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用于癌癥診斷與治療的靶向納米粒傳輸系統的構建方法.pdf

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用于 癌癥 診斷 治療 靶向 納米 傳輸 系統 構建 方法
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摘要
申請專利號:

CN201110008653.0

申請日:

20110114

公開號:

CN102172410A

公開日:

20110907

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K49/16,A61K47/42,A61K31/337,A61P35/00 主分類號: A61K49/16,A61K47/42,A61K31/337,A61P35/00
申請人: 華南理工大學
發明人: 魏坤,凌友
地址: 510640 廣東省廣州市天河區五山路381號
優先權: CN201110008653A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110008653.0

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了用于癌癥診斷與治療的靶向納米粒傳輸系統的構建方法。以單鏈抗體為介導構建載超順磁性四氧化三鐵和抗腫瘤藥物的納米粒傳輸系統,靶向給藥,向全身傳遞抗腫瘤藥物至靶部位來治療癌癥,利用抗體-抗原高特異性結合作用識別靶點,可使藥物在體內傳輸具有主動靶向性,既可提高藥效,又可減少藥物對正常組織的毒副作用;同時該系統還可作為核磁共振成像技術造影劑以提高實時監測靶部位腫瘤變化情況的準確性。

權利要求書

1.用于癌癥診斷與治療的靶向納米粒傳輸系統的構建方法,其特征在于,包括以下步驟:(1)利用巰基乙胺裂解雙鏈抗體,獲得具有游離巰基的單鏈抗體;(2)α-氨基聚乙二醇修飾的單鏈抗體的制備:將上述具有游離巰基的單鏈抗體與含有α-氨基-ω-馬來酰亞胺聚乙二醇和EDTA的PBS緩沖液混合后在4℃孵育12h,脫鹽柱純化后獲得α-氨基聚乙二醇修飾的單鏈抗體;(3)載抗腫瘤藥物和超順磁四氧化三鐵的納米粒的制備:稱取5~15mg抗腫瘤藥物和20mg超順磁四氧化三鐵,溶于二氯甲烷中,混勻1h;將100mg的端羧基聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物溶于其中,在超聲條件下,加入質量分數2%的聚乙烯醇水溶液中;揮去有機溶劑,離心,超濾,水洗3~5次,冷凍干燥,得載抗腫瘤藥物和超順磁四氧化三鐵的納米粒;(4)靶向納米粒傳輸系統的制備:將步驟(3)制得的納米粒分散在水中,加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽,孵育2h;加入步驟(2)制得的α-氨基聚乙二醇修飾的單鏈抗體,4℃孵育12h;離心.,脫鹽柱純化后得到用于癌癥診斷與治療的靶向納米粒傳輸系統。2.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)中,所述利用巰基乙胺裂解雙鏈抗體包括以下步驟:(1)將10μg雙鏈抗體加入到10μL?0.5mol/L的EDTA溶液中;(2)將60mg巰基乙胺溶解在0.5mL含10μL?0.5mol/L?EDTA的PBS緩沖液中,4℃孵育15min,得到巰基乙胺溶液;(3)將上述巰基乙胺溶液加入到步驟(1)得到的溶液中,37℃孵育1.5h;(4)脫鹽柱純化除去過量巰基乙胺。3.根據權利要求1或2所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)中,所述雙鏈抗體為抗表皮生長因子受體抗體、免疫球蛋白G抗體、血管內皮生長因子受體抗體或細胞表面抗原抗體。4.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(3)中,所述離心的轉速為2500rpm,超濾的轉速為6000rpm。5.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(3)中,所述抗腫瘤藥物為紫杉醇或多西紫杉醇。6.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(3)中,所述超順磁四氧化三鐵為油酸或油胺改性的納米四氧化三鐵顆粒,粒子直徑為6~12nm,300K下磁飽和強度值為50~90emu/g。

說明書

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技術領域

本發明屬于抗腫瘤藥物傳遞、癌癥的核磁共振成像(簡稱:MRI)診斷與治療和分子靶向領域。涉及用于癌癥診斷與治療的靶向納米粒傳輸系統的構建方法,具體地涉及單鏈抗體靶向載超順磁性四氧化三鐵和抗腫瘤藥物的納米粒傳輸系統的構建方法。

背景技術

納米粒藥物制劑具有改善難溶藥物的溶解度、延長藥物作用時間、提高生物利用度、改變和改善藥物的動力學性質等優點,已成為近年來醫藥學領域研究的重要方向之一。一般情況下,未經表面修飾的納米顆粒進入血液循環,大部分被單核巨噬細胞系統中的巨噬細胞吞噬,將藥物富集于肝、脾和肺等器官中,而粒徑小于50nm的納米粒則易進入骨髓,這些器官和組織是載藥納米粒的天然靶器官,可利用巨噬細胞的吞噬作用達到被動靶向給藥的目的。但是,對于其他的組織或器官來說,由于僅有少部分納米顆粒經通透性大的血管進入,加之這種載藥納米顆粒在血液循環中存在時間短,滲透入組織的藥物量極少,難以達到所需的有效治療濃度。因此,開發利用抗體、細胞膜表面受體或特定基因片段的專一性作用,將配位子結合在載體上,在啟動子的作用下與目標細胞表面的抗原性識別器進行特異性結合,使藥物能夠準確送到靶細胞中,實現主動靶向治療是現代靶向制劑發展的趨勢之一。

影像學診斷在癌癥的早期診斷和治療監測中具有重要的地位。其中,MRI相對于放射造影技術,無輻射;相對于超聲探測技術,其成像更加清晰,分辨率高;因此對于癌癥患者的術前評估、手術方案的制定和術后隨訪具有重要的意義。目前臨床上廣泛使用釓的螯合物作為MRI增強造影劑,但是,該類造影劑對早期腫瘤和微轉移診斷的敏感性不高,不能準確區分腫瘤和正常組織的分界,并且會增加腎系統性纖維化的風險,因此開發新的MRI增強造影劑來提高MRI對于早期癌癥及其微轉移的診斷準確性意義重大。隨著現代醫學的發展,體內靶向示蹤成為有效的診斷早期腫瘤的新技術。利用磁性納米微粒表面結合親和力分子如單克隆抗體,能為識別腫瘤細胞提供靶向。因此構建用于體內靶向示蹤的癌癥診斷與治療的靶向納米粒傳輸系統是現代癌癥診斷治療的最新趨勢之一。

發明內容

本發明的目的是提供一種癌癥MRI診斷與治療的靶向納米粒傳輸系統的構建方法。利用構建一種單鏈抗體靶向載超順磁性四氧化三鐵和抗腫瘤藥物的納米粒傳輸系統,用于體內傳遞抗腫瘤藥物至靶部位來治療癌癥,以及作為MRI技術造影劑來提高實時監測腫瘤變化情況的準確性。

本發明的目的通過以下技術方案來實現:

用于癌癥診斷與治療的靶向納米粒傳輸系統的構建方法,包括以下步驟:

(1)利用巰基乙胺裂解雙鏈抗體,獲得具有游離巰基的單鏈抗體;

(2)α-氨基聚乙二醇修飾的單鏈抗體的制備:將上述具有游離巰基的單鏈抗體與含有α-氨基-ω-馬來酰亞胺聚乙二醇和EDTA的PBS緩沖液混合后在4℃孵育12h,脫鹽柱純化后獲得α-氨基聚乙二醇修飾的單鏈抗體;

(3)載抗腫瘤藥物和超順磁四氧化三鐵的納米粒的制備:稱取5~15mg抗腫瘤藥物和20mg超順磁四氧化三鐵,溶于二氯甲烷中,混勻1h;將100mg的端羧基聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物溶于其中,在超聲條件下,加入質量分數2%的聚乙烯醇水溶液中;揮去有機溶劑,離心,超濾,水洗3~5次,冷凍干燥,得載抗腫瘤藥物和超順磁四氧化三鐵的納米粒;

(4)靶向納米粒傳輸系統的制備:將步驟(3)制得的納米粒分散在水中,加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽,孵育2h;加入步驟(2)制得的α-氨基聚乙二醇修飾的單鏈抗體,4℃孵育12h;離心.,脫鹽柱純化后得到用于癌癥診斷與治療的靶向納米粒傳輸系統。

本發明所述利用巰基乙胺裂解雙鏈抗體包括以下步驟:將10μg雙鏈抗體加入到10μL0.5mol/L的EDTA溶液中;將60mg巰基乙胺溶解在0.5mL含10μL?0.5mol/L?EDTA的PBS緩沖液中,4℃孵育15min,得到巰基乙胺溶液;將上述巰基乙胺溶液加入到步驟(1)得到的溶液中,37℃孵育1.5h;脫鹽柱純化除去過量巰基乙胺。

本發明步驟(1)中,所述雙鏈抗體為抗表皮生長因子受體抗體、免疫球蛋白G抗體、血管內皮生長因子受體抗體或細胞表面抗原抗體。

本發明步驟(3)中,所述離心的轉速為2500rpm,超濾的轉速為6000rpm。

本發明步驟(3)中,所述抗腫瘤藥物為紫杉醇或多西紫杉醇。

本發明步驟(3)中,所述超順磁四氧化三鐵為油酸或油胺改性的納米四氧化三鐵顆粒,粒子直徑為6~12nm,300K下磁飽和強度值為50~90emu/g。

本發明所述超順磁四氧化三鐵為油酸或油胺改性的納米四氧化三鐵顆粒,粒子直徑為6~12nm,300K下磁飽和強度值為50~90emu/g。

本發明所述油酸或油胺改性的納米四氧化三鐵顆粒的制備參考了以下文獻:Sun?S,Zeng?H,Robinson?DB,Raoux?S,Rice?PM,Wang?SX,Li?G.,Monodisperse?MFe2O4(M=Fe,Co,Mn)Nanoparticles,Journal?of?the?American?Chemical?Society,2004,126:273-279。具體包括以下步驟:

(1)將2mmol乙酰丙酮鐵、10mmol?1,2-十六烷二醇、6mmol油酸和6mmol油胺,加入三口反應瓶中,氮氣保護下加入20ml二芐醚溶解后,在沙浴中加熱到200℃回流攪拌2h;

(2)加熱到300℃回流1h,反應體系由暗紅色變為黑色后移去熱源,自然冷卻;

(3)將上述反應物沉淀在80ml乙醇中,在10000rpm轉速下離心5分鐘,棄去上層清液,下層沉淀溶解在分別加有0.5ml油酸和油胺的35ml正己烷中;10000rpm轉速下離心10分鐘,去掉不溶解部分,溶液再沉淀在100ml乙醇中;10000rpm轉速下離心10分鐘,得下層沉淀即為納米四氧化三鐵,置于4℃下保存備用。

本發明與現有技術相比,具有以下有益效果:

1.利用功能化聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物、聚乙烯醇衍生物等高分子作為載體材料,具有良好的生物相容性、可降解性和緩釋藥物性能;

2.以單鏈抗體修飾納米粒,可將包載抗腫瘤藥物和磁性顆粒的納米粒特異性導向目標靶點,從而提高納米粒載體的靶向性,增加藥物的生物利用度,降低全身毒副作用;

3.納米粒載超順磁性四氧化三鐵納米顆粒可作為MRI技術造影劑,提高腫瘤部位的成像與實時監測的準確性。

附圖說明

圖1為實施例1所制備納米粒傳輸系統的抗腫瘤藥物釋放曲線。

圖2為實施例2所制備納米粒傳輸系統的細胞吸收后MRI成像T2加權圖,a,b分別為細胞吸收納米粒傳輸系統后和空白細胞的T2的加權信號。

圖3為實施例2所制備納米粒傳輸系統的腫瘤細胞吸收后的激光共聚焦照片,納米粒傳輸系統包載綠色熒光染料香豆素作為示蹤,腫瘤細胞用藍色熒光染料染細胞核部位。

圖4為普通納米粒的腫瘤細胞吸收后的激光共聚焦照片,納米粒傳輸系統包載綠色熒光染料香豆素作為示蹤,腫瘤細胞用藍色熒光染料染細胞核部位。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步說明,但本發明的實施方式不限于此。

實施例1

(1)雙鏈抗體裂解制備單鏈抗體:將20μL的毛細血管內皮細胞表面細胞間粘附分子-1(簡稱:ICAM-1)的單克隆抗體(簡稱:AbICAM-1,0.5mg/ml,分子量:95kDa)加入到10μL?0.5mol/L的EDTA溶液中;將60mg巰基乙胺溶解在0.5mL含10μL?0.5mol/L?EDTA的PBS緩沖液中,4℃預冷孵育處理15min;把巰基乙胺溶液加入到AbICAM-1溶液中,37℃孵育1.5h;用脫鹽柱(型號:PD-10?Desalting?Columns,GE?Healthcare,MWCO=5000Da)除掉過量的巰基乙胺。

(2)α-氨基聚乙二醇修飾的單鏈抗體的制備:將含有α-氨基-ω-馬來酰亞胺聚乙二醇(簡稱:mal-PEG-NH2)和10μL?0.5mol/L?EDTA的PBS緩沖液先在冰箱里預冷15分鐘到4℃,向其中加入步驟(1)得到的單鏈抗體并混和,在4℃孵育12h;用脫鹽柱純化得α-氨基聚乙二醇修飾的毛細血管內皮細胞表面細胞間粘附分子-1單鏈單克隆抗體(簡稱:NH2-PEG-scAbICAM-1)。

(3)載抗腫瘤藥物和超順磁四氧化三鐵的PLGA納米粒的制備:準確稱取10mg的抗腫瘤藥物紫杉醇(簡稱:PTX)和20mg超順磁四氧化三鐵(簡稱:USPIO),溶于4ml二氯甲烷中,混勻孵育1h;稱取100mg端羧基聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物(簡稱:PLGA-COOH,LA∶GA=50∶50)溶于其中,在超聲條件下,滴入100ml質量分數2%的聚乙烯醇水溶液中;揮去有機溶劑,以2500rpm離心去除大顆粒雜質,以6000rpm截留分子量3500的超濾離心去除聚乙烯醇,水洗3~5次,冷凍干燥,得載紫杉醇和四氧化三鐵的納米粒(簡稱:USPIO-PTX-PLGA-COOH)。

(4)靶向納米粒傳輸系統的制備:稱取10mg上述步驟(3)制得的納米粒分散在水中,加入10μg?N-羥基琥珀酰亞胺和10μg?1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽,室溫孵育2h;加入步驟(2)制得的NH2-PEG-scAbICAM-1,4℃孵育12h,離心去除雜質,脫鹽柱純化后得單鏈抗體靶向載超順磁性四氧化三鐵和抗腫瘤藥物的納米粒傳輸系統(簡稱:USPIO-PTX-PLGA-PEG-scAbICAM-1)。

圖1表明通過本發明構建的納米粒傳輸系統具有良好的藥物緩釋效果,無明顯初期藥物突釋,緩釋時間長達800h。

實施例2

(1)雙鏈抗體裂解制備單鏈抗體:將50μL的前列腺癌干細胞抗原(簡稱:PSCA)的單克隆抗體(簡稱:AbPSCA,0.2mg/ml,分子量:29kDa)加入到10μL?0.5mol/L的EDTA溶液中;將60mg巰基乙胺溶解在0.5mL含10μL?0.5mol/L?EDTA的PBS緩沖液中,4℃預冷孵育處理15min;把巰基乙胺溶液加入到AbPSCA溶液中,37℃孵育1.5h;用脫鹽柱(型號:PD-10?Desalting?Columns,GE?Healthcare,MWCO=5000Da)除掉過量的巰基乙胺。

(2)α-氨基聚乙二醇修飾的單鏈抗體的制備:將含有α-氨基-ω-馬來酰亞胺聚乙二醇(簡稱:mal-PEG-NH2)和10μL?0.5mol/L?EDTA的PBS緩沖液先在冰箱里預冷15分鐘到4℃,向其中加入步驟(1)得到的單鏈抗體并混和,在4℃孵育12h;用脫鹽柱純化得α-氨基聚乙二醇修飾的前列腺癌干細胞抗原單鏈單克隆抗體(簡稱:NH2-PEG-scAbPSCA)。

(3)載抗腫瘤藥物和超順磁四氧化三鐵的PLGA納米粒的制備:準確稱取10mg的抗腫瘤藥物多西紫杉醇(簡稱:DTX)和20mg超順磁四氧化三鐵(簡稱:USPIO),溶于4ml二氯甲烷中,混勻孵育1h;稱取100mg端羧基聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物(簡稱:PLGA-COOH,LA∶GA=50∶50)溶于其中,在超聲條件下,滴入100ml質量分數2%的聚乙烯醇水溶液中;揮去有機溶劑,以2500rpm離心去除大顆粒雜質,以6000rpm截留分子量3500的超濾離心去除聚乙烯醇,水洗3~5次,冷凍干燥,得載紫杉醇和四氧化三鐵的納米粒(簡稱:USPIO-DTX-PLGA-COOH)。

(4)靶向納米粒傳輸系統的制備:稱取10mg上述步驟(3)制得的納米粒分散在水中,加入10μg?N-羥基琥珀酰亞胺和10μg?1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽,室溫孵育2h;加入步驟(2)制得的NH2-PEG-scAbPSCA,4℃孵育12h,離心去除雜質,脫鹽柱純化后得單鏈抗體靶向載超順磁性四氧化三鐵和抗腫瘤藥物的納米粒傳輸系統(簡稱:USPIO-DTX-PLGA-PEG-scAbPSCA)。

圖2表明,細胞吸收納米粒傳輸系統后MRI成像T2加權信號強度明顯減弱,圖像變得更黑,信號對比度顯著增強,可見通過本發明構建的納米粒傳輸系統作為MRI造影劑可提高腫瘤部位的成像與實時監測的準確性。

圖3與圖4表明,與普通的納米粒相比,通過本發明構建的納米粒傳輸系統具有較高的靶向性。

實施例3

(1)雙鏈抗體裂解制備單鏈抗體:將10μL的貝伐單抗(簡稱:Avastin)的單克隆抗體(簡稱:AbAvastin,1mg/ml,分子量:149kDa)加入到10μL?0.5mol/L的EDTA溶液中;將60mg巰基乙胺溶解在0.5mL含10μL?0.5mol/L?EDTA的PBS緩沖液中,4℃預冷孵育處理15min;把巰基乙胺溶液加入到AbAvastin溶液中,37℃孵育1.5h;用脫鹽柱(型號:PD-10Desalting?Columns,GE?Healthcare,MWCO=5000Da)除掉過量的巰基乙胺。

(2)α-氨基聚乙二醇修飾的單鏈抗體的制備:將含有α-氨基-ω-馬來酰亞胺聚乙二醇(簡稱:mal-PEG-NH2)和10μL?0.5mol/L?EDTA的PBS緩沖液先在冰箱里預冷15分鐘到4℃,向其中加入步驟(1)得到的單鏈抗體并混和,在4℃孵育12h;用脫鹽柱純化得α-氨基聚乙二醇修飾的前列腺癌干細胞抗原單鏈單克隆抗體(簡稱:NH2-PEG-scAbAvastin)。

(3)載抗腫瘤藥物和超順磁四氧化三鐵的PLGA納米粒的制備:準確稱取15mg的抗腫瘤藥物多西紫杉醇(簡稱:DTX)和20mg超順磁四氧化三鐵(簡稱:USPIO),溶于4ml二氯甲烷中,混勻孵育1h;稱取100mg端羧基聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物(簡稱:PLGA-COOH,LA∶GA=50∶50)溶于其中,在超聲條件下,滴入100ml質量分數2%的聚乙烯醇水溶液中;揮去有機溶劑,以2500rpm離心去除大顆粒雜質,以6000rpm截留分子量3500的超濾離心去除聚乙烯醇,水洗3~5次,冷凍干燥,得載紫杉醇和四氧化三鐵的納米粒(簡稱:USPIO-DTX-PLGA-COOH)。

(4)靶向納米粒傳輸系統的制備:稱取10mg上述步驟(3)制得的納米粒分散在水中,加入10μg?N-羥基琥珀酰亞胺和10μg?1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽,室溫孵育2h;加入步驟(2)制得的NH2-PEG-scAbAvastin,4℃孵育12h,離心去除雜質,脫鹽柱純化后得單鏈抗體靶向載超順磁性四氧化三鐵和抗腫瘤藥物的納米粒傳輸系統(簡稱:USPIO-DTX-PLGA-PEG-scAbAvastin)。

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