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羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠及其制備方法.pdf

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羅哌卡 長效 注射 用溫敏 凝膠 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201510028754.2

申請日:

20150121

公開號:

CN104606129B

公開日:

20180504

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K9/06,A61K31/445,A61K47/34,A61P29/00 主分類號: A61K9/06,A61K31/445,A61K47/34,A61P29/00
申請人: 中國人民解放軍廣州軍區武漢總醫院
發明人: 符旭東,曾慧琳,郭家平,劉宏,施震
地址: 430030 湖北省武漢市洪山區武珞路627號
優先權: CN201510028754A
專利代理機構: 北京匯澤知識產權代理有限公司 代理人: 張瑾
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510028754.2

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠及其制備方法,該凝膠包括主藥羅哌卡因、鹽酸羅哌卡因或甲磺酸羅哌卡因;丙交酯與乙交酯摩爾比2~3:1,PEG分子量1000的PLGA?PEG?PLGA共聚物,PEG占共聚物總質量的18~30%;注射用水、生理鹽水或pH調節溶液。制備方法是先將共聚物在溶劑中溶脹充分,再加主藥,經濾膜除菌。該溫敏凝膠給藥方便,在體溫下迅速膠凝而發揮緩釋作用,藥物在體外12h釋放≤35~45%,48h釋放≥65%~75%,72h釋放≥80%,符合局麻藥物術后單次注射持續鎮痛48h的設計要求。藥效學研究表明羅哌卡因溫敏凝膠組能顯著延長藥效維持時間,可持續發揮48h的鎮痛作用。

權利要求書

1.一種羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠,其特征在于,成分由主藥,PLGA‐PEG‐PLGA共聚物和溶劑組成;按質量百分比計,主藥1%~5%,PLGA‐PEG‐PLGA共聚物10%~25%,溶劑余量;主藥為鹽酸羅哌卡因或甲磺酸羅哌卡因;PLGA‐PEG‐PLGA共聚物中丙交酯與乙交酯的摩爾比為2~3:1,聚乙二醇數均分子量為1000,聚乙二醇占PLGA‐PEG‐PLGA共聚物總質量的18%~30%;溶劑為注射用水、生理鹽水或pH調節溶液,所述pH調節溶液為pH>7.5的磷酸鹽緩沖液;所述羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠中凝膠體系的pH值為5~6;羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠的制備方法包括以下步驟:(1)將PLGA‐PEG‐PLGA共聚物適量置于溶劑中,攪拌直至共聚物分散均勻,于4℃中保存至凝膠充分溶脹溶解,得到PLGA‐PEG‐PLGA共聚物溶液;(2)將主藥在攪拌下緩慢地加入步驟(1)所得的PLGA‐PEG‐PLGA共聚物溶液中,繼續攪拌均勻即得羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠;(3)將步驟(2)所得的羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠通過0.2μm微孔濾膜過濾除菌。

說明書

技術領域

本發明涉及羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠及其制備方法。

背景技術

術后疼痛可導致心血管系統負擔增加,使肺順應性、通氣功能和血氧合功能降低等,從而誘發多種并發癥。術后急性疼痛如果不能在初始狀態下被控制,還可能發展為持續半年至數年的慢性疼痛,有效的術后鎮痛能為手術病人的康復提供更有利的條件。

術后疼痛可持續48~72h,而這個時間段的疼痛是最難控制的,局部應用麻醉藥是一種最直接的術后鎮痛方法,但臨床應用的局麻藥半衰期短,需要4~6h給藥一次,目前主要通過間斷性持續滴注和通過體內植入導管持續給藥的方式維持藥效,間斷性持續滴注所引起的血藥濃度波動,不僅影響了療效,而且增加毒副作用發生的幾率。而后一種給藥方式雖能持續作用于疼痛部位,但卻需要較昂貴的設備及連續監護,且長時間留置導管容易引起感染或導管移位。開發能延緩藥物釋放,延長作用時間的局麻藥緩釋制劑是施行舒適醫療迫切需要解決的問題。

羅哌卡因(Ropivacaine),化學結構式如下,臨床上主要用其鹽酸鹽和甲磺酸鹽。

羅哌卡因是新型酰胺類局麻藥,為純左旋構象,化學結構類似于布比卡因,但因其有適中的脂溶性,在相同濃度和劑量下,羅哌卡因比布比卡因具有更小的心血管及中樞神經毒性;在低濃度下羅哌卡因具有感覺、運動分離阻滯作用,常用于術后鎮痛。羅哌卡因血漿半衰期只有1.8h,需要持續注射給藥才能獲得滿意的鎮痛效果。為了延長給藥間隔,開發能發揮48h鎮痛作用的局部注射用長效制劑具有重要的臨床應用意義。

目前有關羅哌卡因局部注射用長效制劑涉及的技術主要有:多囊脂質體技術、微球技術和原位成型技術。

(1)多囊脂質體技術:多囊脂質體(multivesicular liposomes,MVL)是由荷負電的磷脂、中性脂質、兼性磷脂(磷脂酰膽堿)和一種輔助膜材(主要為膽固醇),通過乳化溶劑揮發法制備的具有“泡沫狀矩陣”結構的新型脂質體。MVL獨特的結構使其具有良好的緩釋效應。多囊脂質體研究開發仍然存在一些問題,如制備工藝復雜;在貯存過程中易出現聚集和泄露,易影響藥物的穩定性;MVL多為混懸液,不利于保存和運輸等。徐盛杰等報道了采用復乳化法制備鹽酸羅哌卡因多囊脂質體:稱取處方量磷脂、膽固醇和三油酸甘油酯溶于氯仿-乙醚的有機溶劑中(油相),加入等體積含有葡萄糖的鹽酸羅哌卡因溶液(第一水相),用高剪切分散乳化機在10000r/min的條件下剪切分散8min得W/O型初乳;加入一定體積的含有40mmol/L賴氨酸的4%葡萄糖溶液(第二水相),于4000r/min條件下剪切分散形成W/O/W型復乳;將復乳轉移至含有一定體積第二水相的平底錐形瓶中,通入氮氣除去有機溶劑,即得。采用上述方法的鹽酸羅哌卡因多囊脂質體體外24h的釋放度大于80%,大鼠皮下注射的體內藥代動力學研究雖然顯示和溶液劑相比,達峰時間、T1/2、MRT延長,但是由于缺少藥效學評價,無法證實其體內是否能夠持續發揮鎮痛作用。

(2)微球(microsphere)技術:以天然高分子材料(如明膠)或合成高分子材料(乳酸羥基乙酸共聚物)為載體材料,通過交聯固化法或乳化溶劑揮發法將藥物包裹固化于高分子材料中而得的粒徑在1到幾百微米的球狀實體。材料完全降解以及藥物完全釋放所需要的時間顯著長于藥效需要維持的時間,這也是微球制劑作為局麻藥物緩釋載體的局限性。此外,從微球的制備工藝來看,整個過程中有多個工藝參數需要控制,這在一定程度上影響了工藝的重現性,而且制備過程中所殘留的有機溶劑在一定程度影響了制劑的安全性,去除有機溶劑殘留也增加了生產成本。

趙峰等采用乳化-交聯法制備鹽酸羅哌卡因明膠微球,外科植入手術法給藥將其植入大鼠坐骨神經,觀測其鎮痛持續時間及其對運動的影響。結果鹽酸羅哌卡因明膠微球的載藥量為21.4%,體內藥效學顯示鹽酸羅哌卡因明膠微球可持續發揮4小時以上的鎮痛作用。該項研究存在鎮痛作用持續時間短的缺陷。

田洪居等以乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA))為載體材料,采用乳化溶劑揮發法制備了鹽酸羅哌卡因PLGA微球,微球的包封率為58.05%,載藥量為6.067%,12h羅哌卡因累積釋放率達到24%,192h累積釋藥率達82%,微球釋藥半衰期為60.16h,將載藥PLGA微球置入小鼠坐骨神經旁,可以使小鼠的感覺和運動阻滯作用持續48h。鹽酸羅哌卡因PLGA微球雖然可以使藥效維持48h,但是由于載體材料需要一個月才能完全降解,而藥物在后期的釋放主要是通過材料的降解溶蝕而實現的,因此在需要藥物發揮鎮痛作用的術后48~72h以后,體內依然有部分藥物沒有從微球中釋放出來。

(3)原位成型(in situ forming)技術:將藥物和聚合物溶于或分散在適當的溶劑中,通過局部注射植入給藥,在機體內由于溶劑的擴散、溫度的改變等使聚合物溶解度發生變化而形成固體或半固體的藥物貯庫,持續緩慢釋放藥物。

①溶劑擴散機制:高申等將PLGA及鹽酸羅哌卡因溶于N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)和聚乙二醇400或三乙酸甘油酯(triacetin,TA)或苯甲酸芐酯(BB)組成的溶劑系統中,該制劑接觸到釋放介質(或體內組織液)后,溶劑NMP與水的互溶性,使其迅速向外界擴散,快速的相分離使聚合物PLGA沉淀下來。該項研究鹽酸羅哌卡因在體內外的釋藥時間可達14d,大鼠坐骨神經給藥后對感覺的阻滯作用可持續48~72h,對運動的阻滯作用可持續12~24h。此項研究和PLGA微球制劑類似,也存在釋藥后期釋放速度太慢的缺點,此外這種凝膠制劑在制備中使用了NMP,而最近幾年歐洲及美國的研究顯示NMP積蓄毒性或有致癌可能,結論暫未肯定。因此通過溶劑擴散機制而形成的原位凝膠應用的安全性還有待進一步評價。

②溫敏膠凝機制:以溫度敏感型聚合物為載體制備的含藥凝膠在室溫下為自由流動的液體,易于保存,使用方便;當溫度升高至膠凝溫度(人體正常溫度)時,形成物理交聯的凝膠,從而達到減緩藥物釋放的目的。

目前國內外有關鹽酸羅哌卡因注射用溫敏凝膠的研究報道非常少,國內學者以泊洛沙姆作為溫敏材料,以冷法制備鹽酸羅哌卡因凝膠,但是該項研究未涉及釋放度以及藥效學評價等內容。Foley等通過堿化方式將鹽酸羅哌卡因轉化成難溶性的羅哌卡因,并將其與地塞米松配伍,以殼聚糖溫敏性凝膠作為載體,制備了羅哌卡因地塞米松緩釋制劑,體外96h僅釋放40%,大鼠體內注射后7d在坐骨神經周圍依然可見部分殘留的凝膠。該制劑經大鼠坐骨神經周圍注射雖然能夠發揮48h的感覺和運動神經阻滯作用,但依然存在藥物釋放速度過慢的缺陷。

喬明曦以丙交酯、乙交酯和聚乙二醇為單體化合物,合成了丙交酯/乙交酯摩爾比例介于6/1~15/1的具有適宜相轉變溫度的溫敏型聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯-乙交酯(PLGA-PEG-PLGA)嵌段共聚物,該共聚物水溶液的相轉變溫度介于30~37℃之間。共聚物對難溶性藥物吲哚美辛等具有較好的增溶作用,但對激素類藥物雌二醇和炔諾酮的增溶能力卻非常有限。(注射用溫敏型PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物合成及其應用研究,喬明曦,沈陽藥科大學博士學位論文,2005年)。但是這種PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物并不適合作為羅哌卡因的緩釋材料,實驗表明,該嵌段共聚物在大鼠注射部位第4周仍然可以清晰地觀察到聚合物凝膠的存在,不能滿足局麻藥物術后鎮痛48h的目標要求。

發明內容

為了延長羅哌卡因給藥間隔,減少導管留置所帶來的不便和安全隱患,針對羅哌卡因現有緩釋技術中存在的制備工藝復雜、有機溶劑殘留、包封率較低、釋藥速度不理想等問題,本發明提供了一種羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠。

本發明提供的羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠,成分包括:主藥,PLGA-PEG-PLGA共聚物和溶劑;主藥為羅哌卡因、鹽酸羅哌卡因或甲磺酸羅哌卡因;PLGA-PEG-PLGA共聚物中丙交酯與乙交酯的摩爾比為2~3:1,聚乙二醇數均分子量為1000,聚乙二醇(PEG)占PLGA-PEG-PLGA共聚物總質量的18%~30%;溶劑為注射用水、生理鹽水或pH調節溶液。

PLGA-PEG-PLGA共聚物,又稱聚丙交酯-乙交酯/聚乙二醇三嵌段共聚物,或(聚(乳酸-乙醇酸)聚乙二醇三嵌段共聚物,是以聚乙二醇引發丙交酯和乙交酯開環共聚而成的聚合物。經過試驗發現,丙交酯與乙交酯的摩爾比為2~3:1、聚乙二醇數均分子量為1000、聚乙二醇(PEG)占PLGA-PEG-PLGA共聚物總質量的18%~30%的PLGA-PEG-PLGA共聚物能夠與羅哌卡因,或其鹽酸鹽,或其甲磺酸鹽形成良好的溫敏凝膠體系,在室溫下為自由流動的液體,給藥十分方便,在體溫下則迅速膠凝而發揮緩釋作用,凝膠多孔的內部結構使藥物在釋放后期更容易擴散出來,而且加快了載體材料在體內降解,克服了以往研究藥物完全釋放以及載體材料完全降解所需要的時間遠大于48h的缺陷。并且PLGA-PEG-PLGA共聚物在體內可以最終代謝成二氧化碳和水,具有良好的生物可降解性和組織相容性。

優選地,上述羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠中,所述主藥為鹽酸羅哌卡因或甲磺酸羅哌卡因。鹽酸羅哌卡因或甲磺酸羅哌卡因能在水中溶解,更有利于制備的溫敏凝膠在期望的時間內將主藥較完全地釋放出來。

優選地,上述羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠中,凝膠體系的pH值為5~6。由于PLGA-PEG-PLGA共聚物與主藥的水溶液pH為2.3左右,呈弱酸性,因此將pH調節至5~6,一方面可以降低由于凝膠的弱酸性所帶來的局部刺激性,另一方面可以滿足不同溫度下主藥在凝膠中具有良好的溶解性。

優選地,上述羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠中,所述pH調節溶液為pH>7.5的磷酸鹽緩沖液。以pH>7.5的磷酸鹽緩沖液作為溶劑可以使凝膠的pH調至5~6,并且具有一定的緩沖能力,同時避免藥物在凝膠溶液中析出。

優選地,上述羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠中,按質量百分比計,主藥1%~5%,PLGA-PEG-PLGA共聚物5%~30%,溶劑余量。該優選的用量比可以使凝膠在室溫下呈自由流動的液體狀態,便于注射;在人體正常溫度左右膠凝,發揮藥物緩釋作用。

更優選地,上述羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠中,按質量百分比計,主藥1%~5%,PLGA-PEG-PLGA共聚物10%~25%,溶劑余量。該進一步優選的用量比不僅使本品具有上述溫敏特性,而且可以降低藥物在初期的突釋,同時增加藥物在后期釋放。

本發明還提供了一種上述羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠的制備方法,包括以下步驟:

(1)將PLGA-PEG-PLGA共聚物適量置于溶劑中,攪拌直至共聚物分散均勻,于4℃中保存至凝膠充分溶脹溶解,得到PLGA-PEG-PLGA共聚物溶液;

(2)將主藥在攪拌下緩慢地加入步驟(1)所得的PLGA-PEG-PLGA共聚物溶液中,繼續攪拌均勻即得羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠;

(3)將步驟(2)所得的羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠通過0.2μm微孔濾膜過濾除菌。

該制備方法較現有技術中的其他緩釋制劑,制備工藝簡單,包封率高,且不含有任何有機溶劑,更安全環保經濟。

與現有技術相比,本發明具有以下有益效果:

本發明以PLGA-PEG-PLGA溫敏凝膠作為羅哌卡因或其鹽的緩釋載體,該凝膠在室溫下為自由流動的液體,給藥方便,在體溫下迅速膠凝而發揮緩釋作用,除給藥方便外,還可以使藥物在體外12h釋放≤35~45%,48h釋放≥65%~75%,72h釋放≥80%,更符合局麻藥物術后鎮痛48h的設計目標。本發明所述的PLGA-PEG-PLGA溫敏凝膠,還具有以下優勢:

(1)與多囊脂質體、微球制劑和原位溶劑擴散機制凝膠相比,制備工藝簡單,包封率高,未使用任何有機溶劑,更安全環保經濟。

(2)相比上述其他幾種制劑,凝膠多孔的內部結構使藥物在釋放后期更容易擴散出來,而且加快了載體材料在體內降解,克服了藥物完全釋放以及載體材料完全降解所需要的時間遠大于48h的缺陷。

(3)目前上市的羅哌卡因為鹽酸鹽和甲磺酸鹽,本發明未將主藥轉化為難溶性的羅哌卡因,即在體內外獲得理想的緩釋效果。本發明與文獻“A chitosan thermogel for delivery of ropivacaine in regional musculoskeletal anesthesia.Biomaterials:2013,(34):2539~2546(Patricia L.Foley,Bret D.Ulery,Ho M.Kan,etal.)所提到的殼聚糖凝膠相比,制備工藝更簡單,主藥釋放曲線更理想。參看文獻中將水溶性較好的鹽酸羅哌卡因轉化成難溶性的羅哌卡因,雖然可以延緩藥物的釋放,但是也導致了藥物在體外48h僅釋放30%左右,96h釋放不足40%。本發明未將主藥轉化成難溶性的堿,選擇使用丙交酯與乙交酯的摩爾比為2~3:1的PLGA-PEG-PLGA共聚物,不僅簡化了制備工藝,而且使藥物在體外12h釋放≤35~45%,48h釋放≥65%~75%,72h釋放≥80%,更符合局麻藥物術后鎮痛48h的設計目標。由于本發明在需要發揮鎮痛作用的48h內具有較理想的釋藥速度,所以在大鼠體內獲得明顯的48h鎮痛效果所需要的劑量為15mg/kg(按鹽酸羅哌卡因計算),大約為上述文獻給藥劑量的1/5。

(4)本發明所選擇的溫敏材料PLGA-PEG-PLGA共聚物,在體內可以最終代謝成二氧化碳和水,具有良好的生物可降解性和組織相容性。

附圖說明

圖1:鹽酸羅哌卡因PLGA-PEG-PLGA溫敏凝膠的制備工藝流程圖。

圖2:鹽酸羅哌卡因PLGA-PEG-PLGA溫敏凝膠在室溫和37℃外觀圖。

圖3:不同濃度的PLGA-PEG-PLGA凝膠溶液的溶膠-凝膠轉變相圖。

圖4:鹽酸羅哌卡因PLGA-PEG-PLGA溫敏凝膠的體外釋放曲線。

圖5:鹽酸羅哌卡因溶液組、溫敏凝膠組和生理鹽水組在不同時間點大鼠機械縮足閾值。

圖6:鹽酸羅哌卡因溶液組、溫敏凝膠組和合生理鹽水組在不同時間點大鼠熱痛閾值。

圖7:鹽酸羅哌卡因溶液組、溫敏凝膠組和生理鹽水組在不同時間點大鼠累積疼痛積分。

圖8:注射鹽酸羅哌卡因溫敏凝膠組7d后注射部位肌肉組織學切片。

圖9:注射生理鹽酸7d后注射部位肌肉組織學切片。

圖10:注射鹽酸羅哌卡因溶液7d后注射部位肌肉組織學切片。

圖11:注射鹽酸羅哌卡因溫敏凝膠組1h后注射部位切口照片。

圖12:注射鹽酸羅哌卡因溫敏凝膠組7d后注射部位切口照片。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明,以使本領域的技術人員可以更好地理解本發明并能予以實施,但所舉實施例不作為對本發明的限定。

實施例1

稱取PLGA-PEG-PLGA共聚物(丙交酯與乙交酯的摩爾比=3:1,聚乙二醇質量百分比為25%,聚乙二醇數均分子量為1000,濟南岱罡生物技術有限公司產品)2.5g置于燒杯中,加入8mL pH=8的磷酸鈉緩沖液(取Na2HPO4·12H2O5g,NaH2PO4·2H2O 0.16g,加水至1000mL),攪拌直至聚合物分散均勻,于4℃冰箱中保存至凝膠充分溶脹后,即得PLGA-PEG-PLGA聚合物凝膠溶液。將0.15g鹽酸羅哌卡因緩慢地加入溶脹完全的PLGA-PEG-PLGA聚合物凝膠溶液中,繼續攪拌均勻,滴加上述pH 8的磷酸鈉緩沖液至10mL刻度,即得含藥的羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠,最后通過0.2μm微孔濾膜過濾除菌。

按照本法制備的羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠的相變溫度為36.5℃,在室溫下為自由流動的液體,在體溫下迅速膠凝固化,見圖2。

實施例2

稱取PLGA-PEG-PLGA共聚物(丙交酯與乙交酯的摩爾比=3:1,聚乙二醇質量百分比為24%,聚乙二醇數均分子量為1000,濟南岱罡生物技術有限公司產品)2g置于燒杯中,加入8mL pH=8的磷酸鈉緩沖液(取Na2HPO4·12H2O15g,NaH2PO4·2H2O 0.5g,加水至1000mL),攪拌直至聚合物分散均勻,于4℃冰箱中保存至凝膠充分溶脹后,即得PLGA-PEG-PLGA聚合物凝膠溶液。將0.15g鹽酸羅哌卡因緩慢地加入溶脹完全的PLGA-PEG-PLGA聚合物凝膠溶液中,繼續攪拌均勻,滴加上述磷酸鈉緩沖液至10mL刻度,即得含藥的羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠,最后通過0.2μm微孔濾膜過濾除菌。

按照本法制備的羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠的相變溫度為35.8℃,在室溫下為自由流動的液體,在體溫下迅速膠凝固化。

實施例3

稱取PLGA-PEG-PLGA共聚物(丙交酯與乙交酯的摩爾比=2:1,聚乙二醇質量百分比為22%,聚乙二醇數均分子量為1000,濟南岱罡生物技術有限公司產品)1.5g置于燒杯中,加入8mL pH=8的磷酸鈉緩沖液(取Na2HPO4·12H2O15g,NaH2PO4·2H2O 0.5g,加水至1000mL),攪拌直至聚合物分散均勻,于4℃冰箱中保存至凝膠充分溶脹后,即得PLGA-PEG-PLGA聚合物凝膠溶液。將0.15g鹽酸羅哌卡因緩慢地加入溶脹完全的PLGA-PEG-PLGA聚合物凝膠溶液中,繼續攪拌均勻,滴加上述磷酸鈉緩沖液至10mL刻度,即得含藥的羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠,最后通過0.2μm微孔濾膜過濾除菌。

按照本法制備的羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠的相變溫度為36.2℃,在室溫下為自由流動的液體,在體溫下迅速膠凝固化。

實施例4

采用試管倒轉法測定不同濃度的PLGA-PEG-PLGA空白凝膠溶液發生相轉變的溫度。以水為溶劑,用實施例2的PLGA-PEG-PLGA共聚物配制一系列不同質量百分濃度的PLGA-PEG-PLGA空白凝膠溶液(5%,10%,15%,20%,25%),取1mL置于玻璃試管中,然后置于水浴中,溫度從20℃逐漸升溫直到發生相變,當溶液形成凝膠并保持30s不流動判定此時的水浴溫度即為凝膠的相變溫度,記錄溫度,每個樣品測定3次,取平均值。

PLGA-PEG-PLGA空白凝膠的相變溫度有濃度依賴性,隨著聚合物濃度的增加,相變溫度降低,不同濃度的PLGA-PEG-PLGA溶液的溶膠-凝膠轉變相圖見圖3。

實施例5

參照無膜擴散法測定藥物從凝膠劑中的釋放,取實施例2制備的羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠1mL置于試管中,于恒溫氣浴震蕩儀37℃下形成凝膠,10min后加入5mL生理鹽水,隨后將裝有凝膠的試管放置恒溫振蕩儀中,將溫度控制在37.0℃±0.5℃,轉速為50r/min。整個溶出的過程將試管密封,以防止水分蒸發而影響實驗結果。在設定的時間點取樣,取樣量4mL,同時補充4mL恒溫的生理鹽水介質,樣品經合理稀釋后,于HPLC測定,然后計算累計釋放度,每個樣品測定3次,取平均值,結果見圖4。

實施例6

選取SD大鼠30只,200~250g,隨機分為3組,分別為:A、生理鹽水組:切口附近注射生理鹽水0.2mL;B、鹽酸羅哌卡因溶液組(簡稱RP溶液組):切口附近注射濃度為1.5wt%鹽酸羅哌卡因注射液,劑量為15mg/kg(按鹽酸羅哌卡因計);C、羅哌卡因長效注射用溫敏凝膠組(簡稱RP溫敏凝膠組):切口附近注射濃度為1.5wt%鹽酸羅哌卡因溫敏凝膠(按照實施例2制備)劑量為15mg/kg(按鹽酸羅哌卡因計)。此3組分別于術前2h測定各組大鼠累積疼痛評分、熱痛閾值、機械縮足反射閾值作為基礎值。

1.切口疼痛模型的制備:大鼠術前禁食6h、禁飲1h,將大鼠置入放有浸泡約0.3mL異氟醚液體棉球、容積為1L的透明玻璃杯中加蓋,觀其意識消失后,碘伏消毒大鼠左后足底,按Brennan法從足底近端0.5cm處向趾部做一長約1cm的切口,切開皮膚,用眼科鑷挑起足底肌肉并縱向切割,但保持肌肉的起止及附著完整。按壓止血后,用細針縫合皮膚2針,于縫皮處A、B、C組在切口內分別注射對應的藥物。整個手術操作過程約5min,并由同一人完成,術后傷口碘伏消毒并涂抹少量紅霉素軟膏,將大鼠置于安靜、溫暖、避強光的環境中喂養。

2.機械縮足反射閾值測定

將大鼠置于底為1cm×1cm孔徑鐵絲網的透明有機玻璃箱中,適應環境15min,用電子式機械測痛儀的金屬絲(直徑0.4mm)刺激大鼠左后足底2、3趾骨間部位,當大鼠出現快速縮足、舔足或嘶叫動作時,停止加壓,記錄其壓力值(g),每只動物連續測量5次后,計算平均值,即為大鼠機械縮足反射閾值。每只大鼠于術前2h測定機械縮足反射閾值作為基礎機械痛閾值,分別于術后2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h、96h測定機械縮足反射閾值的變化。

與術前基礎值相比,術后2h各組大鼠的機械縮足閾值顯著降低(p<0.01),術后2h RP溫敏凝膠組與RP溶液組的機械縮足閾值明顯高于生理鹽水組(p<0.01),RP溫敏凝膠組與RP溶液組之間無顯著性差異。術后4h~48h,RP溶液組在各時間點的機械縮足閾值降低,與生理鹽水相比無明顯差異;術后4h~48h,RP溫敏凝膠組在各時間點機械縮足閾值顯著高于RP溶液組和生理鹽水組(p<0.01)。說明RP溫敏凝膠組能明顯提高大鼠術后的機械縮足閾值,在術后48h內與生理鹽水組有顯著性差異,在術后4h~48h內與溶液組相比有顯著性差異。結果見圖5。

3.熱痛閾值的測定

將大鼠放在55±0.5℃熱板上,從右后肢接觸到出現踮腳、回縮、舔足、掙扎任一動作的時間計為后肢回縮時間(PWL)(秒表計時),作為后肢痛閾指標。測量3遍,每次時間<40s,間隔10min,取其平均值。每只大鼠于術前2h測定熱痛閾值作為基礎熱痛閾值,分別于術后2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h、96h測定熱痛閾值的變化。

與術前基礎值相比,術后2h各組大鼠的熱痛閾值顯著降低(p<0.01),術后2h RP溫敏凝膠組與RP溶液組的熱痛閾值明顯高于生理鹽水組(p<0.01),RP溫敏凝膠組與RP溶液組之間無顯著性差異。術后4h~48h,RP溶液組熱痛閾值降低,與生理鹽水相比無明顯差異;術后4h~48h,RP溫敏凝膠組在各時間點的熱痛閾值顯著高于RP溶液組和生理鹽水組(p<0.01或p<0.05)。說明RP溫敏凝膠組能明顯提高大鼠術后的熱痛閾值,在術后48h內與生理鹽水組相比有顯著性差異,在術后4~48h內與RP溶液組相比有顯著性差異。結果見圖6。

4.切口疼痛評分的測定

切口前2h(基礎值)及切口后2h、4h、6h、12h、24h、48h、60h、72h、96h對大鼠進行累積疼痛評分(CPS),以此評估各組藥物對大鼠術后疼痛的鎮痛效果。觀察和比較大鼠兩后爪著地及負重情況(后爪被壓迫發白表示負重):后爪著地并且負重0分;后爪著地但不負重1分;后爪翹起不著地2分。每5分鐘觀察一次,每次一分鐘,以1分鐘內最常采取的姿勢為標準,持續觀察1小時,將分值累積相加即得此時段的累積疼痛評分值(0~24分),以每一時段末作為時間記錄標志。為免引起應激反應,所有過程均在溫和、安靜和避強光的環境中進行。

與術前基礎值相比,術后2h各組大鼠的累積疼痛評分顯著升高(p<0.01)。術后4h內RP溶液組的累積疼痛評分明顯低于生理鹽水組(p<0.01),6h~48h后RP溶液組的累積疼痛評分與生理鹽水組相比,無明顯差異;術后48h內,RP溫敏凝膠組在各時間點的累積疼痛評分明顯低于生理鹽水相(p<0.01),術后4h~48h明顯低于RP溶液組(p<0.01)。結果見圖7。

綜上所述,與生理鹽水和RP溶液相比,按照實施例2制備的鹽酸羅哌卡因溫敏凝膠藥效維持時間顯著延長,可持續發揮48h鎮痛效果。

實施例7

將實施例6中的大鼠在術后7d處死,取切口部位給藥處的肌肉組織,用10%多聚甲醛溶液固定后,常規脫水及石蠟包埋,切片(5μm),進行常規HE染色,光學顯微觀察肌肉組織反應。

結果顯示生理鹽水組、RP溶液組及RP溫敏凝膠組三組的病理特征并無明顯差異。注射溫敏凝膠7d后,切口給藥處周圍的肌肉組織沒有組織滲透液蓄積現象,僅見輕微炎癥反應,表現為少數巨噬細胞和淋巴細胞的浸潤現象,伴有輕度組織水腫,未見感染、組織細胞壞死及組織纖維化等反應,組織結構完整(圖8)。同樣生理鹽水組(圖9)和RP溫敏凝膠組(圖10)大鼠7d后切口處肌肉組織僅見輕微炎癥反應,未見肌肉組織的變性和壞死等現象。實驗結果表明鹽酸羅哌卡因溫敏凝膠具有良好的體內生物相容性。

實施例8

按照實施例6方法注射RP溫敏凝膠,在注射完凝膠1h和7d后,切開傷口,觀察注射部位是否有凝膠殘留。結果顯示注射凝膠1h后,在傷口注射部位可以見到肌肉表面附著半透明的凝膠(圖11),在注射凝膠7d后,注射部位附近未見明顯的凝膠殘留(圖12)。

以上所述實施例僅是為充分說明本發明而所舉的較佳的實施例,本發明的保護范圍不限于此。本技術領域的技術人員在本發明基礎上所作的等同替代或變換,均在本發明的保護范圍之內。本發明的保護范圍以權利要求書為準。

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