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用于治療癌癥的方法.pdf

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用于 治療 癌癥 方法
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摘要
申請專利號:

CN201680038907.4

申請日:

20160429

公開號:

CN108024540A

公開日:

20180511

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N57/00,A01N57/10 主分類號: A01N57/00,A01N57/10
申請人: 雷迪厄斯制藥公司
發明人: 蓋理·哈特斯利
地址: 美國馬薩諸塞州
優先權: 62/154,699,62/155,451,62/158,469,62/192,940,62/192,944,62/252,085,62/252,916,62/265,696,62/265,658,62/265,774,62/265,663,62/323,572,62/323,576
專利代理機構: 北京潤平知識產權代理有限公司 代理人: 嚴政;劉依云
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201680038907.4

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本文公開了通過向受試者施用治療有效量的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)的組合來治療一種或多種腫瘤的方法。所述癌癥是雌激素依賴性癌癥,例如乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、子宮內膜癌、或前列腺癌。

權利要求書

1.一種在具有耐藥性雌激素受體α陽性癌癥的受試者中抑制腫瘤生長或產生腫瘤消退的方法,其包括向所述受試者施用治療有效量的依維莫司和具有以下結構的RAD1901或其鹽或其溶劑化物的組合:2.一種在具有突變型雌激素受體α陽性癌癥的受試者中抑制腫瘤生長或產生腫瘤消退的方法,其包括向所述受試者施用治療有效量的依維莫司和具有以下結構的RAD1901或其鹽或其溶劑化物的組合:3.根據權利要求1或2所述的方法,其中所述癌癥選自乳腺癌、子宮癌、卵巢癌和垂體癌。4.根據權利要求1或2所述的方法,其中所述癌癥是轉移性癌癥。5.根據權利要求1或2所述的方法,其中所述癌癥對于包含選自Y537X、L536X、P535H、V534E、S463P、V392I、E380Q及其組合的一個或多個突變的突變型雌激素受體α呈陽性,其中:X是S、N或C;D538G;X是R或Q。6.根據權利要求5所述的方法,其中所述突變是Y537S。7.根據權利要求1或2所述的方法,其中在施用后,RAD1901或其鹽或其溶劑化物在所述腫瘤中的濃度與RAD1901或其鹽或溶劑化物在血漿中的濃度比(T/P)為至少約15。8.根據權利要求1或2的方法,其中所述受試者患有骨質疏松癥或具有高骨質疏松癥風險。9.根據權利要求1或2所述的方法,其中所述受試者是絕經前婦女。10.根據權利要求1或2所述的方法,其中所述受試者是之前用SERM和/或AI治療后復發或惡性進展的絕經后婦女。11.根據權利要求1或2所述的方法,其中所述治療有效量為約150至約1,500mg/天。12.根據權利要求1或2所述的方法,其中所述鹽是RAD1901二鹽酸鹽。13.根據權利要求1或2所述的方法,其中所述腫瘤對選自抗雌激素藥、芳香酶抑制劑及其組合的藥物具有耐藥性。14.根據權利要求12所述的方法,其中所述抗雌激素藥是他莫昔芬或氟維司群。15.根據權利要求12所述的方法,其中所述芳香酶抑制劑是aromasin。16.根據權利要求1或2所述的方法,其中所述治療有效量為150mg至2,000mg。17.根據權利要求16所述的方法,其中所述治療有效量是200mg、400mg或500mg。18.一種藥物組合物,其包含依維莫司和RAD1901或其鹽或溶劑化物。19.一種治療具有耐藥性雌激素受體α陽性癌癥的受試者中的乳腺癌的方法,其包括向所述受試者施用治療有效量的m-TOR抑制劑和具有以下結構的RAD1901或其鹽或其溶劑化物的組合:20.根據權利要求19所述的方法,其中所述耐藥性乳腺癌對一種或多種抗雌激素藥或芳香酶抑制劑療法具有耐藥性。21.根據權利要求20所述的方法,其中所述一種或多種抗雌激素藥選自他莫昔芬、托瑞米芬和氟維司群,并且所述一種或多種芳香酶抑制劑選自aromasin、來曲唑和阿那曲唑。22.根據權利要求19-21中任一項所述的方法,其中所述婦女表達選自D538G、Y537S、Y537N、Y537C、E380Q、S463P、L536R、L536Q、P535H、V392I和V534E的至少一種突變型雌激素受體α。23.根據權利要求22所述的方法,其中所述突變型雌激素受體α選自Y537S、Y537N、Y537C、D538G、L536R、S463P和E380Q。24.根據權利要求22-23所述的方法,其中所述突變型受體α是Y537S。25.根據權利要求19-24中任一項所述的方法,其中以100mg至1,500mg的總日劑量施用所述RAD1901。26.根據權利要求25所述的方法,其中以100mg至1,000mg的總日劑量施用所述RAD1901。27.根據權利要求26所述的方法,其中以100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1,000mg的總日劑量施用所述RAD1901。28.根據權利要求22-27中任一項所述的方法,其中以兩個分開的劑量遞送所述日劑量。29.根據權利要求28所述的方法,其中所述分開的劑量是相等的劑量。30.根據權利要求29所述的方法,其中所述相等的劑量各自為100mg、200mg、250mg、300mg、400mg或500mg。31.根據權利要求25-30中任一項所述的方法,其中通過口服途徑遞送所述劑量。32.根據權利要求19-31中任一項所述的方法,其中所述婦女是絕經后婦女。33.根據權利要求19-32中任一項所述的方法,其中通過測量選自以下一種或多種基因的表達增加來首次識別用于治療的所述婦女:ABL1、AKT1、AKT2、ALK、APC、AR、ARID1A、ASXL1、ATM、AURKA、BAP、BAP1、BCL2L11、BCR、BRAF、BRCA1、BRCA2、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDH1、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CEBPA、CTNNB1、DDR2、DNMT3A、E2F3、EGFR、EML4、EPHB2、ERBB2、ERBB3、ESR1、EWSR1、FBXW7、FGF4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、FRS2、HIF1A、HRAS、IDH1、IDH2、IGF1R、JAK2、KDM6A、KDR、KIF5B、KIT、KRAS、LRP1B、MAP2K1、MAP2K4、MCL1、MDM2、MDM4、MET、MGMT、MLL、MPL、MSH6、MTOR、MYC、NF1、NF2、NKX2-1、NOTCH1、NPM、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PIK3R1、PML、PTEN、PTPRD、RARA、RB1、RET、RICTOR、ROS1、RPTOR、RUNX1、SMAD4、SMARCA4、SOX2、STK11、TET2、TP53、TSC1、TSC2、和VHL。34.根據權利要求33所述的方法,其中所述一種或多種基因選自AKT1、AKT2、BRAF、CDK4、CDK6、PIK3CA、PIK3R1和MTOR。35.根據權利要求19-34中任一項所述的方法,其中所述m-TOR抑制劑選自西羅莫司、替西羅莫司、依維莫司和ridafarolimus。36.根據權利要求19-34所述的方法,其中所述m-TOR抑制劑以每天1mg至500mg的劑量給藥。37.根據權利要求36所述的方法,其中所述m-TOR抑制劑以每天5mg至100mg的劑量給藥。38.根據權利要求37所述的方法,其中所述m-TOR抑制劑以每天10mg至50mg的劑量給藥。39.根據權利要求35所述的方法,其中所述m-TOR抑制劑是依維莫司。40.根據權利要求39所述的方法,其中所述依維莫司以10mg的日劑量給藥。41.根據權利要求39所述的方法,其中所述依維莫司以2.5至7.5mg的劑量給藥。42.根據權利要求19-41中任一項所述的方法,其中所述m-TOR抑制劑經口服給藥。43.根據權利要求19-42中任一項所述的方法,其中所述m-TOR抑制劑每天給藥一次。

說明書

相關申請的交叉引用

本申請要求2015年4月29日提交的美國臨時申請第62/154,699號、2015年4月30日提交的美國臨時申請第62/155,451號、2015年11月6日提交的美國臨時申請第62/252,085號、2015年12月1O日提交的美國臨時申請第62/265,696號、2015年5月7日提交的美國臨時申請第62/158,469號、2015年11月9日提交的美國臨時申請第62/252,916號、2015年12月10日提交的美國臨時申請第62/265,774號、2015年7月15日提交的美國臨時申請第62/192,940號、2015年12月10日提交的美國臨時申請第62/265,658號、2016年4月15日提交的美國臨時申請第62/323,572號、2015年7月15日提交的美國臨時申請第62/192,944號、2015年12月10日提交的美國臨時申請第62/265,663號以及2016年4月15日提交的美國臨時申請第號62/323,576號的權益;所有這些申請均通過引用以其全文并入本文。

背景技術

基于三種受體:雌激素受體(ER)、孕酮受體(PR)和人表皮生長因子受體-2(Her2)的表達,將乳腺癌分為三種亞型。在許多乳腺癌患者體內發現了ER的過度表達。ER陽性(ER+)乳腺癌占所有乳腺癌的三分之二。除乳腺癌之外,雌激素和ER與例如卵巢癌、結腸癌、前列腺癌和子宮內膜癌有關。

ER可以被雌激素激活并轉移到細胞核中以結合DNA,由此調節幾種基因的活性。參見例如Marino等人的“Estrogen Signaling Multiple Pathways to Impact Gene Transcription”(Curr.Genomics 7(8):497-508(2006));和Heldring等人的“Estrogen Receptors:How Do They Signal and What Are Their Targets”(Physiol.Rev.87(3):905-931(2007))。

在ER陽性乳腺癌的治療中,之前已經在使用或者正在開發抑制雌激素產生的藥劑(例如芳香酶抑制劑(AI,例如來曲唑、阿那曲唑和阿諾新))、或者直接阻斷ER活性的那些藥劑(例如選擇性雌激素受體調節劑(SERM,例如他莫昔芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、艾多昔芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、阿佐昔芬、米潑昔芬、左美洛昔芬、和EM-652(SCH 57068))以及選擇性雌激素受體降解劑(SERD,例如氟維司群、TAS-108(SR16234)、ZK191703、RU58668、GDC-0810(ARN-810)、GW5638/DPC974、SRN-927、ICl182782和AZD9496)。

經常使用SERM(例如他莫昔芬)和AI作為ER陽性乳腺癌的一線輔助系統治療。他莫昔芬通常用于ER陽性乳腺癌。AI通過阻斷芳香酶的活性(其將體內的雄激素轉化為雌激素)來抑制外周組織中的雌激素產生。然而,AI不能阻止卵巢制造雌激素。因此,AI主要用于治療絕經后的婦女。此外,由于AI比他莫昔芬有效得多且產生較少的嚴重副作用,所以AI也可以用于治療其卵巢功能受抑制的絕經前婦女。參見例如Francis等人的“Adjuvant Ovarian Suppression in Premenopausal Breast Cancer”(N.Engl.J.Med.,372:436-446(2015))。

雖然利用這些藥劑進行的初始治療可能是成功的,但許多患者最終復發耐藥性乳腺癌。影響ER的突變已經成為這種耐藥性發展的潛在機制之一。參見例如Robinson等人,“Activating ESR1 mutations in hormone-resistant metastatic breast cancer,”Nat.Genet.45:1446-51(2013)。在21%的來自接受至少一線內分泌治療患者的轉移性ER陽性乳房腫瘤樣品中發現了ER配體結合結構域(LBD)中的突變。Jeselsohn等人,“ESR1 mutations-a mechanism for acquired endocrine resistance in breast cancer,”Nat.Rev.Clin.Oncol.,12:573-83(2015)。

氟維司群是目前唯一批準用于治療抗雌激素治療后具有疾病進展的ER陽性轉移性乳腺癌的SERD。盡管其具有臨床功效,但是氟維司群的效用已經受單次注射中可施用的藥劑量和生物利用度降低限制。使用18F-氟雌二醇正電子發射斷層掃描(FES-PET)的成像研究表明,甚至在500mg劑量水平,一些患者也可能不能完全抑制ER,并且劑量不足可能是治療失敗的原因。

與雌激素指導的療法相關的另一挑戰在于它們可能對子宮、骨和其他組織具有不期望的影響。ER指導幾種組織和細胞類型中的雌激素應答基因的轉錄。隨著絕經期間雌激素和其他卵巢激素的內源性水平減少,這些影響可能會特別顯著。例如,由于對子宮內膜具有部分激動劑的作用,他莫昔芬可導致絕經前婦女骨質疏松,并增加罹患子宮內膜癌的風險。在絕經后婦女中,AI相比他莫昔芬可導致更多的骨質流失和更多的骨折。由于其作用機制,利用氟維司群治療的患者也可能遭受骨質疏松癥的風險。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素(mTOR)途徑的哺乳動物靶標是在調節細胞周期中重要的胞內信號傳導途徑。癌癥中PI3K/AKT/mTOR途徑的頻繁激活及其在細胞生長和存活中的關鍵作用對尋找適宜的增殖-分化量以在開發各種療法時利用這種平衡帶來了挑戰。參見,例如Gitto等,“Recent insights into the pathophysiology of mTOR pathway dysregulation,”Res.Rep.Bio.,2:1-16(2015)。

與其他療法結合施用時,PI3K途徑的抑制劑顯示出最大的希望。例如,2012年依維莫司(一種變構型mTOR抑制劑)被批準用于與AI依西美坦聯用治療患有晚期激素受體陽性(HR+)、HER2-乳腺癌的絕經后婦女(BOLERO-2研究)。正在開發用于治療HR+癌癥的靶向PI3K途徑其他組分的藥物,例如PI3K和mTOR的ATP競爭性雙重抑制劑(例如BEZ235,GDC-0980)、抑制I類PI3K的全部四種同種型的泛PI3K抑制劑(例如BKM120、GDC-0941)、各種PI3K同種型的異構體特異性抑制劑(例如BYL719、GDC-0032)、AKT的變構和催化抑制劑(MK2206、GDC-0068、GSK2110183、GSK2141795、AZD5363)、和僅mTOR的ATP競爭性抑制劑(AZD2014、MLN0128和CC-223)。Dienstmann等人,“Picking the point of inhibition:a comparative review of PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitors,”Mol.Cancer Ther.,13(5):1021-31(2014)。

盡管它們具有巨大的潛力,但是與mTOR抑制劑有關的不良副作用阻礙了它們作為有效癌癥療法的發展。Kaplan等,“Strategies for the management of adverse events associated with mTOR inhibitors,”Transplant Rev(Orlando),28(3):126-133(2014);and Pallet et al.,“Adverse events associated with mTOR inhibitors,”Expert Opin.Drug Saf.12(2):177-186(2013)。

仍然需要如下更為持久和有效的ER靶向療法:所述療法可以克服與目前的內分泌治療相關的挑戰,同時通過與第二治療劑(例如,依維莫司和其它靶向PI3K/AKT/mTOR途徑的藥劑)結合對抗晚期癌癥和/或對既往治療具有耐藥性的癌癥來提供額外的益處。

發明內容

本發明的一個方面涉及用于治療受試者中的一種或多種癌癥和/或腫瘤的方法,其包括向所述受試者施用治療有效量的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽的組合和如本文所述的一種或多種第二治療劑(例如,依維莫司)。

在一些實施方案中,所述癌癥是雌激素依賴性癌癥,諸如乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、子宮內膜癌或前列腺癌。在一些實施方案中,所述癌癥是ER陽性乳腺癌。

將RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)組合施用至有需要的受試者。短語“組合”是指在施用所述第二治療劑(例如依維莫司)之前、期間或之后施用RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽。例如,可以按以下時間施用RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑:間隔約一周、間隔約6天、間隔約5天、間隔約4天、間隔約3天、間隔約2天、間隔約24小時、間隔約23小時、間隔約22小時、間隔約21小時、間隔約20小時、間隔約19小時、間隔約18小時、間約17小時、間隔約16小時、間隔約15小時、間隔約14小時、間隔約13小時、間隔約12小時、間隔約11小時、間隔約10小時、間隔約9小時、間隔約8小時、間約7小時、間隔約6小時、間隔約5小時、間隔約4小時、間隔約3小時、間隔約2小時、間隔約1小時、間隔約55分鐘、間隔約50分鐘、間隔約45分鐘、間隔約40分鐘、間隔約35分鐘、間隔約30分鐘、間隔約25分鐘、間隔約20分鐘、間隔約15分鐘、間隔約10分鐘或間隔約5分鐘。在其它實施方案中,將RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)同時或基本上同時施用至所述受試者。在這些實施方案的某些實施方案中,可以作為單一制劑的一部分來施用化合物。

在一些實施方案中,以分開的制劑施用RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑。在這些實施方案中的某些實施方案中,制劑可以是相同類型的制劑。例如,可以將兩種制劑都設計用于口服施用(例如,通過兩種分開的丸劑)或用于注射(例如,通過兩種分開的可注射制劑)。在其他實施方案中,可以將RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)配制成不同類型的制劑。例如,一種化合物可以在設計用于口服給藥的制劑中,而另一種化合物在設計用于注射的制劑中。

在其他實施方案中,作為單一制劑的一部分施用RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑。例如,將RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑配制成用于口服施用的單一丸劑或配置成單一注射劑。相應地,在某些實施方案中,本文提供了包含RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和一種或多種第二治療劑的制劑。

RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和/或第二治療劑的施用途徑包括但不限于局部施用、口服施用、皮內施用、肌內施用、腹膜內施用、靜脈內施用、膀胱內灌注、皮下施用、透皮施用、和透粘膜施用。

附圖說明

圖1:RAD1901在源自患者的幾個異種移植(PDx)模型中抑制腫瘤生長(TGI),無論該腫瘤的ESR1狀態和既往內分泌治療史。其顯示了利用RAD1901治療的PDx模型中的腫瘤生長抑制(TGI)的百分比。

圖2A-C:在野生型(WT)ERα MCF-7小鼠異種移植模型(PR+,Her2-)中,RAD1901和依維莫司的組合表現出腫瘤生長抑制和消退。(圖2A):利用載體對照、依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)、氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)、氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)和依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)的組合、RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)、和RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)和依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)的組合治療的MCF-7異種移植模型中的腫瘤生長;單因素方差分析,“ns”為不顯著,*p值<0.05,***p值<0.001;(圖2B):用溶媒對照、依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)、氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)、氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)和依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)的組合、RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)、和RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)與依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)組合治療的MCF-7異種移植模型中從基線至研究結束時個體腫瘤尺寸的變化;(圖2C):利用溶媒對照、依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)、氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)、氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)和依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)的組合、RAD1901(30或60mg/kg,口服,每日一次)、和RAD1901(30或60mg/kg,口服,每日一次)和依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)的組合治療的MCF-7異種移植模型中的腫瘤生長。

圖3A-B:在WT ERα PDx-11模型(PR+,Her2-,之前曾用芳香酶抑制劑、氟維司群和化學療法進行治療)中,RAD1901和依維莫司的組合表現出腫瘤生長抑制和消退。(圖3A):利用溶媒對照、氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)、依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)、RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)、和RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)與依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)的組合治療的PDx-11模型的腫瘤生長;(圖3B):在利用溶媒對照、氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)、RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)、和RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)與依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)的組合治療的PDx-11模型中從基線到研究結束時個體腫瘤尺寸的變化。n=8-10/組。

圖4A-B:在WT ER+PDx-2模型(PR+,Her2-,初次治療)中,RAD1901和依維莫司的組合表現出腫瘤生長抑制。(圖4A):利用溶媒對照、RAD1901(60mg/kg,口服,隔日一次)、氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)、和RAD1901(60mg/kg,口服,隔日一次)與氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)的組合治療的PDx-2模型的腫瘤生長;(圖4B):利用溶媒對照、依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)、RAD1901(60mg/kg,口服,隔日一次)、和RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)與依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次)的組合治療的PDx-2模型的腫瘤生長。n=8-10/組。

圖5:在RAD1901治療結束之后繼續在WT ERα PDx-4模型(PR+,Her2-,初次治療)中進行雌二醇治療,RAD1901的功效持續至少兩個月。

圖6A-B:在突變型(Y537S)ERα PDx-5模型(PR+,Her2+,之前曾用芳香酶抑制劑治療)中,RAD1901與依維莫司的組合表現出腫瘤生長抑制。(圖6A)利用溶媒對照、RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)、和氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)治療的PDx-5模型的腫瘤生長;(圖6B)利用溶媒對照、RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)、依維莫司(2.5mg,口服,每日一次)、和RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)與依維莫司(2.5mg,口服,每日一次)的組合治療的PDx-5模型的腫瘤生長。n=8-10/組。

圖7:裸鼠中的氟維司群藥代動力學分析。其顯示在1mg/劑(實心菱形)、3mg/劑(實心圓圈)和5mg/劑(實心三角形)下氟維司群的血漿濃度。在第1天給裸鼠皮下注射氟維司群,在第8天施用第二劑。在第二劑之后長達168小時的時間內,在指定的時間點監測氟維司群的血漿濃度。

圖8:RAD1901和氟維司群(Faslodex)對顱內MCF-7腫瘤模型中小鼠存活的影響。

圖9A-C:利用200和500mg RAD1901(口服,每日一次)治療的受試者的子宮的FES-PET掃描的代表性圖像和RAD1901治療后ER結合的變化。(圖9A):在200mg RAD1901治療之前(a)和之后(c)的子宮CT掃描的橫向視圖以及在RAD1901治療之前(b)和之后(d)的子宮FES-PET掃描的橫向視圖;(圖9B):在500mg RAD1901治療之前(上(a)圖)和之后(下(a)圖)的子宮CT掃描的矢狀位圖、在RAD1901治療之前(上(b)圖)和之后(下(b)圖)的子宮FES-PET掃描的矢狀位圖、在RAD1901治療之前(上(c)圖)和之后(下(c)圖)的子宮CT掃描的橫向視圖、在RAD1901治療之前(上(d)圖)和之后(下(d)圖)的子宮FES-PET掃描的橫向視圖;(圖9C):與基線(RAD1901治療前)相比受試者1-3(200mg)和受試者4-7(500mg)進行RAD1901治療后的%ER結合變化。

圖10A-B:RAD1901治療(500mg)之前(基線)和之后(治療后)子宮(圖10A)和垂體(圖10B)的FES-PET掃描的代表性圖像。(a)側向截面;(b)縱向截面;和(c)縱向截面。

圖11:利用溶媒對照、RAD1901、依維莫司、RAD1901和依維莫司的組合、氟維司群、和氟維司群與依維莫司的組合治療的MCF-7異種移植模型中的PR和ER表達。

圖12A-B:在體外,RAD1901治療導致MCF-7細胞系(圖12A)和T47D細胞系(圖12B)中ER完全降解并抑制ER信號傳導。顯示在以0.001μM、0.01μM、0.1μM和1μM的幾種濃度下分別用RAD1901和氟維司群治療的兩種細胞系中的ER表達。通過測試的三種ER靶基因顯示ER信號傳導:PGR、GREB1和TFF1。

圖13A-C:在MCF-7異種移植模型中,RAD1901治療導致ER降解并消除ER信號傳導。(圖13A):蛋白質免疫印跡,其顯示了在利用溶媒對照、30和60mg/kg RAD1901和3mg/劑氟維司群治療的MCF-7異種移植模型中、在最后一劑后2小時或8小時時的PR和ER表達;(圖13B):在利用溶媒對照、30和60mg/kg RAD1901和3mg/劑氟維司群治療的MCF-7異種移植模型中、在最后一劑后2小時時的ER蛋白表達;(圖13C):在利用溶媒對照、30和60mg/kg RAD1901和3mg/劑氟維司群治療的MCF-7異種移植模型中、在最后一劑后8小時時的PR蛋白表達。

圖14A-C:RAD1901治療導致MCF-7異種移植模型中的PR快速降低。(圖14A):蛋白質免疫印跡,其顯示在利用溶媒對照和RAD1901(30、60和90mg/kg)治療的MCF-7異種移植模型中、在單劑之后8小時或12小時時的PR表達;(圖14B):蛋白質免疫印跡,其顯示在利用溶媒對照和RAD1901(30、60和90mg/kg)治療的MCF-7異種移植模型中、在第7劑之后4小時或24小時時的PR表達;(圖14C):在利用30、60和90mg/kg RAD1901治療的MCF-7異種移植模型中PR表達的劑量依賴性降低。

圖15A-B:RAD1901治療導致MCF-7異種移植模型中的增殖快速降低。(圖15A):在單劑后8小時和第4劑后24小時時從利用溶媒對照和90mg/kg RAD1901治療的MCF-7異種移植模型采集的切片腫瘤的代表性照片,其中對增殖標志物Ki-67進行染色;(圖15B):直方圖,其顯示在單劑之后8小時和第4劑之后24小時時利用溶媒對照和90mg/kg RAD1901治療的MCF-7異種移植模型中的增殖標志物Ki-67減少。

圖16:在56天功效研究的最后一天,4小時時,30、60和120mg/kg RAD1901治療相比氟維司群(1mg/動物)更顯著地降低PDx-4模型的研究結束腫瘤中的Ki67。

圖17:60和120mg/kgRAD1901治療導致PDx-5模型中的體內ER信號傳導減少,伴隨PR表達降低。

圖18A-D:RAD1901對新斷奶雌性Sprague-Dawley大鼠子宮組織的影響。(圖18A):在最后一劑后24小時時安樂死的大鼠的子宮濕重;(圖18B):子宮組織切片中的上皮高度;(圖18C):400倍放大的經甲苯胺藍O-染色的子宮組織的代表性切片,箭頭指示子宮上皮;(圖18D):從子宮組織提取并通過定量RT-PCR分析其相對于18S核糖體RNA看家基因的補體C3表達水平的總RNA。

圖19:在第7天給藥200、500、750和1000mg/kg RAD1901后的血漿藥代動力學結果。

圖20:3ERT(I)。

圖21:3ERT(II)。

圖22:表11中匯總的ERα LBD拈抗劑復合物的疊加。

圖23A-B:(圖23A)RAD1901-1R5K;和(圖23B)GW5-1R5K的建模。

圖24A-B:(圖24A)RAD1901-1SJ0;和(圖24B)E4D-1SJ0的建模。

圖25A-B:(圖25A)RAD1901-2JFA;和(圖25B)RAL-2JFA的建模。

圖26A-B:(圖26A)RAD1901-2BJ4;和(圖26B)OHT-2BJ4的建模。

圖27A-B:(圖27A)RAD1901-2IOK;和(圖27B)IOK-2IOK的建模。

圖28:由利用1R5K和2OUZ進行的IFD分析獲得的RAD1901構象的疊加。

圖29:由利用2BJ4和2JFA進行的IFD分析獲得的RAD1901構象的疊加。

圖30A-B:由利用2BJ4、2JFA和1SJ0進行的IFD分析獲得的RAD1901構象的疊加。

圖31A-C:利用2BJ4進行的RAD1901的IFD。

圖32A-C:通過IFD對接在2BJ4中的RAD1901的蛋白質表面相互作用。

圖33A-C:利用2BJ4進行的氟維司群的IFD。

圖34A-B:利用2BJ4進行的氟維司群和RAD1901的IFD。

圖35A-B:利用2BJ4進行的氟維司群和RAD1901的IFD的疊加。

圖36:利用WT和LBD突變體的ERα構建體進行的RAD1901體外結合測定。

表1.治療40天后在植入MCF7細胞的小鼠的血漿、腫瘤和大腦中的RAD1901水平。BLQ:低于定量極限。

表2.用200mg劑量(口服,每日一次)治療6天的人受試者的子宮、肌肉和骨的SUV。

表3.用500mg劑量(口服,每日一次)治療6天的人受試者(n=4)的子宮、肌肉和骨的SUV。

表4.RAD1901對卵巢切除大鼠中的BMD的影響。對成年雌性大鼠進行假手術或卵巢切除手術,然后利用載體、E2(0.01mg/kg)或RAD1901(3mg/kg)每天一次(n=20/每個治療組)開始治療。在基線和治療4周后通過雙發射x射線吸收測量法測量BMD。數據表示為平均值±SD。相對于對應的OVX+Veh對照,*P<0.05。BMD為骨礦物質密度;E2為β雌二醇;OVX為卵巢切除;Veh為溶媒。

表5.RAD1901對卵巢切除大鼠的股骨微構造的影響。對成年雌性大鼠進行假手術或卵巢切除手術,然后利用載體、E2(0.01mg/kg)或RAD1901(3mg/kg)每天一次(n=20/每個治療組)開始治療。在4周后,使用微計算機斷層掃描技術評估骨的微結構。數據表示為平均值±SD。相對于對應的OVX+Veh對照,*P<0.05。ABD為表觀骨密度;BV/TV為骨體積密度;ConnD為連接密度;E2為β雌二醇;OVX為卵巢切除;TbN為骨小梁數目;TbTh為骨小梁厚度;TbSp為骨小梁間距;Veh為溶媒。

表6.RAD1901的1期劑量遞增研究的關鍵基線人口統計學。

表7.在RAD1901的1期劑量遞增研究中最頻繁(>10%)的治療相關AE。AE根據CTCAE v4.0進行分級。經歷同一優先項目的多種情形的任何患者都只以最嚴重的等級計算一次。*>10%的總活躍組中具有任何相關TEAE的患者。N=給定類別中具有至少一個治療相關AE的受試者數目。

表8.RAD1901的1期劑量遞增研究中的藥物動力學參數(第7天)。

表9.LBD突變的頻率。

表10.ER-α LBD-拈抗劑復合物與3ERT的殘基構型差異。

表11.通過RMSD計算評估ER-α LBD-拈抗劑復合物的結構重疊。

表12.ER-α LBD-拈抗劑復合物中配體結合的分析。

表13.RAD1901對接的模型評估。

表14.RAD1901與1R5K、1SJ0、2IFA、2BJ4和2OUZ的誘導契合對接評分。

具體實施方式

如以下實施例部分闡述的,在幾種乳腺癌異種移植模型中,RAD1901和依維莫司的組合(RAD1901-依維莫司組合)(結構見下)比單獨使用RAD1901表現出更大的腫瘤生長抑制,所述幾種乳腺癌異種移植模型包括:野生型(WT)ERα MCF-7異種移植物模型(圖2A-C)、WT ERα PDx-2(圖4A-B)和PDx-11模型(圖3A-B)、和突變型(例如Y537S)ERα PDx-5模型(圖6A-B),無論該腫瘤的ESR1狀態以及實施例I中描述的既往內分泌治療史。PDx-2、PDx-5和PDx-11模型具有表達WT或突變型(例如Y537S)ERα、具有PR表達,具有高或低Her2表達、以及具有或沒有既往內分泌治療(例如,AI、氟維司群)、和/或化療(chemo)(圖1)的腫瘤。單獨使用RAD1901也抑制圖1中列出的所有其他PDx模型中的腫瘤生長,即具有表達WT或突變型(例如,Y537S)ERα、具有PR表達、具有高或低Her2表達、以及有或沒有既往內分泌療法(例如,他莫昔芬(tam)、AI、氟維司群)、化療(chemo)、Her2抑制劑(Her2i,例如曲妥珠單抗、拉帕替尼)、貝伐單抗和/或利妥昔單抗的腫瘤。

ER WT PDx模型和ER突變型PDx模型對于單獨使用氟維司群、單獨使用依維莫司、和/或氟維司群和依維莫司的組合(氟維司群-依維莫司組合)進行的治療可以具有不同的反應水平。然而,與單獨使用RAD1901或單獨使用依維莫司進行的治療相比,RAD1901-依維莫司組合表現出改善的腫瘤生長抑制和/或腫瘤消退,無論該PDx模型是否對氟維司群治療和/或氟維司群-依維莫司組合治療有反應。換言之,RAD1901-依維莫司組合可以在氟維司群耐藥性癌癥中抑制腫瘤生長和/或產生腫瘤消退。

與單獨使用氟維司群或利用氟維司群-依維莫司組合進行的治療相比,RAD1901-依維莫司組合治療表現出改善的腫瘤生長抑制和/或腫瘤消退。例如,與單獨使用氟維司群、單獨使用RAD1901、或單獨使用依維莫司進行的治療相比,RAD1901-依維莫司組合在更多的WT ER+異種移植模型中產生更顯著的腫瘤消退,即使這些異種移植模型對氟維司群治療具有不同的反應性(例如,對氟維司群治療具有反應的MCF7細胞系異種移植模型(圖2);對于氟維司群治療有反應的PDx-11模型(圖3);以及對氟維司群治療反應最少的PDx-2模型(圖4))也是如此。與利用氟維司群-依維莫司組合進行的治療相比,RAD1901-依維莫司組合還在更多的WT ER+MCF7細胞系異種移植模型和PDx-11模型中產生更為顯著的腫瘤消退(圖2和3)。RAD1901-依維莫司組合提供了與30mg/kg或60mg/kg劑量RAD1901相似的效果,但是以30mg/kg單獨使用RAD1901在抑制腫瘤生長方面不如以60mg/kg單獨使用RAD1901有效(圖2C)。所述結果表明,具有較低劑量的RAD1901(例如30mg/kg)的RAD1901-依維莫司組合足以使所述異種移模型中的腫瘤生長抑制/腫瘤消退效果最大化。

RAD1901-依維莫司組合在對氟維司群治療幾乎沒有反應的突變型ER+(例如Y537S)PDx模型中表現出腫瘤消退或改善的腫瘤生長抑制(圖6A)。例如,PDx-5是在對氟維司群治療幾乎沒有反應的ER Y537S突變型PDx模型(PR+,Her2+,具有AI既往治療)。RAD1901-依維莫司組合在PDx-5模型中表現出腫瘤消退,而單獨使用依維莫司或單獨使用RAD1901僅抑制腫瘤生長而不引起腫瘤消退(圖6B)。與單獨使用RAD1901、單獨使用依維莫司、單獨使用氟維司群、相比,RAD1901-依維莫司組合在突變型PDx-5模型中產生更顯著的腫瘤生長抑制(圖6B)。因此,當與RAD1901組合施用時,添加依維莫司使PDx-5模型受益。因此,RAD1901-依維莫司組合為表達WT或突變型ER、具有PR表達、具有高或低Her2表達、以及對氟維司群具有或沒有耐藥性的ER+乳腺癌提供了強力的抗腫瘤療法。

本文提供的結果還顯示,RAD1901可以被遞送至大腦(實施例II),并且所述遞送改善了表達野生型ERα的顱內腫瘤模型(MCF-7異種移植模型,實施例I(B))中的小鼠存活。依維莫司已被批準用于治療室管膜下巨細胞星形細胞瘤(SEGA),這是一種見于結節性硬化癥(TS)的腦腫瘤。因而,RAD1901-依維莫司組合的兩種組分都可能能夠穿過腦-血屏障并治療大腦中的ER+腫瘤。這代表了與氟維司群-依維莫司組合相比在治療大腦內ER+腫瘤方面的額外優勢,原因是氟維司群不能穿過血-腦屏障(Vergotel等,“Fulvestrant,a new treatment option for advanced breast cancer:tolerability versus existing agents,”Ann.Oncol.,17(2):200-204(2006))。能夠穿過血-腦屏障的RAD1901與其它第二治療(例如,mTOR抑制劑,例如雷帕霉素類似物(Geoerger等人,“Antitumor activity of the rapamycin analog CCI-779 in human primitive neuroectodermal tumor/medulloblastoma models as single agent and in combination chemotherapy,”Cancer Res.61:1527-1532(2001))的組合也可以對大腦中的ER+腫瘤具有相似的治療效果。

在RAD1901治療結束后繼續進行雌二醇治療(例如PDx-4模型)的情況下RAD1901顯示出持續的抑制腫瘤生長的功效。因此,RAD1901-依維莫司組合可能通過在治療結束后抑制腫瘤生長而使患者受益,特別是當由于不良反應而可能中斷(例如,對依維莫司而言29%)或減少或延遲(對于依維莫司治療的患者而言70%)第二治療劑時如此。http://www.fda.gov/Drugs/InformationOnDrugs/ApprovedDrugs/ucm488028.htm.

與單獨使用依維莫司或使用依維莫司與其他激素療法(例如,AI(例如來曲唑)和SERD(利如氟維司群)的組合進行的治療相比,RAD1901-依維莫司組合可能具有較低的和/或較不嚴重的副作用。例如,AI和氟維司群兩者都可能導致治療患者的骨質流失。RAD1901不太可能有類似的副作用。已發現,RAD1901優先積累在腫瘤中,其中腫瘤RAD1901水平:血漿RAD1901水平(T/P比)高達約35(實施例II)。計算以約200mg至高達約500mg(每天一次)的劑量利用RAD1901治療的人受試者的子宮、肌肉和骨的標準攝取值(SUV)(實施例III(A))。給藥后的子宮信號接近來自“非標靶組織”(不表達雌激素受體的組織)的水平,其表明RAD1901治療后的FES-PET攝取完全減弱。在不顯著表達雌激素受體(例如肌肉、骨)的組織中,在治療前和治療后的PET掃描中幾乎沒有觀察到變化(實施例III(A))。最后,RAD1901治療拈抗卵巢切除(OVX)大鼠中雌二醇對子宮組織的刺激(實施例IV(A)),并且大幅保持接受治療的受試者的骨質量。例如,利用RAD1901治療的OVX大鼠顯示出維持的BMD和股骨微構造(實施例IV(A))。因此,因此,RAD1901-依維莫司組合對于患有骨質疏松癥或具有較高骨質疏松癥風險的患者可能尤其有用。

此外,已經報道基因表達分析對于鑒別對依維莫司治療有反應的患者是有效的。Yoon等人,“Gene expression profiling identifies responsive patients with cancer of unknown primary treated with carboplatin,paclitaxel,and everolimus:NCCTG N0871(alliance),”Ann.Oncol.,27(2):339-44(2016)。研究NCT00805129發現依維莫司在TSC1中存在體細胞突變的患者中更有效,原因是所述突變導致復發增加并且對依維莫司的反應時間增加。因此,本文公開的方法可以進一步包括待治療受試者進行基因分析,以識別具有更大反應和/或更長反應時間的受試者。

此外,已經發現,RAD1901在MCF-7細胞系異種移植模型中降解野生型ERα并消除體內ER信號傳導,并且在這些MCF-7細胞系異種移植模型中顯示出PR的劑量依賴性降低(實施例III(B))。RAD1901降低MCF-7細胞系異種移植模型和PDx-4模型中的增殖,如從接受治療的受試者采集的腫瘤中的增殖標志物Ki67減少所證實的。在對氟維司群治療幾乎沒有反應的突變型ER PDx模型中,RAD1901還降低了體內ER信號傳導(實施例III(B))。

RAD1901-依維莫司組合對氟維司群治療幾乎沒有反應的腫瘤和表達突變型ERα的腫瘤中的出乎意料的功效可能是由于RAD1901和ERα之間的獨特相互作用引起的。對結合至RAD1901和其他ERα-結合化合物的ERα的結構模型進行分析,以獲得關于特異性結合相互作用的信息(實施例V)。計算機建模顯示,RAD1901-ERα相互作用不太可能受ERα的LBD突變體影響,所述LBD突變體例如為Y537X突變體,其中X是S、N或C;D538G;和S463P,其占接受至少一線內分泌治療的患者的轉移性ER陽性乳房腫瘤樣品的最近研究中發現的LBD突變的約81.7%(表9,實施例V)。因此,一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)和RAD1901或其鹽或其溶劑化物(例如水合物)的組合可能具有與本文所公開的RAD1901-依維莫司類似的治療效果,同時具有相對低的副作用。計算機建模使得能夠識別出對于結合至關重要的ERα C-末端配體結合結構域中的特定殘基,該信息可用于開發不僅結合和拈抗野生型ERα而且還結合并拈抗其某些突變體和其變體的化合物,當與第二治療劑(例如依維莫司)組合時所述化合物可提供與本文公開的RAD1901-依維莫司組合類似的強抗腫瘤療法,同時具有相對低的副作用。

基于這些結果,本文提供了用于通過向受試者施用治療有效量的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽與本文所述一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)的組合而在有需要的受試者中抑制ERα陽性腫瘤生長或使其消退的方法。

在某些實施方案中,除了抑制腫瘤生長(包括例如抑制癌細胞增殖或抑制ERα活性(例如,通過抑制雌二醇結合或通過下調ERα))之外,施用RAD1901或其鹽或其溶劑化物(例如水合物)還具有另外的治療益處。在某些實施方案中,該方法對肌肉、骨、乳房和子宮不產生負面影響。

在某些實施方案中,RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽調節和/或降解ERα和突變型ERα。

在本文提供的腫瘤生長抑制或腫瘤消退方法的某些實施方案中,提供了通過向受試者施用治療有效量的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽與本文所述一種或多種第二治療劑的組合而在有需要的受試者中抑制ERα陽性腫瘤生長或使其消退的方法。在這些實施方案的某些實施方案中,它的鹽是具有以下結構的RAD1901二鹽酸鹽:

第二治療劑

用于本文提供方法中的第二種治療劑可以是化療劑或AKT抑制劑、雄激素受體、血管生成抑制劑、芳香化酶、極光激酶A、BCL2、EGFR、雌激素途徑、雌激素信號途徑、雌激素受體、HER2、HER3、熱休克蛋白90(Hsp90)、Hedgehog(Hh)信號傳導途徑、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)、KIT途徑、mTOR(例如TORC1和/或TORC2)、微管、MYC、核苷代謝、PARP、泛PI3K、PI3K、蛋白激酶CK2、RAS途徑、類固醇硫酸酯酶(STS)、TK、Top2A、酪氨酸激酶、VEGF受體酪氨酸激酶或其任意組合。第二治療劑也可以是抗體,例如抗TGF β抗體、抗1型胰島素樣生長因子受體抗體、抗TROP-2抗原抗體、抗HER3抗體、抗PD1抗體或其藥物綴合物。

第二治療劑的進一步實例包括但不限于乙酸阿比特龍、ADI-PEG 20、ado-trastuzumab emtansine、阿法替尼、alisertib、阿那曲唑、紫杉醇和紫杉醇衍生物(例如ANG1005、紫杉醇聚合物膠束)、ARN-810、阿扎胞苷、AZD2014、AZD5363、貝伐單抗、BP-C1、buparlisib(BKM120)、BYL719、卡培他濱、卡鉑、馬來酸西地替尼、西妥昔單抗、順鉑/AC4-CDDP4、CR1447、CX-4945、達沙替尼、denosumab、多西他賽、多柔比星、恩尿嘧啶、entinostat、恩雜魯胺、表柔比星、艾日布林、依西美坦、依維莫司、氟尿嘧啶、氟維司群、fresolimumab、ganetespib、ganitumab、GDC-0032、GDC-0941、吉西他濱、glembatumumab Vedotin、GnRH激動劑(例如醋酸戈舍瑞林)、GRN1005、GSK 2141795、伊班膦酸鹽、IMMU-132、依立替康、irosustat、埃博霉素(例如伊沙匹隆)、拉帕替尼、sonidegib(LDE225)、來曲唑、LGK974、LJM716、lucitanib、甲氨蝶呤、MK-2206、MK-3475、MLN0128、MM-302、來那替尼、niraparib、奧拉帕尼、抗雄激素藥(例如orteronel)、奧沙利鉑、帕唑帕尼、帕妥珠單抗、PF-05280014、PM01183、孕酮、pyrotinib、羅米地辛、魯索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、talazoparib、他莫昔芬、紫杉烷、T-DM1、telapristone(CDB-4124)、替莫唑胺、替西羅莫司、四硫鉬酸鹽、tesetaxel、TLR7激動劑、TPI 287、曲美替尼、曲妥珠單抗、TRC105、trebananib(AMG 386)、曲普瑞林、veliparib、長春氟寧、長春瑞濱、vorinostat、諾雷得和唑來膦酸,包括其溶劑化物(例如水合物)和其鹽。

在某些實施方案中,第二治療劑選自ado-trastuzumab emtansine、極光激酶A抑制劑(例如alisertib)、AI(例如阿那曲唑、依西美坦、來曲唑)、ARN-810,mTOR抑制劑(例如,依維莫司、AZD2014、BEZ235、GDC-0980、CC-223、MLN0128)、AKT抑制劑(例如AZD5363、GDC-0068、GSK2110183、GSK2141795、GSK690693、MK2206)、PI3K抑制劑(例如BKM120、BYL719、GDC-0032、GDC-0941)、選擇性組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑(例如entinostat)、GnRH激動劑(例如醋酸戈舍瑞林)、GRN1005及其與曲妥珠單抗、拉帕替尼、酪氨酸激酶抑制劑(例如,lucitanib、來那替尼)、抗雄激素藥(例如,orteronel)、帕妥珠單抗、替莫唑胺和抗體(例如,keytruda和BYM338)。

在某些實施方案中,第二治療藥劑可以為AI(例如阿那曲唑、aromasin和來曲唑)、另一種SERM(例如阿佐昔芬、屈洛昔芬、EM-652(SCH 57068)、吲哚昔酚、拉索昔芬、左美洛昔芬、米潑昔芬、雷洛昔芬、他莫昔芬和托瑞米芬)、或另一種SERD(例如氟維司群、GDC-0810(ARN-810)、GW5638/DPC974、ICI182782、RU58668、SRN-927、TAS-108(SR16234)和ZK191703),包括其溶劑化物(例如水合物)和其鹽。

第二治療劑的其他實例包括但不限于:abraxane、AMG 386、卡巴他賽、楷萊、卡培他濱、多西他賽、艾日布林、吉西他濱、赫賽汀、來那替尼、帕唑帕尼(GW786034)、rapalog(雷帕霉素及其類似物)、紫杉醇(包括類似物/替代制劑)、TDM1、temozolamide、泰立沙、veliparib(ABT-888)和長春瑞濱,包括其溶劑化物(例如水合物)和其鹽。

第二治療劑靶向PI3K/AKT/mTOR途徑

在一些實施方案中,第二治療劑靶向PI3K/AKT/mTOR途徑,并且可以是mTOR抑制劑、mTOR雙重抑制劑、PI3K/mTOR抑制劑。在一些實施方案中,第二治療劑是雷帕霉素衍生物(aka rapalog),例如雷帕霉素(西羅莫司或雷帕鳴,Pfizer)、依維莫司(Afinitor或RAD001,Novartis)、ridaforolimus(AP23573或MK-8669,Merck和ARIAD Pharmaceuticals)、替西羅莫司(Torisel或CCI779,Pfizer),包括其溶劑化物(例如水合物)和其鹽。在一些實施方案中,第二治療劑是抑制mTORC1和mTORC2兩者的mTOR雙重抑制劑,例如MLN0128(去勢抵抗性前列腺癌(CRPC),斯隆-凱特林紀念癌癥中心)、CC115和CC223(Celgene)、OSI-027(OSI Pharmaceuticals)、以及AZD8055和AZD2014(AstraZeneca),包括其溶劑化物(例如水合物)和其鹽。在一些實施方案中,第二治療劑是PI3K/mTOR抑制劑,例如GDC-0980、SAR245409(XL765)、LY3023414(Eli Lilly)、NVP-BEZ235(Novartis)、NVP-BGT226(Novartis)、SF1126、和PKI-587(Pfizer),包括其溶劑化物(例如水合物)和其鹽。

在某些實施方案中,上文公開的多于一種的第二治療劑可以與RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽一起使用。例如,mTOR抑制劑可以與另一種mTOR抑制劑或與PI3K/mTOR抑制劑一起使用。而且,本領域已知,可以將包括mTOR抑制劑、mTOR雙重抑制劑和PI3K/mTOR抑制劑在內的上述第二治療劑與其它活性劑一起施用,以增強治療效果。例如,可以將mTOR抑制劑與JAK2抑制劑(Bogani等,PLOS One,8(1):e54826(2013))、化學治療劑(Yardley,Breast Cancer(Auckl)7:7-22(2013))、或內分泌療法(例如他莫昔芬或依西美坦(Vinayak等,“mTOR inhibitors in the treatment of breast cancer,”Oncology,published January 15,2013(http://www.cancernetwork.com/breast-cancer/mtor-inhibitors-treatment-breast-cancer))組合使用。相應地,第二治療劑也包括這些輔助活性劑。

組合療法

RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽與一種或多種第二治療劑的組合

當單獨施用于受試者時,RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)對一種或多種癌癥或腫瘤具有治療效果(實施例I(A)和I(B))。出乎意料地,已經發現,當組合施用于受試者時,RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)對癌癥/腫瘤具有顯著的改善效果(實施例I(A)和I(B))。

如本文所用的ERα陽性腫瘤的“抑制生長”可以指減慢腫瘤生長的速度、或完全停止腫瘤生長。

如本文所用的,ERα陽性腫瘤“腫瘤消退”或“消退”可指減小腫瘤的最大尺寸。在某些實施方案中,施用本文所述一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)(例如,ribociclib、abemaciclib和依維莫司)與RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽的組合可導致腫瘤尺寸相對于基準(即開始治療之前的尺寸)減小或甚至根除或部分根除腫瘤。相應地,在某些實施方案中,本文提供的腫瘤消退方法可以替代地表征為相對于基準減小腫瘤尺寸的方法。

如本文所用的,“腫瘤”是惡性腫瘤,并且可與“癌癥”互換使用。

腫瘤生長抑制或消退可以定位于具體組織或器官內的單個腫瘤或一組腫瘤,或者可以是全身性的(即,影響所有組織或器官中的腫瘤)。

由于已知RAD1901優先結合ERα而不是雌激素受體β(ERβ),所以除非另有說明,雌激素受體、雌激素受體α、ERα、ER、野生型ERα和ESR1在本文中可互換使用。如本文所用的“雌激素受體α”或“ERα”是指包含由基因ESR1編碼的野生型ERα氨基酸序列的多肽、由通過基因ESR1編碼的野生型ERα氨基酸序列組成的多肽或基本上由通過基因ESR1編碼的野生型ERα氨基酸序列組成的多肽。如本文所用的“雌激素受體α陽性”、“ERα陽性”、“ER+”或“ERα+”的腫瘤是指其中一種或多種細胞表達至少一種ERα同種型的腫瘤。在某些實施方案中,這些細胞過度表達ERα。在某些實施方案中,患者具有在腫瘤內的表達一種或多種形式雌激素受體β的一種或多種細胞。在某些實施方案中,ERα陽性腫瘤和/或癌癥與乳腺癌、子宮癌、卵巢癌或垂體癌相關。在這些實施方案中的某些實施方案中,患者具有位于乳房、子宮、卵巢或垂體組織中的腫瘤。在患者具有位于乳房中的腫瘤的那些實施方案中,腫瘤可能與對HER2可能呈陽性或可能不呈陽性的管腔乳腺癌相關,并且對于HER2+腫瘤,腫瘤可能表達高HER2或低HER2(例如圖1)。在其他實施方案中,患者具有位于另一組織或器官(例如,骨、肌肉、大腦)中的腫瘤,但仍然與乳腺癌、子宮癌、卵巢癌或垂體癌相關(例如源自乳腺癌、子宮癌、卵巢癌或垂體癌的遷移或轉移的腫瘤)。相應地,在本文提供的腫瘤生長抑制或消退方法的某些實施方案中,被靶向腫瘤是轉移性腫瘤和/或腫瘤在其他器官(例如骨和/或肌肉)中具有ER過度表達。在某些實施方案中,被靶向腫瘤是大腦腫瘤和/或癌癥。在某些實施方案中,被靶向腫瘤對RAD1901和本文公開的第二治療劑的治療比用以下進行的治療更為敏感:另一種SERD(例如氟維司群、TAS-108(SR16234)、ZK191703、RU58668、GDC-0810(ARN-810)、GW5638/DPC974、SRN-927、ICI182782和AZD9496)、Her2抑制劑(例如曲妥珠單抗、拉帕替尼、曲妥珠單抗艾坦素和/或培妥珠單抗)、化療(例如abraxane、阿霉素、卡鉑、環磷酰胺、柔紅霉素、doxil、ellence、氟尿嘧啶、健擇、helaven、伊沙匹隆、甲氨蝶呤、絲裂霉素、micoxantrone、去甲長春堿、紫杉酚、泰索帝、塞替派、長春新堿和希羅達)、芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑、依西美坦和來曲唑)、選擇性雌激素受體調節劑(例如他莫昔芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、和/或托瑞米芬)、血管生成抑制劑(例如貝伐單抗)、和/或利妥昔單抗。

在本文提供的腫瘤生長抑制或消退方法的某些實施方案中,所述方法還包括在施用RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)的組合之前確定患者是否具有表達ERα的腫瘤的步驟。在本文提供的腫瘤生長抑制或消退方法的某些實施方案中,所述方法還包括在施用RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)的組合之前確定患者是否具有表達突變型ERα的腫瘤的步驟。在本文提供的腫瘤生長抑制或消退方法的某些實施方案中,所述方法還包括在施用RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)的組合之前確定患者是否具有對氟維司群治療具有反應或沒有反應的、表達ERα的腫瘤的步驟。這些確定可以利用本領域已知的任何表達檢測方法來進行,并且可以利用從受試者中取出的腫瘤或組織樣品在體外進行。

除了證明RAD1901在表達野生型ERα的腫瘤中抑制腫瘤生長的能力之外,本文提供的結果還顯示RAD1901表現出出乎意料的、抑制表達突變形式ERα(即Y537SERα)的腫瘤生長的能力(實施例I(A))。ERα突變實施例的計算機模擬評估顯示,預計這些突變中沒有一個會影響LBD,也不會特異性阻礙RAD1901結合(實施例V(A)),例如選自以下的具有一個或多個突變體的ERα:具有Y537X突變體的ERα,其中X是S、N或C;具有D538G突變體的ERα;和具有S463P突變體的ERα。基于這些結果,本文提供了通過對受試者施用治療有效量的一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)和RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽的組合來抑制患癌受試者中的腫瘤生長或導致其消退的方法,所述腫瘤對在配體結合結構域(LBD)內具有一個或多個突變體的ERα呈陽性,所述突變體選自Y537X1,其中X1是S、N或C;D538G;L536X2,其中X2是R或Q;P535H;V534E;S463P;V392I;E380Q;特別是Y537SERα。本文所用的“突變型ERα”是指包含一個或多個替換或缺失的ERα和其變體,其包含與ERα的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少99.5%同一性的氨基酸序列,或由所述氨基酸序列構成,或基本上由所述氨基酸序列構成。

除了在動物異種移植模型中抑制乳腺癌腫瘤生長之外,本文公開的結果還顯示RAD1901在腫瘤細胞內表現出明顯的積累,并且能夠穿透血腦屏障(實施例II)。通過顯示RAD1901施用明顯延長大腦轉移異種移植模型中的存活證實了穿透血腦屏障的能力(實施例I(B))。相應地,在本文提供的腫瘤生長抑制或消退方法的某些實施方案中,被靶向ERα陽性腫瘤位于大腦中或中樞神經系統的其他地方。在這些實施方案中的某些實施方案中,ERα陽性腫瘤主要與腦癌相關。在其他實施方案中,ERα陽性腫瘤是主要與另一類型的癌癥(例如乳腺癌、子宮癌、卵巢癌或垂體癌)或已從另一組織或器官轉移的腫瘤相關的轉移性腫瘤。在這些實施方案中的某些實施方案中,腫瘤是腦轉移,例如乳腺癌腦轉移(BCBM)。在本文公開方法的某些實施方案中,RAD1901或其鹽或其溶劑化物累積在標靶腫瘤內的一個或多個細胞中。

在本文公開方法的某些實施方案中,RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽優選以約15或更高、約18或更高、約19或更高、約20或更高、約25或更高、約28或更高、約30或更高、約33或更高、約35或更高、或約40或更高的T/P(腫瘤中的RAD1901濃度/血漿中的RAD1901濃度)比累積在腫瘤中。

本文提供的結果顯示,RAD1901施用防止了卵巢切除大鼠中的骨質流失(實施例IV(A))。相應地,在本文提供的腫瘤生長抑制或消退方法的某些實施方案中,施用一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)和RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽的組合對骨沒有不良作用,包括例如對經治療受試者的骨體積密度、骨表面密度、骨礦物質密度、骨小梁數目、骨小梁厚度、骨小梁間距、連接密度和/或表觀骨密度的不良影響。他莫昔芬可能與絕經前婦女的骨質流失有關,氟維司群可能由于其作用機制而損害骨結構。一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)和RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽的組合可特別用于絕經前女性、對他莫昔芬或抗雌激素療法具有耐藥性的腫瘤、和具有骨質疏松癥和/或具有高骨質疏松癥風險的患者。

本文提供的結果顯示,RAD1901拈抗卵巢切除大鼠中雌二醇對子宮組織的刺激(實施例IV(A))。此外,以200mg或高達500mg(每日一次)的劑量利用RAD1901治療的人受試者中,未顯著表達ER的子宮、肌肉和骨組織的標準攝取值(SUV)顯示在治療前和治療后幾乎沒有任何信號改變(實施例III(A))。相應地,在某些實施方案中,這樣的施用也不會對其他組織(包括例如子宮、肌肉或乳房組織)造成不良影響。

將RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)組合施用至有需要的受試者。短語“組合”是指在施用第二治療劑(例如依維莫司)之前、期間或之后施用RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽。例如,可以按以下時間施用RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司):間隔約一周、間隔約6天、間隔約5天、間隔約4天、間隔約3天、間隔約2天、間隔約24小時、間隔約23小時、間隔約22小時、間隔約21小時、間隔約20小時、間隔約19小時、間隔約18小時、間約17小時、間隔約16小時、間隔約15小時、間隔約14小時、間隔約13小時、間隔約12小時、間隔約11小時、間隔約10小時、間隔約9小時、間隔約8小時、間約7小時、間隔約6小時、間隔約5小時、間隔約4小時、間隔約3小時、間隔約2小時、間隔約1小時、間隔約55分鐘、間隔約50分鐘、間隔約45分鐘、間隔約40分鐘、間隔約35分鐘、間隔約30分鐘、間隔約25分鐘、間隔約20分鐘、間隔約15分鐘、間隔約10分鐘或間隔約5分鐘。在其它實施方案中,將RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)同時或基本上同時施用至受試者。在這些實施方案的某些實施方案中,可以作為單一制劑的一部分來施用RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)。

在一些實施方案中,將RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和單一第二治療劑(例如依維莫司)的組合施用至受試者。在其他實施方案中,將RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和多于一種的第二治療劑(例如依維莫司)的組合施用至受試者。例如,可以將RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽與兩種或多種第二治療劑(例如依維莫司)組合用于治療癌癥/腫瘤。

(2)劑量

用于本文公開方法的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)的組合的治療有效量為如下量:當在特定時間間隔內施用時,所述量導致實現一個或多個治療基準(例如,減緩或停止腫瘤生長、導致腫瘤消退、癥狀停止等)。可以將用于本文公開的方法的組合按一次或多次施用至對象。在其中按多次施用化合物的那些實施方案中,可以以設定的間隔(例如每天、每隔一天、每周或每月)來施用化合物。或者,可以以不規則的間隔來施用化合物,例如基于癥狀、患者健康等根據需要施用。可以按每天一次施用治療有效量的組合1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少10天、或至少15天。任選地,在治療期間或之后,監測癌癥的狀態或腫瘤的消退,例如通過受試者的FES-PET掃描來監測。可以根據所檢測的癌癥狀態或腫瘤消退來增加或減少施用至受試者的組合的劑量。

理想地,治療有效量不超過最大耐受劑量,即50%或更多的接受治療的受試者經歷惡心或其它毒性反應(其阻止進一步的藥物施用)的劑量。受試者的治療有效量可以根據多種因素變化,所述多種因素包括受試者的癥狀種類和程度、性別、年齡、體重或一般健康、給藥方式和鹽或溶劑化物類型、對藥物的敏感性變化、具體的疾病類型等。

用于本文公開方法中的治療有效量的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽的實例包括但不限于:對于具有耐藥性ER引起的腫瘤或癌癥的受試者而言為約150至約1500mg、約200至約1500mg、約250至約1500mg或約300至約1500mg日劑量;對于同時具有野生型ER引起的腫瘤和/或癌癥和耐藥性腫瘤和/或癌癥的受試者而言為約150至約1500mg、約200至約1000mg或約250至約1000mg或約300至約1000mg日劑量;以及對于具有主要野生型ER引起的腫瘤和/或癌癥的受試者而言為約300至約500mg、約300至約550mg、約300至約600mg、約250至約500mg、約250至約550mg、約250至約600mg、約200至約500mg、約200至約550mg、約200至約600mg、約150至約500mg、約150至約550mg或約150至約600mg日劑量。

第二治療劑(例如依維莫司)的治療有效量或劑量取決于其具體類型。通常,第二治療劑(例如依維莫司)的日劑量的范圍為約1mg至約1500mg、約1mg至約1200mg、約1mg至約1000mg、約1mg至約800mg、約1mg至約600mg、約1mg至約500mg、約1mg至約200mg、約1mg至約100mg、約1mg至約50mg、約1mg至約30mg、約1mg至約20mg、約1mg至約10mg、約1mg至約5mg、約50mg至約1500mg、約100mg至約1200mg、約150mg至約1000mg、約200mg至約800mg、約300mg至約600mg、約350mg至約500mg。第二治療劑(例如依維莫司)的日劑量可以為約1至約100mg/kg、約1至約75mg/kg、約1至約50mg/kg、約1至約45mg/kg、約1至約40mg/kg、約1至約30mg/kg、約1至約20mg/kg、約1至約10mg/kg、約2至約100mg/kg、約2至約75mg/kg、約2至約50mg/kg、約2至約45mg/kg、約2至約40mg/kg、約2至約30mg/kg、約2至約20mg/kg、約2至約10mg/kg、約2.5至約100mg/kg、約2.5至約75mg/kg、約2.5至約50mg/kg、約2.5至約45mg/kg、約2.5至約40mg/kg、約2.5至約30mg/kg、約2.5至約20mg/kg、或約2.5至約10mg/kg。

在某些實施方案中,治療有效量的組合可以利用治療有效量的單獨施用的任一種化合物。在其他實施方案中,由于組合實現了顯著改善的協同治療效果,所以在組合中施用的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)的治療有效量可以小于單獨施用時所需的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)的治療有效量;并且可以以低于分開給藥時通常施用的劑量低的劑量施用一種或兩種化合物。不受任何特定理論限制,通過降低RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)中的至少一種或全部的劑量,組合療法顯著改善了效果,從而消除或減輕不期望的毒性副作用。

在一些實施方案中,當作為組合的一部分施用時,RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽的治療有效量為單獨施用時RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽的治療有效量的約30%至約200%、約40%至約200%、約50%至約200%、約60%至約200%、約70%至約200%、約80%至約200%、約90%至約200%、約100%至約200%、30%至約150%、約40%至約150%、約50%至約150%、約60%至約150%、約70%至約150%、約80%至約150%、約90%至約150%、約100%至約150%、約30%至約120%、約40%至約120%、約50%至約120%、約60%至約120%、約70%至約120%、約80約120%、約90%至約120%、約100%至約120%、30%至約110%、約40%至約110%、約50%至約110%、約60%至約110%、約70%至約110%、約80%至約110%、約90%至約110%、或約100%至約110%。在一些實施方案中,當作為組合的一部分施用時,第二治療劑(例如依維莫司)的治療有效量為單獨施用時第二治療劑(例如依維莫司)的治療有效量的約30%至約200%、約40%至約200%、約50%至約200%、約60%至約200%、約70%至約200%、約80%至約200%、約90%至約200%、約100%至約200%、約30%至約150%、約40%至約150%、約50%至約150%、約60%至約150%、約70%至約150%、約80%至約150%、約90%至約150%、約100%至約150%、約30%至約120%、約40%至約120%、約50%至約120%、約60%至約120%、約70%至約120%、約80%至約120%、約90%至約120%、約100%至約120%、30%至約110%、約40%至約110%、約50%至約110%、約60%至約110%、約70%至約110%、約80%至約110%、約90%至約110%、或約100%至約110%。

在某些實施方案中,癌癥或腫瘤是耐藥性ER-引起的癌癥或腫瘤(例如具有突變型ER結合結構域(例如包含一個或多個突變的ERα,所述一個或多個突變包括但不限于Y537X1,其中X1是S、N或C;D538G;L536X2,其中X2是R或Q;P535H;V534E;S463P;V392I;E380Q及其組合),ER或腫瘤和/或癌癥增殖的過表達體變成配體非依賴性的,或者在利用以下治療的情況下出現進展的腫瘤和/癌癥:SERD(例如氟維司群,TAS-108(SR16234)、ZK191703、RU58668、GDC-0810(ARN-810)、GW5638/DPC974、SRN-927、ICI182782和AZD9496)、Her2抑制劑(例如曲妥珠單抗、拉帕替尼、曲妥珠單抗艾坦素、和/或培妥珠單抗)、化療(例如abraxane、阿霉素、卡鉑、環磷酰胺、柔紅霉素、doxil、ellence、氟尿嘧啶、健擇、helaven、伊沙匹隆、甲氨蝶呤、絲裂霉素、micoxantrone、去甲長春堿、紫杉酚、泰索帝、塞替派、長春新堿和希羅達)、芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑、依西美坦和來曲唑)、選擇性雌激素受體調節劑(例如他莫昔芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、和/或托瑞米芬)、血管生成抑制劑(例如貝伐單抗)、和/或利妥昔單抗。

在某些實施方案中,通常用于成人受試者的本公開方法的、與本文所述第二治療劑(例如依維莫司)(例如,ribociclib、abemaciclib和依維莫司)組合的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽的劑量可以為約30μg至2000mg、100μg至1500mg、或150mg至1500mg(口服,每日一次)。可以通過單次施用或多次施用來實現該日劑量。

可以將一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)和RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽的組合按一次或多次施用于受試者。在其中按多次施用化合物的那些實施方案中,可以以設定的間隔(例如每天、每隔一天、每周或每月)施用所述化合物。或者,可以以不規則的間隔施用化合物,例如基于癥狀、患者健康等根據需要施用。

(3)制劑

在一些實施方案中,以分開的制劑施用RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)。在這些實施方案中的某些實施方案中,制劑可以是相同類型的制劑。例如,可以將兩種制劑都設計用于口服施用(例如,通過兩種分開的丸劑)或用于注射(例如,通過兩種分開的可注射制劑)。在其他實施方案中,可以將RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)配制成不同類型的制劑。例如,一種化合物可以在設計用于口服給藥的制劑中,而另一種化合物在設計用于注射的制劑中。

在其他實施方案中,作為單一制劑的一部分施用RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)。例如,將RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)配制成用于口服施用的單一丸劑或單一注射劑。在某些實施方案中,本文提供了包含RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)的組合制劑。在某些實施方案中,以單一制劑施用化合物改善了患者的依從性。

當以組合形式施用時,每種化合物的治療有效量可以低于單獨施用每種化合物的治療有效量。

在一些實施方案中,包含RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽、一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)、或RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)兩者的制劑可以進一步包含一種或多種藥物賦形劑、載體、佐劑和/或防腐劑。

可以將用于本公開方法中的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)配制成單位劑型,即適合作為經受治療的受試者的單位劑量的物理分離單位,其中每個單位包含經計算可產生期望治療效果的預定量活性物質,其任選地與合適的藥物載體結合。單位劑型可以用于單個日劑、或多個日劑中的一劑(例如,每天約1至4次或更多次)。當使用多個日劑時,對于每一劑,單位劑型可以相同或不同。在某些實施方案中,可以將化合物配制成受控釋放。

可以根據任何可用的常規方法配制用于本公開方法的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和第二治療劑(例如依維莫司)。優選劑型的實例包括片劑、粉劑、微粒劑、顆粒劑、包衣片劑、膠囊劑、糖漿劑、錠劑、吸入劑、栓劑、注射劑、軟膏劑、眼用軟膏劑、眼滴劑、滴鼻劑、滴耳劑、巴布膏劑、洗劑等。在制劑中,可以施用通常使用的添加劑,例如稀釋劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、調味劑,以及必要情況下的穩定劑、乳化劑、吸收促進劑、表面活性劑、pH調節劑、防腐劑、抗氧化劑等。另外,根據常規方法,還通過組合通常用作藥物制劑原料的組合物來進行制劑。這些組合物的實例包括例如:(1)油,例如大豆油、牛油和合成甘油酯;(2)烴,例如液體石蠟、角鯊烷和固體石蠟;(3)酯油,例如辛基十二烷基肉豆蔻酸和異丙基肉豆蔻酸;(4)高級醇,例如鯨蠟硬脂醇和山崳醇;(5)硅樹脂;(6)硅油;(7)表面活性劑,例如聚氧乙烯脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、固體聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物;(8)水溶性高分子,例如羥乙基纖維素、聚丙烯酸、羧基乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和甲基纖維素;(9)低級醇,例如乙醇和異丙醇;(10)多元醇,例如甘油、丙二醇、二丙二醇和山梨糖醇;(11)糖,例如葡萄糖和蔗糖;(12)無機粉末,例如無水硅酸、硅酸鋁鎂和硅酸鋁;(13)純化水等。用于上述制劑的添加劑可包括例如:1)作為稀釋劑的乳糖、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、結晶纖維素和二氧化硅;2)作為粘合劑的聚乙烯基醇、聚乙烯基醚、甲基纖維素、乙基纖維素、阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、蟲膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙二醇-聚氧乙烯嵌段共聚物、葡甲胺、檸檬酸鈣、糊精、果膠等;3)作為崩解劑的淀粉、瓊脂、明膠粉、結晶纖維素、碳酸鈣、碳酸氫鈉、檸檬酸鈣、糊精、果膠、羧甲基纖維素/鈣等;4)作為潤滑劑的硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇、二氧化硅、濃縮植物油等;5)可接受其添加在藥學上可接受的任何著色劑作為著色劑;6)作為調味劑的可可粉、薄荷醇、芳香劑、薄荷油、肉桂粉;7)其添加在藥學上可接受的抗氧化劑,例如抗壞血酸或α-苯酚。

可以將用于本公開方法的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)作為本文所述的任一種或多種活性化合物和生理上可接受的載體(也稱為藥學上可接受的載體或溶液或稀釋劑)配制成藥物組合物。這樣的載體和溶液包括在本發明方法中使用的化合物的藥學上可接受的鹽和溶劑化物,以及包含兩種或更多種這樣的化合物、所述化合物的藥學上可接受的鹽和所述化合物的藥學上可接受的溶劑化物的混合物。根據可接受的藥學方法制備這樣的組合物,例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版.Alfonso R.Gennaro,Mack Publishing Company,Eaton,Pa.(1990))中描述的,其通過引用并入本文。

術語“藥學上可接受的載體”是指在其施用的患者中不引起過敏反應或其它不良反應并且與制劑中的其他成分相容的載體。藥學上可接受的載體包括例如根據預期給藥形式合適地選擇并符合常規藥學實踐的藥學稀釋劑、賦形劑或載體。例如,固體載體/稀釋劑包括但不限于樹膠、淀粉(例如玉米淀粉、預膠化淀粉)、糖(例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖、右旋糖)、纖維素材料(例如,微晶纖維素)、丙烯酸酯(例如聚丙烯酸甲酯)、碳酸鈣、氧化鎂、滑石或其混合物。藥學上可接受的載體可進一步包含少量的輔助物質,例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑,其提高治療劑的保質期或有效性。

可以通過常規方法將游離形式的一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)和RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽轉化成鹽。本文使用的術語“鹽”不受限制,只要該鹽是利用RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽形成并且在藥學上可接受即可;鹽的優選實例包括氫鹵酸鹽(例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽等)、無機酸鹽(例如硫酸鹽、硝酸鹽、高氯酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽等)、有機羧酸鹽(例如乙酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、檸檬酸鹽等)、有機磺酸鹽(例如甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、樟腦磺酸鹽等)、氨基酸鹽(例如天冬氨酸鹽、谷氨酸鹽等)、季銨鹽、堿金屬鹽(例如鈉鹽、鉀鹽等)、堿土金屬鹽(鎂鹽、鈣鹽等)等。另外,優選鹽酸鹽、硫酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽等作為根據本發明的化合物的“藥學上可接受的鹽”。

可以使用通用分離手段將RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和/或第二治療劑(例如依維莫司)的異構體(例如幾何異構體、旋光異構體、旋轉異構體、互變異構體等)純化成單一異構體,所述分離手段包括例如重結晶、旋光拆分如非對映異構鹽法、酶分級分離法、各種色譜法(例如,薄層色譜法、柱色譜法、玻璃色譜法等)。本文的術語“單一異構體”不僅包括純度為100%的異構體,而且還包括包含除目標之外的、甚至通過常規純化操作也仍然存在的異構體。對于RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和/或第二治療劑(例如依維莫司),有時存在晶體多晶型物,并且其所有的晶體多晶型物都包括在本發明中。晶體多晶型物有時是單一的,有時是混合物,兩者均包括在本文中。

在某些實施方案中,RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和/或第二治療劑(例如依維莫司)可以為前藥形式,這意味著其必須經歷一些改變(例如氧化或水解)來實現其活性形式。或者,RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和/或第二治療劑(例如依維莫司)可以是通過將親本前藥改變為其活性形式而產生的化合物。

(4)施用途徑

本文公開的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和/或第二治療劑(例如依維莫司)的施用途徑包括但不限于局部施用、口服施用、皮內施用、肌內施用、腹膜內施用、靜脈內施用、膀胱內灌注、皮下施用、透皮施用和透粘膜施用。

(5)基因分析

在某些實施方案中,本文提供的腫瘤生長抑制方法還包括對受試者進行基因分析,其中待分析的基因是選自以下的一種或多種基因:ABL1、AKT1、AKT2、ALK、APC、AR、ARID1A、ASXL1、ATM、AURKA、BAP、BAP1、BCL2L11、BCR、BRAF、BRCA1、BRCA2、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDH1、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CEBPA、CTNNB1、DDR2、DNMT3A、E2F3、EGFR、EML4、EPHB2、ERBB2、ERBB3、ESR1、EWSR1、FBXW7、FGF4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、FRS2、HIF1A、HRAS、IDH1、IDH2、IGF1R、JAK2、KDM6A、KDR、KIF5B、KIT、KRAS、LRP1B、MAP2K1、MAP2K4、MCL1、MDM2、MDM4、MET、MGMT、MLL、MPL、MSH6、MTOR、MYC、NF1、NF2、NKX2-1、NOTCH1、NPM、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PIK3R1、PML、PTEN、PTPRD、RARA、RB1、RET、RICTOR、ROS1、RPTOR、RUNX1、SMAD4、SMARCA4、SOX2、STK11、TET2、TP53、TSC1、TSC2、和VHL。

在一些實施方案中,第二劑是依維莫司,并且受試者存在TSC1中的體細胞突變。

在一些實施方案中,本發明提供了如下方法:治療乳腺癌患者亞群,其中所述亞群具有增加的一個或多個以下基因的表達;并且根據本公開內容中描述的給藥實施方案利用有效劑量的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)的組合治療所述亞群。

(6)劑量調整

除了確定RAD1901抑制腫瘤生長的能力之外,本文提供的結果顯示,RAD1901抑制雌二醇與子宮和垂體中的ER結合(實施例III(A))。在這些實驗中,通過FES-PET成像來評估雌二醇與子宮和垂體組織中的ER結合。在利用RAD1901治療后,所觀察到的ER結合水平處于背景水平或低于背景水平。這些結果證實,可以通過實時掃描來評估RAD1901對ER活性的拈抗作用。基于這些結果,本文提供了用于通過測量一種或多種標靶組織中的雌二醇-ER結合來監測本文公開的組合療法中的RAD1901或其溶劑化物或其鹽治療功效的方法,其中結合減少或消失表明產生了功效。

還提供了基于雌二醇-ER結合來調整RAD1901或其溶劑化物或其鹽在組合中的劑量的方法。在這些方法的某些實施方案中,在一次或多次施用第一劑量的化合物之后的某個時間點時對結合進行測量。如果雌二醇-ER結合不受影響或表現出低于預定閾值的降低(例如,相比基線水平,結合降低小于5%、小于10%、小于20%、小于30%或小于50%),則認為第一劑量過低。在某些實施方案中,這些方法包括施用增加的第二劑量化合物的額外步驟。可以重復這些步驟,反復增加劑量,直到實現期望的雌二醇-ER結合降低。在某些實施方案中,可以將這些步驟并入本文提供的抑制腫瘤生長的方法中。在這些方法中,可以將雌二醇-ER結合作為腫瘤生長抑制的替代指標,或評估生長抑制的補充手段。在其他實施方案中,可以將這些方法與RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽的施用結合使用,以用于除了抑制腫瘤生長之外的目的,包括例如抑制癌細胞增殖。

在某些實施方案中,本文提供的用于調整組合療法中RAD1901或其鹽或其溶劑化物(例如,水合物)的劑量的方法包括:

(1)施用第一劑量的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽(例如,約350至約500mg,或約200至約600mg/天)3、4、5、6或7天;

(2)例如使用本文公開的FES-PET成像來檢測雌二醇-ER結合活性;其中:

(i)如果ER結合活性不可檢測或低于預定閾值水平,則繼續施用第一劑量(即維持劑量水平);或者

(ii)如果ER結合活性是可檢測的或高于預定閾值水平,則施用比第一劑量更大的第二劑量(例如,第一劑量加上約50至約200mg)3、4、5、6或7天,然后進行步驟(3);

(3)例如使用本文公開的FES-PET成像檢測雌二醇-ER結合活性;其中,

(i)如果ER結合活性不可檢測或低于預定的閾值水平,則繼續施用第二劑量(即維持劑量水平);或者

(ii)如果ER結合活性是可檢測的或高于預定閾值水平,則施用大于第二劑量的第三劑量(例如,第二劑量加上約50至約200mg)3、4、5、6或7天,然后進行步驟(4);

(4)通過第四劑量、第五劑量等重復上述步驟,直到檢測不到ER結合活性。

在某些實施方案中,本發明包括使用PET成像來檢測ER敏感性或ER耐藥性癌癥和/或對其給藥。

(7)用于本文公開方法的組合

本發明的另一個方面涉及用于本文所闡述的組合方法的藥物組合物,其包含如本文公開的治療有效量的RAD1901或其溶劑化物(例如水合物)或其鹽和/或第二治療劑(例如依維莫司)。

RAD1901-ERα相互作用

(1)來自接受至少一線內分泌治療的患者的ER陽性乳房腫瘤樣品中的突變型ERα

在過去兩年中報道的五項研究中,對來自接受至少一線內分泌治療的患者的總計187個轉移性ER陽性乳房腫瘤樣品進行測序,并且在39名患者(21%)中鑒別出ER LBD突變(Jeselsohn)。在39名患者中,最頻繁的6種LBD突變在方案1(改編自Jeselsohn)中示出。

方案1:ERα的示例性突變的位置及其頻率

所有LBD突變的頻率匯總于表9中。

計算機建模顯示,RAD1901-ERα相互作用不太可能受ERα的LBD突變體影響,所述突變體例如為Y537X突變體,其中X是S、N或C;D538G;和S463P,其占對接受至少一線內分泌治療的患者的轉移性ER陽性乳房腫瘤樣品的最新研究中發現的LBD突變的約81.7%(表10,實施例V)。

本文提供了結合ERα和/或突變型ERα的RAD1901的復合物和晶體,所述突變型ERa包括一個或多個突變,其包括但不限于Y537X1,其中X1是S、N或C;D538G;L536X2,其中X2是R或Q;P535H;V534E;S463P;V392I;E380Q及其組合。

在本文提供的方法的某些實施方案中,ERα和突變型ERα的LBD包含AF-2。在其他實施方案中,LBD包含ERα的氨基酸299-554,由ERα的氨基酸299-554組成,或基本上由ERα的氨基酸299-554組成。在某些實施方案中,突變型ERα的LBD包括一個或多個突變,其包括但不限于Y537X1,其中X1是S、N或C;D538G;L536X2,其中X2是R或Q;P535H;V534E;S463P;V392I;E380Q及其組合。本文使用的術語“和/或”包括“和”情形以及“或”情形。

在某些實施方案中,本文提供了在有需要的受試者中治療與ERα和/或突變型ERα活性或表達相關的病癥的方法,其包括向受試者施用一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)和能夠經由LBD與ERα和/或突變型ERα結合的一種或多種化合物。在某些實施方案中,受試者是哺乳動物,并且在這些實施方案中的某些實施方案中,受試者是人。在某些實施方案中,所述病癥是腫瘤和/或癌癥,包括但不限于如本文所公開的ER陽性腫瘤和/或癌癥。

在本文提供的化合物和方法的某些實施方案中,ERα和突變型ERα的LBD包含AF-2。在其他實施方案中,LBD包含ERα的氨基酸299-554,由ERα的氨基酸299-554組成,或基本上由ERα的氨基酸299-554組成。在某些實施方案中,突變型ERα的LBD包括一個或多個突變,其包括但不限于Y537X1,其中X1是S、N或C;D538G;L536X2,其中X2是R或Q;P535H;V534E;S463P;V392I;E380Q及其組合。

在本文提供的化合物和方法的某些實施方案中,能夠經由LBD與ERα和/或突變型ERα結合的化合物是選擇性雌激素受體降解劑(SERD)或選擇性雌激素受體調節劑(SERM)。在某些實施方案中,能夠經由LBD與ERα和/或突變型ERα結合的化合物經由選自以下的一種或多種相互作用來完成結合:與殘基E353、D351、R349和/或L536的氫鍵相互作用和與ERα和/或突變型ERα的殘基F404的π-相互作用。這種化合物的一個實例是RAD1901。

在某些實施方案中,本文提供了治療與突變型ERα的活性或表達相關的病癥的方法,所述突變型ERα包含一個或多個突變,所述一個或多個突變包括但不限于Y537X1,其中X1是S、N或C;D538G;L536X2,其中X2是R或Q;P535H;V534E;S463P;V392I;E380Q及其組合,其中所述方法包括向所述受試者施用一種或多種第二治療劑(例如,依維莫司)和能夠經由LBD結合ERα的一種或多種化合物。在某些實施方案中,所述病癥是癌癥,包括但不限于ER陽性癌癥、乳腺癌、ER陽性乳腺癌和轉移性乳腺癌,并且在某些實施方案中,所述化合物是RAD1901或其藥學上可接受的溶劑化物(例如水合物)或其藥學上可接受的鹽。

提供以下實施例以更好地舉例說明所要求保護的發明,而不應被解釋為限制本發明的范圍。就所提及的具體材料的范圍而言,這僅僅是為了說明的目的,而無意于限制本發明。本領域的技術人員可以在不發揮創造能力且不偏離本發明的范圍的情況下開發等同手段或反應物。將會理解,可以對本文描述的程序進行許多變化而仍然在本發明的范圍內。本發明人意在將這樣的變化包括在本發明的范圍內。

實施例

材料和方法

測試化合物

在以下實施例中使用的RAD1901是由IRIX Pharmaceuticals公司(Florence,SC)制造的(6R)-6-(2-(N-(4-(2-(乙基氨基)乙基)芐基)-N-乙基氨基)-4-甲氧基苯基)-5,6,7,8-四氫萘-2-醇二鹽酸鹽。RAD1901以干粉形式儲存,在去離子水中配制成0.5%(w/v)甲基纖維素的均勻懸浮液待用,并口服施用至動物模型。他莫昔芬、雷洛昔芬和雌二醇(E2)得自Sigma-Aldrich(密蘇里州圣路易斯市),并通過皮下注射施用。氟維司群得自Tocris Biosciences(明尼蘇達州明尼阿波利斯市)并通過皮下注射施用。除非另有說明,其他實驗室試劑購自Sigma-Aldrich。

細胞系

從美國典型培養物保藏中心(馬里蘭州羅克維爾市)購買MCF-7細胞(人類乳房轉移性腺癌)并以5%CO2常規保持在包含2mM L-谷氨酰胺和Earle’s BSS、0.1mM非必需氨基酸和補充有0.01mg/ml牛胰島素和10%胎牛血清(Invitrogen,加利福尼亞州卡爾斯巴德)的1mM丙酮酸鈉的無酚紅最低基本培養基(MEM)中。

在補充有10%FBS和5μg/mL人胰島素的RPMI生長基質中,將T47D細胞在5%CO2培養箱中的10cm培養皿中培養至約75%匯合。

體內異種移植模型

將所有小鼠置于單獨通風的鼠籠中的無病原體房舍(具有無菌和無塵用品)中,可隨意獲得消毒的食物和水,處于暗光周期(12-14小時的人造光晝夜節律周期)和受控室溫和濕度。每周用游標卡尺測量腫瘤兩次,并利用下式計算體積:(L×W2)×0.52。

PDx模型

來自患者的異種移植模型(PDx模型)的一些實例顯示在圖1中。由已經在動物(無胸腺裸鼠(Nu(NCF)-Foxnlnu))中連續傳代有限次數以維持腫瘤異質性的可存活人腫瘤組織或流體來建立源自患者的乳腺癌腫瘤的PDx模型。對于每個實驗,在其估計開始日期之前大約一周開始記錄研究前的腫瘤體積。當腫瘤達到適當的腫瘤體積引發(TVI)范圍(150-250mm3)時,將動物隨機分成治療組和對照組并開始給藥(第0天,每組8-10個受試者);所有研究中的動物逐個進行每個實驗。初始劑量從第0天開始;所有組的動物按重量給藥(0.01mL/g;10ml/kg)。利用溶媒(對照,口服,每日一次至終點)、他莫昔芬(1mg/受試者,皮下注射,隔日一次至終點)、氟維司群(;1mg/受試者或3mg/受試者,皮下注射,每周×5,如有必要的話延長)、或RAD1901(30、60或120mg/kg受試者,口服,每日一次至終點)按照說明從第0天開始對每個組進行治療。根據模型,治療期持續56-60天。在這些PDx模型的飲用水中補充17β-雌二醇。

藥劑功效

對于所有研究,從第0天開始,通過數字卡尺測量腫瘤尺寸,并且針對各組記錄數據,所述數據包括個體和平均估計腫瘤體積(平均TV±SEM);利用公式(Yasui等,Invasion Metastasis 17:259-269(1997),其通過引用并入本文)來計算腫瘤體積:TV=(寬度)2×(長度)×0.52。一旦評估的組平均腫瘤體積達到腫瘤體積(TV)終點(時間終點為60天;體積終點為組平均2cm3),就結束每個組或研究;從研究中取出腫瘤體積達到2cm3或更多的個體小鼠,并且將最終測量包括在組平均中,直到組平均達到體積終點或研究達到時間終點。

功效計算和統計分析

在單個時間點(當對照組達到腫瘤體積或時間終點時)計算%腫瘤生長抑制(%TGI)值,并且通過下式(Corbett TH等人,In vivo methods for screening and preclinical testing.In:Teicher B,ed.,Anticancer Drug Development Guide.Totowa,NJ:Humana.2004:99-123.)利用初始(i)和最終(f)腫瘤測量值對每個治療組(T)-對照(C)報道該%腫瘤生長抑制(%TGI)值:%TGI=1-Tf-Ti/Cf-Ci。

統計

TGI研究-單因素方差分析+Dunnett多重比較檢驗(Corbett TH等人)。

樣品采集

在終點時移除腫瘤。將一個片段快速冷凍,而將另一個片段置于10%NBF中至少24小時,并用福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)。將快速冷凍樣品儲存在-80℃;將FFPE塊在室溫下儲存。

蛋白質免疫印跡

采集細胞并利用標準做法來分析蛋白質表達。在給藥最后一天之后的指定時間點收集腫瘤,使用Tissuelyser(Qiagen)在具有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中勻漿。通過MW分離等量的蛋白質,將其轉移至硝酸纖維素膜并使用標準做法利用以下抗體進行印跡分析:

·雌激素受體(SantaCruz(HC-20);sc-543)

·孕酮受體(Cell Signaling Technologies;3153)

·紐蛋白(Sigma-Aldrich,v9131)

按以下進行qPCR分析:采集細胞,提取mRNA,將其等量用于cDNA分析以及利用孕酮受體、GREB1和TFF1(LifeTech)特異性引物進行qPCR。使用1D Quant軟件(GE)量化條帶。

免疫組化

收集腫瘤,利用福爾馬林固定并包埋入石蠟中。將包埋的腫瘤切片(6μM)并利用ER、PR和Her2特異性抗體染色。按如下進行定量:對陽性細胞(0-100%)和染色強度(0-3+)計數五個區域。利用以下公式計算H評分(0-300):%陽性×強度。

實施例I.在具有不同既往內分泌治療的情況下RAD1901-依維莫司組合增強表達WT ER或突變型ER(例如Y537S)的腫瘤和/或癌癥中的腫瘤生長抑制。

I(A).RAD1901對動物異種移植模型的有效性

I(A)(i)RAD1901在PDx模型(PDx-1至PDx-12)中抑制腫瘤生長,無論該腫瘤的ER狀態和既往內分泌療法史。

圖1顯示出對于單獨利用RAD1901治療的小鼠在幾種PDx模型中的腫瘤生長抑制作用。篩選12個源自患者的異種移植模型以測試具有不同ER、PR和Her2水平的幾種遺傳背景下的RAD1901反應。對標記有“*”的PDx模型(PDx-1至PDx-4和PDx-12)進行全功效研究,其中n=8-10。對于其他PDx模型(PDx-5至PDx-11)進行篩選研究(其中n=3),利用溶媒(陰性對照)或RAD1901以60mg/kg劑量(口服,每日一次)治療60天。如圖1所示出的,其中由ER和另外的驅動因子(例如PR+和/或Her2+)驅動生長的PDx模型獲得了RAD1901治療的益處。RAD1901有效地抑制具有ER突變和/或Her2高表達水平(PDx)的模型中的腫瘤生長,無論該腫瘤的既往治療史,即初次治療(Rx-)或利用芳香化酶抑制劑、他莫昔芬(tam)、化療(chemo)、Her2抑制劑(Her2i,例如曲妥珠單抗、拉帕替尼)、貝伐單抗、氟維司群和/或利妥昔單抗進行的治療。

I(A)(ii)RAD1901-依維莫司組合在表達WT ER的異種移植模型中相比單獨使用RAD1901引起更多的消退

I(A)(ii)(1)RAD1901-依維莫司在對氟維司群治療有反應的MCF-7異種移植物中相比單獨使用RAD1901引起更多的消退。

MCF-7異種移植模型

在細胞植入前兩天,用0.18/90天釋放的17β-雌二醇丸粒接種Balb/C-Nude小鼠。采集MCF-7細胞(PR+,Her2-),并將1×107個細胞皮下植入Balb/C-Nude小鼠的右側腋下。當腫瘤平均達到200mm3時,按腫瘤體積將小鼠隨機分成治療組,并用測試化合物進行治療。利用溶媒(對照,口服,每日一次,至終點)、氟維司群(3mg/受試者,皮下注射,每周一次,×5,如果必要的話延長)、RAD1901(30mg/kg或60mg/kg受試者,口服,每日一次,至終點)、依維莫司(2.5mg/kg,口服,每日一次,至終點)或規定劑量的RAD1901-依維莫司組合從第0天開始對每個組進行治療。治療期持續28天。

利用溶媒(陰性對照)、RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)、依維莫司(2.5mg/kg,口服)、RAD1901(30mg/kg或60mg/kg,口服,每日一次)和依維莫司(2.5mg/kg,口服)的組合、氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)、或氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)和依維莫司(2.5mg/kg,口服)的組合治療MCF7異種移植小鼠。在幾個時間點測量腫瘤尺寸,測量27天。

結果顯示在圖2A-B中。利用RAD1901(60mg/kg)和依維莫司(2.5mg/kg)的組合治療再次導致顯著的腫瘤消退,該結果優于單獨使用RAD1901、依維莫司或氟維司群、或使用氟維司群和依維莫司組合進行的治療(圖2B)。

圖2C顯示,具有30mg/kg或60mg/kg RAD1901的RAD1901-依維莫司組合提供了相似的效果,但是以30mg/kg單獨使用RAD1901在抑制腫瘤生長方面不及以60mg/kg單獨使用RAD1901有效。所述結果表明,具有較低劑量RAD1901(例如30mg/kg)的RAD1901-依維莫司組合足以使所述異種移植模型中的腫瘤生長抑制/腫瘤消退效果最大化。

與單獨使用RAD1901、依維莫司或氟維司群、或使用氟維司群和依維莫司組合進行的治療相比,利用RAD1901和依維莫司組合進行的治療在降低MCF7異種移植模型體內ER和PR表達方面也更有效(圖11);在最后一次給藥后兩個小時時采集腫瘤)。

I(A)(ii)(2)在對氟維司群治療有反應的PDx-11和PDx-2模型中,RAD1901-依維莫司比單獨使用RAD1901引起更多的腫瘤消退。

ER WT PDx模型PDx-2(PR+,Her2+,初次治療)和PDx-11(PR+,Her2+,利用AI、氟維司群和化療進行治療)對氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)表現出不同的敏感性。使用RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)和依維莫司(2.5mg/kg,口服)的組合、單獨使用RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)、單獨使用依維莫司(2.5mg/kg,口服)、或單獨使用氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)治療PDx-2和PDx-11模型。

在PDx-11模型中,單獨施用氟維司群或依維莫司顯著抑制腫瘤生長,而利用氟維司群治療的小鼠在腫瘤生長抑制方面表現出更好的效果。氟維司群治療表現出輕微的腫瘤消退(圖3B)。出乎意料地,單獨施用RAD1901或與依維莫司組合施用導致顯著的腫瘤消退,且在野生型ESR1 PDx模型中該組合實現甚至更顯著的腫瘤消退效果(圖3B)。

在PDx-2模型中,與單獨注射氟維司群相比,單獨口服施用RAD1901獲得了更好的抑制腫瘤生長的效果(圖4A)。此外,單獨施用RAD1901或依維莫司顯著抑制腫瘤生長。出乎意料地,RAD1901與依維莫司組合施用導致甚至更強的腫瘤生長抑制效果(圖4B)。

此外,在對氟維司群治療(1mg/劑,皮下注射,每周一次)有反應的PDx-4模型中,在RAD1901治療(30mg/kg,口服,每日一次)期結束之后繼續進行雌二醇治療的情況下,RAD1901介導的腫瘤生長抑制在不進行治療的情況下維持至少兩個月(圖5)。

因此,一種或多種第二治療劑與RAD1901的組合可能有益于患者在治療結束后抑制腫瘤生長,特別是當一種或多種第二治療劑(例如依維莫司)由于不良反應而可能被減少或延遲時如此。

I(A)(iii)在表達突變型ER(ERα Y537S)的異種移植模型中,RAD1901-依維莫司比單獨使用RAD1901引起更多的消退

I(A)(iii)(1)在對氟維司群治療幾乎沒有反應的PDx-5模型中,RAD1901-依維莫司比單獨使用RAD1901引起更多的消退。

按照上文針對PDx模型所述的類似方案制備PDx-5模型。用游標卡尺每周測量兩次給藥組的腫瘤尺寸,并使用公式(L×W2)×0.52計算體積。

利用本文所述方法評估RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)、依維莫司(2.5mg/kg,口服)和RAD1901(60mg/kg,口服,每日一次)與依維莫司(2.5mg/kg)的組合對突變型ER PDx-5模型(患有來源于具有Y537S雌激素受體突變、PR+、Her2+的乳腺癌腫瘤患者的PDx模型,具有芳香酶抑制劑的既往治療)的腫瘤生長抑制。對于表達某些ERα突變(例如Y537S)的腫瘤,RAD1901和依維莫司的組合治療在抑制腫瘤生長方面比單獨使用任一種藥劑進行的治療更有效(圖6B)。這些PDx模型對氟維司群(3mg/劑)治療不敏感。RAD1901和依維莫司的組合治療在RDX-5模型中引起腫瘤消退方面比單獨使用任一種藥劑進行的治療更為有效(圖6B)。

因此,結果顯示RAD1901是增強靶向藥物腫瘤生長抑制的有效內分泌骨架。此外,RAD1901在來源于已經接受多次既往內分泌治療(包括對氟維司群不敏感的那些)的患者的PDx模型中顯示出有效的抗腫瘤活性。

I(A)(iv)氟維司群治療對非荷瘤小鼠的藥代動力學評估。

向小鼠施用幾種劑量的氟維司群,其對受試者表現出顯著的劑量暴露(圖7)。

在第1天(D1Rx)和第8天(D8Rx,n=4/劑水平)時將氟維司群以1、3或5mg/劑經皮下施用至裸鼠。在第二劑之后長達168小時的時間內在指定的時間點采集血液,離心分離,并通過液相色譜-質譜分析血漿。

I(B)RAD1901在腦轉移的小鼠異種移植模型(MCF-7顱內模型)中促進存活。

使用MCF-7顱內腫瘤異種移植模型進一步評估RAD1901穿過血腦屏障并抑制腫瘤生長的潛在能力。

使用雌性無胸腺裸鼠(Cr1:NU(NCr)-Foxnlnu)用于腫瘤異種移植研究。在腫瘤細胞植入前三天,使用滅菌的套管針將雌激素丸粒(0.36mg E2,60天釋放(Innovative Research of America,弗羅里達州薩拉索塔市))經皮下植入所有測試動物的肩胛骨之間。在包含10%胎牛血清、100單位/mL青霉素G、100μg/mL硫酸鏈霉素、2mM谷氨酰胺、10mM HEPES、0.075%碳酸氫鈉和25g/mL慶大霉素的RPMI-1640培養基中將MCF-7人乳腺癌細胞培養至對數生長中期。在腫瘤細胞植入當天,用胰蛋白酶消化細胞,沉淀,并以5×107個細胞/mL的濃度重新懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中。對每只測試小鼠經顱內植入1×106個MCF-7細胞。

在腫瘤細胞植入(指定為研究的第1天)后第5天,將小鼠隨機分成三組,每組12只動物,并用載體、氟維司群(0.5mg/動物,每天一次)或RAD1901(120mg/kg,每天一次)進行治療,如上文所述的。

終點定義為對照組的死亡率或3×存活率,以先到者為準。通過體重測量和頻繁觀察治療相關不良反應的臨床征兆來評估治療耐受性。將一次測量的體重減輕超過30%的動物或三次測量的體重減輕超過25%的動物人道安樂死并歸類為治療相關死亡。可接受的毒性被定義為在研究期間組平均體重減輕小于20%,并且在10只接受治療的動物中具有不多于一個的治療相關死亡(或10%)。在研究結束時,在異氟烷麻醉下,通過終末心臟穿刺將動物安樂死。利用LC-MS/MS測定血漿和腫瘤中的RAD1901和氟維司群濃度。

Kaplan Meier存活分析表明,RAD1901相比氟維司群顯著延長存活(P<0.0001;圖8)。對照組或氟維司群組中沒有動物分別存活超過第20天和第34天,而RAD1901治療的動物中41%(5/12)存活至第54天研究結束時。

RAD1901在血漿中的濃度為738±471ng/mL,在顱內腫瘤中的濃度為462±105ng/g,其支持RAD1901能夠有效穿過血腦屏障的假設。與此相比,血漿(21±10ng/mL)和顱內腫瘤(8.3±0.8ng/g)內的氟維司群濃度明顯較低。

I(C).RAD1901治療ER+晚期乳腺癌的1期研究。

在1期研究中,在44位健康的絕經后女性中評估安全性、耐受性和藥代動力學。沒有觀察到劑量限制毒性,未確定最大耐受劑量(MTD)。在所測試的劑量范圍內,血漿暴露量隨劑量增加而成比例增加。

受試者

招募8名患有晚期乳腺癌(具有不少于1%IHC染色的ER+腫瘤、具有0或1的ECOG表現狀態的HER2-陰性腫瘤)的絕經后女性作為該1期研究的受試者。受試者必須接受以下既往治療:

·在晚期/轉移性情形中不超過2個既往化療方案

·6個月的既往內分泌治療,并且在既往內分泌治療中取得進展

·排除未經治療或有癥狀的中樞神經系統轉移或在以下時間窗內接受既往抗癌治療的患者:

·在第一劑量研究治療之前他莫西芬<14天

·在第一劑量研究治療之前氟維司群<90天

·在第一劑量研究治療之前化療<28天

·在第一劑量研究治療之前LHRH類似物<12個月

DLT標準

·不低于3非血液學毒性(排除尚未用最佳藥物治療的脫發和惡心、嘔吐或腹瀉)的任何等級

·不低于3血液學毒性的任何等級

·導致研究藥物中斷>7天的任何等級毒性

·劑量限制毒性觀察期是第1周期的第1-28天

治療緊急不良事件(TEAE)

在整個研究中記錄TEAE。初步數據匯總在表12中。“n”是在給定類別中具有至少一個治療相關AE的受試者的數目(AE根據不良事件通用標準(CTCAE)v4.0進行分級),并且經歷同一優先項目的多種情形的任何患者都只以最嚴重的等級計算一次。沒有觀察到死亡或劑量限制性毒性,未確定最大耐受劑量(MTD)。大多數AE為1或2級。最常見的治療相關AE為消化不良(5/8的患者)和惡心(3/8的患者)。觀察到兩例嚴重AE(SAE),一例是3級治療相關便秘,另一例是呼吸短促(胸腔積液),與治療無關。

該1期研究中經過嚴重預治療的受試者包括之前曾用多種內分泌和靶向藥劑(例如CDK4/6、PI3K和mTOR抑制劑)治療的受試者。在以200mg劑量(口服,每日一次)治療長達6個月和400mg劑量(口服,每日一次)治療長達2個月的RAD1901治療之后,沒有觀察到劑量限制性毒性。因此,RAD1901顯示出治療ER+晚期乳腺癌的潛力,尤其是在之前曾用內分泌和/或靶向藥劑如CDK4/6、PI3K和mTOR抑制劑治療的受試者中如此。

實施例II.RAD1901優先在腫瘤中累積并且可以遞送至腦。

使用LC-MS/MS進一步評價實施例I(A)(i)中所述的MCF-7異種移植物的血漿和腫瘤中的RAD1901濃度。在研究結束時,在60mg/kg劑量水平下,血漿中RAD1901的濃度為344±117ng/mL,腫瘤中的濃度為11,118±3801ng/mL。在其中腫瘤濃度為血漿濃度的約20-30倍的較低劑量水平下也觀察到類似的腫瘤與血漿比。接受治療40天的小鼠的血漿、腫瘤和大腦中的RAD1901水平匯總在表1中。將顯著量的RAD1901遞送到接受治療的小鼠的大腦(例如,參見B/P比(大腦中的RAD1901濃度/血漿中的RAD1901濃度)),其表明RAD1901能夠穿過血腦屏障(BBB)。出乎意料地,RAD1901優先積累在腫瘤中。參見例如表1中所示的T/P(腫瘤中的RAD1901濃度/血漿中的RAD1901濃度)比。

實施例III.RAD1901抑制ER途徑和降解ER。

Ⅲ(A).在健康的絕經后女性人類受試者中,RAD1901降低了在子宮和垂體中的ER結合。

受試者具有至少12個月的閉經持續時間和與更年期一致的血清FSH。受試者為40-75歲,其中BMI為18.0-30kg/m2。受試者有完整的子宮。排除如下受試者:具有臨床相關病理證據、中風風險增加或具有靜脈血栓事件史,或在進入臨床研究中心之前不到14天內使用伴隨用藥(允許至多3天之前使用撲熱息痛)。

在基線和暴露于RAD19016天之后進行FES-PET以評價子宮中的ER結合。在200mg(7名受試者)和500mg(6名受試者)劑量水平下,RAD1901分別占據子宮中83%和92%的ER。

在用200mg或500mg(口服,每日一次,6天)進行RAD1901治療后,FES-PET成像顯示經標記的雌二醇與子宮和垂體的結合顯著降低。

由于ER表達高,所以子宮在RAD1901治療之前的基線處顯示出強FES-PET信號(圖9A,利用200mg劑量水平治療的受試者3的子宮FES-PET掃描的基線橫向視圖;圖9B,分別為用500mg劑量水平治療的受試者7的子宮FES-PET掃描的基線矢狀位圖和橫向視圖)。然而,當在研究的第6天給藥后4小時進行掃描時,幾乎看不見子宮(處于背景FES-PET信號水平或接近背景FES-PET信號(圖9A,第6天時受試者3子宮掃描的橫向視圖;以及圖9B,分別為第6天受試者7子宮掃描的矢狀位圖和橫向視圖)。這些數據與ER降解和/或與受體結合的競爭一致。圖9A和9B還包括由FES-PET掃描的子宮CT掃描,其顯示在RAD1901治療前和治療后存在子宮。

進一步量化FES-PET子宮掃描結果以顯示7名受試者中給藥后的ER-結合相對于基線的變化(圖9C),其分別顯示作為200mg劑量組和500mg劑量組實施例的受試者1-3和受試者4-7。RAD1901在較低劑量水平(200mg)下顯示出穩定的ER結合。

圖10A-B顯示在6天之后,以500mg(口服,每日一次)進行RAD1901治療之前(基線)和之后(治療后)的子宮(A)和垂體(B)的FES-PET掃描的代表性圖像。圖10A按如下顯示子宮的FES-PET掃描:(a)側向截面;(b)縱向截面;和(c)縱向截面。

受試者的子宮和垂體的給藥后FES-PET劑量掃描分別顯示,在子宮(圖10A,治療后)和垂體(圖10B,治療后)處沒有明顯的ER結合信號。

因此,結果顯示,在6天之后,在200mg和500mg的劑量(口服,每日一次)下RAD1901有效地結合人體內的ER。

計算子宮、肌肉和骨的標準攝取值(SUV),并且將針對200mg和500mg(口服,每日一次)的RAD1901治療分別匯總在表2和3中。給藥后子宮信號非常接近來自“非標靶組織”的水平,其表明RAD1901治療后的FES-PET攝取完全減弱。在不顯著表達雌激素受體的組織中,在治療前和治療后的PET掃描中幾乎沒有觀察到變化。

因此,RAD1901或其鹽或其溶劑化物(例如其水合物)可用于治療具有ER過度表達的癌癥和/或腫瘤細胞(例如,乳腺癌、子宮癌和卵巢癌),而對其他器官(例如,骨、肌肉)沒有負效應。RAD1901或其鹽或其溶劑化物(例如水合物)可能特別適用于治療轉移性癌癥和/或在其他器官中具有ER過度表達的腫瘤,例如轉移至其他器官(例如骨、肌肉)的原發性乳腺癌、子宮癌和/或卵巢癌,以治療其他器官(例如,骨、肌肉)中的乳腺癌、子宮癌和/或卵巢癌病變,而對所述器官沒有負面影響。

III(B).RAD1901降低ER表達并抑制ER途徑。

III(B)(i)(1)RAD1901-依維莫司組合在降低MCF7異種移植模型中的ER和PR表達方面相比單獨使用RAD1901、依維莫司或氟維司群或氟維司群-依維莫司組合進行的治療更為有效。

與單獨使用RAD1901、依維莫司或氟維司群進行的治療、或利用氟維司群和依維莫司組合進行的治療相比,利用RAD1901和依維莫司組合進行的治療在降低MCF7異種移植模型(如實施例I(A)(ii)中描述的)中的體內ER和PR表達降低方面也更有效(圖11);在最后一次給藥后兩個小時時采集腫瘤)。

III(B)(i)(2)RAD1901和氟維司群在MCF7和T47D細胞系中的比較。

使用MCF-7和T47D細胞系比較不同濃度的RAD1901和氟維司群的效果,所述細胞系均為人乳腺癌細胞系,所述不同濃度為0.01μM、0.1μM和1μM(圖12A為MCF-7細胞系分析;圖12B為T47D細胞系)。使用以下三種ER標靶基因作為標志物:孕酮受體(PgR)、通過乳腺癌1的雌激素進行的生長調節(GREB1)和三葉因子1(TFF1)。RAD1901引起幾乎完全的ER降解并抑制ER信號傳導(圖12A-B)。特別是對于MCF-7細胞系,當以相同濃度施用時,氟維司群在抑制ER信號傳導方面表現出相當的或甚至略高的功效。出乎意料地,與氟維司群相比,RAD1901在抑制腫瘤生長和引起腫瘤消退方面與其相當或更為有效,如在實施例I(A)和I(B)中公開的。

III(B)(i)(3)在上文I(A)(ii)(1)實施例中描述的MCF-7異種移植模型-II中RAD1901治療導致ER降解并消除ER信號傳導。

RAD1901治療導致體內ER降解(圖13A和13B,學生t檢驗:*p值<0.05,**p值<0.01)并且抑制體內ER信號傳導(圖13A和13C,學生t檢驗:*p值<0.05,**p值<0.01)。

在RAD1901的最終劑(30mg/kg,60mg/kg,口服,每日一次)或氟維司群(3mg/劑,皮下注射,每周一次)之后2小時從MCF-7異種移植物采集的腫瘤顯示ER和PR表達顯著降低(圖13A-B)。在氟維司群治療的最終劑之后8小時從MCF-7異種移植物采集的腫瘤顯示出不同的PR和ER表達。然而,在RAD1901治療的最終劑之后8小時從MCF-7異種移植物采集的腫瘤顯示PR和ER表達降低(圖13A和13C)。

在單劑RAD1901(30mg/kg、60mg/kg或90mg/kg,口服,每日一次)之后8小時或12小時從MCF-7異種移植物采集的腫瘤顯示PR表達迅速降低(圖14A-C)。在第7劑RAD1901(30mg/kg、60mg/kg或90mg/kg,口服,每日一次)之后4小時或24小時從MCF-7異種移植物采集的腫瘤顯示出穩定且一致的ER信號傳導抑制作用(圖14B)。在RAD1901(30mg/kg、60mg/kg或90mg/kg,口服,每日一次)治療期間的幾個時間點對從MCF-7異種移植物采集的腫瘤進行蛋白質免疫印跡分析的定量分析顯示出劑量依賴性的PR降低(圖14C)。

RAD1901治療導致MCF-7異種移植模型中的增殖快速降低。例如,將單劑RAD1901(90mg/kg,口服,每日一次)之后8小時和第4劑RAD1901(90mg/kg,口服,每日一次)之后24小時時從MCF-7異種移植模型中采集的腫瘤切片并染色,其顯示增殖標志物Ki67快速降低(圖15A和15B)。

這些結果表明RAD1901治療導致ER降解并抑制WT ER異種移植物中的體內ER信號傳導。

III(B)(i)(4)RAD1901治療在實施例I(A)(ii)中描述的PDx-4模型中導致ER降解并消除ER信號傳導。

RAD1901治療導致PDx-4模型中的增殖快速降低。例如,將在56天功效研究最后一天的最后一劑之后四小時時從利用RAD1901(30、60或120mg/kg,口服,每日一次)或氟維司群(1mg/動物,每周一次)治療的PDx-4模型采集的腫瘤切片;與利用氟維司群治療的PDx-4模型相比,其顯示增殖標志物Ki67快速降低(圖16)。

這些結果表明,RAD1901治療導致ER降解并抑制WT ER異種移植物中的體內ER信號傳導。

III(B)(ii)RAD1901治療導致上文實施例I(A)(iii)(1)中描述的突變型ER異種移植模型(PDx-5)中的ER信號傳導降低。

在給藥最后一天(除非另有說明)后的指定時間點采集腫瘤,并使用Tissuelyser(Qiagen)在具有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中勻漿。通過MW分離等量的蛋白質,將其轉移至硝酸纖維素膜,并利用按照材料和方法部分所述的以下抗體進行印跡:孕酮受體(PR,Cell Signaling Technologies;3153)。

使用1D Quant軟件(GE)量化條帶,并且從如實施例I(A)(iii)(1)中所述的PDx-5模型獲得的PR(Allred評分)示于圖17中。氟維司群對PR表達幾乎沒有影響,而RAD1901在60mg/kg和120mg/kg(口服,每日一次,圖17)劑量下均顯示出功效。

這些結果表明,對于表達某些ERα突變(例如Y537S)的腫瘤,RAD1901在抑制腫瘤生長方面比氟維司群更為有效,并且在抑制對氟維司群治療幾乎沒有反應的腫瘤生長方面尤其有效(例如,劑量為3mg/劑,皮下注射,每周一次,圖6A顯示PDx-5)。此外,對于氟維司群治療沒有良好反應的腫瘤(例如PDx-5),RAD1901在降低體內PR表達方面有效,而氟維司群無效(圖17)。

實施例IV RAD1901治療對子宮組織和/或BMD的影響

IV(A(1)):RAD1901拮抗雌二醇對子宮組織的刺激。

通過評估未成熟大鼠的子宮重量、組織學和C3基因表達的變化來研究RAD1901對子宮的影響。得自代表性研究的結果在圖18A-D中示出。

評估子宮活性

將Sprague-Dawley大鼠幼仔在19日齡斷奶,隨機分組(n=4),連續3天施用溶媒(含水甲基纖維素)、E2(0.01mg/kg)、雷洛昔芬(3mg/kg)、他莫昔芬(1mg/kg)、單獨的RAD1901(0.3至100mg/kg)或RAD1901(0.01至10mg/kg)與E2(0.01mg/kg)的組合,視情況采用皮下注射或口服(見上文的試劑)施用,每日一次。最終劑之后24小時,通過吸入二氧化碳使所有的動物安樂死。記錄每只動物的體重和子宮濕重。在大鼠和小鼠中還利用RAD1901(0.03至100mg/kg)進行類似的測定(Charles River Laboratories,魁北克省蒙特利爾市)。

將來自每只大鼠的新鮮子宮組織固定在4%的多聚甲醛中,用乙醇脫水并且包埋在JB4塑料樹脂中。將切片切成8μm,用0.1%甲苯胺藍O染色。使用Spot Advanced程序,利用Zeiss Axioskop 40顯微鏡測量子宮內膜上皮的厚度;計算每個樣本9次測量的平均值。

子宮補體成分3(C3)基因表達

為了測定接受治療的子宮組織中C3的相對表達水平,使用微至中量總RNA純化試劑盒(Invitrogen,加利福尼亞州卡爾斯巴德市)根據制造商的說明從剩余組織中提取RNA。對RNA進行定量,并使用高容量cDNA存檔試劑盒(Applied Biosystems,加利福尼亞州福斯特城)對等量RNA進行逆轉錄。

使用ABI Prism 7300系統(Applied Biosystems)進行定量PCR。使用Taqman通用母液混合器進行PCR,該混合器具有用于C3和用于作為參照基因的18S核糖體RNA的探針組。熱循環條件包括95℃下10分鐘的初始變性步驟和隨后在95℃下15秒和在60℃下1分鐘的40個循環。

通過將每個樣品歸一化至內源性對照(18S)并與校準物(溶媒)比較來測定相對基因表達。使用下式確定相對基因表達:2-ΔΔCt(其中Ct=循環閾值或首次檢測PCR產物的循環次數,ΔCt=歸一化樣品值,ΔΔCt=給藥受試者與溶媒之間的歸一化差異)。在每個研究中對每個劑量進行5次重復的基因表達測定。

與單獨的溶媒相比,用E2(0.01mg/kg)、雷洛昔芬(RAL,3mg/kg)或他莫昔芬(TAM,1mg/kg)的治療導致子宮濕重顯著增加,而0.3-100mg/kg劑量范圍的RAD1901治療不顯著影響子宮濕重(圖18A)。所示數據(圖18A)是平均值(±SEM);每組n=4只大鼠;P-溶媒:*<0.05;P-E2:此外,當與E2(0.01mg/kg)聯合施用時,RAD1901以劑量依賴性方式拈抗E2介導的子宮刺激,其在0.1mg/kg和更高的劑量下對子宮活性表現出顯著抑制,并且在3mg/kg劑量下完全抑制子宮活性。RAD1901的EC50約為0.3mg/kg。在其中RAD1901劑量0.03至100mg/kg對子宮濕重或上皮厚度沒有影響的小鼠中也獲得了類似的結果(數據未顯示)。

通過定量顯微組織學進一步研究子宮組織中的治療依賴性變化。在以0.01和0.3mg/kg利用E2治療之后,子宮內膜上皮厚度存在統計學顯著性增加(圖18B)。在利用他莫昔芬(1mg/kg)或雷洛昔芬(3mg/kg)治療后,也觀察到上皮厚度顯著增加。與此相比,RAD1901治療在高達100mg/kg的最高評價劑量下也沒有使子宮內膜上皮厚度增加。圖18C中顯示子宮內膜上皮的代表性圖像。

與子宮重量和子宮內膜上皮厚度兩者的變化一致,E2、他莫昔芬和雷洛昔芬均顯著增加雌激素調節的補體基因C3的表達(圖18D)。與此相比,在所測試的任何劑量(0.3至100mg/kg)下,RAD1901均未增加C3基因表達。而且,1、3和10mg/kg的RAD1901顯著抑制E2刺激的C3基因表達。

RAD1901不刺激未成熟雌性大鼠的子宮

連續3天給未成熟雌性大鼠(口服,每日一次)施用溶媒(VEH)、雌二醇(E2)、雷洛昔芬(RAL)、他莫昔芬(TAM)、RAD1901或RAD1901+E2。測量子宮濕重。所示數據(圖18)是平均值(±SEM);每組n=4只大鼠;P-溶媒:*<0.05;P-E2:

實施例II(A)(2).RAD1901治療防止卵巢切除大鼠中的骨質流失

在卵巢切除大鼠中檢查RAD1901的骨特異性效應。

作為絕經后骨質流失的模型,對麻醉的成年雌性Sprague-Dawley大鼠進行卵巢切除術,以假手術作為對照。手術后,利用溶媒、E2(0.01mg/kg)或RAD1901(0.1、0.3、1、3mg/kg)治療卵巢切除的大鼠4周(每日一次,如上所述施用),每組20只動物。用溶媒治療假手術組中的動物。在最終劑后24小時,通過吸入二氧化碳使所有動物安樂死。使用PIXImus雙發射x射線吸收測定法在基線處評估骨礦物質密度,并且治療4周后再次評估。

在尸體剖檢時,取出每只動物的左股骨,解剖掉軟組織,并在分析之前保存在70%乙醇中。使用micro-CT40系統(Scanco Systems,賓夕法尼亞州韋恩市)進行詳細的定性和定量3-D評價。對于每個樣本,獲取遠端股骨干骺端的250個圖像切片。在預先選擇的分析區域中使用直接3D方法確定形態測定參數。在小梁骨中測定的參數包括骨體積密度、骨表面密度、骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁間距、連接密度和表觀骨密度。

在卵巢切除術后,與基線相比,未治療(溶媒對照)大鼠在整個全股骨和腰椎骨中都出現了骨礦物質密度降低(表4)。E2治療與預防股骨和脊柱兩者中的骨質流失相關。RAD1901治療對卵巢切除術誘發的骨質流失產生了劑量依賴性的和統計學顯著的抑制(數據顯示3mg/kg治療組)。在0.1mg/kg至3mg/kg的劑量下,接受RAD1901治療的大鼠中的骨礦物質密度是完整的,與E2治療組無統計學顯著差異。

遠端股骨的Micro-CT分析(表5)證實,與假手術動物相比,卵巢切除術誘發多種關鍵微觀結構參數的顯著變化。這些變化與骨質減少相一致,包括骨體積減少、骨小梁數、厚度和密度減小、以及骨小梁分離增加。與用RAD1901治療后觀察到的保持骨礦物質密度的結果一致,在關鍵微觀結構參數中觀察到了明顯的骨小梁結構保存(表5)

實施例IV(B):在健康的絕經后婦女中的RAD1011期劑量遞增研究

在1期研究中,在44名健康的絕經后女性中評價安全性、耐受性和藥代動力學。沒有觀察到劑量限制性毒性(DLT),未確定耐受劑量(MTD)。在所測試的劑量范圍內,血漿暴露量隨劑量增加而按比例增加。

受試者

招募44名健康的絕經后女性作為1期研究的受試者。受試者的閉經時間為至少12個月,血清FSH與絕經一致。受試者為40-75歲,BMI為18.0-30kg/m2。排除如下受試者:具有臨床相關病理證據、中風風險增加或有靜脈血栓事件史,或在進入臨床研究中心前不到14天內使用伴隨用藥(允許在至多3天前使用撲熱息痛)。

給藥

在少量早餐之后利用安慰劑或至少一劑(口服,每日一次)治療受試者7天,劑量分別為200mg、500mg、750mg和1000mg。在1期研究中招募的44名健康的絕經后女性的關鍵基線人口統計學匯總在表6中。

治療緊急不良事件(TEAE)

記錄TEAE,并將最頻繁的(>10%的具有任何相關TEAE的總活性組中的患者)不良事件(AE)匯總在表7中,“n”是在給定類別中具有至少一個治療相關AE的受試者的數目(AE根據不良事件通用標準(CTCAE)v4.0進行分級),并且經歷同一優先項目的多種情形的任何患者都只以最嚴重的等級計算一次。沒有觀察到劑量限制毒性,未確定最大耐受劑量(MTD)。

藥代動力學評估

在研究期間采集一系列血液樣品用于分析血漿中的RAD1901。通過留置IV導管或直接靜脈穿刺采集每個5mL的血液樣品至包含K3-EDTA作為抗凝血劑的試管中。在治療第5天達到穩定狀態。評價RAD1901的幾何平均(Geo-Mean)血漿濃度-時間曲線。作為實例,將研究第7天(N=35)利用RAD1901(200、500、750或1000mg)治療的組的血漿藥代動力學結果提供在表8和圖19中。中位t1/2在37.5-42.3小時之間(表8)。在施用多劑RAD1901后,中值tmax在給藥后3-4小時之間。

實施例V(A)-1.使用選用的公開ER結構對RAD1901-ERα結合進行建模。

除非另外指定,當通過其桿狀模型顯示結構時,將鍵的每個末端著色為與其所連接的原子相同的顏色,其中灰色是碳,紅色是氧,藍色是氮,白色是氫。

通過仔細評價,從96個公開的模型中選擇14個與幾種ER配體復合的ERα配體結合結構域(LBD)的公開結構(即模型)。14個模型中的一個模型是3ERT(與4-羥基他莫昔芬(OHT)結合的人ERα LBD)。OHT是他莫昔芬的活性代謝物和第一代SERM,其在乳房組織中起拈抗劑的作用。

在3ERT(圖20和21)中,ERα結合位點采用形成包括螺旋3(H3)、螺旋5(H5)和螺旋11(H11)的疏水口袋的三層“螺旋三明治”(圖20)。圖21中的虛線框表示結合位點和結合位點內重要或受OHT結合影響的殘基。OHT通過將H12置換到LXXLL共激活劑結合的位點而起拈抗劑的作用。OHT占據L540正常填充的空間并修飾螺旋11的C端子上的四個殘基(G521、H524、L525和M528)的構象。OHT也與D351形成鹽橋,導致電荷中和。

將另外十三個ERα LBD-ER配體模型與3ERT進行比較。表10中匯總了它們殘基構型中的差異。十四個模型(圖22)的ERα結構疊加顯示這些結構在殘基E380、M421、G521、M522、H524、Y526、S527、M528、P535、Y537、L540及其各種組合處明顯不同。

在表11中匯總了十四種模型中的任一對模型的均方根偏差(RMSD)計算。當時認為結構是重疊的。表11顯示,所有十四個模型的RMSD均使用條件格式分析表明,1R5K和3UUC與其他模型最不相似(分析未顯示)。因此,將1R5K和3UUC視為獨特的、獨立的結構類群來考查。

在表12匯總了十四種模型中的由配體結合的ERα殘基。表12還顯示了ERαLBD-拈抗劑復合物中的EC50。在十四個模型中,十三個模型顯示配體和E353之間的氫鍵相互作用;十二個模型顯示配體與F404之間的π相互作用;五個模型顯示配體和D351之間的氫鍵相互作用;六個模型顯示配體和H524之間的氫鍵相互作用;四個模型顯示配體和R394之間的氫鍵相互作用;以及一個模型(3UUC)顯示配體和T347之間的相互作用。

使用十四個模型中的每個模型對接1000個化合物加配體的隨機文庫,(所述模型已公開為具有已知的拈抗劑),以確定模型是否能夠識別和優先考慮已知的拈抗劑。如果模型能夠識別已知的拈抗劑,則確定該模型能夠預測其自己公開的配體的構型。然后計算EF50來量化模型強度,以查看它如何比隨機選擇要好多少。RAD1901對接在選定的模型中(例如,圖23A&B-27A&B)。確定所公開配體和RAD1901在模型中的對接評分。還確定EC50。目視檢查RAD1901顯示它“服從”所顯示的與1R5K、1SJ0、2JFA、2BJ4和2OUZ中的公開配體的相互作用。沒有發現空間沖突。在某些實施方案中,例如在1R5k和2BJ4中,RAD1901具有比公開的配體更高的對接評分。

表13匯總了9個模型(1ERR、3ERT、3UCC、2IOK、1R5K、1JJ0、2JFA、2BJ4和2OUZ)的評估結果。

1ERR和3ERT不能預測其結晶配體的正確構型。RAD1901沒有對接在3UCC中。2IOK-RAD1901中的四氫萘胺以非傳統方式結合。

模型1R5K、1SJ0、2JFA、2BJ4和2OUZ之間的主要差別是螺旋11的C-末端中的殘基(G521-M528)。

圖23A&B顯示了RAD1901-1R5K(A)和GW5-1R5K(B)的建模。RAD1901利用氫鍵相互作用結合至E353、R394和L536;并利用p-相互作用結合至F404。

圖24A&B顯示了RAD1901-1SJ0(A)和E4D-1SJ0(A)的建模。RAD1901利用氫鍵結合至E353和D351;并利用p-相互作用與F404結合。

圖25A&B顯示了RAD1901-2JFA(A)和RAL-2JFA(B)的建模。RAD1901利用p-相互作用與F404結合。

圖26A&B顯示了RAD1901-2BJ4(A)和OHT-2BJ4(B)的建模。RAD1901利用氫鍵相互作用結合至E353和R394;并且利用p-相互作用與F404結合。

圖27A&B顯示RAD1901-2IOK(A)和IOK-2IOK(B)的建模。RAD1901利用氫鍵相互作用與E353、R394和D351結合;并且利用p-相互作用與F404結合。

模型中的公開配體具有以下結構:

GW5,(2E)-3-{4-[(1E)-1,2-二苯基丁-1-烯基]苯基}丙烯酸

E4D,(2S,3R)-2-(4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯基)-2,3-二氫-3-(4-羥基苯基)苯并[B][1,4]氧硫雜環己二烯-6-醇

OHT,4-羥基他莫昔芬

IOK,N-[(1R)-3-(4-羥基苯基)-1-甲基丙基]-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酰胺

實施例V(A)-2.ERα與RAD1901和氟維司群的誘導契合對接(IFD)

通過對5種ERα晶體結構1R5K、1SJ0、2JFA、2BJ4和2OUZ的IFD分析來進一步優化ERα中RAD1901的結合構象。IFD分析考慮了適應其正確結合構象的受體靈活性(在配體結合后)。

通過尋找作為圍繞可旋轉鍵的旋轉的函數的局部最小值來產生每個配體(例如RAD1901和氟維司群)的不同構象文庫。RAD1901的文庫有25種不同的構象。

制備五種ERα晶體結構并使其最小化。使用公開的X射線結構中的對應配體來定義ERα結合口袋。

將RAD1901構象對接到所制備的ERα結構中,其中使它們誘導側鏈或主鏈移動到位于結合口袋中的殘基。這些移動使得ERα能夠改變其結合位點,使得其更緊密地順應RAD1901構象的形狀和結合模式。在一些實施例中,在IFD分析中允許受體結構中的主鏈少量松弛和顯著的側鏈構象變化。

使用經驗評分函數來近似獲得配體結合自由能以提供對接評分或G評分。G評分也被稱為GlideScore,在該實施例中其可以與對接得分互換使用。對接評分是結合親和力的估計值。因此,對接評分的值越低,則配體與其受體結合“越好”。對接評分為-13至-14對應于非常良好的結合相互作用。

將分別用1R5K、1SJ0、2JFA、2BJ4和2OUZ進行的IFD分析得到的RAD1901構象進行疊加以顯示它們的差異(圖28-30A&B,顯示為桿狀模型)。每個RAD1901構象中的所有鍵在圖28、29和30A中均用相同的顏色顯示。

由1R5K(藍色)和2OUZ(黃色)的IFD分析得到的RAD1901構象在正面具有RAD1901的N-芐基-N-乙基苯胺基團(圖28)。利用2BJ4(綠色)和2JFA(粉色)進行IFD分析得到的RAD1901構象在背面具有RAD1901的N-芐基-N-乙基苯胺基團(圖29)。利用2BJ4(綠色)、2JFA(粉色)和1SJ0(棕色)進行IFD分析得到的RAD1901構象與通過其疊加所示的構象(圖30A和30B)非常相似。RAD1901IFD對接評分匯總在表14中。

利用2BJ4進行的RAD1901 IFD顯示與E353和D351的氫鍵相互作用和與F404的π-相互作用(圖31A-31C)。圖31A顯示了結合位點內適合于氫鍵受體基團(紅色)、氫鍵供體基團(藍色)和疏水性基團(黃色)的區域。在圖31A和31B中,淺藍色是RAD1901的碳。圖32A-32C顯示了利用2BJ4進行的RAD1901的IFD的蛋白質-表面相互作用。圖32A和32B是正視圖,圖32C是側視圖。RAD1901的分子表面在圖32A中為藍色,而在圖32C中為綠色。圖32B和32C是ERα的溶劑可及表面的靜電圖示,其中紅色代表電負性,藍色代表電正性。

如上所述利用2BJ4對氟維司群進行類似的IFD分析。氟維司群-2BJ4 IFD得到-14.945的G評分,并顯示與E353、Y526和H524的氫鍵相互作用以及與F404的π-相互作用(圖33A-33C)。圖33A顯示了結合位點內適合氫鍵受體基團(紅色)、氫鍵供體基團(藍色)和疏水性基團(黃色)的區域。在圖33A中,淺藍色是RAD1901的碳。

圖34A和34B顯示了通過IFD對接在2BJ4中的RAD1901和氟維司群,兩者與F404具有π-相互作用并且與E353具有氫鍵相互作用。此外,RAD1901與D351具有氫鍵相互作用(藍色表示RAD1901分子表面,圖34B),而氟維司群與Y526和H524(綠色表示氟維司群分子表面,圖34C)具有氫鍵相互作用。在圖35A和35B中顯示了與RAD1901和氟維司群對接的2BJ4的疊加。在圖35A中,綠色代表氟維司群分子表面,藍色代表RAD1901分子表面。在圖35B中,棕色結構是氟維司群,藍色結構是RAD1901。

實施例Example V(A)-3.選用的ERα突變的建模評估。

評估幾種ERα突變對C末端配體結合結構域的影響。所評估的具體ERα突變是Y537X突變體,其中X是S、N或C;D538G;和S463P。

Y537位于螺旋12中。它可以在磷酸化后調節配體結合、同源二聚化和DNA結合,并且可以允許ERα脫離磷酸化介導的控制并提供具有潛在選擇性致瘤優勢的細胞。此外,它可能會引起構象變化,從而使受體具有組成活性。

Y537S突變有利于轉錄活性閉合的口袋構象,而不管是否被配體占據。閉合但未被占據的口袋可以解釋ERα的組成活性(Carlson等人,Biochemistry 36:14897-14905(1997))。Ser537與Asp351形成氫鍵相互作用,導致螺旋11-12環的構象改變,并且導致Leu536包埋在溶劑不可到達的位置處。這可能促進Y537S突變蛋白的組成性活性。Y537S表面突變對LBD口袋的結構沒有影響。

Y537N常見于ERα陰性轉移性乳腺癌。在該位點的突變可能使ERα脫離磷酸化介導的控制,并提供具有潛在的選擇性致瘤優勢的細胞。具體而言,Y537N的替換誘發ERα中的構象變化,其可模擬激素結合,不影響受體二聚化的能力,但為受體提供組成轉活功能(Zhang等人,Cancer Res 57:1244-1249(1997))。

Y537C具有與Y537N相似的作用。

D538G可通過穩定活性構象和非活性構象來改變整個能量全景,但是更優選活性構象。這可能在不存在激素的情況下導致這種突變體具有組成活性,如在激素耐藥性乳腺癌中觀察到的(Huang等人,“A newfound cancer activating mutation reshapes the energy landscape of estrogen-binding domain,”J.Chem.Theory Comput.10:2897-2900(2014))。

預期這些突變都不會影響配體結合結構域,也不會特異性阻礙RAD1901結合。Y537和D538可引起構象變化,其導致與配體結合無關的組成受體活化。

實施例V(B).野生型和LBD突變型ERα構建體與RAD1901和其他化合物的體外結合測定

野生型(WT)和LBD突變型ERα構建體與RAD1901的體外結合測定顯示,RAD1901結合至突變型ERα的親和力與結合至WT ERα的親和力相似。

通過表達和純化相應的LBD殘基302-552來制備WT和LBD突變型ERα的構建體,所述LBD殘基302-552具有N-末端硫氧還蛋白和通過TEV蛋白酶切割的6xHis標簽。

根據制造商(Polar Screen,Invitrogen)的說明,利用2nM熒光酮、100nM WT或LBD突變型ERα的構建體,使用熒光偏振(FP)來測定受試化合物(RAD1901、氟維司群、巴多昔芬、雷洛昔芬、他莫昔芬和AZD9496)與ERα的結合。每組進行兩次測試,并測試一種測試化合物來測定不同ERα構建體的IC50(圖36顯示RAD1901結合測定)。

如上所述,前文僅意在舉例說明本發明的幾種實施方案。上文討論的具體修改方案不應被解釋為限制本發明的范圍。本領域技術人員明顯可知,在不脫離本發明范圍的情況下可以做出各種等同方案、變化方案和修改方案,并且應當理解,這樣的等同實施方案也被包括在本文中。本文引用的所有參考文獻均通過引用并入本文,如同在本文中完全記載一樣。

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