和研究最廣泛的磁性納米粒子。當今國際上報道的用于治療腦部疾病的磁靶向治療藥物或載體有磁靶向作用,但只能靠擴散作用,而不能特異性的靶向透過BBB,進入腦中發揮治療作用。如果將磁性納米粒應用到抗壞血酸修飾的材料上,即形成抗壞血酸介導的腦靶向磁性納米粒。這類藥物不僅克服了磁性納米粒的無腦靶向性的難題,同時也增加了藥物在血腦屏障附近的藥物濃度,有利于藥物通過抗壞血酸轉運進入腦,有望增加藥物在腦中的濃度,從而提供更為有效的治療。

發明內容

本研究的目的是提出一種新型的基于抗壞血酸修飾的具有主動腦靶向的磁性納米藥物載體,以提高藥物的腦靶向性,增加藥物的中樞濃度,從而增強藥物療效,同時降低了藥物在外周器官的分布,減少了藥物的毒副作用。因此,我們設計了如通式(I)所示的一類磁性納米粒,旨在設計并制備這類腦靶向的磁性納米粒。

本發明提供一類通式(I)所示結構的化合物或其藥學上可接受的鹽或水合物:

其中:

X代表羧基化的聚乙二醇PEG,可以是三甘醇、四甘醇或聚乙二醇PEG分子量為200、400、600、800、1000、1500、2000、4000等;

Y代表-(CH2)a-、-C(O)-(CH2)a-C(O)-或-O-(CH2)b-、-NH-(CH2)b-、-C(O)-(CH2)b-、-C(O)-(CH2)b-C(O)-,a表示0~6,b表示1~4;

MNPs代表Fe3O4、γ-Fe2O3、MnFe2O4、CoFe2O4和ZnFe2O4等;

Drug代表可作用于中樞神經系統的藥物。

通式(I)所示化合物的具體制備方法如下所示:

具體實施方法

但以下實施例旨在說明本發明而不是對本發明的進一步限定。

實施例1

油酸包裹的Fe3O4磁性納米粒([email protected])的制備

精密稱取 4.00 g FeCl3·6H2O,1.47 g FeCl2·4H2O加入到120 ml的去離子水中,在氮氣保護作用下,攪拌溶解完全,然后迅速加入40 ml的 25%的氨水,溶液從黃色變成黑色。向溶液中加入1 ml的油酸(OA),攪拌5 min,再加入到80℃油浴中反應1 h。反應結束后待溶液冷卻至室溫,離心得黑色沉淀,并用正己烷、甲醇洗滌,得到油酸包裹的Fe3O4磁性納米粒([email protected])。

實施例2

多巴胺功能化的Fe3O4磁性納米粒([email protected])的制備

稱取30 mg前面制備的[email protected]納米顆粒加入到含有100 mg多巴胺(DA)的10 ml的去離子水中,超聲30分鐘,室溫下攪拌反應24小時。離心,并用乙醇洗滌得到多巴胺功能化的Fe3O4磁性納米粒([email protected]),4℃保存備用。

實施例3

化合物2的制備

取抗壞血酸(1)(24 g, 0.135 mol)于500 ml雙頸瓶中,氬氣保護,加入干燥的丙酮(150 ml)、乙酰氯(0.6 ml, 7.5 mmol)。室溫攪拌24 h,TLC檢測反應完全,停止反應。過濾反應液,丙酮洗滌濾餅,干燥,得白色固體2,收率85.3%,mp:202-204°C。

實施例4

化合物3的制備

將化合物2(20 g, 0.108 mol)、K2CO3粉末(37.3 g, 0.27 mol)溶于干燥的丙酮(150 ml)室溫攪拌20 min,向上混懸液中加入BrBn(30 ml, 0.25 mol),升溫回流4 h。減壓除去溶劑,依次加入少量水、乙醚,析出白色固體,過濾,冰乙醚洗滌濾餅,干燥,得白色固體3,收率44.1%,mp:200-202°C。

實施例5

化合物4的制備

將化合物3(10 g,25.23 mmol)溶于乙腈(500 ml)中,逐滴加入HCl(2 mol/L, 75 ml),室溫攪拌3 h。減壓除去溶劑,加入乙酸乙酯(30 ml)溶解,水洗三次,有機層用飽和食鹽水洗兩次,無水Na2SO4干燥,濃縮得黃色油狀物純品,后緩慢固化為白色固體4,收率99%,mp:67-69 °C。1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 2.09 (s, 2H), 3.77 (m, 2H), 3.91 (m, 1H), 4.72 (m, 1H), 5.15 (ABq, 4H, J=11.4Hz), 7.22-7.38 (m, 10H)。

實施例6

化合物5的制備

將布洛芬(1.00 g, 4.85 mmol)溶解于20 ml二氯甲烷,置于-5℃下,加入DCC(1.50 g, 7.27 mmol)和DMAP(0.12 g, 0.97 mmol),攪拌30 min后,加入化合物4(1.90 g, 5.34 mmol),移至室溫攪拌過夜。過濾,除去白色固體,濾液濃縮,經柱層析純化得到白色固體5,1.53 g,收率58%。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 0.87 (dd, 6H, J = 2.4 & 6.8 Hz), 1.48 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.79-1.84 (m, 1H), 2.41 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 3.72 (q, 1H, J = 7.2 Hz), 3.98 (br, 1H), 4.12-4.17 (m, 1H), 4.27-4.33 (m, 1H), 4.48 (dd, 1H, J = 2.0 & 16 Hz), 5.05-5.20 (m, 4H), 5.11 (s, 1H), 7.03-7.20 (m, 4H), 7.34-7.36 (m, 10H)。

實施例7

化合物6的制備

將羧基化的PEG800(1.83 g, 2.29 mmol)溶解于30 ml二氯甲烷,置于-5℃下,加入DCC(0.17 g, 0.84 mmol)和DMAP(18 mg, 0.15 mmol),攪拌30 min后,加入化合物5(0.42 g, 0.76 mmol),移至室溫攪拌過夜。過濾,除去白色固體,濾液濃縮,經柱層析純化得到油狀物6,0.51 g,收率49.9%。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 0.87 (d, 6H, J = 6.4 Hz), 1.46 (dd, 3H, J = 7.2 & 1.6 Hz), 1.78-1.85 (m, 1H), 2.41 (t, 2H,J = 6.8 Hz), 3.63-3.75 (m, H-PEG), 3.91-4.04 (m, 2H) , 4.14-4.37 (m, 4H), 4.61 (dd, 1H, J = 2.4 & 6.8 Hz), 5.04-5.14 (m, 4H), 5.30-5.39 (m, 1H), 7.03-7.39 (m, 14H)。

實施例8

化合物7的制備

向化合物6(0.40 g, 0.30 mmol)的甲醇(20 ml)溶液加入Pd/C(10%, 40 mg),在0.4 MPa H2下室溫反應2 h。濾去Pd/C,濃縮溶劑得油狀物7,,0.32 g,收率92%。1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 0.89 (d, 6H, J = 6.8 Hz), 1.50 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.81-1.86 (m, 1H), 2.44 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 3.65-3.76 (m, H-PEG), 4.17 (s, 3H), 4.30-4.34 (m, 1H), 7.10 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.22 (d, 2H, J = 8.0 Hz)。

實施例9

抗壞血酸修飾的Fe3O4磁性納米粒([email protected])的制備

將化合物7(47 mg, 0.04 mmol)溶解于10 ml 無水DMF中,依次分別加入NHS(10 mg, 0.06 mmol)、DCC(13 mg, 0.06 mmol)、DMAP(2 mg, 0.016 mmol)和[email protected](20 mg),室溫攪拌24小時,磁鐵分離并用乙醇和水洗滌,30℃真空干燥即可得到抗壞血酸修飾的Fe3O4磁性納米粒([email protected])。

實施例10

腦靶向磁性納米粒([email protected])的紅外表征

Fe3O4磁性納米粒([email protected][email protected][email protected])的紅外光譜參見圖2。[email protected]的紅外光譜中,580 cm-1處有很強的吸收峰,歸屬為Fe3O4中的Fe-O振動吸收峰,2845 cm-1和2926 cm-1處較強的吸收峰分別歸屬于油酸的CH2-對稱伸縮及不對稱伸縮振動峰,以上證明了[email protected]合成的成功。[email protected]的紅外光譜中,1612 cm-1、1477 cm-1、1413 cm-1和1277 cm-1,分別是多巴胺苯環、氨基、C-N鍵和C-H鍵的彎曲振動,這些新吸收峰的出現證明多巴胺存在于MNPs納米顆粒的表面。[email protected]的紅外光譜中,1626 cm-1的酰胺的伸縮振動表明化合物7與MNPs上的DA縮合成功,此外,1626 cm-1酯鍵的伸縮振動和PEG亞甲基(2921 cm-1和2859 cm-1)的伸縮振動,進一步證明了抗壞血酸修飾的腦靶向磁性納米粒合成的成功。

實施例11

腦靶向磁性納米粒([email protected])的粒徑大小與分布

掃描電鏡下觀察腦靶向磁性納米粒的大小及形狀,結果參見圖3。[email protected][email protected]都呈近似圓球形,顆粒較為規則,分散性較好,未見明顯團聚現象發生。另取適量,用動態光散射分析儀測定納米粒的粒徑大小與分布,測定結果表明,[email protected][email protected]的粒徑大小與掃描電鏡結果一致,即[email protected]相對于[email protected],有一個輕微變大的平均粒徑。此外,[email protected][email protected]的分散系數分別為0.129和0.156,表明制備得到的抗壞血酸修飾的腦靶向磁性納米粒大小均勻性良好。

實施例12

腦靶向磁性納米粒([email protected])的磁性表征

磁力學性質測定,結果參見圖4。合成的[email protected]正己烷溶液具有磁流體的性質,在磁場的作用下,磁溶液向磁場方向定位。精密稱取實施例中所得的Fe3O4磁性納米粒([email protected][email protected][email protected]),放置于JDM-13D磁性測定儀中,隨著外磁場的變化,測定納米粒磁矩的變化情況,并繪制對應的磁滯回線:曲線為過原點的單一曲線,即當外加磁性為0時,沒有剩磁;當有外加磁性存在時,產生剩磁。其最大磁飽和強度分別為68.39 emu/g、65.64 emu/g和52.17 emu/g。

實施例13

腦靶向磁性納米粒([email protected])的細胞毒性考察

將bEnd.3細胞(小鼠腦微血管內皮細胞)復蘇后,用含10%胎牛血清的DMEM培養基,37℃,5%CO2的環境下培養兩周,每隔一天換液一次。用培養基分別將Fe3O4磁性納米粒([email protected][email protected][email protected])和化合物7逐步稀釋為6.125μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的溶液備用。將C6細胞以2 × 103個/孔的密度接種于96孔板內,培養24h后,分別加入上述系列濃度的載多西紫杉醇的脂質體或多西紫杉醇溶液繼續孵育24h。孵育結束后,棄去培養基,向細胞孔內加入20μl 5mg/ml的MTT溶液,于37℃條件下孵育4h后,小心吸去上層培養基,加入150μl DMSO,于37℃恒溫空氣搖床中緩慢振搖30min后,置酶標儀中測定490nm波長處的吸光度值A測定。以DMSO的吸光度值A空白作為空白,以未加藥處理的細胞孔同法操作測得的吸光度值A對照作為對照,計算各孔細胞的存活率,存活率(%)=(A測定-A空白)/(A對照-A空白)× 100%。結果表明,所有的材料在0-200μg/ml的濃度下,均為見明顯毒性。

實施例14

腦靶向磁性納米粒([email protected])的釋藥行為

精密稱取實施例中所得的抗壞血酸修飾的腦靶向磁性納米粒([email protected]),分別加入到不同的釋放介質中(pH 2.5、5.0、7.4和8.0的磷酸鹽緩沖液,以及小鼠血漿和腦勻漿),于預定的時間點取樣,分別通過HPLC檢測布洛芬的含量。結果表明,在pH7.4的緩沖液中,布洛芬釋放最為緩慢,從而保證了藥物在生理環境下的穩定以及有足夠的時間到達靶部位。此外,在血漿和腦勻漿的釋放行為表明,磁性納米粒在腦勻漿的釋放要快于血漿,從而避免磁性納米粒在腦部的過度蓄積。

附圖說明

圖1本發明實施例8中化合物7結構的1H-NMR譜圖

圖2本發明實施例10中磁性納米粒的紅外光譜圖

圖3本發明實施例11中磁性納米粒的掃描電鏡圖與粒徑分布

圖4本發明實施例12中磁性納米粒的磁性表征

圖5本發明實施例13中磁性納米粒的細胞毒性

圖6本發明實施例14中磁性納米粒在不同體系中的釋藥行為。

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