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幽門螺旋桿菌粘附抑制劑.pdf

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幽門 螺旋 桿菌 粘附 抑制劑
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摘要
申請專利號:

CN03804435.8

申請日:

20030127

公開號:

CN1638787A

公開日:

20050713

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K38/00,A61K45/00,A61K35/20,A61K31/7004,A61K31/7016,A61P1/04,A61K31/04,A23C9/156,A23F3/00,A23F5/00,A23L1/22,A23L1/40,A23L2/00 主分類號: A61K38/00,A61K45/00,A61K35/20,A61K31/7004,A61K31/7016,A61P1/04,A61K31/04,A23C9/156,A23F3/00,A23F5/00,A23L1/22,A23L1/40,A23L2/00
申請人: 日清藥業股份有限公司,株式會社源
發明人: 平本茂,森下由朗,木村修武,兒玉義勝
地址: 日本東京
優先權: 18606/2002
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 代理人: 趙艷華
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法律狀態
申請(專利)號:

CN03804435.8

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及能夠從胃中根除與消化性潰瘍發病相關的幽門螺旋桿菌的幽門螺旋桿菌粘附抑制劑,制備其的方法,和包含這種幽門螺旋桿菌粘附抑制劑的預防或治療與幽門螺旋桿菌相關的疾病的藥物和食品。本發明的幽門螺旋桿菌粘附抑制劑具有根除幽門螺旋桿菌的極好活性并且非常安全。因此,包含其的藥物組合物和食品可非常有效治療或預防上面提及的疾病。

權利要求書

1.幽門螺旋桿菌粘附抑制劑,其包含作為活性成分的糖和蛋白的褐變反應的產物。2.根據權利要求1的幽門螺旋桿菌粘附抑制劑,其中所述的蛋白是選自來源于小麥、大麥、稻米、玉米、大豆或紅豆的植物蛋白,和來源于奶、蛋、魚或肉的動物蛋白組成的組的至少一個成員。3.根據權利要求1或2的幽門螺旋桿菌粘附抑制劑,其中所述的糖是選自D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-核糖和乳糖組成的組的至少一個成員。4.制備幽門螺旋桿菌粘附抑制劑的方法,包括在水溶液中使糖和蛋白經歷褐變反應的步驟。5.制備幽門螺旋桿菌粘附抑制劑的方法,包括在水溶液中使含糖和蛋白的食品經歷褐變反應的步驟。6.根據權利要求4或5的方法,其中所述的蛋白是選自來源于小麥、大麥、稻米、玉米、大豆或紅豆的植物蛋白和來源于奶、蛋、魚或肉的動物蛋白組成的組的至少一個成員。7.根據權利要求4或5的方法,其中所述的糖是選自D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-核糖和乳糖組成的組的至少一個成員。8.根據權利要求5的方法,其中所述的食品是生牛奶、奶粉、脫脂奶粉、乳清或濃縮奶。9.根據權利要求4至8任一項的方法,其中實施褐變反應直到5%水溶液在405nm的吸光度變為至少0.01。10.幽門螺旋桿菌粘附抑制劑,其包含糖和蛋白的褐變反應的產物和胃酸分泌抑制劑。11.幽門螺旋桿菌粘附抑制劑,其包含糖和蛋白的褐變反應的產物和能夠根除幽門螺旋桿菌的其它物質。12.根據權利要求11的粘附抑制劑,其中所述的物質是選自能夠結合幽門螺旋桿菌粘附素-尿素酶的多酚、抗生素、抗幽門螺旋桿菌的抗體和多糖或糖蛋白組成的組的至少一個成員。13.預防或治療與幽門螺旋桿菌相關的疾病的藥物組合物,包含根據權利要求1至3和權利要求10至12任一項的幽門螺旋桿菌粘附抑制劑。14.預防或改善與幽門螺旋桿菌相關的疾病的食品,包含根據權利要求1至3和權利要求10至12任一項的幽門螺旋桿菌粘附抑制劑。

說明書

?

發明背景

發明領域

本發明涉及能夠從胃中消除與消化性潰瘍的發展有關的幽門螺旋 桿菌(Helicobacter?pylori)的幽門螺旋桿菌粘附抑制劑,制備其的方法, 和預防或治療與幽門螺旋桿菌相關的消化性疾病的含這個抑制劑的藥 物組合物和食品。

現有技術

幽門螺旋桿菌是一類螺旋形革蘭氏陰性桿菌,在其一個末端具有 幾根鞭毛并寄居在人胃粘膜。在1983年,來自澳大利亞的Marshall, B.J.和Warren,J.R.報道了從胃炎和胃潰瘍患者取樣的胃活檢樣品可 高效率地檢測到這個細菌。從那時開始,很多報道連續關注這個細菌。 例如流行病學研究結果報道了這個細菌引起胃炎、胃潰瘍和十二指腸 潰瘍,并與如胃癌等疾病相關。

因此,目前認為幽門螺旋桿菌的根除對消化性潰瘍的永久治愈是 必須的。采用抗生素和胃酸分泌抑制劑的組合治療已經廣泛用作如下 述的根除治療。

一旦幽門螺旋桿菌定居到胃粘膜,它就持續寄居在胃部不被消除, 盡管對感染有有力的免疫反應(即抗體效價高)。因此,在給藥停止后 大約一月內,患者的情況返回到治療前(即感染狀態),除非依靠抗生 素療法完全根除幽門螺旋桿菌。由于鹽酸使胃中pH水平保持很低, 所以很多抗生素失效。因此,有力抑制胃酸分泌的質子泵抑制劑用于 與滅菌劑(抗生素)組合來根除幽門螺旋桿菌。目前,利用三種類型 試劑如阿莫西林、克拉霉素和蘭索拉唑的組合治療是日本根除幽門螺 旋桿菌的標準治療。然而,長期給予抗生素可能引起很嚴重的問題, 如耐藥菌株數量增加以及副作用。

目前,使用口服疫苗的免疫治療方法可利用作為解決由給予抗生 素根除細菌引起的副作用或耐藥菌株增加的問題的方法。然而,由于 實驗的復雜條件,旨在建立新的預防或治療方法的研究基本上沒有發 生進展。而且,給予疫苗的原理目的是預防。因此,它對已經感染幽 門螺旋桿菌的患者無效。

通常,細菌首先需要粘附、繁殖和定居到宿主細胞以建立細菌感 染。細菌對宿主細胞的粘附需要粘附素與宿主細胞表面的受體結合。 JP10-287585(1998)公開了幽門螺旋桿菌粘附的機制。也就是,尚未闡 明的粘附素是由該細菌產生的尿素酶,來自雞蛋的抗這種尿素酶的抗 體抑制胃中幽門螺旋桿菌的增生。

JP3,255,161公開了去除牛奶脂肪得到的來自乳清的粘蛋白和來 自牛奶的酪蛋白可抑制消化道中幽門螺旋桿菌的定居。

然而,仍未知各種糖和蛋白褐變反應(browning?reaction)的產物是 否能夠抑制幽門螺旋桿菌粘附素-尿素酶與胃粘膜的粘附。

發明概述

本發明的一個目的是提供非常安全的可有效抑制與消化性潰瘍發 展有關的幽門螺旋桿菌與胃粘膜的粘附的幽門螺旋桿菌粘附抑制劑, 其中這種粘附抑制劑不涉及如由常規抗生素的使用引起的副作用或耐 藥菌株增加的問題。

本發明檢測了可抑制尿素酶粘附胃粘膜的各種物質。結果,它們 發現糖和蛋白褐變反應的產物能夠有效抑制作為粘附素的尿素酶與胃 粘膜的粘附。這導致本發明的完成。

更特別地,本發明涉及幽門螺旋桿菌粘附抑制劑,其包括作為活 性成分的糖和蛋白褐變反應的產物。本發明可以采用任何可口服攝取 蛋白和任何可口服攝取還原糖。

本發明也涉及制備幽門螺旋桿菌粘附抑制劑的方法,包括在水溶 液中使糖和蛋白經歷褐變反應的步驟。

而且,本發明涉及制備幽門螺旋桿菌粘附抑制劑的方法,包括在 水溶液中使含糖和蛋白的食品經歷褐變反應的步驟。在本發明中,實 施褐變反應直到糖-蛋白混合物的5%水溶液在405nm的吸光度變為 至少0.01。食品不特別限定,只要它們含有糖和蛋白。其優選的實例 包括生牛奶、奶粉(全奶粉)、脫脂奶粉、乳清和脫水奶(濃縮奶)。

本發明涉及幽門螺旋桿菌粘附抑制劑,包含糖和蛋白褐變反應的 產物和胃酸分泌抑制劑。本發明也涉及幽門螺旋桿菌粘附抑制劑,包 含糖和蛋白褐變反應的產物和能夠根除幽門螺旋桿菌的其它物質。此 外,本發明涉及幽門螺旋桿菌粘附抑制劑,包含糖和蛋白褐變反應的 產物,胃酸分泌抑制劑和能夠根除幽門螺旋桿菌的其它物質。在本發 明中,術語“能夠根除”是指如下作用如粘附抑制、抑制或預防增殖, 和幽門螺旋桿菌體內和/或體外滅菌。

本發明也涉及預防或治療與幽門螺旋桿菌相關的疾病的藥物組合 物,它包含上述幽門螺旋桿菌粘附抑制劑。此外,本發明涉及預防或 改善與幽門螺旋桿菌相關的疾病的食品,它包含上述幽門螺旋桿菌粘 附抑制劑。

發明詳述

下面將詳細描述本發明。

本發明的幽門螺旋桿菌粘附抑制劑的活性成分是糖和蛋白褐變反 應的產物,也就是,氨基-羰基反應的產物。可以通過在水溶液中將 各種糖和各種蛋白混合和加熱該化合物實施褐變反應。

在本發明中,可以使用任何可口服攝取蛋白。其實例包括但不限 于來源于小麥、大麥、稻米、玉米、大豆、紅豆等植物蛋白,和來源 于奶、蛋、魚、肉或等動物蛋白。其具體實例包括:牛奶中含有的酪 蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白或乳鐵 蛋白;小麥中含有的麥谷蛋白或白蛋白;玉米中含有的玉米蛋白;蛋 中含有的卵白蛋白、卵轉鐵蛋白、卵類粘蛋白、卵粘蛋白或溶酶菌; 和魚和肉中含有的肌球蛋白或肌動蛋白。使用前可以根據常規技術純 化這些蛋白,或商業化蛋白可以無需加工使用。這些蛋白可以單獨或 兩種或更多組合使用。可供選擇地,含有這種蛋白的食物,例如含牛 奶來源的蛋白的生牛奶、奶粉、脫脂奶粉、乳清或濃縮奶可以用作蛋 白混合物。

用于制備褐變反應的產物的糖的實例包括各種還原糖如D-葡萄 糖、D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D -核糖和乳糖。可以使用這些糖的純化產物。然而當使用脫脂奶粉或 乳清時,可以不另外添加牛奶來源的蛋白實施褐變反應,因為這些物 質已經含有如上提及的蛋白。

糖與蛋白的質量比可以是任何水平。通常,它在1∶100和10∶1之 間,并優選1∶9-1∶1。

在本發明中,可以通過如上提及在水溶液中將糖和蛋白混合來制 備褐變反應的產物。可供選擇地,含有糖和蛋白的食品,優選含有上 面提及的量的糖和蛋白的食品,如生牛奶、奶粉、脫脂奶粉、乳清或 濃縮奶,可在水溶液中在那種狀態下加熱,并且允許發生褐變反應得 到褐變反應的產物。

脫脂奶粉含有各種牛奶蛋白,多數是酪蛋白,和糖如乳糖。通過 用常規技術離心生牛奶而分離和除去脂肪和霧化所得脫脂奶可以獲得 脫脂奶粉。可供選擇地,也可以使用商業化的脫脂奶粉。

通過從脫脂奶除去酪蛋白制備乳清,它含有糖如乳糖和乳清蛋白 如β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白或乳鐵蛋白。 在本發明中,可以根據常規技術從牛奶中制備乳清,或商業化乳清(如 濃縮物或粉劑)可以不加工使用。

在本發明中,優選在中性或堿性水溶液中實施褐變反應。可以使 用各種堿性水溶液,其實例是氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉(小蘇 打)、碳酸鈉和磷酸二鈉的堿性水溶液。添加的堿濃度不特別限定。例 如,可以使用0.05N至0.5N氫氧化鈉。水溶液的量不特別限定,只要 該溶液可均勻懸浮為糖-蛋白混合物或含糖和蛋白的食品。例如,該 溶液的體積可以是混合物或食品體積的1至100倍,優選5至20倍。

實施褐變反應直到糖-蛋白混合物的5%水溶液在405nm的吸光 度變為至少0.01,優選至少0.1。在405nm的吸光度至少0.01意味著 褐變反應在進行。通過例如使用微板讀器檢測100μl?5%水溶液來確定 吸光度。

當在中性水溶液中實施褐變反應時,優選反應溫度至少100℃, 并特別優選至少120℃。反應時間通常至少20分鐘,并優選為30分 鐘-10小時。當在堿性水溶液中實施褐變反應時,優選反應溫度室溫 -100℃,特別優選40℃-90℃。反應時間通常為1小時-20小時,優選 為2小時-8小時。

褐變反應的產物可以不進一步加工而攝入。可供選擇地,它可以 接受普通技術,例如,超濾或離子交換樹脂來除去未反應的糖和脫鹽。 通過用來選擇性沉淀蛋白的常規技術,如等電沉淀、鹽析或有機溶劑 沉淀來沉淀褐變反應的產物。為了促進將其制備成藥物組合物或添加 到食品,優選用普通技術,如冷凍干燥或噴霧干燥使褐變反應的產物 脫水。當在中性水溶液中實施褐變反應時,可以使該產物脫水而不進 一步加工。優選,除去未反應的糖和脫鹽、隨后用上述技術脫水米霧 化產物。當在堿性水溶液中實施褐變反應時,可以用酸(無機和/或有 機酸)中和該溶液。中和后,可以使該溶液脫水而不進一步加工。可 供選擇地,從溶液中除去未反應的糖,可以用上述技術使溶液脫鹽, 隨后脫水。可接著霧化產物。

本發明的褐變反應的產物優先結合幽門螺旋桿菌粘附素-尿素酶, 由此抑制其與胃粘膜上受體的結合。本發明的褐變反應的產物具有根 除幽門螺旋桿菌的極好能力,并且因此可以有效預防或改善與幽門螺 旋桿菌相關的疾病,如消化性潰瘍。而且,起始原料如糖和蛋白是食 品或由食品或食品材料得到的可口服攝入的物質,在烹飪食品的加工 中不斷發生褐變反應。因此,本發明的褐變反應產物非常安全且不引 起副作用。如果含有本發明褐變反應的產物的幽門螺旋桿菌粘附抑制 劑引入藥物組合物或食品,那么它們可以預防或改善與幽門螺旋桿菌 相關的疾病。

可以根據制備藥物的常規技術,通過產物單獨或與載體或賦形劑 (如填充劑或粘合劑)適當組合配制包含本發明褐變反應的產物的粘 附抑制劑。可以根據需要其它添加劑或物質,例如,抗酸劑(如碳酸 氫鈉、碳酸鎂、碳酸鈣沉淀或水滑石(hydrotalcite)),胃粘膜保護劑(如 合成硅酸鋁、sucralfate或葉綠酸銅鈉),或消化酶(如生物淀粉酶或 脂肪酶)。口服給予本發明的粘附抑制劑,劑量通常是每個成人每天 0.01g至10.0g的范圍(在干燥基礎上)的褐變反應的產物,優選0.5g 至5.0g的范圍。

通過與胃酸分泌抑制劑組合使用可以增強包含本發明褐變反應的 產物的粘附抑制劑的作用。可以使用的胃酸分泌抑制劑的實例包括但 不限于H2阻斷劑,如法莫替丁、尼扎替丁、羅沙替丁、雷尼替丁和西 咪替丁,和質子泵抑制劑,如奧美拉唑、蘭索拉唑和rabeprazole鈉。 酸還原劑的劑量根據使用的試劑類型變化。劑量通常每個成人每天 10mg至50mg的范圍,優選20mg至30mg的范圍。

當與能夠根除幽門螺旋桿菌的其它物質組合使用時,可以進一步 增強本發明的粘附抑制劑根除幽門螺旋桿菌的作用。這種其它物質的 實例包括能夠結合幽門螺旋桿菌粘附素-尿素酶的各種抗生素、多酚、 抗幽門螺旋桿菌的抗體,和多糖或糖蛋白。此外,本發明的粘附抑制 劑可以與胃病的治療劑組合,如鉍劑,或殺寄生蟲劑如甲硝基羥乙唑。

多酚的實例包括兒茶素、棓兒茶酸、棓兒茶酸棓酸鹽、表兒茶素、 表兒茶素棓酸鹽、表棓兒茶酸、表棓兒茶酸棓酸鹽、游離茶黃素、茶 黃素單棓酸鹽、茶黃素棓酸鹽、白藜蘆醇、原花色素、槲皮素、花色 素苷、1-異硫氰基-4R-[甲基亞硫酰基]丁烷(sulforaphane)和異黃酮。 本發明的粘附抑制劑也可以含有這種多酚。本發明的粘附抑制劑可以 引入含有這種多酚的茶、食品物質如可可或水果,或其提取物。

抗幽門螺旋桿菌的抗體的實例包括抗整個細胞的抗體和抗細胞表 面分子的抗體。從可利用性和增強根除的觀點來看,優選來自雞蛋的 抗細胞表面分子的抗體,尤其是來自雞蛋的抗與幽門螺旋桿菌粘附相 關的尿素酶和鞭毛的抗體(JP?10-28758A(1998))。

能夠結合幽門螺旋桿菌尿素酶的糖蛋白的實例包括得自哺乳動物 消化道的粘蛋白、得自乳清的粘蛋白、得自雞蛋白蛋白的粘蛋白,和 這些粘蛋白組成的糖蛋白。

能夠結合上述尿素酶的多糖的實例包括葡聚糖硫酸鹽 (Antimicrobiol?Agents?and?Chemotherapy,44卷,9期,2492-2497頁, 2000)和巖藻聚糖(Gastroenteroligy,119卷,358-367頁,2000)。 抑制上述尿素酶活性的物質的實例是蜂膠提取物。報道了依靠超臨界 提取法獲得的蜂膠特別有效(Medical?Nutrition,2003年1月1日發 行)。

抗生素的實例包括青霉素、頭孢烯、大環內酯、neuquinoron和 四環素抗生素。特別優選阿莫西林和克拉霉素。抗生素劑量根據使用 的試劑類型變化。它們通常是每個成人每天100mg至5000mg的范圍, 并優選500mg至3000mg的范圍。

當引入食品時,含有本發明褐變反應的產物的粘附抑制劑可以更 容易地被攝入。待引入食品的本發明的褐變反應的產物的量通常是大 約0.5%至10%質量,并優選1.0%至3.0%質量。這種食品如健康食 品和功能食品形式的實例包括:各種藥物組合物如細粒、片劑、顆粒、 膠囊和流體;液體食物如湯、汁、茶飲料、牛奶飲料、可可和果凍樣 飲料;半固體食品如布丁和酸奶;面包;點心;面條如Udon;點心 如甜點、巧克力、糖果,和大米餅;和涂味品如日本furikake、黃油 和果醬。優選食品包括含能夠根除幽門螺旋桿菌的大量多酚、多糖或 糖蛋白的物質。其具體實例包括包含含多酚的水果、茶或可可的汁、 茶飲料、可可或巧克力,和包含多糖或糖蛋白的牛奶飲料和發酵牛奶 飲料。

具體健康食品的褐變反應的產物的形式不特別限定,盡管優選那 些可不斷攝入的,如點心、干湯和飲料。而且,它們也可以制備成用 于病人的食品,如低鈉食品、低熱量食品或低蛋白食品,或醫學上使 用的食品,例如湯、飲料或流體食物的形式。

此外,食品可以含有各種各種食品添加劑,如各種營養素、維生 素、礦物質、食物纖維、多不飽和脂肪酸、穩定劑如分散劑或乳劑, 甜味劑,矯味成分或加香劑。液體食物可以制備成這種形式。可供選 擇地,它們可以首先制備成粉劑或糊劑和接著溶解于給定量的水流體 中。

發明的優選實施方案

下面參考下列實施例,更詳細地描述本發明,盡管本發明的技術 范圍不限于此。

實施例

實施例1:堿性水溶液中酪蛋白和乳糖的褐變反應

如下表所示量的乳糖和酪蛋白添加到50ml試管中的10ml?0.2N NaOH水溶液中,并用混合器振蕩試管直到形成均勻懸液。試管在水 浴中,50℃溫育4小時以促進褐變反應。0.2N?HCl添加到溶液中直到 pH?7.0。冷凍干燥所中和的溶液得到褐色粉末。

表1

實例??????????乳糖????????酪蛋白

1-1???????????100mg???????900mg

1-2???????????300mg???????700mg

1-3???????????400mg???????600mg

1-2???????????500mg???????500mg

實施例2:水溶液中酪蛋白酸鈉和乳糖的褐變反應

乳糖(400mg)和酪蛋白酸鈉(600mg)添加到50ml試管中的10ml 蒸餾水中,并用混合器振蕩試管以溶解這些物質。在高壓鍋中,120℃ 實施褐變反應20分鐘。隨后,冷凍干燥溶液得到褐色粉末。

實施例3:β-乳球蛋白和和乳糖的褐變反應

乳糖(400mg)和β-乳球蛋白(60mg)添加到15ml試管中的1.0ml 0.2N?NaOH溶液中,并用混合器振蕩溶解。試管在50℃水浴中溫育4 小時以促進褐變反應。0.2N?HCl添加到溶液中直到pH?7.0。使用 Sephadex?G-25(Amersham?Pharmacia)通過凝膠過濾使中和溶液脫 鹽,接著冷凍干燥得到褐色粉末。

實施例4:α-乳白蛋白和和乳糖的褐變反應

乳糖(400mg)和α-乳白蛋白(60mg)添加到15ml試管中的1.0ml 0.2N?NaOH溶液中,并用混合器振蕩溶解。試管在50℃水浴中溫育4 小時以促進褐變反應。以與實施例3相同的方式中和該溶液并脫鹽, 接著冷凍干燥得到褐色粉末。

實施例5:脫脂奶粉的褐變反應

奶粉(1.0g,Kyoupuro?E-22,Kyodo?Milk?Industry?Co.,Ltd.)添加 到10ml?0.2N?NaOH溶液中。攪拌混合物直到形成均勻懸液。該懸液 在50℃水浴中溫育4小時進行褐變反應。以與實施例3相同的方式中 和該溶液,接著冷凍干燥得到褐色粉末。

實施例6:乳清的褐變反應

乳清(1.0g,Simplesse?100,CP?Kelco)添加到10ml?0.2N?NaOH溶 液中。攪拌混合物直到形成均勻懸液。該懸液在50℃水浴中溫育4小 時進行褐變反應。以與實施例3相同的方式中和該溶液,接著冷凍干 燥得到褐色粉末。

實施例7:酪蛋白酸鈉和葡萄糖的褐變反應

葡萄糖(4g)和酪蛋白酸鈉(6g)添加到100ml蒸餾水中,并攪 拌混合物直到固體物質溶解。在高壓鍋中實施褐變反應,反應溫度和 反應時間如下表所示。使用Sephadex?G-25(Amersham?Pharmacia) 通過凝膠過濾除去低分子量部分后,冷凍干燥殘留物得到褐色粉末。

表2

實例??????反應溫度??????反應時間

7-1???????110℃?????????30分鐘

7-2???????120℃?????????10分鐘

7-3???????120℃?????????40分鐘

實施例8:使用碳酸氫鈉的酪蛋白酸鈉和乳糖的褐變反應

酪蛋白酸鈉(60mg)、乳糖(40mg)和碳酸氫鈉(42mg)添加到 1.5ml微試管中的1ml蒸餾水中并攪拌溶解。在熱部件上,90℃實施 褐變反應5小時。使用Sephadex?G-25(Amersham?Pharmacia)通過 凝膠過濾使該溶液脫鹽,接著冷凍干燥得到褐色粉末。

實施例9:大豆蛋白的褐變反應

乳糖(400mg)和大豆蛋白粉末(600mg,Wako?Pure?Chemical Industries,Ltd.)添加到50ml試管中的10.0ml?0.2N?NaOH溶液中, 并用混合器振蕩懸浮。懸液在40℃水浴中溫育5小時以促進褐變反應。 0.6N?HCl添加到溶液中直到pH?7.0。冷凍干燥中和溶液得到褐色粉末。

實施例10:乳清白蛋白的褐變反應

乳糖(400mg)和乳清白蛋白(600mg,Nisshin?Pharma?Inc.)添 加到50ml試管中的10.0ml?0.2N?NaOH溶液中,并用混合器振蕩溶解。 生成物在40℃水浴中溫育5小時以促進褐變反應。以與實施例9相同 的方式中和該溶液并冷凍干燥得到褐色粉末。

實施例11:卵白蛋白的褐變反應

乳糖(400mg)和卵白蛋白(600mg,Wako?Pure?Chemical Industries,Ltd..)添加到50ml試管中的10.0ml?0.2N?NaOH溶液中, 并用混合器振蕩溶解。生成物在40℃水浴中溫育5小時以促進褐變反 應。以與實施例9相同的方式中和該溶液并冷凍干燥得到褐色粉末。

實施例12:玉米蛋白和乳糖的褐變反應

乳糖(400mg)和玉米蛋白(600mg,Wako?Pure?Chemical Industries,Ltd..)添加到50ml試管中的10.0ml?0.2N?NaOH溶液中, 并用混合器振蕩溶解。溶液在40℃水浴中溫育5小時以促進褐變反應。 以與實施例9相同的方式中和該溶液并冷凍干燥得到褐色粉末。

實施例13:使用磷酸二鈉的酪蛋白和木糖的褐變反應

木糖(40mg)和酪蛋白(60mg)添加到Eppendorf管中含0.1mol/l 磷酸氫二鈉的1.0ml水溶液中,并用混合器振蕩懸浮。懸液在85℃熱 部件中溫育2小時促進褐變反應。使用Sephadex?G-25(Amersham Pharmacia)通過凝膠過濾除去低分子量部分后,冷凍干燥殘留物得 到褐色粉末。

測試實施例1:褐變反應進行的測定

根據在405nm的吸光度來估計褐變反應的進行。

實施例1至13制備的褐變反應的產物(每種50mg)溶于1ml蒸 餾水中。該溶液在10000×g下離心15分鐘,向96孔板(Nunc Immunoplate;Order?number:442404)的每孔分配每種上清100μl。 使用微板讀器(Versa?Max,Molecular?Device),采用在650nm的吸 光度作為參照波長,測定在405nm的吸光度。如表3所示,實施例制 備的所有褐變反應的產物顯示出0.1或更高的吸光度。這表明所有實 施例中褐變反應都在充分進行。

表3 ????實例 ????在405nm的吸光度(參照波長:650nm) ????1-1 ????0.363 ????1-2 ????0.956 ????1-3 ????1.017 ????1-4 ????1.03 ????2 ????0.128 ????3 ????1.761 ????4 ????1.911 ????5 ????1.431 ????6 ????1.302 ????7-1 ????0.164 ????7-2 ????0.582 ????7-3 ????1.219 ????8 ????1.893 ????9 ????0.601 ????10 ????0.561 ????11 ????0.455 ????12 ????0.347 ????13 ????0.807

測試實施例2:抑制幽門螺旋桿菌粘附的活性的測定

下列體外實驗估計實施例1至13的褐變反應的產物抑制幽門螺旋 桿菌粘附素-尿素酶與胃粘膜的粘附的作用。幽門螺旋桿菌通過幽門 螺旋桿菌粘附素-尿素酶與胃粘膜粘蛋白的特異性結合定居到宿主 胃。因此,較低濃度的能夠抑制幽門螺旋桿菌尿素酶和胃粘蛋白之間 粘附的產物具有抑制幽門螺旋桿菌粘附的更強活性。

(材料和方法)

以下列方式制備測試中使用的尿素酶和豬胃粘蛋白。

(1)尿素酶的制備

幽門螺旋桿菌#130菌株(得自Tokai?university,School?of Medicine,Laboratory?of?Infectious?Disease)在Brucella肉湯培養基中 的培養溶液(3.5×108CFU/ml)在12000×g下離心20分鐘。沉淀溶于 純化水中并用旋渦混合器混合該溶液60秒。再次離心該溶液,獲得含 尿素酶的提取物的上清。如下述實施純化。

上面提及的提取物施加到用緩沖液(20mM磷酸鹽(pH?6.8), 1mM?EDTA,1mM?2-巰基乙醇和10%PEG-300)平衡的 DEAE-Sephacel柱上,接著以0.5ml/分的流速吸收到凝膠。用0至0.5M KCl濃度梯度實施洗脫。監測每個分分的尿素酶活性。混合和濃縮具 有尿素酶活性峰的級分。隨后,濃縮物施加到用緩沖液(20mM磷酸 鹽(pH?6.8)和150mM?NaCl)平衡的Sephacryl?S-300柱上,然后洗 脫。檢測每個級分的尿素酶活性,并混合尿素酶活性峰,用SDS-PAGE 分析。結果表明目的級分包含尿素酶A(32kDa)或尿素酶B(60kDa) 蛋白。分裝尿素酶并在使用前保存在-80℃。

(2)豬胃粘蛋白的制備

殺死健康豬(大約2月齡),取出它的胃,用含0.1M磷酸鹽、0.15M NaCl、5mM?N-乙基馬來酰亞胺(NEM)、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF) 和1mM?EDTA的PBS(pH?7.4)洗滌胃的內部。切開胃,剝離粘膜, 剝離的粘膜懸于上面提及的緩沖液中。使用Polytron勻漿器在冰冷下 勻漿懸液。勻漿在15000×g下離心,在25000×g下再次離心這上清。 回收上清,用蒸餾水透析,接著冷凍干燥得到粗純化的胃粘蛋白。隨 后,脫水和粗純化的胃粘蛋白溶于PBS(pH?6.8,含6M鹽酸胍和蛋 白酶抑制劑(5mM?NEM、1mm?PMSF和1mM?EDTA)),該溶液放置 于氯化銫密度梯度(1.5g/ml)上,隨后在34000×g下離心48小時。 用雜交硝酸纖維素膜并使用高碘酸Schiff試劑染色檢測到含唾液酸的 部分。混合已顯色的部分并再次接受氯化銫密度梯度離心。混合染色 部分并冷凍干燥。隨后,使用0.1M硫酸鹽緩沖液(含0.1M?NaCl, pH?6.8)平衡的Sepharose?CL-4B柱實施凝膠過濾,接著分部收集。 混合含高蛋白水平的PAS陽性級分并用PBS(pH?6.8)透析,獲得純 化的豬胃粘蛋白。生成物使用前保存在-80℃(純化的豬胃粘蛋白)。 SDS-PAGE結果發現純化的豬胃粘蛋白由66kD糖蛋白組成。

根據常規技術生物素化純化的豬胃粘蛋白,接著用于試驗。

(3)幽門螺旋桿菌尿素酶粘附的抑制測試

向96孔微板的每孔中分配含5μg/ml幽門螺旋桿菌尿素酶的 0.05M碳酸鈉緩沖液,每孔50μl的量,微板保存在4℃過夜以使孔吸 附尿素酶。每孔用150μl含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖鹽溶液 (PBS)(pH7.0)洗滌三次,接著向其中添加150μl含3%牛血清白 蛋白的PBS(pH7.0)。微板在37℃溫育1小時進行封閉。除去溶液后, 用150μl含0.05%Tween-20的PBS(pH7.0)洗滌孔三次。

含2.5μg/ml的生物素化豬胃粘蛋白的含0.05%Tween-20的PBS (50μl,pH4.0)和給定量的測試樣品分配到每孔中,微板在37℃溫 育1小時以允許生物素化的豬粘蛋白吸附尿素酶。從孔中除去溶液, 孔用150μl含0.05%Tween-20的PBS(pH4.0)洗滌三次。此后,微 板在65℃溫育10分鐘固定其上的蛋白。孔用150μl含0.05%Tween-20 的PBS(pH7.0)洗滌三次后,向其中添加50μl含過氧化物酶標記的 鏈霉抗生物素的含0.05%Tween-20的PBS(pH7.0),生成物在室溫 溫育1小時。孔用150μl含0.05%Tween-20的PBS(pH4.0)洗滌五 次,向每孔中添加含O-鄰苯二胺二鹽酸和H2O2的底物溶液(pH?4.5), 每孔每種50μl進行過氧化物酶反應。室溫下進行反應5分鐘,添加 50μl?2N硫酸終止反應。在490nm測定每孔的吸光度。

基于下面的等式計算抑制粘附的活性。

抑制粘附的活性(%)=[1-(含樣品的孔的吸光度/不含樣品的孔 的吸光度)]×100

(4)結果

測定100μg/ml的實施例1至13的褐變反應的產物抑制粘附的活 性。發現所有產物有效抑制幽門螺旋桿菌尿素酶和豬粘蛋白之間的粘 附。結果示于表4。

表4:褐變反應的產物抑制粘附的活性 ????實施例 ????抑制粘附的活性(%) ????1-1 ????70 ????1-2 ????78 ????1-3 ????84 ????1-4 ????81 ????2 ????60 ????3 ????72 ????4 ????66 ????5 ????82 ????6 ????69 ????7-1 ????50 ????7-2 ????52 ????7-3 ????43 ????8 ????66 ????9 ????63 ????10 ????38 ????11 ????62 ????12 ????16 ????13 ????48

測試實施例3:根除幽門螺旋桿菌的體內實驗

(方法)

用對幽門螺旋桿菌感染非常敏感的NS:Hr/ICR無毛小鼠(the Institute?of?Animal?Reproduction;登記號IAR-NHI-9710, ATCC#72024)(Clin.Diagn.Lab.Immunol.5,578-582頁,1998)作為 實驗動物。用NSP335菌株(1×109CFU/小鼠)口服接種小鼠并飼養1 周。此后,實施例5或實施例8的褐變反應的產物與飼料混合,飼料 混合物供應給小鼠10周。每組的小鼠數量是6。10周后殺死每組的小 鼠,取出它們的胃,取出其中的內容物。接著使用勻漿器制備懸液。 采用該懸液作為檢測幽門螺旋桿菌的樣品。

檢測幽門螺旋桿菌的培養基(Poa?Media,分離幽門螺旋桿菌的培 養基,Eiken?Chemical?Co.,Ltd.)接種懸液,用氣裹方法(gas?pack method)在37℃培養所得培養基3天,計算菌落的數量,因而檢測幽 門螺旋桿菌。用不含褐變反應的產物的飼料喂養的組確定為對照,采 用對照組平均菌落數量為100估計作用。結果示于下表5。

表5:根除幽門螺旋桿菌的作用 ??棕黃產物 ??0.025%飼料混合物 ??0.25%飼料混合物 ???2.5%飼料混合物 ??實施例5 ??11 ??4 ???12 ??實施例8 ??48 ??18 ???10

從上面結果明顯看出,給予本發明褐變反應的產物導致小鼠胃中 幽門螺旋桿菌的量明顯降低。而且,給予實施例5和實施例8的褐變 反應的產物組的一些小鼠中沒有檢測到幽門螺旋桿菌。這表明本發明 的褐變反應的產物具有根除幽門螺旋桿菌的極好作用。

測試實施例4:根除幽門螺旋桿菌的體內實驗

測試了本發明褐變反應的產物、胃酸分泌抑制劑和能夠根除幽門 螺旋桿菌的各種物質的組合作用。

以與測試實施例3相同的方式,用實施例5的褐變反應的產物 (0.25%飼料混合物)、法莫替丁(0.01%飼料混合物)、來自雞蛋的抗 幽門螺旋桿菌尿素酶抗體(0.25%飼料混合物)、來源于牛奶乳清的粘 蛋白(0.25%飼料混合物)、酪蛋白酸鈉(0.25%飼料混合物)、兒茶素 (0.25%飼料混合物)、巖藻聚糖(0.25%飼料混合物)、奧美拉唑(0.01 %飼料混合物)、克拉霉素(0.1%飼料混合物)、阿莫西林(0.1%飼 料混合物)、硫酸葡聚糖(0.25%飼料混合物)、蜂膠提取物(0.25%飼 料混合物)或超臨界流體提取物蜂膠(0.25%飼料混合物)中之一喂 養感染幽門螺旋桿菌的小鼠。可供選擇地,用褐變反應的產物與任何 上面提及物質組合喂養它們。10周后檢測小鼠胃中的幽門螺旋桿菌。 結果,與單獨給予本發明的褐變反應的產物得到的相比較,單獨給予 任何上面的物質產生的根除率增加。結果示于表6。

表6 ?測試樣品 ????根除作用 ?棕黃產物 ????++ ?法莫替丁 ????- ?雞蛋抗體 ????++ ?來源于牛奶乳清的粘蛋白 ????++ ?酪蛋白酸鈉 ????+ ?兒茶素 ????+ ?巖藻聚糖 ????+ ?奧美拉唑 ????- ?克拉霉素 ????++ ?阿莫西林 ????++ ?硫酸葡聚糖 ????++ ?蜂膠 ????+ ?超臨界流體提取蜂膠 ????+ ?棕黃產物+法莫替丁 ????+++ ?棕黃產物+來自雞蛋的抗體 ????+++ ?棕黃產物+來源于牛奶乳清的粘蛋白 ????+++ ?棕黃產物+酪蛋白酸鈉 ????+++ ?棕黃產物+兒茶素 ????+++ ?棕黃產物+巖藻聚糖 ????+++ ?棕黃產物+奧美拉唑 ????+++ ?棕黃產物+克拉霉素 ????+++ ?棕黃產物+阿莫西林 ????+++ ?棕黃產物+硫酸葡聚糖 ????+++ ?棕黃產物+蜂膠 ????+++ ?棕黃產物+超臨界流體提取蜂膠 ????+++

下文給出含本發明褐變反應的產物的藥物組合物的實施例和含本 發明褐變反應的產物的食品。

實施例14:干湯

以如下述方式,制備具有下列組成的干湯。

肉提取物、洋蔥提取物、胡蘿卜糊、sea?tangle提取物、鹽和鮮味 劑混合,接著使用攪拌器攪拌。加入乳化劑,攪拌生成物。隨后,加 入褐變反應的產物和很好打勻的雞蛋,接著混合。最后,添加調味劑 (spice),并攪拌混合。冷凍干燥生成物得到干湯。

本發明褐變反應的產物?????????????23

雞蛋?????????????????????????????26

肉提取物?????????????????????????5

洋蔥提取物???????????????????????17

胡蘿卜糊?????????????????????????21

sea?tangle提取物?????????????????1

乳化劑???????????????????????????1

鹽???????????????????????????????2

調味劑(紅辣椒)???????????????????2

鮮味劑(如氨基酸)?????????????????2???????????

總量?????????????????????????????100(質量%)

實施例15:細粒

用濕制粒技術制備具有下列成分的細粒。

本發明褐變反應的產物?????????????45

乳糖(賦形劑)?????????????????????35

玉米淀粉?????????????????????????15

聚乙烯吡咯烷酮PVP(K-30)??????????5????????????

總量?????????????????????????????100(質量%)

實施例16:醫學流體食物

制備具有下列成分的醫學流體食物(200ml/袋)。

礦物質、磷酸鈉和磷酸鉀添加到少量水中,并攪拌混合物。向其 中添加褐變反應的產物、麥芽糖糊精、酪蛋白酸鈉和乳化劑、牛奶蛋 白和少量水,所得混合物加熱至大約50℃,隨后攪拌。上面提及的物 質懸浮后,溶液冷卻至室溫,添加菜籽油、維生素、調味劑、穩定劑 和剩余的水得到含褐變反應的產物的醫學流體食物。

本發明褐變反應的產物??????????3.6

麥芽糖糊精????????????????????38.0

酪蛋白酸鈉????????????????????13.0

菜籽油????????????????????????12.0

維生素????????????????????????1.0

礦物質????????????????????????1.5

乳化劑????????????????????????0.2

牛奶蛋白??????????????????????10.3

磷酸鈉????????????????????????1.8

磷酸鉀????????????????????????1.2

調味劑????????????????????????0.5

穩定劑(carragheenan)??????????1.5

水????????????????????????????余量?????????

總量??????????????????????????100(重量%)

實施例17:片劑

用常規濕壓縮技術獲得片劑。

本發明褐變反應的產物??????????40.0

D-甘露糖醇????????????????????20.0

乳糖??????????????????????????20.0

晶體纖維素????????????????????10.0

羥丙基纖維素??????????????????5.0

檸檬酸????????????????????????5.0??????????

總量??????????????????????????100(質量%)

實施例18:茶飲料

以下述方式,制備具有下列成分的茶飲料(綠茶和烏龍茶)。

使3g綠茶在100ml水中85℃浸泡5分鐘來制備綠茶提取物。或 者,使4g烏龍茶在100ml水中95℃浸泡5分鐘來制備烏龍茶提取物。 綠茶提取物或烏龍茶提取物與其五倍體積的褐變反應的產物混合,并 攪拌混合物。褐變反應的產物變懸浮后,添加剩余茶提取物得到含褐 變反應的產物的茶飲料。

本發明褐變反應的產物??????????1

綠茶提取物????????????????????99??????????

總量??????????????????????????100(質量%)

實施例19:可可飲料

制備具有下列組分的可可飲料。

可可(Morinaga?Milk?Industry?Co.,Ltd.)添加到褐變反應的產物 中,并攪拌混合物。向其中添加褐變反應的產物的五倍體積的熱水(大 約80℃),隨后攪拌為懸液。獲得懸液后,添加剩余的熱水和奶得到 可可飲料。

本發明褐變反應的產物??????????5

可可??????????????????????????5

牛奶??????????????????????????20

水????????????????????????????70???????????

總量??????????????????????100(質量%)

實施例20:咖啡飲料

制備具有下列組成的咖啡飲料。

在100ml水中,95℃提取咖啡沉渣(6g)1分鐘來制備咖啡提取 物。添加褐變反應的產物體積的五倍的咖啡提取物和糖,混合物攪拌 為懸液。添加剩余咖啡提取物和牛奶得到含褐變反應的產物的咖啡飲 料。

本發明褐變反應的產物?????????2

糖???????????????????????????1

牛奶?????????????????????????30

咖啡提取物???????????????????67??????????

總量?????????????????????????100(質量%)

實施例21:香蕉奶昔(milk?shake)

制備具有下列組成的香蕉奶昔。

褐變反應的產物、牛奶和香蕉放置于家庭混合器中制成懸液。最 后,添加維生素C得到含褐變反應的產物的香蕉奶昔。

本發明褐變反應的產物??????????2

維生素C???????????????????????0.5

牛奶??????????????????????????40

香蕉??????????????????????????57.5????????

總量??????????????????????????100(質量%)

實施例22:Furikake

制備具有下列組成的Furikake。

本發明褐變反應的產物?????????????????40

調味干燥狐鰹片(bonito?flakes)????????25

調味白芝麻???????????????????????????20

調味海藻?????????????????????????????10

維生素E??????????????????????????????5???????????

總量?????????????????????????????????100(質量%)

實施例23:發酵牛奶飲料

含乳酸菌的發酵牛奶(25g,Yakult)添加5g本發明的褐變反應 的產物,接著在其中懸浮。懸浮后,添加70g含乳酸菌的發酵牛奶得 到含褐變反應的產物的發酵牛奶飲料。

實施例24:牛奶飲料

牛奶(25g)添加5g本發明的褐變反應的產物進行懸浮。獲得懸 液后,添加70g牛奶得到含褐變反應的產物的牛奶飲料。

工業實用性

本發明提供了具有根除幽門螺旋桿菌的很好活性的幽門螺旋桿菌 粘附抑制劑,它非常安全,并且沒有副作用。不象常規抗生素,本發 明的粘附抑制劑可特異性根除胃中幽門螺旋桿菌,沒有耐藥菌株數量 增加的問題。因此,本發明的幽門螺旋桿菌粘附抑制劑和含其的藥物 組合物和食品可有效預防和改善與幽門螺旋桿菌相關的疾病,如消化 性潰瘍。

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