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一種防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑及其生產方法和用途.pdf

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一種 防治 松突圓蚧 真菌 粉劑 及其 生產 方法 用途
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摘要
申請專利號:

CN200810073988.9

申請日:

20081216

公開號:

CN101422169B

公開日:

20110914

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01N63/04,A01P7/00 主分類號: A01N63/04,A01P7/00
申請人: 廣西大學
發明人: 黃寶靈,方麗英,呂成群,王緝健
地址: 530004 廣西壯族自治區南寧市大學東路100號
優先權: CN200810073988A
專利代理機構: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 代理人: 王素娥
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200810073988.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑及其生產方法和用途。防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑是采用擬盤多毛孢真菌(Pestalotiopsis?olivacea)菌種,通過一級固體菌種培養、二級液體培養和三級固體培養,將培養物加工而成。本發明的生產方法,包括如下步驟:1)一級固體菌種培養;2)二級液體培養;3)三級固體培養;4)經過半成品自然陰干至含水率為10%-14%;5)用粉碎機粉碎,要求粒徑為0.2-0.5cm,6)包裝。本發明防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑主要用于防治松突圓蚧,也可用于防治濕地松粉蚧,對氣候干旱和濕潤地區均適用。

權利要求書

1.一種防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑,其特征在于,采用擬盤多毛孢真菌(Pestalotiopsis?olivacea)菌種,通過一級固體菌種培養、二級液體培養和三級固體培養,將培養物加工而成;所述的擬盤多毛孢真菌(Pestalotiopsis?olivacea)是發明人從自然染病的松突圓蚧僵蟲體上分離并經純化獲得,經形態和rDNA?ITS序列分子鑒定為擬盤多毛孢真菌(Pestalotiopsis?olivacea)。2.如權利要求1所述的一種防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑的生產方法,其特征在于,包括如下步驟:1)一級固體菌種培養:一級固體菌種培養:在無菌條件下,將擬盤多毛孢真菌(Pestalotiopsis?olivacea)菌種接入用馬玲薯過濾液與蔗糖和瓊脂制成平板或用試管制成斜面的培養基中,置入恒溫培養箱內,在溫度為28℃條件下培養4-5d,待菌絲長滿培養基表面時備用;2)二級液體培養,分兩步操作:培養的第一步:在無菌條件下,將培養好的一級菌種一個平板或一支斜面接入盛裝有500ml培養液的1000ml大三角瓶中,在搖床上培養3d,培養溫度在15℃~32℃之間,得到菌液;第二步:將第一步培養好菌液,加入到裝有培養液的發酵灌中培養4d,培養溫度在15℃~32℃之間,至獲得粘稠的液體培養物即菌液;3)三級固體培養:在無菌培養室內,將發酵灌培養好的菌液與滅過菌的固體培養基按重量比1∶1.5的比例混和拌勻,然后鋪于培養床上,于室溫為15℃~32℃下培養7~10d,至菌絲長滿并產生孢子;4)將3)完成的半成品移至干燥車間自然陰干至含水率為10%-14%;5)將4)完成的產品用粉碎機粉碎,要求粒徑為0.2-0.5cm;6)將5)粉碎后的產品包裝。3.根據權利要求2所述的一種防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑的生產方法,其特征在于,所述的平板或用試管制成斜面的培養基成分及其配比為:去皮馬玲薯200mg,切碎煮30min,取過濾液,蔗糖10g,瓊脂20g,自來水定容至1000ml。4.根據權利要求2所述的一種防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑的生產方法,其特征在于,所述的二級液體培養的液體培養基成分及其配比為:花生餅粉50g,面粉50g,蔗糖10g,KHPO?0.5g,MgSO?0.2g,自來水定容至1000ml。5.根據權利要求2所述的一種防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑的生產方法,其特征在于,所述的固體培養基原料成分為統糠和麩皮,它們的重量比為5∶5或4∶6。6.如權利要求1所述的一種防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑的用途,其特征在于,用于防治松突圓蚧或用于防治濕地松粉蚧,對氣候干旱和濕潤地區均適用。

說明書

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技術領域

本發明涉及一種微生物制劑,具體是一種防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑,以及它的生產方法和應用。

背景技術

我國長江以南以馬尾松為主的松林面積達3300多萬hm2,是我國最主要的植被組成成份之一,同時也是我國人造板、造紙、林產化工等林產工業的最主要原料,松樹在我國具有重要的經濟、社會和生態效益。然而,目前這一重要的森林資源正面臨著松突圓蚧的嚴重威脅。該蟲于1982首先在廣東省發現,危害較重的林分3~5年時間可成片枯死,大發生時,可使每公頃松林材積生長量下降2.548m3,是松毛蟲為害損失的3.2倍。到2001年,松突圓蚧已擴散到廣東省的60個縣(市),有蟲面積達132萬hm2,其中發生危害面積44萬hm2,特別嚴重瀕臨死亡的馬尾松林5.02萬hm2。并且以每年6.7萬公頃的速度向周邊地區擴展。至今,不僅廣東全境的松樹受其危害,損失慘重,近年來又在福建、廣西等地迅速擴散蔓延,從幼樹至二三十年生的大樹均可受害,造成大面積的松林枯死,防控形勢非常嚴峻。為了遏制松突圓蚧的蔓延,國內學者對其防治技術進行了研究。

松突圓蚧Hemiberlesia?pitysophila?Takagi,又名松櫛盾蚧,隸屬同翅目Homoptera蚧總科Cocoidea盾蚧科Diaspididae灰圓盾蚧亞科Diaspidinae突圓蚧屬Hemiberlesia。該蟲在國外僅分布于日本,國內分布在廣東、福建、廣西、香港、澳門、臺灣。

松突圓蚧在松屬樹種中有著廣泛的寄主,可寄生馬尾松、濕地松、火炬松、加勒比松、卵果松、展松、短葉松、卡西亞松、晚松、光松、沙松、南亞松、黑松和琉球松等。在我國松突圓蚧的發生區,目前主要危害馬尾松、濕地松和加勒比松。

目前,控制該蟲危害的主要措施有:加強檢疫封鎖,禁止進口松類苗木和嚴禁蚧蟲發生區內的松苗、松枝、原木向非發生區運輸;營造闊葉樹林帶,緩解松突圓蚧的蔓延;對受害嚴重瀕臨枯死的松林,實施林分階伐改造;加強松突圓蚧疫區松林采脂管理,嚴禁進行掠奪性采刈。這些措施對減少蟲源,控制松突圓蚧的大發生起到了一定的作用。

采用天敵防治松突圓蚧是一項重要的防控措施。松突圓蚧花角蚜小蜂是我國在1986-1988年從日本沖繩引進防治松突圓蚧的天敵昆蟲。該小蜂在廣東一年發生9-10代,以蛹越冬,雌雄蜂的寄主不同,雌性蜂以松突圓蚧的雌性成蚧為寄主,營內寄生。雄性蜂則是營體外寄生的重寄生蜂,以松突圓蚧雌性僵蚧體內的同種或它種寄生蜂的老熟幼蟲,預蛹和蛹作為寄主。至1998年廣東省累計放蜂防治面積達103.2萬公頃,取得較好效果,寄生率在20%-30%。1999年后,因花角蚜小蜂種源缺乏而使放蜂防治工作中斷,致使不少地方松突圓蚧危害又呈上升擴展趨勢。此外廣東省還開發利用本地天敵,包括黃蚜小蜂、麗蚜小蜂、瓢蟲、薊馬等,其中范氏黃蚜小蜂的自然寄生率可達33.24%。

探索微生物防治技術也取得一些可喜的進展。用寄生在甘蔗粉蚧上的寄生曲霉菌對松突圓蚧進行致病力試驗,其寄生率為13.9%~64.9%。另據報道,采用板栗紅蚧上分離的芽枝狀枝孢霉(Cladosporium?cladosporioides)菌粉對3467頭松突圓蚧毒力測定,平均死亡率達38.9%;林間試驗效果達20.0%以上,最高達57.7%。

以上這些防控措施,存在防控效果不理想或防控寄生率低的不足。因此,必須針對松突圓蚧的定殖特點,研制出有效防治和控制松突圓蚧的應用技術。

發明內容

本發明的目的在于提供一種防治松突圓蚧的蟲生真菌粉制劑,以及粉劑的生產方法和用途。

本發明解決上述技術問題的技術方案是:

本發明提供一種防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑,是采用擬盤多毛孢真菌(Pestalotiopsis?olivacea)菌種,通過一級固體菌種培養、二級液體培養和三級固體培養,將培養物加工而成。所述的擬盤多毛孢真菌(Pestalotiopsis?olivacea)是發明人從自然染病的松突圓蚧僵蟲體上分離并經純化獲得,經形態和rDNA?ITS序列分子鑒定為擬盤多毛孢真菌(Pestalotiopsis?olivacea)。

本發明防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑的生產方法,包括如下步驟:

1)一級固體菌種培養:

一級固體菌種培養:在無菌條件下,將擬盤多毛孢真菌(Pestalotiopsis?olivacea)菌種接入用馬玲薯過濾液與蔗糖和瓊脂制成平板或用試管制成斜面的培養基中,置入恒溫培養箱內,在溫度為28℃條件下培養4-5d,待菌絲長滿培養基表面時備用;

2)二級液體培養,分兩步操作:

培養的第一步:在無菌條件下,將1)培養好的一級菌種一個平板或一支斜面接入盛裝有500ml培養液的1000ml大三角瓶中,搖床上培養3d,培養溫度在15℃~32℃之間,得到菌液;

第二步:將第一步培養好菌液,加入到裝有培養液的發酵灌中培養4d,培養溫度在15℃~32℃之間,至獲得粘稠的液體培養物即菌液;

3).三級固體培養:在無菌培養室內,將發酵灌培養好的菌液與滅過菌的固體培養基按重量比1∶1.5的比例混和拌勻,然后鋪于培養床上,于15℃~32℃下培養7~10d,至菌絲長滿并產生孢子;

4).將3)完成的半成品移至干燥車間自然陰干至含水率為10%-14%;

5).將4)完成的產品用粉碎機粉碎,要求粒徑為0.2-0.5cm;

6).將5)粉碎后的產品包裝。

其中,步驟1)中所述的平板或用試管制成斜面的培養基成分及其配比為:去皮馬玲薯200mg,切碎煮30min,取過濾液,蔗糖10g,瓊脂20g,自來水定容至1000ml;步驟2)中所述的二級液體培養的液體培養基成分及其配比為:花生餅粉50g,面粉50g,蔗糖10g,KH2PO4?0.5g,MgSO4?0.2g,自來水定容至1000ml;步驟3)中所述的固體培養基原料成分為統糠和麩皮,它們的重量比為5∶5或4∶6。

本發明防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑可用于防治松突圓蚧,也可用于防治濕地松粉蚧,對氣候干旱和濕潤地區均適用。

本產品的使用方法:本產品要求低溫、陰涼、干燥處室內保存。保存良好的菌粉,一年四季均可使用。林間施用時,可采用機動噴霧機噴粉、滅火機噴粉、粉炮炸粉、或站在高處徒手撒粉,使菌粉在林冠層擴散。

效果檢查:在噴菌后1個月即可檢查松突圓蚧死蟲率。在噴過菌粉的松樹樹冠的中、下部位,用高枝剪剪下一小枝椏,摘取枝梢稍老、有蚧蟲的針葉1小撮;然后間隔5-10株,再行重復取樣。根據防治面積大小,可選擇5-10株松樹的針葉,混合后,抽出50-100束松針,在解剖鏡或手持放大鏡下,清點針葉基部松突圓蚧的活蟲、死蟲數量,按下式計算死亡率:

死亡率=死蟲口數÷總蟲口數

在未防治地區按相同方法取樣作為對照。防治效果按下式計算:

校正死亡率=死亡率-對照的自然死亡率

用松突圓蚧的蟲生真菌粉劑防治松突圓蚧害蟲具有以下優點:

1.本產品為無公害的生物制劑,對人畜無害,不易產生抗性,尤其是其可通過體壁侵染害蟲,這種獨特的侵染方式可用來防治對化學農藥易產生抗性的刺吸式口器害蟲(蚜蟲、葉蟬、蚧蟲等),有利于維護生態平衡;減少化學農藥的使用量,降低防治成本;可降解,減少環境污染;易于生產等。

2.針對松突蚧蟲體小、繁殖速度快、寄生部位隱蔽、防治難度大的問題,開發了松突圓蚧蟲生真菌粉劑,通過向松突圓蚧發生林區噴灑該菌粉,利用蟲生真菌與松突圓蚧的特異識別能力,能準確的寄生于蚧蟲蟲體并導致蚧蟲死亡,死亡率達80%以上,從而有效地解決了松突圓蚧防治難的問題。

3.應用本產品防治松突圓蚧,一年四季均可取得很好的防治效果,對不同季節孵化及不同世代的蚧蟲,均可有效感染。突破了白僵菌的季節使用缺陷。

4.人工施用本產品,在局部形成優勢菌群落,使蚧蟲感染病菌的機會大大增加;菌粉可隨氣流、水流自然擴散,擴大了感染區域;感病死亡的蚧蟲,脫落后可隨空氣、雨水流動,形成傳播,促使流行病發生,有顯著的流行潛力,流行病發生可自然控制害蟲種群數量,可產生持續控制的良好效果。

5.本發明生產方法簡單,工藝條件不苛刻,容易操作,原材料易得,成本低廉,無污染,所得產品防治松突圓蚧效果顯著,產品使用方法多樣、隨意、簡便,有廣闊的應用前景。

具體實施方式

1.目的菌株的獲得

采用踏查和完全隨機設置樣地調查相結合的方法,對廣西境內松突圓蚧發生區中自然死亡率高的林區進行調查和采集死蟲,實驗室內對典型蟲尸進行蟲生真菌的分離和純化,共獲得一批松突圓蚧蟲生真菌。對分離過程中出現頻率較高的菌株進行液體培養,用于接種防治試驗,檢測各菌株的致病毒力。經室內接種、庭院盆栽幼樹接種、野外幼林接種、野外成林接種等一系列水劑試驗,從供試菌株中篩選出2號菌株為目的菌株。經形態觀察和分子技術分析,該菌株鑒定為擬盤多毛孢屬的真菌Pestalotiopsis?olivacea。

2.目的菌株對不同培養基的生長適應性

配置A、B、C、D四種培養基制成平板,分別取5mm的供試菌塊接種,8次重復,28℃恒溫培養,分別于48h、72h、96h測量菌落生長直徑,結果見表1。

目的菌株在A培養基上生長速度最快,48h時菌落直徑達21.0mm,且在之后的培養中,均以在該培養基上生長最好;在C培養基上生長次之,在D培養基上生長速度居第三,而在B培養基上生長最差。說明目的菌株在不同營養條件下生長速度有一定的差異。

表1??菌株在不同培養基上的生長速度(單位:mm)

培養時間?A培養基?B培養基?C培養基?D培養基?平均值徑48h?21.0?16.0?17.5?16.5?17.7572h?32.0?21.5?28.0?25.0?26.6396h?40.0?27.0?38.0?34.0?34.75

培養基配方(1000ml水中):

A培養基:去皮馬玲薯200mg,切碎煮30min,取過濾液,蔗糖10g。

B培養基:麩皮50g,蔗糖10g,KH2PO4?0.5g,MgSO4?0.2g。

C培養基:花生餅粉50g,蔗糖10g,KH2PO4?0.5g,MgSO4?0.2g。

D培養基:花生餅粉40g,麩皮10g,蔗糖10g,KH2PO4?0.5g,MgSO4?0.2g。

3.目的菌株對不同溫度的生長適應性

在15℃、20℃、28℃、32℃、35℃溫度梯度培養中,目的菌株也表現出不同的生長適應性(表2)。在供試的兩種培養基上均以20℃生長最好,高溫對其生長有不利的影響,但在35℃時仍有弱生長,表現出能適應生長的溫度范圍較寬。

表2菌株在不同溫度下的生長速度(菌落直徑,單位:mm)

培養基培養時間?15℃?20℃?28℃?32℃?35℃A培養基48h?18.0?26.0?21.0?10.5?9.296h?36.5?48.5?40.0?11.5?10.5?B培養基48h?16.5?27.0?16.0?10.0?9.796h?26.0?52.5?27.0?10.0?10.5

4.目的菌株的產孢量及菌粉含孢率

分別對培養6d、7d、8d、9d三級培養的培養物檢測其產孢量,以白僵菌為對照,結果見表3。

表3菌株產孢情況(單位:108個/g)

培養天數菌株重復1?重復2?重復3?重復4?平均產孢量6d2號16.0?14.0?20.0?16.0?16.50

白僵菌15.0?16.0?11.0?20.0?15.507d2號24.0?18.0?20.0?20.0?20.5白僵菌23.0?19.0?23.0?20.0?21.258d2號26.0?21.0?22.0?23.0?23.0白僵菌21.0?20.0?21.0?22.0?21.09d2號21.0?24.0?18.0?25.0?22.0白僵菌23.0?27.0?26.0?20.0?24.0成品27d2號58.0?42.0?55.0?50.0?51.25

由表3可以看出,培養至6d、7d、8d時,目的菌的產孢量略高于白僵菌,9d后產孢量減慢,而白僵菌產孢量增長較快。但在成品時,由于有后熟作用,目的菌的孢子量明顯增加,這應該說與其生長適應性較強有很關。

下面結合實施例對本發明的生產方法和應用作進一步的描述:

防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑的生產實施例:

實施例1:第一批菌粉生產

2007年10月,月平均氣溫27℃,最低溫14℃,最高溫36℃;大氣濕度50%-70%,正值廣西特旱時期。在實驗室內采用馬玲薯固體培養基(1000ml水中:去皮馬玲薯200mg切碎煮30min取過濾液,蔗糖10g,瓊脂20g)接種擬盤多毛孢Pestalotiopsis?olivacea菌塊(直徑為5mm),28℃培養5d,制成一級菌種。進入生產車間進行二級培養,其中:在盛裝500ml的花生餅培養液(花生餅粉50g,面粉50g蔗糖10g,KH2PO4?0.5g,MgSO4?0.2g,自來水1000ml)的1000ml大三角瓶中接入一級培養的菌種1皿,培養3d;將2瓶三角瓶擴大培養的菌液加入到裝有7000ml花生餅培養液的發酵灌中繼續培養4d,培養溫度在16℃至35℃之間。按液體∶固體的重量比為1∶1.5,將發酵灌培養好的菌液接種到滅過菌的統糠麩皮固體培養基中拌勻,所用統糠麩皮(二者重量比為4∶6)固體培養基1000kg,混合物鋪于培養床上培養7d,室溫下至菌絲長滿后,移至干燥車間自然陰干至含水率為10%~12%。粉碎機粉碎至粒徑為0.2cm,獲得含孢量46×108個的松突圓蚧蟲生真菌粉劑750kg,用編織袋包裝。

實施例2:第二批菌粉生產:

2008年3月初,月平均氣溫19℃,最低溫10℃,最高溫26℃;大氣濕度90%-95%,正值廣西特大冰凍后的陰雨時節。在實驗室內采用馬玲薯固體培養基(1000ml水中:去皮馬玲薯200mg切碎煮30min取過濾液,蔗糖10g,瓊脂20g)接種擬盤多毛孢Pestalotiopsis?olivacea菌塊(直徑為5mm),28℃培養5d,制成一級菌種。進入生產車間進行二級培養,其中:在盛裝500ml的花生餅培養液(花生餅粉50g,面粉50g,蔗糖10g,KH2PO4?0.5g,MgSO4?0.2g,自來水1000ml)的1000ml大三角瓶中接入一級培養的菌種1支,培養3d;將2瓶三角瓶擴大培養的菌液加入到裝有7000ml花生餅培養液的發酵灌中繼續培養4d,培養溫度在12℃至26℃之間。按液體∶固體的重量比為1∶1.5,將發酵灌培養好的菌液接種到滅過菌的統糠麩皮固體培養基中拌勻,所用統糠麩皮(二者重量比為5∶5)固體培養基6000kg,混合物鋪于培養床上培養10d,室溫下至菌絲長滿后,移至干燥車間自然陰干至含水率為10%-14%。粉碎機粉碎至粒徑為0.2cm,獲得含孢量36×108個的松突圓蚧蟲生真菌粉劑5000kg,用編織袋包裝。

防治松突圓蚧的蟲生真菌粉劑的防治應用實施例:

實施例3:

1.冬季對松突圓蚧的防治

2007年11月25日于松突圓蚧蚧蟲越冬前,在廣西博白林場三育分場白梅林站5林班實施林間防治,使用進口彌霧噴粉機作業,為了保證防治效果,此次防治于清晨6時樹葉露水未干時作業,每公頃噴施松突圓蚧蟲生真菌菌粉7.5kg,防治面積13.33公頃。分別于2007年12月21日、2008年2月25日、2008年5月8日三次連續采樣調查松突圓蚧平均死蟲率為:95.68%、96.22%、80.18%。表明研制的擬盤多毛孢Pestalotiopsis?olivacea菌粉劑在冬季對松突圓蚧產生了良好的防治效果。

2.春季對松突圓蚧的防治

2008年3月11日于春季松突圓蚧蚧蟲孵化階段,在廣西岑溪市歸義鎮實施林間防治,使用進口彌霧噴粉機作業,每公頃噴施菌粉7.5kg,防治面積20公頃。分別于2008年4月18日、2008年8月1日調查松突圓蚧平均死蟲率為:97.9%和84.1%。表明研制的擬盤多毛孢Pestalotiopsis?olivacea菌粉劑在春季對松突圓蚧同樣產生了良好的防治效果。

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