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多組分組合物以及它們的用途.pdf

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組分 組合 以及 它們 用途
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摘要
申請專利號:

CN201280009550.9

申請日:

20120216

公開號:

CN103501823B

公開日:

20180504

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K48/00,A61K38/17,A61K38/16,A61P35/00 主分類號: A61K48/00,A61K38/17,A61K38/16,A61P35/00
申請人: 杜蘭教育基金委員會
發明人: D·H·蔻易,L·孫
地址: 美國洛杉磯
優先權: 61/463,482,61/558,227
專利代理機構: 北京市正見永申律師事務所 代理人: 黃小臨;閔丹
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201280009550.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種多組分組合物及使用它們的方法。本發明的一些實施方式包括含有第一組分和第二組分的多組分組合物,其中,所述第一組分含有Notch影響分子,且第二組分含有GPCR靶分子。還公開了含有所述多組分組合物的試劑盒。另外提供了用于向一種或多種細胞提供所述多組分組合物的方法。其他的實施方式包括使用所述多組分組合物的方法,例如,所述多組分組合物的給藥方法,使用所述多組分組合物治療生物體(例如,哺乳動物)的方法。

權利要求書

1.一種多組分組合物,該多組分組合物含有第一組分和第二組分,其中,所述第一組分為含有Notch影響分子的組合物,所述第二組分為含有GPCR靶分子的組合物,其中,所述Notch影響分子為VPA,所述GPCR靶分子為COL-SST或CPT-SST。2.根據權利要求1所述的多組分組合物,其中,所述Notch影響分子為VPA,且所述GPCR靶分子為CPT-SST。3.根據權利要求1所述的多組分組合物,其中,所述Notch影響分子為VPA,且所述GPCR靶分子為COL-SST。4.根據權利要求1所述的多組分組合物,其中,所述Notch影響分子為VPA,VPA的濃度在0.25mM到20mM的范圍內;且所述GPCR靶分子為CPT-SST,CPT-SST的濃度在0.01μM到50μM的范圍內。5.根據權利要求1所述的多組分組合物,其中,所述Notch影響分子為VPA,VPA的濃度在0.25mM到20mM的范圍內;且所述GPCR靶分子為COL-SST,COL-SST的濃度在0.01μM到50μM的范圍內。6.一種藥物組合物,該藥物組合物含有權利要求1所述的多組分組合物。7.根據權利要求6所述的藥物組合物,其中,所述Notch影響分子為VPA,VPA的劑量濃度在1mg/kg到50mg/kg的范圍內。8.根據權利要求6所述的藥物組合物,其中,所述GPCR靶分子的劑量濃度在0.01mg/kg到10mg/kg的范圍內。9.根據權利要求6所述的藥物組合物,其中,所述Notch影響分子為VPA,VPA的劑量濃度在1mg/kg到50mg/kg的范圍內;且所述GPCR靶分子為CPT-SST,CPT-SST的劑量濃度在0.01mg/kg到10mg/kg的范圍內。10.根據權利要求6所述的藥物組合物,其中,所述Notch影響分子為VPA,VPA的劑量濃度在1mg/kg到50mg/kg的范圍內;且所述GPCR靶分子為COL-SST,COL-SST的劑量濃度在0.01mg/kg到10mg/kg的范圍內。11.權利要求1所述的多組分組合物在制備用于在動物中治療宮頸癌或胰腺癌的藥物中的用途。12.根據權利要求11所述的用途,其中,所述Notch影響分子為VPA,且GPCR靶分子為CPT-SST。13.根據權利要求11所述的用途,其中,所述Notch影響分子為VPA,且GPCR靶分子為COL-SST。14.根據權利要求11所述的用途,其中,所述藥物是通過口服給藥、鼻內給藥或通過注射給藥的藥物。15.根據權利要求11所述的用途,其中,所述藥物是通過靜脈注射、通過腹腔注射、通過肌肉注射或通過皮下注射的藥物。16.根據權利要求11所述的用途,其中,所述動物為哺乳動物。17.根據權利要求11所述的用途,其中,所述動物為人或嚙齒動物。18.根據權利要求11所述的用途,其中,所述藥物是治療宮頸癌的藥物。19.根據權利要求11所述的用途,其中,所述治療抑制癌癥細胞中的上皮-間質轉化。20.一種試劑盒,該試劑盒含有權利要求1所述的多組分組合物。

說明書

相關申請的交叉引用

本申請要求于2011年2月17日提交的美國臨時申請No.61/463,482的優先權,并將其全部內容通過引用并入本申請。本申請還要求于2011年11月10日提交的美國臨時申請No.61/558,227的優先權,并將其全部內容通過引用并入本申請。

背景技術

Notch基因家族編碼單向的I型異源二聚體跨膜受體。Notch信號通過兩個相鄰細胞之間的跨膜配體的DSL(Delta、Serrate、Lag-2)家族被激活,并參與細胞-細胞通訊。迄今為止,已鑒定了4種Notch受體和至少5種哺乳動物配體。Notch受體為異源二聚體,各自包括胞外域(ECN)、跨膜域以及胞內域(ICN)。ICN包括參與CSL結合、錨蛋白重復序列(ankyrin repeats,ANK)、核定位信號(NLS)和PEST序列的RAM結構域。轉錄激活結構域(TAD)與4種受體不同。ECN含有多個類EGF重復序列和LIN12/Notch重復序列(LNR)。

Notch信號能夠以配體結合在Notch的胞外域(ECN)開始,誘導溶蛋白性裂解,并釋放激活的Notch的胞內域(ICN)。然后,ICN轉移到細胞核,并結合CSL(DNA結合轉錄因子),起始依賴CSL的Notch靶基因的轉錄。

已知G蛋白偶聯受體(GPCRs)具有7個跨膜域受體。GPCRs可以通過G蛋白調節下游信號通路。參與GPCRs的兩個信號轉導通路為cAMP和磷脂酰肌醇信號通路。存在均屬于GPCR超家族的5種生長激素抑制素受體(SSTR)亞型、3種蛙皮素受體亞型和3種PACAP受體亞型。

已知生長激素抑制素(SST)(一種生長激素釋放抑制因子(SRIF),還被稱為生長激素抑制激素(GHIH))為具有兩種激活形式(SST-14和SST-28)的肽激素,并且能夠由內分泌細胞分泌。SST能夠作為多種細胞功能(例如,細胞增殖和激素釋放)的內源性抑制調節劑發揮作用。SST能夠通過激活G蛋白偶聯SSTR或抑制生長因子的釋放發揮其作用。

本發明的一些實施方式包括含有可以利用上述功能的組合物或分子的組合物。通過以下描述,本發明的其它實施方式、目的和優點將是顯而易見的。

發明內容

本發明的一些實施方式包括含有第一組分和第二組分的多組分組合物,其中,所述第一組分為含有Notch影響分子的組合物,且所述第二組分為含有GPCR靶分子的組合物。在某些情況下,所述Notch影響分子可以為Notch配體,Notch受體、激活Notch信號的分子或抑制Notch信號的分子。在特定的實施方式中,所述Notch影響分子可以為VPA、SBHA、DBZ或NLE。在特定的實施方式中,所述GPCR靶分子具有細胞毒性。在其它實施方式中,所述GPCR靶分子對癌細胞具有細胞毒性。在某些情況下,所述GPCR靶分子可以為選自式(I)的綴合物(conjugate)、可以為SST-14或者可以為SST類似物。例如,所述綴合物可以為COL-SST、CPT-SST或CPT-BN。在一些實施方式中,所述Notch影響分子為VPA,且所述GPCR靶分子為CPL-SST。在其他實施方式中,所述Notch影響分子為VPA,且所述GPCR靶分子為COL-SST。在一些典型的實施方式中,所述Notch影響分子為VPA,VPA的濃度在約0.25mM到約20mM的范圍內;且所述GPCR靶分子為CPT-SST,CPT-SST的濃度在約0.01μM到約50μM的范圍內。在其它的實施方式中,所述Notch影響分子為VPA,VPA的濃度在約0.25mM到約20mM的范圍內;且所述GPCR靶分子為COL-SST,COL-SST的濃度在約0.01μM到約50μM的范圍內。

本發明其它的實施方式還包括含有所述多組分組合物的藥物組合物。在某些情況下,所述Notch影響分子為VPA,VPA的劑量濃度在約1mg/kg到約50mg/kg的范圍內。在另外其它的實施方式中,所述Notch影響分子為SBHA,SBHA的劑量濃度在約0.01mg/kg到約25mg/kg的范圍內。在其它的實施方式中,所述GPCR靶分子為CPT-SST、COL-SST或CPT-BN,且所述GPCR靶分子的劑量濃度在約0.01mg/kg到約10mg/kg的范圍內。其它的例子包括藥物組合物,其中,所述Notch影響分子為VPA,VPA的劑量濃度在約1mg/kg到約50mg/kg的范圍內;且所述GPCR靶分子為CPT-SST,CPT-SST的濃度在約0.01mg/kg到約10mg/kg的范圍內。在該藥物組合物的其它例子中,所述Notch影響分子為VPA,VPA的劑量濃度在約1mg/kg到約50mg/kg的范圍內;且所述GPCR靶分子為COL-SST,COL-SST的濃度在約0.01mg/kg到約10mg/kg的范圍內。另外,其它的例子包括藥物組合物,其中,所述Notch影響分子為SBHA,SBHA的劑量濃度在約0.01mg/kg到約25mg/kg的范圍內;且所述GPCR靶分子為CPT-SST、COL-SST或CPT-BN,所述GPCR靶分子的濃度在約0.01mg/kg到約10mg/kg的范圍內。

本發明的其它實施方式包括對至少一種細胞進行所述多組分組合物給藥的方法。在某些情況下,所述多組分組合物為藥物組合物。在該方法的一些實施方式中,所述細胞為癌細胞,其中,所述癌細胞可以為來自宮頸癌、胰腺癌、胰腺類癌、肺癌、小細胞肺癌(SCLC)、皮膚癌、甲狀腺髓樣癌(MTC)、皮膚鱗狀細胞癌、結直腸癌、骨肉瘤、肝癌、白血病、卵巢癌、腫瘤或內分泌腫瘤的細胞。在另外的其它實施方式中,所述給藥針對生物體,例如,動物(例如,人或嚙齒動物)。所述給藥的方法可以為,例如,口服給藥、鼻內給藥,或通過注射給藥(例如,通過靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射或皮下注射)。

本發明的其他實施方式包括用于在動物中治療癌癥的方法,該方法包括對動物進行所述多組分組合物的給藥。在某些情況下,所述多組分組合物為藥物組合物。所述動物可以為,例如,哺乳動物(例如,人或嚙齒動物)。所述給藥可以通過,例如,口服給藥、鼻內給藥,或通過注射給藥(例如,通過靜脈注射、通過腹腔注射、通過肌肉注射或通過皮下注射)而進行。在一些實施方式中,待治療的癌癥可以為宮頸癌、胰腺癌、胰腺類癌、肺癌、小細胞肺癌(SCLC)、皮膚癌、甲狀腺髓樣癌(MTC)、皮膚鱗狀細胞癌、結直腸癌、骨肉瘤、肝癌、白血病、卵巢癌、腫瘤或內分泌腫瘤。在某些情況下,所述治療抑制癌細胞中的上皮-間質轉化。

本發明其它的實施方式包括含有所述多組分組合物的試劑盒。

附圖說明

以下附圖來自說明書的一部分,以進一步證明本發明特定方面。在本文中,通過參考這些附圖中的一幅或多幅,并結合本文中示出的具體實施方式的描述可以更好的理解本發明。

圖1,在正常的Hela細胞中,4種Notch受體表達的RT-PCR檢測。Notch1和Notch2發生表達,Notch3和Notch4沒有發生表達或微量表達。

圖2,在正常的Hela細胞中,5種Notch配體表達的RT-PCR檢測。Notch配體JAG1發生表達。

圖3,具有Notch1信號激活的穩定細胞系Hela-ICN1的建立。抗-Notch1抗體(sc-6014-R)用于蛋白免疫印跡。

圖4,通過細胞增殖試驗(MTT),Notch信號的激活抑制Hela細胞增殖(Hela-ICN)。

圖5,通過腫瘤重量的測定,Notch信號的激活抑制腫瘤生長。在體內,與對照Hela-GFP腫瘤相比,Hela-ICN1腫瘤顯示出較低的腫瘤重量。

圖6,通過腫瘤生長曲線的繪制,Notch信號的激活抑制Hela腫瘤生長(Hela-ICN1)。

圖7,Notch1信號激活對cAMP產生的影響。在Hela-GFP和Hela-ICN1細胞中,毛喉素均刺激cAMP產生,但Notch1激活(在Hela-ICN1細胞中)促進cAMP產生,并且是劑量依賴的。

圖8,使用實時定量PCR,在Notch激活的Hela-ICN1細胞中,檢測到SST表達在mRNA水平上上調。在Hela-ICN1細胞中,SST比在Hela-GFP細胞中增加了2200倍以上。

圖9,使用ELISA,與對照Hela-GFP細胞相比,在來自Notch激活的Hela-ICN1細胞的培養基中檢測到了SST在蛋白水平上的增加。

圖10,使用蛋白免疫印跡,在Notch激活的Hela-ICN1細胞中檢測到了SSTR2表達的增強。

圖11,受體結合試驗證明,在Hela-ICN1中,通過Notch1激活,SSTR2的密度增加。

圖12,原生SST-14以劑量依賴的方式抑制Hela-GFP細胞增殖,在20μM下,產生約40%的抑制率。SST-14加強了Notch1激活的Hela-ICN1細胞生長的抑制,在20μM下,產生了12%的抑制率。

圖13,Notch激活抑制宮頸癌Hela細胞克隆的形成。平板B1顯示了Hela-GFP克隆,平板B2顯示了呈現激活的Notch信號的Hela-ICN克隆。Hela-ICN證明了比Hela-GFP對照細胞克隆更低的細胞增殖。

圖14,Hela-GFP對照沒有顯示細胞凋亡。

圖15,箭頭顯示了Hela-ICN細胞的細胞凋亡。與對照Hela-GFP相比,顯示在圖14中的這些結果證明了激活Notch信號會誘導腫瘤細胞凋亡。

圖16,以β-肌動蛋白作為對照,在宮頸癌Hela細胞中,不同濃度的Notch激活劑VPA對Notch1、SST和SSTR2表達的影響。VPA激活Notch1、SST和SSTR2的表達。

圖17,以β-肌動蛋白作為對照,在胰腺類癌BON細胞中,不同濃度的VPA對Notch1、SST和SSTR2表達的影響。在BON細胞中,VPA激活Notch1、SST和SSTR2的表達。

圖18,小分子Notch激活劑VPA和SBHA抑制宮頸癌Hela細胞的生長。

圖19,VPA和CPT-SST綴合物(JF-10-81)對宮頸癌Hela細胞生長的結合治療結果。可見,2.5mM的VPA加強了CPT-SST綴合物(JF-10-81)對Hela細胞生長的抑制。

圖20,VPA/SBHA和CPT-SST綴合物(JF-10-81)對胰腺類癌BON細胞生長的結合治療結果。2.5mM的VPA或10uM的SBHA加強了CPT-SST綴合物(JF-10-81)對BON細胞生長的抑制。

圖21,VPA/SBHA和CPT-SST綴合物(JF-10-81)對肺癌DMS-53細胞生長的結合治療結果。2.5mM的VPA或10uM的SBHA加強了CPT-SST綴合物(JF-10-81)對DMS-53細胞生長的抑制。

圖22,VPA和秋水仙素-SST綴合物(JF-16-87)對宮頸癌Hela細胞生長的結合治療結果。2.5mM的VPA加強了秋水仙素-SST綴合物(JF-16-87)對Hela細胞生長的抑制。

圖23,VPA和秋水仙素-SST綴合物(JF-16-87)對胰腺類癌BON細胞生長的結合治療結果。2.5mM的VPA加強了秋水仙素-SST綴合物(JF-16-87)對BON細胞生長的抑制。

圖24,VPA和秋水仙素-SST綴合物(JF-16-87)對肺癌DMS-53細胞生長的結合治療結果。2.5mM的VPA加強了秋水仙素-SST綴合物(JF-16-87)對DMS-53細胞生長的抑制。

圖25,使用8mM的VPA處理后Hela細胞的形態學變化,表明可能的上皮-間質轉化(EMT)。

圖26,在原生Hela細胞中SSTR亞型的表達。存在大量的SSTR2和SSTR5,少量的SSTR1,沒有或微量的SSTR3和SSTR4。

圖27,Notch信號的激活(Hela-ICN1)上調SST的表達。在Hela-GFP對照中,SST沒有表達或微量表達。

圖28,在Hela-ICN1細胞中,Notch信號的激活誘導SSTR1和SSTR2的上調,SSTR3的下調,而SSTR4和SSTR5沒有變化。GFP表示Hela-GFP,ICN1表示Hela-ICN1。

圖29,SST通過SST siRNA而發生基因沉默(knockdown)。使用5μl(泳道1)、15μl(泳道2)、30μl(泳道3)的SST siRNA、15μl的對照siRNA(泳道4)處理的過表達SST的Hela-ICN1細胞。泳道5和泳道6分別為對照Hela-ICN1細胞和Hela-GFP細胞。

圖30,在Hela-ICN1細胞中,通過SST siRNA的SST基因沉默對特定基因表達的影響。通過Notch1激活的抗細胞凋亡基因BCL-2的基因沉默通過SST siRNA得到逆轉,表明Notch1介導的細胞凋亡通過SST信號通路。對照siRNA(15μl),SST siRNA(15μl)。

圖31,SST-14抑制Hela-GFP細胞增殖,DC-53-22加強所述抑制。

圖32,綴合物JF-10-81和DC-53-22均加強了通過在Hela-ICN1細胞中激活Notch1誘導的抑制。

圖33,SST-14抑制Hela-GFP細胞增殖,綴合物CPT-SST(JF-10-81)加強所述抑制。

圖34,綴合物JF-10-81對胰腺類癌BON腫瘤生長的影響。在該實驗中,使用2mg/kg的JF-10-81處理BON腫瘤,每天1次,每周5次,總共進行21次注射。所述綴合物JF-10-81抑制胰腺類癌BON細胞的生長。

圖35,綴合物JF-10-81和/或Notch/SSTR2誘導物VPA對胰腺類癌BON腫瘤生長的影響。對攜帶BON腫瘤的裸鼠進行隔一天一次,每周3次,總共21次注射的治療。低劑量的VPA(50mg/kg)和綴合物JF-10-81(0.5mg/kg)的結合治療比較高劑量的單獨的VPA(200mg/kg,高4倍)或單獨的JF-10-81(1mg/kg,高2倍)顯示出更有效地抗腫瘤能力。VPA和SSTR2特異性綴合物JF-10-81的結合治療加強了對胰腺類癌BON腫瘤生長的抑制。

圖36,細胞增殖試驗顯示了單獨的VPA和綴合物CPT-SST以劑量依賴的方式抑制宮頸癌Hela細胞的生長,但在一起的結合處理加強了所述抑制。

圖37,用VPA和CPT-SST處理來自宮頸癌Hela細胞生長的腫瘤。由200mg/kg劑量的VPA和1mg/kg劑量的CPT-SST誘導的腫瘤抑制率分別為46%和57%。VPA和CPT-SST結合處理的抑制效果增加為85%。

圖38,VPA誘導了胰腺類癌BON細胞的生長停滯,并加強了綴合物COL-SST(秋水仙素-SST)對BON細胞的抑制。

圖39,VPA誘導了宮頸癌Hela細胞的生長停滯,并加強了綴合物COL-SST(秋水仙素-SST)對Hela細胞的抑制。

圖40,SBHA(辛二酰雙羥肟酸,Suberoyl Bis-hydroxamic Acid)誘導了胰腺類癌BON細胞的生長抑制,并加強了綴合物CPT-SST對BON細胞生長的抑制。

圖41,SBHA誘導了小細胞肺癌(SCLC)DMS53細胞的生長抑制,并加強了綴合物CPT-SST對DMS-53細胞生長的抑制。

圖42,在裸鼠中,VPA誘導了宮頸癌Hela腫瘤的抑制,并加強了綴合物COL-SST對Hela腫瘤的抑制。

圖43,在裸鼠中,VPA誘導了胰腺類癌BON腫瘤的抑制,并加強了綴合物COL-SST對BON腫瘤的抑制。

圖44,綴合物CPT-SST和Notch抑制劑DBZ(二苯并氮卓,dibenzazepine)以及NLE對卵巢癌OVCAR8細胞生長的影響,與使用CPT-SST及DBZ和CPT-SST及Nle的結合處理的加強效果。

圖45,綴合物CPT-SST和Notch抑制劑DBZ和NLE對胰腺癌CFPAC-1細胞生長的影響,與使用CPT-SST及DBZ和CPT-SST及Nle的結合處理的加強效果。

圖46,綴合物CPT-SST和Notch抑制劑DBZ和NLE對結直腸癌HT-29細胞生長的影響,與使用CPT-SST及DBZ和CPT-SST及Nle的結合處理的加強效果。

圖47,細胞增殖試驗。在胰腺類癌BON細胞和宮頸癌Hela細胞中,VPA加強了綴合物COL-SST的抗增殖能力。

圖48,VPA抑制胰腺類癌BON細胞的生長,并加強CPT-BN誘導的抑制。

圖49,VPA抑制CNDT2細胞的生長,并加強CPT-BN誘導的抑制。

圖50,VPA抑制白血病MOLT-4細胞的生長,并加強CPT-BN誘導的抑制。

圖51,細胞增殖試驗。顯示的是使用VPA測試的選自16種不同類型的癌細胞的6株典型的癌細胞系。在白血病MOLT-4細胞、前列腺癌DU-145細胞、前列腺癌PC-3細胞、結腸癌HT-29細胞、卵巢癌OVCAR8、SKOV3和NCI/ADR-RES細胞中,VPA顯示了其抗增殖的能力,但在肺癌A549細胞中不明顯。

圖52,在宮頸癌Hela、胰腺類癌BON、SCLC DMS-53、MTC TT細胞和肝癌HTB-52細胞中,VPA介導的Notch表達的RT-PCR檢測。

圖53,在Hela細胞中,VPA介導的特定癌相關基因(BCL-2、COX2、MMP2、PCNA、p53、p21和p63)的表達的RT-PCR檢測。在Hela細胞(Hela-ICN1)中,還研究了ICN1激活對這些基因的影響。

圖54,VPA和ICN1誘導的Hela細胞的形態學改變。(A)Hela-GFP細胞(對照),(B)Hela-ICN1細胞(Notch1由ICN1激活),(C)和(D)顯示了0(C)和8mM(D)的VPA處理的Hela細胞。

圖55,在宮頸癌Hela細胞、胰腺類癌BON、SCLC DMS-53、MTC TT和肝癌HTB-52細胞中以及在具有Notch1激活的宮頸癌Hela-ICN1細胞中,VPA介導的特定GPCR成員和生長激素抑制素(SST)的表達的RT-PCR檢測。測試的GPCRs包括SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、GRPR、BRS3、NMBR、PAC1、VPAC1和VPAC2。

具體實施方式

本發明的一些實施方式包括含有兩種組分(第一組分和第二組分)的多組分組合物。

所述第一組分含有第一組合物,該第一組合物可以含有Notch影響分子。所述Notch-影響分子可以包括,但并不限于Notch配體(例如,Jagged1、Jagged2、Delta1、類Delta1(Dll1)、Dll3和Dll4)、Notch受體(例如,Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)、激活Notch信號的分子(例如,丙戊酸(valproic acid,VPA)和辛二酰雙羥肟酸(SBHA))或抑制Notch信號的分子(例如,Z-Leu-Leu-Nle-CHO(Nle=正亮氨酸)(NLE)和二苯并氮卓(DBZ))。在一些實施方式中,所述Notch影響分子為組蛋白脫乙酰酶抑制劑,所述組蛋白脫乙酰酶抑制劑可以為但并不限于,羧化物(例如,丁酸鈉、丙戊酸、苯丁酸鈉和丁酸新戊酰氧甲酯(pivaloyloxymethyl butyrate))、異羥肟酸(例如,辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid)(SAHA)、曲古抑菌素A(7-[4-(二甲氨基)苯基]-N-羥基-4,6-二甲基-7-氧代-2,4-二酰胺(7-[4-(dimethylamino)phenyl]–N–hydroxy-4,6–dimethyl-7-oxohepta-2,4-dienamide)、SBHA)、苯甲酰胺(例如,CI-994(4-乙酰氨基-N-(2′-氨基苯基)-苯甲酰胺))和MS-275(N-(2-氨基苯基)4[N-(吡啶-3-基-甲氧基-羰基)氨甲基]苯甲酰胺)、環氧酮(例如,Trapoxin B和2-氨基-8-氧代-9,10-環氧癸酸)、環肽(例如,Apicidin(環(N-O-甲基-L-色氨酸-L-異亮氨酸-D-甲基哌啶-L-2-氨基-8-氧癸基),cyclo(N-O-methyl-L-tryptophanyl-L-isoleucinyl-D-pipecolinyl -L-2-amino-8-oxodecanoyl))和縮肽類)、雜分子(例如,CHAP31和CHAP50)、環海洋生物堿(cyclostellettamines)和卡馬西平(carbamazepines)。在其它實施方式中,所述Notch影響分子可以為Notch抑制劑,例如,但并不限于,Z-Leu-Leu-Nle-CHO(Nle=正亮氨酸)(NLE)、二苯并氮卓(DBZ)、γ-分泌酶抑制劑(例如,MRK003)、苯甲基羰基氧化酶-Leu-Leu-Nle-CHO(Benzyloxicarbonyl-Leu-Leu-Nle-CHO,LLNle)、N-[N-(3,5-雙氟酚內氨酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁基酯(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT)和L685458((5S)-(t-丁氧基羰基氨基)-6-苯基-(4R)羥基-(2R)苯甲己酰)-L-leu-L-phe-氨基,(5S)-(t-Butoxycarbonylamino)-6-phenyl-(4R)hydroxy-(2R)benzylhexanoyl)-L-le u-L-phe-amide)。在一些實施方式中,組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑,可以為,但并不限于,丙戊酸(VPA)或辛二酰雙羥肟酸(SBHA)。

在一些實施方式中,所述Notch影響分子靶向Notch受體。在一些實施方式中,所述Notch影響分子導致SST表達的增強、一種或多種SSTRs表達的增強、SST信號的上調、GPCR表達的改變,或它們的組合。在某些情況下,所述GPCR可以為SSTR(例如,SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4或SSTR5)、胃泌素-釋放肽受體(GRPR)、BRS3、NMBR、PAC1、VPAC1和VPAC2。在一些實施方式中,所述Notch影響分子增強Notch的胞內域(ICN)的表達、增加ICN的胞內量、或增加ICN的胞外量。

在一些實施方式中,所述Notch影響分子為VPA,且VPA的濃度范圍為約0.1mM到約50mM,約1mM到約10mM,可以為,例如,約0.1mM、約0.2mM、約0.3mM、約0.4mM、約0.5mM、約0.6mM、約0.7mM、約0.8mM、約0.9mM、約10mM或約25mM。在一些實施方式中,所述Notch影響分子為SBHA、DBZ或NLE,且Notch影響分子的濃度范圍為約0.1μM到約100μM,約0.1μM到約50μM,或者約1μM至約10μM,并且可以為,例如,約0.1μM、約0.2μM、約0.3μM、約0.4μM、約0.5μM、約0.6μM、約0.7μM、約0.8μM、約0.9μM、約10μM、約20μM、約30μM、約40μM或約50μM。

所述多組分組合物的第二組分含有第二組合物,該第二組合物可以含有GPCR靶分子。在某些情況下,GPCR靶分子可以為綴合物或多肽(例如,SST-14、SST-28或SST類似物)。在一些實施方式中,GPCR靶分子對細胞具有細胞毒性。在其它實施方式中,GPCR靶分子對癌細胞具有細胞毒性。在一些情況下,靶向的GPCR可以為SSTR(例如,SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4或SSTR5)、胃泌素-釋放肽受體(GRPR)、BRS3、NMBR、PAC1、VPAC1或VPAC2。在其它實施方式中,GPCR靶分子能夠導致SST表達的增強、一種或多種SSTRs表達的增強、SST信號的上調,或它們的組合。在另外的其它實施方式中,所述Notch影響分子能夠增強GPCR(例如,SSTR)的表達,隨后能夠加強GPCR靶分子的作用。所述GPCR靶分子的加強能夠,例如,產生加強的癌癥治療,包括但并不限于癌細胞生長抑制或腫瘤生長抑制。

在一些實施方式中,當GPCR靶分子為多肽時,其可以為SST-14或SST類似物。SST-14為Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(SEQ ID NO:1)。本文中,SST-14也被稱為DC-53-99。在特定的實施方式中,SST類似物可以為與SST-14序列相似但仍然靶向GPCR的多肽。在某些情況下,SST類似物包括一個或多個來自SST-14的保守突變。在某些情況下,SST類似物含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個與SST-14相同的氨基酸(例如,在相同的相對位置上)。在某些情況下,SST類似物含有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個氨基酸。在某些情況下,SST類似物可以為生長激素抑制素類似物。在特定的實施方式中,SST類似物可以是環形的或者含有至少一個環形結構;例如,可以通過在兩個半胱氨酸之間形成二硫鍵而發生環化。在一些實施方式中,SST類似物可以為奧曲肽(octreotide)、奧曲鹽(octreotate)、蘭瑞肽(lanreotide)或帕瑞肽(pasireotide)。

在一些實施方式中,當GPCR靶分子為綴合物時,所述綴合物可以為

X-Y-Z-Q (式I)

其中,X為單價部分(univalent moiety),Y為鍵(bond)或二價的第一連結物,Z為鍵或二價的第二連結物,Q為單價的氨基酸鏈。在一些實施方式中,X具有細胞毒性。在其它實施方式中,X為抗癌部分。在另外的其它實施方式中,Q可以含有D-氨基酸、L-氨基酸,或兩種均含有。Q可以,例如,含有環形的氨基酸結構(例如,由兩個半胱氨酸之間的二硫鍵形成的環形結構)。

在一些實施方式中,X可以為

在一些實施方式中,Y可以為鍵,或

連接到連接到Z,

其中,A1可以為-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N-(CH3)2、-CH2-CH2-CH2-NH2或-CH2-CH2-OH。

在一些實施方式中,Z可以為鍵,

{連接到Y}-NMeAmEtGly-Gaba-{連接到Q},

{連接到Y}-Gly-(Gaba)-{連接到Q},

{連接到Y}-(Gaba)-{連接到Q},

{連接到Y}-(D-Lys)-(D-Tyr)-Lys-(D-Tyr)-(D-Lys)-{連接到Q},或者

{連接到Y}-(D-Ser)-(Nle)-(D-Tyr)-(D-Ser)-{連接到Q},Nle為正亮氨酸。

在一些實施方式中,Q可以為

(D-Ser)-(D-Lys)-Gln-Trp-Ala-Val-(β-Ala)-His-Phe-Nle-NH2,

(D-,L-Ser)14-(D-Ser)-(D-Lys)-Gln-Trp-Ala-Val-(β-Ala)-His-Phe-Nle-NH2,

(D-Ser)-(D-Tyr)-Gln-Trp-Ala-Val-(β-Ala)-His-Phe-Nle-NH2,

Gly-(D-Ser)-(D-Tyr)-Gln-Trp-Ala-Val-(β-Ala)-His-Phe-Nle-NH2,

His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-NH2,或者

His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys-NH2。

上述Q的環形結構通過半胱氨酸之間的二硫鍵形成,圖強調連接,但連接的硫來自半胱氨酸;沒有使用額外的硫原子形成那些環形部分。

在一些實施方式中,X直接與Q連接。在一些實施方式中,Z為鍵,Y不為鍵。在一些實施方式中,Y為鍵,Z不為鍵。在一些實施方式中,式I為

本文中,式(I-1)被稱為CPT-SST或JF-10-81。本文中,式(I-2)被稱為COL-SST或JF-16-87。本文中,式(I-3)被稱為CA-SST。本文中,式(I-4)被稱為MTX-SST。本文中,式(I-5)被稱為CPT-BN。本文中,式(I-12)被稱為DC-53-22。在一些實施方式中,所述綴合物可以為,但并不限于COL-SST、CPT-SST、CPT-BN、CA-SST或MTX-SST。式(I-1)-(I-4)和(I-6)的Q部分通過半胱氨酸之間的二硫化物連接而形成;圖強調連接,但連接的硫來自半胱氨酸,沒有使用額外的硫原子形成那些環形部分。

在一些實施方式中,所述GPCR靶分子濃度范圍為約0.1μM至約100μM,約0.1μM至約50μM,或者約1μM至約10μM,并且可以為,例如,約0.1μM、約0.2μM、約0.3μM、約0.4μM、約0.5μM、約0.6μM、約0.7μM、約0.8μM、約0.9μM、約10μM、約20μM、約30μM、約40μM或約50μM。

在一些實施方式中,所述GPCR靶分子為COL-SST或CST-SST,且所述GPCR靶分子濃度范圍為約0.1μM至約100μM,約0.1μM至約50μM,或者約1μM至約10μM,并且可以為,例如,約0.1μM、約0.2μM、約0.3μM、約0.4μM、約0.5μM、約0.6μM、約0.7μM、約0.8μM、約0.9μM、約10μM、約20μM、約30μM、約40μM或約50μM。

在一些實施方式中,所述多組分組合物不含有順鉑-抑拓撲酶素、肼苯噠嗪(hydralazine)或抑拓撲酶素中的一種或多種。在一些實施方式中,所述Notch影響分子與GPCR靶分子不相同(例如,它們在單一種類的多組分組合物中不同時使用)。在一些實施方式中,表示Notch影響分子的種類(genus)與表示GPCR靶分子的種類不重疊。

本發明的一些實施方式包括對至少一種或多種細胞進行所述多組分組合物給藥的方法。在某些情況下,所述一種或多種細胞可以為癌細胞。在特定的實施方式中,所述細胞可以為人胰腺類癌BON細胞(例如,加爾維斯頓德克薩斯大學的Courtney Townsend博士的實驗室的人胰腺類癌BON細胞)、人T細胞急性淋巴細胞白血病(T-ALL)HPB-ALL細胞、骨肉瘤U2OS細胞、淋巴瘤Jurkat細胞、宮頸癌HeLa細胞、小細胞肺癌(SCLC)DMS-53、甲狀腺髓樣癌(medullary thyroid cancer,MTC)TT細胞、肝癌HB-8064(Hep3B)、HTB-52細胞、卵巢癌OVCAR8、SKOV3、NCI/ADR-RES細胞、前列腺癌DU-145細胞、前列腺癌PC-3細胞、胰腺癌CFPAC-1細胞、肺癌A549、白血病Molt-4細胞和結腸癌HT-29細胞。在一些實施方式中,所述細胞能夠正常地表達、有限地表達、或不表達SST/SSTR(s)。在一些實施方式中,所述細胞為能夠正常地表達、有限地表達、或不表達SST/SSTR(s)的癌細胞。

本發明的一些實施方式包括對生物體(例如,動物)進行所述組合物給藥的方法。在某些情況下,所述動物是哺乳動物,例如,但并不限于,人、嚙齒動物(例如,大鼠或小鼠)、馬、犬、貓、豬、牛或羊。

在本發明的其它實施方式中,還包括使用所述組合物用于治療動物的方法。在特定的實施方式中,可以使用所述方法治療癌癥。例如,可以使用所述方法治療宮頸癌、胰腺癌、胰腺類癌、肺癌、小細胞肺癌(SCLC)、皮膚癌、甲狀腺髓樣癌(MTC)、皮膚鱗狀細胞癌、結直腸癌、骨肉瘤、肝癌、白血病、卵巢癌、腫瘤和內分泌腫瘤。在另外的其它實施方式中,所述治療能夠在癌細胞中抑制上皮-間質轉化(EMT)。在一些實施方式中,所述癌癥類型為膠質瘤、成神經細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、肝癌、子宮內膜癌、神經外胚層癌、黑色素瘤、畸胎癌、成髓細胞瘤(meduloblastoma)、胸部腫瘤(例如,肺、食道(esopagheal)或間皮瘤)、膀胱癌、EBV-相關腫瘤、良性腫瘤(例如,例如,胃腸道或肺)或纖維肉瘤。在一些實施方式中,以下對癌癥的一種或多種治療結果:抑制癌癥的增殖、抑制腫瘤的生長、癌細胞凋亡、抗血管生成、抗轉移作用、化療敏感(chemo-sensitation)、放射敏感(radio-sensitation)、對腫瘤免疫應答的促進作用、癌細胞的生長停滯、或腫瘤的停滯。

在一些實施方式中,所述哺乳動物為需要治療疾病、狀況或紊亂的人。例如,需要癌癥治療的哺乳動物(例如,人),包括本文述及的那些類型中的任何一種。

對生物體進行給藥或治療的方法可以以任何方式進行,包括,但并不限于,口服治療、鼻內治療或注射。例如,注射可以包括,但并不限于,靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射或皮下注射。

在一些實施方式中,治療生物體的方法將涉及使用第一組分和第二組分的結合的治療。在多組分組合物中的Notch影響分子的量依賴多種因素,包括,例如,生物體的疾病狀態、具體的生物體、生物體的重量、生物體的成熟狀態以及綴合物的量和特性。所述GPCR靶分子的量依賴多種因素,包括,例如,生物體的疾病狀態、具體的生物體、生物體的重量、生物體的成熟狀態和Notch影響分子的量和特性。在一些實施方式中,多組分組合物中的Notch影響分子的量為約0.05到約1000mg/kg體重、約0.2到約500mg/kg體重、約0.5到約200mg/kg體重、約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1.0mg/kg、約1.2mg/kg、約1.4mg/kg、約1.6mg/kg、約1.8mg/kg、約2.0mg/kg、約5.0mg/kg、約10.0mg/kg、約20.0mg/kg、約50.0mg/kg、約75.0mg/kg、約100.0mg/kg、約200.0mg/kg、約300.0mg/kg、約500.0mg/kg、約750.0mg/kg、約1000.0mg/kg、約1500.0mg/kg或約2000.0mg/kg。一些情況下,多組分組合物中Notch影響分子的量約為100mg/kg體重。在一些實施方式中,多組分組合物中的GPCR靶分子的量為約0.05到約1000mg/kg體重、約0.2到約500mg/kg體重、約0.5到約200mg/kg體重、約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1.0mg/kg、約1.2mg/kg、約1.4mg/kg、約1.6mg/kg、約1.8mg/kg、約2.0mg/kg、約5.0mg/kg、約10.0mg/kg、約20.0mg/kg、約50.0mg/kg、約75.0mg/kg、約100.0mg/kg、約200.0mg/kg、約300.0mg/kg、約500.0mg/kg、約750.0mg/kg、約1000.0mg/kg、約1500.0mg/kg或約2000.0mg/kg。一些情況下,多組分組合物中GPCR靶分子的量約為1mg/kg體重。當然,在本發明的方法中,使用多種濃度是可能的,且可以在特定環境中調節濃度以獲得理想的結果。

本發明的一些實施方式包括藥物組合物。例如,藥物組合物可以含有多組分組合物中的有效量的組分、治療試劑、或溶解或分散在藥學上可接受的載體中的其他試劑。本發明的水性組合物可以含有多組分組合物中的有效量的組分,溶解或分散在藥學上可接受的載體或水介質中。短語“藥學上或藥理上可接受的”是指,當酌情對動物或人進行給藥時,不產生副作用、過敏、或其它不良反應的分子實體和組合物。

本文中使用的“藥學上可接受的載體”包括任何以及所有的溶劑、分散介質、涂料(coatings)、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如,抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑(isotonic agents)、吸收延緩劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩定劑、凝膠劑、粘結劑、賦形劑(excipients)、裂解劑(disintegration agents)、潤滑劑、甜味劑、調味劑、色素,類似的原料以及它們的組合。補充的活性成分也可以加入到所述組合物中。

本發明的一些實施方式包括含有所述多組分組合物的試劑盒。在一些情況下,所述試劑盒含有濃縮形式或干燥形式的多組分組合物,其中,在所述濃縮形式或干燥形式(例如,凍干的)中添加水、緩沖液、或惰性產品以調節用于給藥的組分的量。在一些情況下,所述試劑盒包括分離的容器,例如,在試劑盒的一個容器中含有第一組分,在試劑盒的另一個容器中含有第二組分。試劑盒中的所有或部分組分可以為濃縮形式或干燥形式。

實施例

本文中使用的實施例和方法作為教導本領域技術人員以任何適當的方式實施本發明的基礎。本文中公開的這些實施例不能被理解為限制。

設計實施例A

材料和方法

丙戊酸(VPA)購自Sigma(圣路易斯,MO),SBHA購自Santa Cruz(圣克魯茲,CA)。按照Sun等,Anticancer Drugs,2007,Vol.18,pp.341-348(Sun等,2007)中已描述的方法在我們實驗室中合成綴合物COL-SST和CPT-SST。綴合物DC-53-22按照Fuselier等,Bioorg&Med Chem Lett.,2003,vol.13,pp.799-803中的描述通過將CPT偶聯到DTrp8-SST-14的N末端而制備。DC-50-101,一種SST類似物,按照Rajeswaran等,Bioorg Med Chem.,2002,Vol.10,pp.2023-2029中的描述而制備。

質粒構建體和病毒包裝

通過RT-PCR擴增ICN1(Notch1的激活形式)并插入到逆轉錄病毒載體pMSCV-GFP(pGFP)中。將新的命名為pICN1-GFP的構建體和載體pGFP,與pVSV-G分別共轉染到包裝的細胞系,以分別獲得完整的病毒顆粒。測量所述病毒顆粒的病毒滴度,并轉導進HeLa細胞中。

細胞培養

將來自ATCC(弗吉尼亞州,馬納薩斯,美國典型菌種保藏中心)的人宮頸癌HeLa細胞,以及新構建的細胞Hela-GFP和Hela-ICN1保存在含有10%胎牛血清的MEM培養基中,并在37℃、5%CO2的氛圍下孵育。

RT-PCR、實時定量PCR和PCR試驗

按照試劑盒說明書(Invitrogen,卡爾斯巴德,CA)中的描述,從腫瘤細胞中分離總RNAs。表1中示出了用于RT-PCR的引物和PCR條件。

對于實時定量PCR,引物與表1中示出的相同。在Bio-Rad iCycler(Hercules CA)上進行實時定量PCR試驗。使用iScriptTM cDNA合成試劑盒和iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad)進行試驗。cDNA的合成在25℃5min、42℃30min、85℃5min下運行一個循環,并4℃下維持。PCR反應在10μl反應體系中運行。每10μl反應體系含有4μl模板(cDNA、基因組或質粒DNA)、5μl的iQTM SYBR Green Supermix(BioRad)、以及分別為0.25μM的相應的正向和反向引物。進一步在以下條件下運行PCR:1個用于初始變性的循環:95℃5min;以及40個用于引物退火和產物延伸的循環:95℃30s,56℃(SST)、57℃(SSTR2)30s。收集并分析溶解曲線數據,95℃1min和55℃1min,從55℃到95℃,以0.5℃的速率升溫下運行1個循環。在恒定的15℃下進行試驗。使用β-肌動蛋白作為內標(internal control)。按照Livak等,Methods,2001,Vol.25,pp.402-408中的描述,使用比對2-ΔΔCT方法計算結果。

表1用于PCR擴增的引物序列

Ref1-在Talora等,Genes&Dev.,2002,Vol.16,pp.22520-2263中記載的引物序列。

Ref.2-在Bellavia等,EMBO J.,2007,Vol.26,pp.1670-1680中記載的引物序列。

按照試劑盒的說明書(SABiosciences公司,Frederick,MD21703)的描述進行PCR試驗。首先,通過按照以下Qiagen RNeasy Mini試劑盒(巴倫西亞,CA91355)的說明書從Hela細胞中分離總RNA。為了去除基因組DNA,在96-孔板的0.5ml管中加入5μg的總RNA、2μl5×gDNA去除緩沖液以及不含RNase的水至10μl的終體積。輕輕的混合基因組DNA去除混合物,在42℃下孵育5min,立即放在冰上保持至少1min。然后,通過添加4μl5×RT緩沖液、1μl的引物和外部控制混合物(External Control Mix)、2μl的RT酶混合物以及不含RNase的水至10μl的終體積,以制備反轉錄(RT)混合物。對于第一鏈RT反應,將10μl的RT混合物和10μl的基因組DNA去除混合物混合在一起,在42℃下精確孵育15min,通過在95℃下加熱5min立即終止cDNA合成反應。在每個20μl的cDNA合成反應體系中加入90μl的ddH2O。在96-孔板格中進行實時定量PCR。通過添加1275μl2×SABiosciences RT qPCR混合母液、102μl稀釋的第一鏈cDNA合成反應物和1173μl ddH2O制備總體積為2550μl的實驗混合物。使用8通道移液器,將25μl的實驗混合物添加到96-孔PCR實驗板的每個孔中。在BioRad CFX96實時定量系統上進行實時定量PCR檢測,條件為:95℃10min的1個循環,和95℃15s、60℃1min的40個循環。按照如上所述的通過使用比對2-ΔΔCT分析結果。

蛋白免疫印跡

使用按照(圣克魯茲生物技術有限公司,圣克魯茲,CA.95060)描述的方案。簡單地,收獲細胞,重懸于含有混合物抑制劑的RIPA緩沖液中,通過穿過21號針(21gauge needle)使其分散均勻,與含有新鮮DTT的加樣緩沖液(loading buffer)混合,并在95℃下加熱5min。在10,000×g下離心后,對上清進行上樣以在8-16%的Tris-甘氨酸凝膠中跑樣。將蛋白質從凝膠中轉移至硝酸纖維膜上,然后使用5%的脫脂奶粉封閉,使用Notch1(sc-6014-R)、SSTR2(sc-11609)抗體(圣克魯茲)分別進行洗滌和孵育。再次洗滌所述膜并用第二抗體(圣克魯茲)進行孵育。最終,根據ECL系統說明(Amersham Biosciences,英國)形成薄膜。

ELISA

按照試劑盒說明(Phoenix Pharmaceuticals,伯林蓋姆,CA94010)通過ELISA測定培養基中的SST濃度和細胞內部的SST濃度。簡單地,分別在96-孔板中加入50μl的對照、制備的樣品、制備的肽標準品。在每個孔中添加25μl再水化的初級抗體,輕輕拍打板以保證徹底混勻,并在4℃下孵育過夜。除了空白孔,在每個孔中加入25μl再水化的生物素化的肽。將板在室溫下孵育90min。去除每個孔中的內容物。使用350μl的試驗緩沖液將板洗滌4次。在每個孔中添加100μl的鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(SA-HRP)。將板在室溫下孵育1h,洗滌并干燥。在每個孔中加入100μl制備的底物溶液,充分混合,并孵育15-20min。使用Victor Reader(PerkinElmer,波士頓,MA)在325/420nm波長(激發或發射)條件下測量熒光。

熒光偏振(FP)cAMP試驗

根據制造商的說明書(PerkinElmer,波士頓,MA02118-2512)進行FP cAMP試驗。簡單地,在每個孔中加入10μl不同濃度的毛喉素,然后再在每個孔中加入10μl的懸浮在刺激混合液(使用前,通過在刺激緩沖液中混合抗-cAMP抗體新鮮配制)中的細胞。將板在37℃下孵育30min。加入20μl的檢測混合物(在檢測緩沖液中稀釋熒光-cAMP母液),并在37℃下繼續孵育30min。同時,制備標準曲線,進行對照試驗。通過Victor Reader(PerkinElmer)測量cAMP。

細胞增殖試驗(MTT)

按照Sun等,Bioorg Med Chem Lett,2004,Vol.14,pp.2041-2046中的描述進行細胞增殖試驗(Promega,麥迪遜,WI)。簡單地,在96-孔板中加入50μl含有或不含有測試組分的培養基。將另外50μl的懸浮在培養基中的測試癌細胞(1×105個細胞/ml)分散在每個孔中。將板在37℃下孵育3天。然后,在板的每個孔中添加15μl的染料溶液。并在37℃下孵育4h。然后在每個孔中添加100μl的溶解溶液,并將板再在37℃下孵育直至每個孔中的內容物變為顏色均一的溶液。通過Victor Reader(PerkinElmer)在570nm下檢測板。

在體內腫瘤的生長和治療

按照Sun等,Drug Deliv.,2004,Vol.11,pp.231-238中的描述,在達到5-7周齡的裸鼠(NCI,Frederick,MD)的兩側的每個側面皮下植入在指數生長階段收獲并使用冰冷的PBS洗滌3次后的胰腺類癌BON細胞、宮頸癌Hela-GFP和Hela-ICN1細胞(4×106個細胞/100μl/老鼠)。每周對所有的老鼠進行檢測,在植入后的第11天測量腫瘤的體積,并且每周稱一次體重。在實驗結束時,對腫瘤進行稱量并拍照。

結果

具有激活的Notch1信號的Hela細胞的產生

我們通過RT-PCR在親本Hela細胞中研究了Notch1受體和配體的表達水平。我們的結果顯示,受體NOTCH1、NOTCH2和配體JAG1很容易被檢測到,然而NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL2、DLL4和JAG2很少或沒有表達(圖1&2)。

為了確定Notch信號對細胞生長的潛在影響。使用表達Notch1受體構成型激活形式的逆轉錄病毒、表達具有GFP的雙順反子(biscistronic)表達的Notch1(ICN1)的胞內區的逆轉錄病毒、以及表達GFP的逆轉錄病毒作為對照轉導Hela細胞。通過用于GFP表達的FACS對轉導的細胞、Hela-ICN1和Hela-GFP對進行分類,并通過蛋白免疫印跡分析確定ICN1蛋白的表達(圖3)。

Notch1信號的激活,在體外抑制細胞增殖,在體內抑制腫瘤生長。

我們通過在體外進行細胞增殖試驗(MTT試驗)(圖4)和體內的腫瘤生長(圖5&6)確定了Notch1信號對細胞生長是否有影響。我們發現,與對照細胞相比,Notch1信號的激活產生了50%以上(51.42%)的細胞生長抑制(圖4)。對于體內試驗,結果顯示激活的Notch1信號(Hela-ICN1)顯著地抑制了Hela腫瘤生長。在移植后的34天,對照組(Hela-GFP)中的腫瘤體積從91.27±23.46mm3增長到了1445±534.6mm3(圖6)。在移植后的34天,Hela-ICN1組中的腫瘤體積從88.56±11.05mm3增長到了294.1±172.5mm3。與Notch1激活相關的抑制率高于80%(腫瘤重量:86.18%,腫瘤體積:84.82%)(圖5&6)。

Notch1激活刺激毛喉素誘導的cAMP積累。

G蛋白偶聯受體(GPCRs)包括含有SSTRs的跨膜受體的大家族。環腺苷酸(cAMP)為GPCRs的第二信使。為了確定在Hela細胞中,Notch1信號的激活是否影響cAMP的積累,以及進一步確定GPCR是否參與其中,我們進行了cAMP試驗。使用毛喉素(一種通過激活腺苷酸環化酶來刺激cAMP產生的受體非依賴性cAMP激活劑)進行研究。我們發現,在Hela-GFP(對照)和Hela-ICN1細胞中,均提高了劑量依賴性的毛喉素刺激的cAMP的產生。1、10和50μM的毛喉素處理,在對照Hela細胞中導致了0.005、0.018和0.024pMol cAMP/103個細胞的產生,在具有激活的Notch1信號的Hela細胞中導致了0.05、0.25和0.46pMol cAMP/103個細胞的產生。由于Hela-ICN1細胞中通過毛喉素刺激的cAMP產量遠高于對照Hela-GFP細胞的cAMP產量(圖7),當使用1、10和50μM的毛喉素進行處理時,Hela-ICN1細胞中的cAMP濃度分別比Hela-GFP細胞中的cAMP濃度高10、14和19倍,因此,這些數據是預想之外的。因此,這些結果表明,激活的Notch1信號可以影響cAMP相關的信號通路。

具有Notch1信號激活的Hela細胞中基因表達圖譜的建立

隨后,基于以上結果,我們測試了參與cAMP和GPCR信號通路的基因是否參與Notch1介導的腫瘤抑制。我們使用了通路特異性的PCR試驗以建立參與cAMP/Ca++(PAHS-066A,SABsciences)、GPCR(PAHS-071A)和癌(PAHS-033A)信號通路的基因表達圖譜。

我們發現,應答cAMP/Ca2+的一組基因和在它們的啟動子中包括CRE、SRE或類SRE增強子序列的一組基因似乎通過Notch1信號介導。例如,上調了一些基因,例如,SST、FOS、COX-2、PIK3R1(PI3K p85α)、THBS1、CDKN1A(p21)和COX-2(表2)。下調了一些基因,例如,RB1、JUNB、PCNA、STAT3、Akt(PKB)和MYC(表2)。這些基因中的一些參與調節細胞功能,例如,DNA修復、轉錄和細胞周期。另外,我們發現,在Hela-ICN1細胞中,僅顯著上調了測試的41個GPCR基因中3個基因(SSTR2、ADRB2和AGTR2)。因此,SST和SSTR2似乎參與Notch1-介導的通路。

表2通過實時定量PCR檢測到的Notch信號對基因表達的影響

我們進行了與癌信號通路(PAHS-033A)相關的基因的PCR試驗。在Hela-ICN1中除了上述基因,與細胞凋亡、增殖、細胞周期、信號轉導和轉錄因子相關的一些基因(癌通路PCR試驗包括基因板中的這些基因)上調了(例如,整合蛋白α1、整合蛋白α4、MMP2、MMP9、TWIST1),或下調了(例如,MAP2K、RB1、E6/E7)(表2)。然而,例如p53、NFκB、BRCA1的特定基因的表達沒有明顯改變。這些數據表明,Notch1介導的腫瘤抑制可以通過包括cAMP/Ca++、GPCR組分和癌信號通路的信號通路級聯進行調節。

通過Notch1信號激活上調SST和SSTR2的確定

為了確定在Notch1激活的HeLa-ICN1細胞中SST和SSTR2的表達,我們進行了實時定量PCR、ELISA和蛋白免疫印跡分析。

對于SST表達,我們的結果顯示,在mRNA水平上,HeLa-ICN1細胞中激活的Notch1信號增加的SST轉錄比Hela-GFP中的高2200倍以上(圖8和表2)。我們進一步做了ELISA分析,并發現了SST在蛋白水平上的增加,與實時定量PCR顯示了相同的趨勢。HeLa-ICN1培養基中的SST濃度(657pg/ml)比Hela-GFP培養基中的SST濃度(311pg/ml)高2倍以上(圖9),但在細胞中未檢測到。

對于SSTR2表達,我們發現,在mRNA水平上,HeLa-ICN1細胞的SSTR2表達量比Hela-GFP細胞中的高21倍,在蛋白水平上,HeLa-ICN1細胞的SSTR蛋白比Hela-GFP細胞中的高70%以上(表2和圖10)。另外,我們進一步的結合試驗(按照Sun等,Clinical Medicine:Oncology,2008,Vol.2,pp.1-9中的描述)顯示,與Hela-GFP細胞相比,在HeLa-ICN1細胞表面上SSTR密度增加了10%以上(圖11)。

圖12顯示了SST-14以劑量依賴的方式抑制Hela-GFP(在圖12中為“Hela”)的細胞增殖,在20μM下產生了約40%的抑制率。SST-14加強了Notch1信號激活的Hela-ICN1細胞的生長抑制,在20μM下進一步產生了12%的抑制率,但是對Hela-ICN1細胞幾乎沒有影響。這表明ICN1的過表達可以導致更大量的通過Notch激活的SST基因表達產生的SST(圖12)。

設計實施例B

材料和方法

以下除非另有說明,否則所有的材料和方法均與在設計實施例A中提供的材料和方法相同。

RT-PCR和實時定量PCR

對于實時定量PCR,除SSTR1引物(正向:5’ATC TGC TGG ATG CCT TTC TAC G3’,反向:5’CAG GTG CCA TTA CGG AAG ACG3’)和SSTR2引物(正向:5’GAG AAG AAG GTC ACC CGA ATG G3’,反向:5’TTG TCC TGC TTA CTG TCA CTC CGC3’)外,引物與表1中所示的相同。按照之前的方法進行實時定量PCR試驗。使用iScriptTM cDNA合成試劑盒和iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad)進行試驗。cDNA合成運行條件為:25℃5min、42℃30min、85℃5min的1個循環并在4℃下保持。PCR反應在20μl體系中運行。每個反應體系含有1μl的cDNA、10μl的iQ SYBR Green Supermix(BioRad)和分別為1μl的相應正向和反向引物。PCR進一步在以下條件下運行:1個用于初始變性的循環:95℃5min;以及40個用于引物退火和產物延伸的循環:95℃30s和58℃(SSTR1)、57℃(SSTR2)、65℃(SSTR3和SSTR5)、60℃(SSTR4)和56℃(SST)30s。使用β-肌動蛋白作為內標。采用按照如上所述的比對2-ΔΔCT方法計算結果。

細胞克隆形成試驗

分別在6孔板中加入200個Hela-GFP和Hela-ICN1細胞。將板連續孵育7-8天直至細胞克隆可見。在室溫下使用100%的甲醇固定克隆15min,并使用PBS進行洗滌。在室溫下,進一步使用0.1%的結晶紫對克隆染色1h,用水沖洗,風干后拍照。

細胞周期分析

通過流式細胞術進行細胞周期分析。收獲細胞(2×106),使用PBS洗滌,并于-20℃下在70%的乙醇中固定過夜。離心(5min,200×g)后將細胞重懸于5mL的PBS中,孵育60s,并在200×g條件下離心5min。將細胞沉淀懸浮在1mL含有0.1%Triton-100、20μg碘化丙啶(PI)(Sigma p4864)和200μg不含DNase的RNase A(Sigma R6513)的PBS中。在室溫下保持1h,并送至杜蘭大學癌癥中心(Tulane Cancer Center)進行流式細胞術分析。

結果

Notch1信號的激活誘導了抗細胞增殖

MTT試驗顯示,Notch1激活抑制Hela細胞(Hela-ICN1)增殖,平均抑制率為46%(表3)。細胞克隆形成試驗顯示,Notch1信號誘導克隆形成(圖13)。發現增殖標記PCNA和p21由Notch1激活調節。改變與Notch1的抗增殖功能是相同的。通過Notch1激活,下調了PCNA,但上調了p21(表2)。

Notch1信號的激活誘導了細胞凋亡和細胞周期停滯

通過FACS對Hela-GFP和Hela-ICN1細胞的細胞凋亡和細胞周期進行了分析。表3、圖14和圖15中的結果顯示,激活的Notch1信號導致細胞周期停滯在DNA損傷經常發生的S期,并誘導了16%的細胞凋亡(圖15)。評價了細胞周期和細胞凋亡標志的表達。在Hela-ICN1細胞中,抗細胞凋亡BCL-2下調了,但細胞周期標志p21上調了,p53、MDM2的表達沒有明顯改變。p21為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑,通過p53依賴性和非依賴性機制誘導。p21的誘導可以引起細胞周期停滯。

表3具有Notch1激活的Hela-ICN細胞的細胞周期分析

Notch刺激物抑制細胞生長并誘導SST信號

發現在宮頸癌Hela細胞和胰腺類癌BON細胞中,Notch刺激物VPA誘導Notch1、SST的表達、VPA介導的Notch1、SST和SSTR2的增加(圖16和17)。采用MTT試驗,VPA還顯示了對Hela細胞、BON細胞和小細胞肺癌DMS53細胞(圖18、19、20、21、22、23和24)的生長抑制。通過MTT試驗,另一個Notch刺激物SBHA也顯示了其抗增殖能力(圖18、20和21)。

Notch1信號的激活可能參與上皮-間質轉化(EMT)

通過VPA誘導的Notch1激活,我們還觀察到了細胞形態的改變(圖25)。Notch1激活后,研究了Hela細胞中一些上皮特異性標記(例如,E-鈣粘蛋白、β-連環蛋白)和間質標記(例如,波形蛋白、N-鈣粘蛋白、MMP-2、纖連蛋白)的表達。在Notch1激活的Hela-ICN1細胞中還檢測到了轉錄因子Twist(一種已知的中胚層組織發育的調節劑)、Snail和Slug。Snail和Slug促進EMT。Slug、Snail和Twist為調節腫瘤抑制劑(例如,E-鈣粘蛋白)表達的轉錄因子。我們發現,E-鈣粘蛋白下調了。通過Notch1激活,Slug、Snail和Twist上調了。然而,β-連環蛋白、波形蛋白、N-鈣粘蛋白和纖連蛋白的表達沒有明顯改變。這些發現表明Notch1激活可以促進EMT。

Notch介導的SST和SSTRs的上調

在HeLa-GFP和HeLa-ICN1細胞中,使用RT-PCR和實時定量PCR研究SST和所有5個SSTR亞型的表達。首先,我們研究了在HeLa細胞中SST和所有SSTRs的背景。我們發現,在原生Hela細胞中,SSTR2和SSTR5高度表達,SSTR1和SSTR3少量表達,SSTR4沒有表達或微量表達(圖26)。來自RT-PCR的結果顯示,在Hela-ICN1細胞中,SST(圖27)、SSTR1和SSTR2的表達增加了;SSTR3顯示出表達的下降,且SSTR4和SSTR5(圖28)沒有明顯的改變。另外,使用實時定量PCR,我們發現了與在RT-PCR中SST、SSTR1和SSTR2增加的相同的趨勢。激活的Notch信號激活SST轉錄,在Hela-ICN1中比在Hela-GFP中高2200倍以上(圖8&10),并且增加了SSTR1(16倍)和SSTR2(21倍),降低了SSTR3(4倍),SSTR4和SSTR5沒有明顯改變(小于2倍)。這些數據表明,在Hela腫瘤生長中的Notch信號的抑制可能與SST和SSTR1/2的激活相關。

SST和SST綴合物的抗細胞增殖

我們通過使用不同濃度(20、10和1μM)的SST-14處理Hela細胞進行細胞增殖試驗,發現SST-14以劑量依賴的方式抑制Hela細胞增殖,20μM下40%的抑制、10μM下28%的抑制,但在1μM下沒有影響。在Hela-ICN1細胞中的SST處理顯示了如在Hela-GFP細胞中的有限的抑制。在20、10和1μM下,SST對Hela-ICN1細胞的抑制率分別為12、8和2%,比在Hela-GFP中的低(圖12)。

SST基因沉默對Notch1誘導的BCL-2基因表達下降的逆轉

Notch1激活降低了抗細胞凋亡BCL-2的表達。將SST siRNA轉染到上述Notch1激活的細胞中,沉默了SST(圖29),并恢復了通過Notch1激活而降低的BCL-2(圖30)。這些發現表明SST信號參與Notch1誘導的Hela細胞凋亡。

SST信號激活在癌癥治療中的結合應用

DC-53-22綴合物抑制Hela-GFP細胞的細胞生長,在1、5和10μM的綴合物處理時,生長抑制率分別為32、40和73%(圖31&32)。綴合物JF-10-81也顯示了抗增殖能力(圖32&33)。

我們使用Notch激活劑和SSTR靶細胞毒素SST綴合物在體外和體內進行了試驗。Notch激活劑VPA和SBHA與綴合物CPT-SST(JF-10-81)或秋水仙素-SST(JF-16-87)結合使用。從體外試驗我們發現,VPA/JF-10-81或VPA/JF-16-87的結合加強了宮頸癌Hela細胞(圖19&22)、胰腺類癌BON細胞(圖20&23)和小細胞肺癌DMS-53細胞(圖21&24)的生長抑制。通過體內試驗,我們證明了單獨的綴合物JF-10-81能夠抑制類癌BON腫瘤生長(圖34)。另外,我們發現VPA(50mg/kg)和CPT-SST綴合物(JF-10-81)(0.5mg/kg)的結合治療比單獨的較高劑量的VPA(200mg/kg,高4倍)或CPT-SST(1mg/kg,高2倍)顯示了更有效的抗腫瘤能力(圖35)。

SSTR2靶向的CPT-SST綴合物的VPA加強的抗腫瘤效果

我們利用體外的MTT試驗研究了VPA對Hela細胞增殖的影響。我們發現,VPA本身以劑量依賴的方式抑制細胞增殖(0-5mM)(圖36)。另外,綴合物CPT-SST也以劑量依賴的方式誘導Hela細胞的生長停滯(0-10μM)。并且,觀察到了VPA和CPT-SST的結合處理加強了細胞生長的抑制(圖36)。

我們在體內進行了抗腫瘤試驗,證明VPA和CPT-SST的結合治療比單獨治療在更大程度上抑制了宮頸癌Hela腫瘤的生長。如圖37所示,200mg/kg的VPA和1mg/kg的CPT-SST的抑制效果分別為46%和57%。然而,200mg/kg的VPA和1mg/kg的CPT-SST的結合治療的抑制效果為85%。結合治療比單獨的通過VPA或CPT-SST的抑制能力要好(圖37),這些體內結果表明,VPA介導的SSTR2上調能夠增加SSTR2靶向綴合物(例如,CPT-SST)的吸收和抗腫瘤效果。

設計實施例C

材料和方法

以下除非另有說明,否則所有的材料和方法均與在設計實施例A中提供的那些相同。

細胞培養

在37℃、5%CO2氛圍下,于補充有10%FBS的培養中培養人骨肉瘤U2OS細胞、胰腺類癌BON細胞、宮頸癌Hela和Hela-ICN1細胞(Notch1激活,用ICN1轉導的Hela細胞)、卵巢癌OVCAR8細胞、胰腺癌CFPAC-1細胞和結直腸癌HT-29細胞。

細胞增殖試驗(MTT)

按照Sun等,Bioorg Med Chem Lett,2004,Vol.14,pp.2041-2046中的描述進行細胞增殖試驗。簡單地,將50μl具有不同濃度組分的培養基加入到96-孔板中。所有組分的濃度均測試3次。將另外50μl的細胞母液(1×105個細胞/ml培養基)分散在每個測試孔中,并將板在37℃下、CO2培養箱中孵育3天。孵育后,將15μl的染料溶液加入每個孔中,并將板在37℃下孵育4h,隨后往每個孔中加入100μl的溶解溶液。將板在37℃下孵育直至每個孔中的內容物變為顏色均一的溶液。通過Victor Plate Reader,在570nm下測量并記錄吸光度。

體內的腫瘤生長和治療

在指數生長階段收獲并使用冰冷的PBS洗滌細胞3次后,以4×107個細胞/ml的細胞密度重懸于冰冷的PBS中。按照Sun等,Drug Deliv.,2004,Vol.11,pp.231-238中的描述,將100μl等分的細胞懸浮液皮下移植到5-7周齡的裸鼠(NCI,Frederick,MD)的兩側。將攜帶腫瘤的小鼠分為4組(n=8-10),在腫瘤相反的側面進行s.c注射以進行進一步的治療。對照組注射PBS,3個測試組使用組分治療。一組接受綴合物COL-SST(2mg/kg),一組接受200mg/kg的VPA。最后一組進行100mg/kg的VPA與1mg/kg的COL-SST的結合治療。所有的小鼠每天注射一次,一周5次。每周測量1次腫瘤體積并稱體重。

VPA抑制細胞增殖并加強受體靶向的細胞毒性肽綴合物的抗增殖

VPA誘導胰腺類癌BON細胞(圖38)、小細胞肺癌(SCLC)DMS53細胞、甲狀腺髓樣癌(MTC)TT細胞和宮頸癌Hela細胞(圖39)的生長停滯。這些癌細胞被認為具有作為腫瘤抑制劑的Notch信號。我們通過體外MTT試驗進一步研究了VPA與SSTR2靶向細胞毒素SST綴合物的結合對上述測試的癌細胞的增殖的影響。VPA以劑量依賴的方式(0-5mM)抑制這些癌細胞的生長。綴合物CPT-SST和COL-SST也以劑量依賴的方式(0-10uM)誘導這些癌細胞的生長停滯。還觀察到,與每種單獨試劑相比,VPA與CPT-SST和VPA與COL-SST(圖38和39)的結合處理加強了測試的癌細胞的生長抑制(例如,圖39中的Hela細胞和圖38中的BON細胞)。我們還觀察到,VPA和CPT-BN綴合物加強了處理的特定癌細胞的抗細胞增殖(圖48-50)。

使用SBHA處理,在具有作為腫瘤抑制劑的Notch的許多測試癌細胞中觀察到了生長停滯。SBHA還加強了綴合物CPT-SST對癌細胞(例如,胰腺類癌BON細胞(圖40)和小細胞肺癌DMS-53細胞(圖41))的抗細胞增殖。

HDAC抑制劑VPA在體內加強SST綴合物COL-SST的抗腫瘤作用

VPA和細胞毒素SST綴合物COL-SST的結合治療比單獨使用每種均能夠更好的抑制宮頸癌Hela腫瘤生長。如圖42所示,使用200mg/kg的VPA或使用2mg/kg的COL-SST的治療的抑制率分別為36.7%和72.9%。然而,100mg/kg的VPA和1mg/kg的COL-SST的低劑量的結合治療的抑制為85.8%(圖42)。在使用VPA和COL-SST治療胰腺類癌BON腫瘤中觀察到了相似的結果(圖43)。200mg/kg的VPA、2mg/kg的COL-SST、100mg/kg的VPA和1mg/kg的COL-SST的結合的治療的抑制率分別為47.9%、31.6%和48.5%(圖43)。

Notch抑制劑抑制細胞增殖并加強綴合物的抗增殖

我們還研究了一些Notch抑制劑(例如,Z-Leu-Leu-Nle-CHO(Nle=正亮氨酸)(NLE)和二苯并氮卓(DBZ))對癌細胞增殖的影響。這些抑制劑誘導細胞生長停滯并在體外加強卵巢癌OVCAR8細胞(圖44)、胰腺癌CFPAC-1細胞(圖45)和結直腸癌HT-29細胞(圖46)中的ted綴合物CPT-SST的抗增殖作用。

設計實施例D

材料和方法

以下除非另有說明,否則所有的材料和方法均與在設計實施例A中提供的材料和方法相同。

細胞培養

人胰腺類癌BON細胞由Courtney Townsend博士(加爾維斯敦德州大學)惠贈,并按照Sun等,2007中的描述進行培養。宮頸癌Hela-ICN1細胞(Notch1激活,用ICN1轉化的Hela細胞)由Lizi Wu博士(弗羅里達大學)惠贈,并按照Sun等,2007中的描述進行培養。人T細胞急性淋巴細胞白血病(T-ALL)HPB-ALL細胞保存在RPMI-1640培養基中。骨肉瘤U2OS細胞培養在McCoy’s5A培養基中培養。淋巴瘤Jurkat細胞在RPMI-1640培養基中培養。宮頸癌Hela細胞培養在含有10%FBS的F-12培養基中。小細胞肺癌(SCLC)DMS53在Waymouth’s培養基中保存。甲狀腺髓樣癌(MTC)TT細胞保存在F-12培養基中。肝癌HB-8064(Hep3B)和HTB-52細胞保存在MEM培養基中。卵巢癌OVCAR8、SKOV3和NCI/ADR-RES細胞保存在RPMI-1640培養基中。所有培養基均補充有10%的FBS。其它癌細胞,包括前列腺癌DU-145細胞、前列腺癌PC-3細胞、前列腺癌CFPAC-1細胞、肺癌A549、白血病MOLT-4細胞和結腸癌HT-29細胞均按照Sun等,2007和Sun等,J Drug Target,2011,Vol.19,pp.719-30(Sun等,2011)中的描述進行培養。

RT-PCR、實時定量PCR

對按照說明書(Invitrogen,Carlsbad,CA)中的描述從腫瘤細胞分離的總RNA進行RT-PCR。用于SST、BN和PACAP受體的所有引物均來自之前公開的報道(例如,Sun等,2011)。表4示出了用于RT-PCR分析的其它引物和條件。PCR擴增為常規的35個循環,由于這些研究的基因的RNA豐度的差異增加或減少循環數。用于實時定量PCR試驗的引物與以上描述的引物相同。按照Sun等,2011中的描述進行實時定量PCR試驗。使用β-肌動蛋白作為內標,使用如上所述的2-ΔΔCT方法計算結果。

表4用于基因擴增的引物序列和PCR條件

Ref1-在Talora等,Genes&Dev.,2002,Vol.16,pp.22520-2263中記載的引物序列。

Ref.2-在Bellavia等,EMBO J.,2007,Vol.26,pp.1670-1680中記載的引物序列。

VPA誘導的細胞形態改變

通過在96-孔板的每個孔中加入50μl的細胞(1×105個細胞/ml)和50μl的培養基,培養基含有或不含有測試組分VPA,以進行用于VPA誘導的細胞形態改變的試驗。在10×放大倍數下使用倒置光學顯微鏡對癌細胞進行觀察并拍照。

細胞增殖試驗(MTT)

按照Sun等,Bioorg Med Chem Lett,2004,Vol.14,pp.2041-2046中的描述進行細胞增殖試驗(Promega,麥迪遜,WI)。使用Victor Plate Reader(PerkinElmer,波士頓,MA)在570nm下測量并記錄吸光度。

體內的腫瘤生長和治療

在指數生長階段收獲并使用冰冷的PBS洗滌細胞3次后,以4×107個細胞/ml的細胞密度重懸于冰冷的PBS中。按照Sun等,Clin Med Oncol,2008;Vol.2,pp.491-9中的描述,將100μl等分的細胞懸浮液皮下移植到5-7周齡的裸鼠(NCI,Frederick,MD)的兩側。將攜帶腫瘤的小鼠分為4組(n=8-10),在腫瘤相反的側面進行s.c注射以進行進一步的治療。對照組注射PBS,3個測試組使用組分治療。一組接受綴合物COL-SST(2mg/kg),一組接受200mg/kg的VPA。最后一組進行100mg/kg的VPA與1mg/kg的COL-SST的結合治療。所有的小鼠每天注射一次,一周5次。每周測量1次腫瘤體積并稱體重。

結果

VPA抑制細胞增殖和腫瘤生長

VPA誘導胰腺類癌BON細胞(圖47)、SCLC DMS-53細胞、MTC TT細胞和宮頸癌Hela細胞(圖47)的生長停滯。這些癌細胞被認為具有作為腫瘤抑制劑的Notch信號。另外,通過下述的體內抗腫瘤試驗我們發現,VPA抑制Hela和BON腫瘤的生長,抑制率分別為36.7%和47.9%(圖42和43)。VPA還在許多其它癌細胞(例如,肝癌HB-8064、HTB-52、卵巢癌OVCAR8、SKOV3和NCI/ADR-RES細胞、前列腺癌DU-145和PC-3細胞、胰腺癌CFPAC-1細胞、T-ALL HPB-ALL細胞、白血病MOLT-4和Jurkat細胞、骨肉瘤U2OS細胞和結腸癌HT-29細胞)中顯示了其抗增殖能力。這些細胞中的一些細胞已經被報道具有作為致癌基因的Notch信號。圖51顯示的是許多這些VPA處理的癌細胞的部分結果。然而,VPA對肺癌A549細胞的增殖幾乎沒有影響。

在癌細胞中VPA可能調節Notch表達

我們發現,在胰腺類癌BON細胞中Notch2是可檢測的,TT、DMS-53和HTB-52基因幾乎不表達。在SCLC DMS53細胞中,檢測到了Notch1、Notch2和Notch4;沒有檢測到Notch3。在MTC TT細胞中,所有Notch基因均可檢測到低量的表達。在肝癌HTB-52細胞中,與Notch3和Notch4的微量或檢測不到的表達相比,Notch1和Notch2受體以較高水平的表達(數據未示出)。

我們研究了在這些細胞中VPA對Notch受體表達的影響。以系列濃度的VPA處理癌細胞,然后通過RT-PCR分析Notch表達。我們發現,在Hela細胞中,VPA增強了Notch1表達,而其它Notch基因的表達沒有明顯的改變。對于胰腺類癌BON細胞,VPA處理增強了Notch1、Notch2和Notch3的表達,沒有檢測到Notch4。在DMS-53中,VPA增強了Notch1和Notch2的表達,其它細胞中表達的沒有明顯改變。實時定量PCR分析進一步證實了VPA誘導Notch1增加(>2倍)。在TT細胞中,發現,VPA處理顯著地增強了Notch1、Notch2和Notch3表達,而降低了Notch4的表達。但在HTB-52細胞中,我們觀察到,VPA處理降低了Notch1和Notch2,而檢測不到Notch3和Notch4(圖52)。我們的發現表明,在4種類型的Notch信號被報道作為腫瘤抑制劑的癌細胞中,VPA增強了Notch1的表達。然而,在VPA作為Notch抑制劑或Notch信號可能作為致癌基因的HTB-52細胞中,VPA降低了Notch信號。

VPA介導的信號通路的參與

通過RT-PCR和實時定量PCR研究了包括COX2(預后標記,prognostic marker)、MMP2(細胞攻擊和轉移標記)、BCL-2(抗細胞凋亡標記)、p53(腫瘤抑制劑)、p21(腫瘤抑制劑)、p63(腫瘤抑制劑)、PCNA(增殖標記)和SST(生長激素釋放抑制因子)的一些基因的ICN1和VPA對Hela細胞的影響。

VPA介導的腫瘤相關標記的表達

通過實時定量PCR證實,在Hela細胞中,ICN1誘導了COX2(11.8倍)、MMP2(47.6倍)和SST(342倍)的增加,BCL-2(4.5倍)和PCNA(2.2倍)的下降。在Hela細胞中,VPA同樣如此(圖53和54),誘導了COX2(3.7倍)、MMP2(25倍)和SST(1.4倍)的增加,BCL-2(42.2倍)和PCNA(476倍)的下降。在BON、TT、DMS53和HTB-52癌細胞中,我們也觀察到了COX2、MMP、SST的增加以及BCL-2和PCNA的下降(數據未示出)。

VPA介導的p53家族信號

還研究了VPA和ICN1對p53和p53家族的影響。通過RT-PCR和實時定量PCR分析顯示,在Hela細胞中,ICN1和VPA上調了兩種基因p21和p63。ICN1誘導的p21和p63的增加分別比對照高7.4和9.0倍。VPA誘導的p21和p63的增加分別為18和12。然而,由ICN1和VPA誘導的p53的改變不同。p53被ICN1增加了(1.6倍),但被VPA降低了(3.1倍)。在BON、TT、DMS53和HTB-52癌細胞中觀察到了由VPA誘導的p53、p21和p63相同的變化趨勢(數據未示出)。

VPA介導的pTEN/PI3K/Akt信號

在Hela細胞中,我們比較了ICN1和VPA對pTEN/PI3K/Akt信號的影響(表2和5)。我們觀察到了由ICN1(6.7倍)和VPA(2倍)處理均導致了PI3K的增加,而兩種處理中具有不同的Akt和pTEN的表達。Akt和pTEN被ICN1下調了(分別為3.44和1.8倍),被VPA上調了(分別為2.1和1.9倍)(表5和圖53)。在Hela細胞中,VPA和ICN1介導的PI3K/Akt信號可以通過不同的信號通路級聯。我們還研究了基因相關信號的表達和某些GPCR成員的表達(討論如下)。

表5宮頸癌Hela細胞中某些基因表達的實時定量PCR

在宮頸癌細胞中VPA誘導的上皮-間質轉化/轉變(EMT)

我們在Notch1激活的Hela-ICN1細胞中觀察到了形態學改變(圖54)。我們還發現,VPA能夠誘導宮頸癌Hela(圖54)、骨肉瘤U2OS、肝癌HTB-52和胰腺類癌BON細胞的形態學改變,對測試的其它癌細胞(包括肺癌A549、SCLC DMS53、胰腺癌DU-145、白血病MOLT-4、Jurkat和HPB-ALL、卵巢癌NCI/ADR-RES和MTC TT)沒有影響。

選擇宮頸癌Hela細胞以比較ICN1和VPA誘導的EMT中基因表達之間的差異。我們最初研究了ICN1對EMT的影響和EMT相關基因的表達的影響,并發現在Hela-ICN1細胞中(表5),上調了Snail(1.4倍)、Slug(1.2倍)、Twist(2267倍)、纖連蛋白(3411)和N-鈣粘蛋白(150倍),下調了E-鈣粘蛋白(2.8倍)。如上所述,在宮頸癌Hela-ICN1細胞中MMP2也增加了(47.6倍)。這些Twist基因可能起始由ICN1誘導的EMT程序。這些發現支持了在宮頸癌Hela細胞中通過ICN1的Notch1激活誘導了EMT。我們進一步研究了在Hela細胞中,VPA對這些EMT-相關基因的表達的影響。我們發現VPA介導這些基因(包括Snail(53倍)、Slug(35倍)、Twist(3.4倍)、N-鈣粘蛋白(14倍)、纖連蛋白(39倍)和MMP2(如上所述的25倍))的上調。另外,我們發現了VPA誘導的E-鈣粘蛋白的增加(25倍)(表5),不同于ICN1誘導的降低。由VPA誘導的基因Snail、Slug和Twist的表達水平不同于ICN1誘導的Hela細胞(Hela-ICN1),盡管ICN1和VPA均介導這些基因的增加(表5)。這些表明VPA可能通過Snail和Slug誘導EMT。

VPA誘導特定GPCRs的表達

我們研究了在Hela-ICN1細胞中Notch1激活和在5種癌細胞系(Hela、BON、TT、DMS53和HTB-52)中VPA對SST、BN和PACAP受體(SSTR1-5、GRPR、BRS3、NMBR、PAC1、VPAC1和VPAC2)的表達的影響。

首先,我們使用RT-PCR和實時定量PCR證實了在Hela-ICN1細胞中SSTR1和SSTR2的增加。我們還發現,在Hela-ICN1細胞中,受體GRPR、BRS3、NMBR、VPAC1和VPAC2上調了,SSTR3、SSTR4和SSTR5下調了(圖55)。進一步研究了VPA對5種測試的癌細胞中這些受體的影響。

宮頸癌Hela細胞對于VPA處理,我們發現,在Hela細胞中,SSTR2(20倍,通過實時定量PCR證實)、SSTR3、SSTR5、PAC1、GRPR和BRS3上調了,SSTR1和VPAC2下調了,VPAC沒有變化。在Hela-ICN1細胞中和VPA處理的Hela細胞中,SSTR1、SSTR3、SSTR5、VPAC2和VPAC1的變化是不同的(圖55)。

胰腺類癌BON細胞在BON細胞中,VPA以劑量依賴的方式誘導SSTR2(25倍,通過實時定量PCR證實)、SSTR4、BRS3、GRPR和VPAC2的表達,并抑制SSTR1,其它的均沒有變化(圖55)。在這些細胞中,SSTR5高度表達,但使用VPA處理的并沒有變化。實時定量PCR進一步顯示了SSTR5的輕微下降(0.9倍)。

小細胞肺癌DMS-53細胞我們在VPA處理的DMS53細胞中研究了這些受體的表達,并發現,SSTR2(5.4倍,通過實時定量PCR證實)、SSTR3、GRPR和PAC1增加了,SSTR1、SSTR2、VPAC1、NMBR和BRS3沒有明顯變化,然而在原生DMS-53細胞中,未檢測到SSTR4、SSTR5、PAC1和VPAC2(圖55)。

甲狀腺髓樣癌TT細胞使用VPA處理,我們發現SSTR2(2.2倍,通過實時定量PCR證實)、BRS3、NMBR和VPAC2增加了,SSTR3和VPAC1下降了,其它均沒有明顯變化(圖55)。

肝癌HTB-52細胞我們發現在HTB-52癌細胞中,VPA增強了SSTR2(19.8倍,通過實時定量PCR證實)、SSTR3、SSTR5、GRPR、BRS3和VPAC1的表達。其它受體沒有被檢測到,并且不受VPA處理的影響(圖55)。

在體內VPA加強綴合物的抗腫瘤效果

我們的體外試驗顯示,在上述的各種腫瘤細胞中,VPA誘導生長停滯,并且在許多癌細胞中,VPA還上調SSTR2的表達。我們的體外試驗顯示,在11種測試的癌細胞中,例如,Hela(圖42)、BON(圖43)、TT、HTB-52、DU-145、PC-3、OVCAR8、HT-29、CFPAC-1、SKOV3和DMS-53,與每一單獨的試劑相比,VPA與CPT-SST和VPA與COL-SST的結合治療能夠顯著加強生長抑制(數據未示出)。通過使用MTT增殖試驗測定,我們還觀察到,在處理的BON癌細胞(圖48)、CNDT2癌細胞(圖49)和MOLT-4癌細胞(圖50)中,VPA和CPT-BN綴合物加強了抗細胞增殖(圖48)。

VPA和COL-SST的結合治療比單獨使用能夠更好的抑制Hela腫瘤生長。如圖42和圖43所示,使用200mg/kg的VPA或2mg/kg的COL-SST的抑制率分別為36.7%和72.9%。然而,低劑量的100mg/kg的VPA和1mg/kg的COL-SST的結合治療的抑制為85.8%(圖42和43)。在使用VPA和COL-SST治療的胰腺類癌BON腫瘤中觀查到了相似的結果。200mg/kg的VPA、2mg/kg的COL-SST以及100mg/kg的VPA和1mg/kg的COL-SST的結合的抑制率分別為47.9%、31.6%和48.5%(圖42和43)。體內實驗均表明VPA介導的SSTR2上調能夠增加綴合物COL-SST的吸收和抗腫瘤效果。

需要注意的是,本文中采用的術語,例如,“優選地”、“通常地”和“典型地”并不用來限制本發明權利要求的范圍,或暗示某些特征對于本發明的權利要求的結構或功能是關鍵的、必須的或甚至重要的。相反,這些術語僅僅意在突出在本發明的特定實施方式中可以或不可以使用的可選的或額外的特征。

本文中提供了一種或多種實施方式的詳細描述。然而,需要理解的是,本發明可以呈現為各種形式。因此,不應理解為受限于本文中公開的具體細節(即使設計為優選的或有利的),而是用于作為權利要求的基礎,并作為教導本領域技術人員以任何適當的方式實施本發明的代表性基礎。

已經描述了大量的實施方式。然而,應當理解的是,在不背離本發明精神和范圍的情況下,可以做出各種變型。因此,其它的實施方式將也被納入本發明的一部分,并包括在隨附的權利要求中。另外,各種實施方式的上述描述并不一定意味著排除。例如,在本發明的范圍內,“一些”實施方式,“典型的”實施方式,或“其他”實施方式可以包括全部或部分“一些”、“其它”和“另外”的實施方式。

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