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一種具有趨化功能的生物活性支架的制備和應用.pdf

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一種 具有 功能 生物 活性 支架 制備 應用
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摘要
申請專利號:

CN201510252317.9

申請日:

20150513

公開號:

CN104800885B

公開日:

20180504

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61L27/22,A61L27/54 主分類號: A61L27/22,A61L27/54
申請人: 中山大學
發明人: 曾園山,李戈
地址: 510275 廣東省廣州市新港西路135號
優先權: CN201510252317A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510252317.9

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

一種用于修復脊髓損傷的具有趨化內源性細胞遷移、促進內源性細胞存活和分化,以及具后神經保護作用的新型生物活性支架。利用蠶繭中提取的天然絲蛋白作為媒介,利用冷凍干燥技術和乙醇交聯劑使神經營養因子?3(NT?3)、維甲酸(RA)和絲蛋白晶形轉變,交聯固定在三維明膠海綿支架中。本發明提供的具有趨化功能的生物活性支架,可以在移植到脊髓后較長時間釋放趨化因子吸引內源性細胞遷移到損傷/移植區,釋放具有神經保護作用的營養因子,改善微環境,達到吸引內源性細胞施實自我修復脊髓損傷的目的。

權利要求書

1.一種用于修復脊髓損傷的具有趨化功能的生物活性支架,其特征是PLGA導管中填充著吸附所述趨化因子NT-3、誘導因子RA和絲蛋白的三維明膠海綿,移植到脊髓損傷動物體內,能夠捕獲機體內干細胞,吸引那些表達與趨化因子NT-3相關受體的內源性細胞遷移到支架內存活和分化,修復脊髓損傷。

說明書

所屬技術領域

本發明專利涉及一種用于修復脊髓損傷的支架材料,尤其是能夠吸引內源性細胞遷移、促進內源性細胞存活和分化的生物活性支架。

背景技術

目前,公知的用于修復脊髓損傷的支架是由支架和外源性細胞組成的。主要是通過外源性細胞移植到受損傷處來達到替換丟失神經元和治療脊髓損傷的效果,而支架僅僅是作為一種支撐細胞附著的載體。但是,臨床應用過程中,外源性細胞的移植面臨著來源、倫理和免疫排斥等重重困難,這使得脊髓損傷的外源性細胞移植治療受到了極大的限制。因此,找到一種有效的方式即可規避細胞移植的細胞來源性問題,又能滿足脊髓損傷/移植區對內源性細胞遷移、存活、分化和提供營養活性因子的需求是關鍵。

細胞的靶向遷移及其機制,一直是科學家們關注的焦點。目前的研究主要集中于外源性細胞體內移植之后的定向遷移。將能夠刺激細胞遷移的趨化因子注射到病變部位,能夠將移植的外源性細胞特異性吸引遷移過來,并能呈現治療和替換的效果。常用的趨化因子包括單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)和基質細胞源性因子-1(SDF-1)等[Takeuchi H,et al.Intravenously transplanted human neural stem cells migrate to the injured spinal cord in adult mice in an SDF-1-and HGF-dependent manner.Neurosci Lett,2007,426(2):69-74]。近年來,利用具有神經保護作用的營養因子作為趨化因子,也展現出很好的趨化效果,同時這些因子還具有營養細胞和改善脊髓損傷微環境的作用,如神經營養素-3(NT-3)等[Chen YF,et al.Neurotrophin-3 stimulates migration of mesenchymal stem cells overexpressing TrkC.Curr Med Chem,2013,20(24):3022-3033]。

維甲酸(RA)是維生素A(Vit.A)的一種代謝產物。動物自身不能合成Vit.A,必須從植物中以胡蘿卜素的形式和在動物中以視黃酸等形式攝取。RA在神經發育中扮演著主要角色。研究表明,RA能夠誘導不同種類的特殊細胞用于移植治療。本課題組前期研究發現,在體外,利用RA誘導骨髓間充質干細胞(MSCs)向神經組織細胞方向分化,提高相關受體mRNA表達水平[Zhang W,et al.Combination of adenoviral vector-mediated neurotrophin-3 gene transfer and retinoic acid promotes adult bone marrow cells to differentiate into neuronal phenotypes.Neurosci Lett,2006,408(2):98]。在體內,經過RA誘導的MSCs在NT-3和督脈電針的協同作用下,具有向神經元方向分化的能力[Zhang K,et al.Electro-acupuncture promotes the survival and differentiation of transplanted bone marrow mesenchymal stem cells pre-induced with neurotrophin-3and retinoic acid in gelatin sponge scaffold after rat spinal cord transection.Stem Cell RevRep,2014,10(4):612]。因此,RA在神經組織細胞的誘導和分化中有著關鍵性的作用。

目前在國內、外,一種自身具有生物活性并能夠趨化內源性細胞遷移到脊髓損傷/移植處的支架材料仍未見報道。為此,我們設想構建一種具有趨化內源性細胞遷移功能的生物活性支架。擬將這種具有趨化活性支架移植入脊髓損傷處,調動內源性細胞遷移到損傷/移植處實施自我修復脊髓損傷。本發明的目的是想克服現有臨床上治療脊髓損傷的技術和方法上的不足,應用我們構建的具有趨化性能的生物活性支架為內源性細胞修復脊髓損傷提供嶄新的思路和方法。

發明內容

為了克服現有的生物活性支架移植治療脊髓損傷的方案不足,本發明專利提供一種具有趨化活性支架,該支架不僅能夠吸引內源性相關細胞遷移到支架內部存活和分化,而且能夠通過緩釋神經營養因子和誘導因子來改善脊髓損傷/移植區的微環境。

本發明專利解決其技術問題所采用的技術方案是:

利用蠶繭中提取的天然絲蛋白作為媒介,利用冷凍干燥技術使神經營養素-3(NT-3)、維甲酸(RA)和絲蛋白混合液去水和除菌,乙醇促進趨化活性因子混合液的晶形轉變,將趨化因子和誘導因子交聯固定在三維支架中。移植后,支架上的趨化活性因子會緩慢釋放到脊髓損傷區的微環境中,以支架移植部位為中心形成一種趨化因子富集區,促進相關的內源性細胞向該區域遷移,達到吸引內源性細胞遷移到支架內部存活和分化修復脊髓損傷的目的。

本發明專利的有益效果是:

這種具有功能性生物活性支架材料移植到脊髓損傷處后,可以較長時間釋放趨化因子(NT-3),持續吸引內源性相關細胞遷移到支架內,在誘導因子(RA)的協同作用下這些內源性相關細胞能夠更好地存活,并且向神經組織細胞方向分化;同時釋放的NT-3具有神經保護作用,持續改善脊髓損傷/移植區的微環境。

附圖說明

下面結合附圖和實施例對本發明專利進一步說明。

圖1是具有趨化功能的生物活性支架的原理圖(1示:趨化因子、誘導因子和絲蛋白復合物;2示:三維明膠海綿;3示:支架內部的不規則多孔隙結構;4示:PLGA外殼)。

圖2是具有趨化功能的生物活性支架的溶脹率。

圖3是具有趨化功能的生物活性支架的吸水率。

圖4是具有趨化功能的生物活性支架移植到大鼠脊髓全橫斷處后,可觀察到神經纖維生長和星形膠質細胞遷移進入損傷/移植區。

圖5是具有趨化功能的生物活性支架移植到大鼠脊髓全橫斷處后,可觀察到包繞著髓鞘結構的神經纖維生長進入損傷/移植區。

圖6是具有趨化功能的生物活性支架移植到大鼠脊髓全橫斷處后,可觀察到損傷/移植區有表達TrkC的細胞遷移進入。

圖7是具有趨化功能的生物活性支架移植到犬脊髓半橫斷處后,可觀察到血管樣的結構延伸進入損傷/移植區。

圖8是具有趨化功能的生物活性支架移植到犬脊髓半橫斷處后,可觀察到大量細胞遷移進入損傷/移植區。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明所用的主要儀器、趨化活性支架和試劑作詳盡的描述:

1.主要儀器

超凈工作臺(蘇州凈化電子設備廠);普通離心機(久保田日本);恒溫水浴箱(北京醫療設備廠);5%CO2培養箱(Queue美國);倒置相差顯微鏡(Olympus日本);熒光顯微鏡(Leica德國);掃描電鏡(Philips荷蘭);透射電鏡(Philips荷蘭);激光共聚焦成像系統(Carl Zeiss德國);低溫烤箱(上海躍進醫療器械廠);高溫烤箱(上海躍進醫療器械廠);高壓消毒鍋(江陰濱江醫療設備廠);恒冷箱切片機(Shandon英國);超純水儀(Molsheim法國);酶聯免疫檢測儀(Bio-Rad美國);電泳儀電源(Bio-Rad美國);垂直板電泳槽(Bio-Rad美國);電轉儀(Bio-Rad美國);超高速低溫離心機(Beckman美國);-80℃超低溫冰箱(Revco Tech美國);JY92-2D超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2.趨化活性支架

制備支架的多孔隙明膠圓柱體支架材料是購自于南京金陵藥業股份有限公司的產品---醫用明膠海綿。包繞在多孔隙明膠圓柱體支架周圍形成外殼薄壁的PLGA(50∶50)薄膜是購自于濟南岱罡生物科技公司的產品。蠶繭是由浙江省農業科學院蠶桑研究所贈送。NT-3和RA均購自Sigma公司。

3.主要試劑

DMEM-LG(Gibico),優級胎牛血清(TBD),多聚賴氨酸(Sigma),D-Hank’s平衡液(自配),胰蛋白酶(Sigma),EDTA(Sangon),0.01mol/L PBS(中杉金橋),MTT(Ameresco公司),二甲基亞砜(DMSO,Sangon),Hoechst33342(Sigma),DAPI(Sigma),山羊血清(中杉金橋),小鼠抗BrdU單克隆抗體(Sigma),Cy3標記羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch),calcein-AM/EthD-III Live/Dead kit(Biotium),兔抗NT-3多克隆抗體(Santa Cruz),鼠抗人TrkC單克隆抗體(RD),兔抗大鼠NF單克隆抗體(Sigma),小鼠抗大鼠NF單克隆抗體(Sigma),兔抗大鼠GFAP多克隆抗體(Sigma),小鼠抗大鼠MBP單克隆抗體(Millipore),山羊抗小鼠FITC(Jackson Immunological Research),Cy3標記的羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch),Cy3標記羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch),Dylight 405標記的羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch),AMCA標記羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch),山羊抗兔HRP(Jackson ImmunoResearch),蛋白定量檢測試劑盒(鼎國),細胞裂解液(Boster),蛋白酶抑制劑cocktail(Sigma),ECL發光底物檢測試劑盒(康為世紀),Epon-812(Ted Pella),考馬斯亮藍(Bio-rad),30%聚丙烯酰胺溶液(康為世紀),X感光膠片(Kodak)。

本發明詳細的具體操作技術說明如下:

1.趨化活性支架的構建

1.1支架外殼的制備

外殼薄壁是環繞圓柱體的聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(poly D,L-lactic-co-glycolic acid,PLGA),其由可降解的高分子合成材料PLGA(聚乳酸與聚羥基乙酸比值為50∶50,分子量為100 000)構成。取一定量的PLGA溶解于二氯甲烷中,配成5%溶液,待PLGA完全溶解后,澆注與已調水平的聚四氟模具中,室溫(控制溫度在20℃),揮發24小時,第2天小心揭下薄膜,反置于模具中24小時,剪裁到適宜大小后干燥保存。將薄膜包繞在直徑為3mm的不銹鋼圓柱磨具上一圈,邊緣用丙酮粘貼,形成直徑為3mm的圓筒狀PLGA外殼。使用時將PLGA外殼剪成2mm長度,酒精浸泡15分鐘,隨后用無菌D-Hank’s平衡液浸洗3次,每次10分鐘。

1.2三維材料的構建

無菌明膠海綿購自金陵藥業公司,在超凈工作臺中將其剪成直徑3mm,厚度2mm大小(約1.0mg),其形貌呈圓柱體,其中的孔隙直徑約200~600μm。無菌干燥保存待用。

1.3趨化活性微分子球的制備

將20g Na2CO3溶于4升水中,加熱至100℃,放入75g家蠶蠶繭(由浙江省農業科學院蠶桑研究所贈送),保持溶液微沸,并不斷攪拌。1小時后,倒去溶液。再重復上述過程1次。將煮沸好的蠶繭自然冷卻,用去離子水沖洗干凈,放在烘箱內24小時,50℃烘干后備用。取CaCl244.40g、乙醇46.00ml,去離子水57.60ml制成混合溶液,在此溶液中放入烘干的蠶繭15.00g。使溶液充分浸沒蠶繭后,80℃水浴加熱,攪拌溶解。1小時后,蠶繭全部溶解為絲蛋白溶液。停止加熱和攪拌,自然冷卻絲蛋白溶液至室溫。用透析袋(購自于廣州市齊云生物技術有限公司)透析去除絲蛋白溶液中的鹽離子。前2天用自來水浸泡含有絲蛋白溶液的透析袋,后1天改用去離子水浸泡,共透析3天。在透析期間,每隔3小時換1次自來水或去離子水。將透析后的絲蛋白溶液倒入量筒中,靜置4小時,除去溶液中的固體雜質。用錐形瓶收集靜置后的絲蛋白溶液。將0.5μg重組人NT-3和10-6mmol/L RA與3%絲蛋白混合,制備混合液。

1.4支架的組裝

裁減好的天然明膠海綿吸附趨化活性微分子球至飽和,放入凍干瓶中,-80℃穩定晶形。在冷凍干燥機中,冷凍抽真空12小時,以除去水分和材料中的氣體。平衡后,70%乙醇交聯材料,D-Hanks洗3遍,并將材料放入PLGA套管中,制備成2mm的生物活性支架。

2.體外檢測支架的性能

2.1溶脹率

一定時間內,支架在PBS溶液中的體積變化表示為其溶脹率,穩定的生物材料其溶脹率變化幅度較小。檢測方法如下:將支架平行樣各5個,分別測其直徑R0和長度h0(精確到0.01mm);將材料滲泡在PBS溶液中,測試樣品在1h、2h、6h、12h和24h的尺寸變化Rt及ht。

2.2吸水率

支架放在PBS溶液中質量的變化,W0表示空白質量,Wt表示滲泡PBS溶液t時間后的質量。

3.體內檢測支架的效能

3.1移植到大鼠體內的效能

大鼠脊髓全橫斷模型制備:選用成年雌性大鼠,體重約220g,每組大鼠各3-5只,在3組大鼠腹腔內注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)進行麻醉,在消毒條件下切開皮膚,分離肌肉,切除T9和T10脊柱椎板,并在T9椎板中位全橫斷脊髓(此處位于T9和T10脊髓節段分界處),并切除其后2mm脊髓組織塊,清除損傷腔內殘留的神經纖維。在脊髓橫斷處分別移植入NT-3/絲素蛋白明膠海綿支架和絲素蛋白支架,明膠海綿大小為2×2×2mm3。充分止血后,逐層縫合肌肉和皮膚。術后每只動物腹腔內注射青霉素5萬單位/d,連續注射3d,必要時給與補液。每天人工排尿,按常規飼養大鼠。

移植具有趨化功能的生物活性支架的大鼠飼養30d后,使用4%多聚甲醛固定。每只大鼠各取損傷/移植區前后共1cm長的脊髓進行縱切片,切片隔5取1。檢測移植的生物活性支架內部遷移細胞的情況。

3.2移植到犬體內的效能

犬脊髓半橫斷模型制備:選用幼年比格犬,每組各5只,腹腔內注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)進行麻醉,在消毒條件下切開皮膚,分離肌肉,切除T9和T10脊柱椎板,并在T9椎板中位半橫斷脊髓(此處位于T9和T10脊髓節段分界處),并切除右半側2mm脊髓組織塊,清除損傷腔內殘留的神經纖維。在脊髓橫斷處移植入具有趨化功能的生物活性支架。充分止血后,逐層縫合肌肉和皮膚。術后每只動物腹腔內注射青霉素5萬單位/d,連續注射3d,必要時給與補液。每天人工排尿。

移植具有趨化功能的生物活性支架的犬飼養30d后,使用4%多聚甲醛固定。每只犬各取損傷/移植區前后共1cm長的脊髓進行縱切片,切片隔5取1。檢測移植的生物活性支架內部遷移細胞的情況。

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