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茯苓酸A用于制備治療慢性腎臟病藥物的應用.pdf

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茯苓 用于 制備 治療 慢性 腎臟病 藥物 應用
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摘要
申請專利號:

CN201710029000.8

申請日:

20170116

公開號:

CN107050035B

公開日:

20180504

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/575,A61P13/12 主分類號: A61K31/575,A61P13/12
申請人: 西北大學
發明人: 趙英永
地址: 710069 陜西省西安市太白北路229號
優先權: CN201710029000A
專利代理機構: 西安恒泰知識產權代理事務所 代理人: 史玫
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710029000.8

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及茯苓酸A用于制備治療慢性腎臟病藥物的應用。發明人的研究結果表明茯苓酸A對5/6腎切除的大鼠模型有較好的治療效果,茯苓酸A可為臨床提供一種新的治療慢性腎臟病的候選藥物。

權利要求書

1.茯苓酸A用于制備治療慢性腎臟病藥物的應用。

說明書

技術領域

本發明涉及茯苓酸A的新應用,具體涉及茯苓酸A用于治療慢性腎臟病藥物的應用。

背景技術

慢性腎臟病是影響人類健康的重大疾病之一。隨著高血壓和糖尿病患病率的增加,慢性腎臟病的發生率在持續上升。

慢性腎臟病(CKD)是指各種原因引起的慢性腎臟結構和功能障礙(腎臟損害病史大于3個月),包括腎腎小球濾過率正常和不正常的病理損傷、血液或尿液成分異常,及影像學檢查異常,或不明原因腎小球濾過率下降(<60ml/min·1.73m2)超過3個月。國際腎臟病協會統計結果顯示慢性腎臟病4期階段的慢性腎衰竭在自然人群中的年發病率為98-198/100萬,經濟發達的日本和美國的發病率分別達996/100萬和802/100萬。

目前對于慢性腎臟病的治療常用內科療法、透析療法、腎臟移植等。雖然這些療法可以改善臨床癥狀,減輕臨床患者的痛苦,但內科療法尚難以徹底阻斷病理進展,且副作用大;透析只能解決腎臟的部分代謝問題,尚不能較好改善腎臟的內分泌功能;腎移植的腎源有限,且免疫排斥現象一時還難以解決。加之透析療法和腎臟移植費用昂貴,使眾多患者望而卻步。

隨著各種疾病發病率的上升,藥物的使用越來越多,因藥物引起的腎損傷發生率逐漸上升。研究顯示藥物導致腎損傷的發生率高達18.3%,目前臨床常見的對腎損傷的藥物有抗感染類、免疫制劑、抗腫瘤藥物、甾體類抗炎藥等,其中抗生素腎損傷占藥物導致的腎損傷的36%。藥物性腎損傷位居與腎臟有關的疾病的首位,特別是引起醫學界的廣泛關注。藥物性腎損傷也是新藥開發過程中的常見問題,它是導致藥物撤市的重要原因之一,消耗了大量的人力和財力。因此,如何有效防治慢性腎臟病一直是全球關注的難點和熱點之一,繼續堅持不懈地研究和探尋治療慢性腎臟病新藥物仍是當前醫學研究的一項艱巨任務。

目前,西藥藥用活性炭和中藥復方尿毒清顆粒、百令膠囊等是治療慢性腎臟病常用藥物。西藥雖然有一定的療效,但存在毒副作用大且復發率高等不足,如藥用活性炭在疾病的初期階段有效,但后期反而會使病情加重,不能改善增加血清肌酐和尿素,出現難以控制的癥狀,最終會發展為更嚴重的后果。雖然透析或腎移植是終末期腎病或尿毒癥患者生存的治療手段,但是在慢性腎臟病的早和中期階段,在治療原發病的基礎上,采用行之有效的藥物治療措施以有效地阻止或延緩慢性腎臟病進展是一個較為理想的方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于克服治療慢性腎臟病藥物的不足。

本發明提供了茯苓酸A用于制備治療慢性腎臟病藥物的應用。

發明人的結果表明茯苓酸A對5/6腎切除(5/6Nx)的大鼠模型有較好的治療效果,茯苓酸A可為臨床提供一種新的治療慢性腎臟病的候選藥物。

附圖說明

圖1為假手術組、5/6腎切除模型組、5/6腎切除模型組+茯苓酸A治療組和5/6腎切除模型組+馬來酸依那普利治療組大鼠第12周末腎組織HE、PAS和Masson染色分析。

具體實施方式

茯苓為多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos)的干燥菌核。茯苓始載于《神農本草經》,茯苓性平,味甘、淡,歸心、肺、脾、腎經。茯苓是一味常用的健脾和胃、利水滲濕、寧心安神的中藥;臨床使用分茯苓、茯神、赤茯苓等,茯苓自古以來就是一味藥食兩用、非常重要的中藥,有十藥九茯苓之說,將茯苓列為上品。茯苓的主要活性成分為茯苓多糖和四環三萜類化合物。茯苓中四環三萜類化合物具有抗癌、抗腫瘤、免疫調節、體內拮抗醛固酮等活性。茯苓皮為茯苓菌核的外皮,茯苓加工時僅使用茯苓內部菌核即白茯苓,加工白茯苓時茯苓外皮和切割下的殘塊都被當成廢料處理,造成了茯苓的極大浪費。研究表明茯苓皮中的四環三萜類化學成分含量遠遠高于茯苓菌核內部的白茯苓中的含量。茯苓皮四環三萜酸類化學成分種類眾多,羊毛甾烷型四環三萜類化合物包括去氫齒孔酸、3-表去氫土莫酸、齒孔酸、3-表去氫土莫酸、去氫土莫酸、去氫齒孔酮酸、茯苓酸等。3,4-裂環羊毛甾烷型四環三萜類化合物包括茯苓酸A、茯苓新酸A、茯苓新酸B、茯苓新酸C、茯苓新酸D、茯苓新酸E、茯苓新酸F等。

本發明用茯苓酸A治療慢性腎臟病藥物以常規藥用制劑的形式來使用;所述的常規藥物用制劑含作為活性組分在制劑中與藥學上可接受的載體,如適宜于腸胃內和腸胃外給藥的有機或無機的固體或液體賦形劑混合,該藥用制劑可以是固體形式如膠囊劑、片劑、丸劑、散劑、顆粒劑等。上述制劑中可含有穩定劑、潤濕劑、輔料和其它常用的添加劑,如玉米淀粉、硬脂酸、橄欖油、檸檬酸、乳糖、乙二醇、硬脂酸鎂、明膠、石膏粉、瓊脂、抗壞血酸等。上述的制劑可按照各種制劑常規的制備工藝制成。

為了確保本發明能夠實現,發明人提供了一種茯苓酸A的制備方法,同時提供了所制備的茯苓酸A的結構鑒定結果。

茯苓酸A的提取制備工藝:經過干燥的茯苓皮藥材粉碎后,用5倍體積的乙酸乙酯浸泡2天,開始滲漉,濃縮提取物,回收乙酸乙酯,得棕色乙酸乙酯提取物。乙酸乙酯提取物用MCI填料拌樣,上MCI色譜柱,采用40:60-70:30甲醇-水梯度洗脫;洗脫液濃縮進一步上200-300目的硅膠柱,石油醚-乙酸乙酯洗脫,收集洗脫液,合并濃縮,最后得茯苓酸A。

黃色粉末,C31H46O5,MW:498,EI-MS m/z:497[M-H]-,479[M-H2O]-,423[M-CH2CH2CO2H]-;1H NMR(pyridine-d5,800MHz)δ:0.963,0.971(2×3H,s,H3-26,27),1.007(3H,s,H3-19),1.111(3H,s,H3-18),1.476(3H,s,H3-30),1.725(3H,s,H3-29),1.802(1H,m,H-1),2.856(1H,dd,J=11.11,5.73Hz,H-17),2.929(1H,dt,J=8.12,2.68Hz,H-20),4.499(1H,dd,J=7.18,6.83Hz,H-16),4.809,4.823(2×1H,brs,H-28),4.837(1H,s,H-31),5.267(1H,brs,H-7),5.25(1H,brs,H-11)。13C NMR(pyridine-d5,200MHz)給出30個碳信號,根據DEPT譜推斷分別為7個甲基,8個亞甲基,7個次甲基(包括3個雙鍵碳δ121.21,116.65,124.92),7個季碳(含3個雙鍵碳δ142.81,146.53,131.64和一個羧基碳δ178.72)。13C NMR(pyridine-d5,200MHz)給出31個碳信號,根據DEPT譜推斷分別為6個甲基δ:18.31(C-18),22.23(C-19),22.19(C-26),21.83(C-27),21.985(C-28),24.82(C-29),7個亞甲基(含2個雙鍵碳δ112.14,C-28,107.07,C-31),9個次甲基(包括2個雙鍵碳δ117.94,120.26和一個羥基碳δ76.38),9個季碳(含4個雙鍵碳δ150.21,141.82,137.46,156.01和2個羧基碳δ176.58,178.59)。13C NMR(pyridine-d5,200MHz)δ:36.34(C-1),30.17(C-2),176.58(C-3),150.21(C-4),50.71(C-5),28.54(C-6),117.94(C-7),141.82(C-8),137.46(C-9),38.80(C-10),120.26(C-11),36.95(C-12),45.59(C-13),49.28(C-14),43.78(C-15),76.38(C-16),57.58(C-17),18.32(C-18),22.23(C-19),48.41(C-20),178.59(C-21),31.33(C-22),33.18(C-23),156.01(C-24),34.05(C-25),22.19(C-26),21.83(C-27),112.14(C-28),21.98(C-29),24.82(C-30),107.01(C-31)。根據以上數據與文獻對照,鑒定該化合物為:16α-羥基-3,4-裂環羊毛甾-4(28),7,9(11),24(31)-三烯-3,21-雙酸(16α-hyroxy-3,4-secolanosta-4(28),7,9(11),24(31)-tetraen-3,21-dioic acid)或者茯苓酸A(poricoic acid A)。

(16α-hyroxy-3,4-secolanosta-4(28),7,9(11),24(31)-tetraen-3,21-dioic acid)的化學結構式如下:

為了說明茯苓酸A對慢性腎臟病治療的效果,發明人以生5/6腎切除大鼠模型對茯苓酸A進行了慢性腎臟病活性實驗,實驗藥物、動物、儀器、方法及結果如下:

1.實驗藥物

馬來酸依那普利片:濟南利民制藥有限公司,批號1601426,生產日期20160124;茯苓酸A由茯苓皮通過乙醇提取和提取物色譜分離進行制備,通過1H NMR、13C NMR、MS、UV和IR等波譜與光譜技術進行鑒定結構。

2.實驗動物

體重180-220g的雄性Sprague-Dawley大鼠購買于西安交通大學醫學部實驗動物中心,動物生產許可證號:SCXK(陜)2012-003。

3.實驗儀器

安徽淮北正華生物儀器有限公的ZH-B6型大鼠代謝籠,TD型電子天平,美特列-托利多十萬分子一分析天平,AU5800全自動生化分析儀。

4.實驗方法

1)茯苓酸A對5/6腎切除大鼠模型治療的實驗方法及生物樣品的收集

32只雄性SD大鼠隨機分為4組(每組8只):假手術組、5/6腎切除組、5/6腎切除+茯苓酸A治療組和5/6腎切除+依那普利治療組。假手術組僅打開腹腔,剝離腎包膜后關腹;5/6腎切除組和5/6腎切除后茯苓酸A治療組大鼠在10%水合氯醛麻醉下切除左腎上下極各1/3腎組織,1周后切除右腎;第10周開始,5/6腎切除+茯苓酸A治療組大鼠每天灌胃茯苓酸A 20mg/kg,5/6腎切除+依那普利治療組大鼠每天灌胃依那普利1.67mg/kg,假手術組和5/6腎切除組大鼠同時給予等體積飲用水,第12周末結束后,麻醉處死所有大鼠,留取血和腎組織標本。

2)實驗動物生化指標檢測方法

生化指標的測定委托西安醫學院附屬醫院完成。采用全自動生化分析儀測定各組大鼠血清肌酐尿、尿素、白蛋白、鈣、磷等慢性腎臟病的藥效評價指標。

3)藥效計算與統計分析

結果均以平均值±SD表示,采用t檢驗,計算t,P值,將5/6腎切除組與假手術組、茯苓酸A治療組與5/6腎切除模型組進行組間差異性比較,t檢驗,P<0.05為有顯著性差異;P<0.01為有非常顯著性差異,判斷藥物對慢性腎臟病的治療效果。

4)5/6腎切除大鼠模型及茯苓酸A對該模型治療的結果

(a)茯苓酸A治療組對5/6腎切除大鼠模型腎功能生化指標的影響

表1是假手術、5/6腎切除大鼠模型、5/6腎切除大鼠模型+茯苓酸A和5/6腎切除大鼠模型+依那普利治療大鼠血清肌酐、尿素、尿酸、白蛋白、鈣和磷的生化指標。與假手術組大鼠相比,5/6腎切除模型大鼠血清肌酐、尿素和尿酸升高和血清白蛋白降低,差異有統計學意義。與5/6腎切除模型大鼠比較,茯苓酸A治療組降低在模型組增加的血清肌酐、尿素和尿酸,差異有統計學意義。與5/6腎切除模型組大鼠比較,茯苓酸A治療組增加在模型組大鼠降低的血清白蛋白,差異有統計學意義。依那普利組降低在模型組增加的血清肌酐、尿素和尿酸且差異有統計學意義,但對尿酸和白蛋白沒有影響,與假手術組大鼠相比,5/6腎切除模型大鼠血清鈣降低和磷升高,但僅磷升高的差異有統計學意義。與5/6腎切除模型組比較,茯苓酸A和依那普利治療組增加血清鈣和減低血清磷的含量,差異有統計學意義。這些生化指標的改變表明茯苓酸A不僅能促進體內的氮質化合物的排出,且對紊亂的鈣和磷代謝也有較好的改善作用,表明茯苓酸A對5/6腎切除大鼠模型有較好治療作用。

表1茯苓酸A對5/6腎切除大鼠的血清生化指標的影響

5/6腎切除模型組與假手術組比較:*p<0.05,**p<0.01;治療組與5/6腎切除模型組比較:

#p<0.05,##p<0.01

(b)HE和PAS染色組織形態觀察

假手術組大鼠腎臟組織形態未見明顯變化,均表現為腎小管上皮細胞胞質豐富,腎小管之間背靠背,腎間質中未見明顯炎癥細胞浸潤;實驗第12周結束后,5/6腎切除模型大鼠顯示腎間質大量的炎性細胞浸潤、腎小管上皮細胞萎縮扁平,腎小管腔擴張及間質增寬,腎間質中出現局灶莊纖維化。茯苓酸A治療組對5/6腎切除模型大鼠腎臟病理改變類似于模型組的改變,但各種病變程度都明顯輕于5/6腎切除模型組。陽性對照藥馬來酸依那普利對5/6腎切除模型大鼠也顯示較好的治療作用。由此可見,茯苓酸A對5/6腎切除大鼠具有較好的防治作用,茯苓酸A對腎臟間質纖維化具有防治和促進腎組織的修復作用,且茯苓酸A對5/6腎切除模型大鼠治療效果類似于馬來酸依那普利的效果(圖1)。

(c)Masson染色

第12周的5/6腎切除大鼠的Masson染色也同樣顯示嚴重的腎小管擴張和腎皮質區嚴重的腎小球周圍的纖維化(圖1)。Masson染色顯示茯苓酸A治療組對5/6腎切除模型大鼠腎臟病理改變類似于模型組的改變,但各種病變程度都明顯輕于5/6腎切除模型組。陽性對照藥馬來酸依那普利對5/6腎切除模型大鼠也顯示較好的治療作用。由此可見,茯苓酸A對5/6腎切除大鼠具有較好的治療作用,茯苓酸A對腎臟間質纖維化具有治療和減少腎損傷的作用,且茯苓酸A對5/6腎切除模型大鼠治療效果類似于馬來酸依那普利的效果(圖1)。

茯苓酸A在5/6腎切除所致慢性腎臟病的大鼠體內進行治療實驗。實驗表明茯苓酸A可以降低腎功能的生化指標血尿素和血肌酐且存在統計學上非常顯著差異。茯苓酸A能改善腎功能、減少腎臟的病理性損害具有較好保護作用。此外,茯苓酸A對慢性腎臟病的鈣磷代謝的紊亂也有較好的改善作用,茯苓酸A不僅可以改善影響氮質代謝產物的排泄,而且對鈣磷代謝有較好的改善作用,且茯苓酸A對5/6腎切除模型大鼠治療效果類似于馬來酸依那普利的效果,可為臨床提供一種新的類似于血管緊張素轉化酶抑制劑馬來酸依那普利治療慢性腎臟病的藥物,具有廣闊的應用前景。

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