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殼聚糖及其衍生物在制備抗幽門螺桿菌產品中的應用.pdf

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聚糖 及其 衍生物 制備 幽門 螺桿 產品 中的 應用
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摘要
申請專利號:

CN200410099063.3

申請日:

20041224

公開號:

CN1660128A

公開日:

20050831

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/722,A61K45/06,A61P31/04,A61P1/04 主分類號: A61K31/722,A61K45/06,A61P31/04,A61P1/04
申請人: 謝勇,周南進
發明人: 謝勇,周南進,周小江,呂農華
地址: 330006江西省南昌市永外正街江西醫學院一附院消化科
優先權: CN200410099063A
專利代理機構: 江西省專利事務所 代理人: 張文
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法律狀態
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CN200410099063.3

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種殼聚糖及其衍生物在制藥領域中的新用途,即殼聚糖及其衍生物在制備抗幽門螺桿菌或制備防治幽門螺桿菌引起的胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍的產品中的應用。本發明通過實驗證實了殼聚糖及其衍生物對幽門螺桿菌有普遍的抑菌作用。殼聚糖在抗幽門螺桿菌的作用機理為:①殼聚糖分子中的-NH+3基團與幽門螺桿菌外膜的帶負電荷的物質相互作用,破壞其結構、功能和通透性,使細菌內容物滲出,細菌破裂;②殼聚糖通過破損的細胞外膜進入幽門螺桿菌內,與胞質作用,擾亂其代謝。③本發明通過實驗還證實了殼聚糖對幽門螺桿菌感染胃黏膜局部的免疫調節作用,這也是它抗幽門螺桿菌的機理之一。

權利要求書

1、殼聚糖在制備抗幽門螺桿菌產品中的應用。2、殼聚糖在制備幽門螺桿菌引起的胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍的產品中的應用。3、殼聚糖衍生物在制備抗幽門螺桿菌產品中的應用。4、殼聚糖衍生物在制備幽門螺桿菌引起的胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍的產品中的應用。5、如權利要求1-4中任意一項所述的殼聚糖及其衍生物在制備抗幽門螺桿菌或幽門螺桿菌引起的胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍的產品中的應用,其特征在于:所述產品為藥品、保健品、添加劑或生物制劑。6、如權利要求3或4中所述的殼聚糖及其衍生物在制備抗幽門螺桿菌或幽門螺桿菌引起的胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍的產品中的應用,其特征在于:所述殼聚糖衍生物為羧甲基殼聚糖。7、殼聚糖對幽門螺桿菌感染胃黏膜局部的免疫調節作用。8、如權利要求5所述的殼聚糖及其衍生物在制備抗幽門螺桿菌產品中的應用,其特征在于:殼聚糖及其衍生物作為添加劑加入到口腔衛生用品、食物或飲料用于防治幽門螺桿菌感染。9?如權利要求5所述的殼聚糖及其衍生物在制備抗幽門螺桿菌產品中的應用,其特征在于:殼聚糖及其衍生物與一種附加的抗菌制劑結合在一起服用。

說明書

?

技術領域

本發明涉及藥物用途發明領域,尤其是涉及一種殼聚糖在制備抗幽門螺桿菌 產品中的應用。

背景技術

殼聚糖(Chitosan),又名幾丁聚糖,化學名稱為聚合β-(1,4)-2-氨基-D- 葡萄糖,即在甲殼素2號位上脫去乙酰基暴露出-NH2基因而形成的產物,是一高 分子量的直鏈多糖,分子式是(C6H11NO4)n,約在185℃時分解。它的平均分子質量 為1MDa,分子鏈長度大約為5000個單位,但在實際應用中,它的分子量大小即 聚合程度隨著不同的需要而變化。殼聚糖為白色或淡黃色粉末,不溶于中性與 堿性水溶液以及絕大部分有機溶劑,可溶于單價無機酸和有機酸。其溶解度取 決于殼聚糖的脫乙酰度、分子量與溶液的pH值,一般情況下,其分子量越小、 脫乙酰度越高,溶解性越好。隨著脫乙酰度(DD)、分子量等理化性質的不同, 殼聚糖的解離常數(pKa)也發生變化。當pH值低于pKa時,殼聚糖分子的氨 基基團即質子化,從而使整個分子帶正電荷,這是殼聚糖分子發揮其生物學特 性的一個重要特點。殼聚糖廣泛存在于甲殼動物外殼、節肢動物表皮、低等動 物細胞膜、高等植物細胞壁等生物組織中,是自然界少見的帶正電荷的聚合物。

由于殼聚糖安全無毒、幾乎無免疫原性、可生物降解并有良好的生物相容性, 并且具有增強免疫、促進傷口愈合、促進上皮細胞增生和血管生成、止血、抗 菌、抑制腫瘤、降血糖、血脂等多種生理活性。因此近年來被廣泛的應用于醫 學領域。

幽門螺桿菌(Helicobacter?Pylori,Hp)已被公認為慢性胃炎、消化性潰 瘍和胃癌的重要致病因子,世界衛生組織已將其列為I類致癌因子,因而有效 根除幽門螺桿菌對于預防幽門螺桿菌的相關性疾病,特別是胃癌的發生具有十 分重要的意義。目前根除幽門螺桿菌雖有多種藥物聯合療法,但仍存在許多問 題,如幽門螺桿菌耐藥菌株的產生,藥物價格昂貴,副作用大以及病人依從性 差等。因此,目前尚無一個簡單、有效、經濟、無毒副作用、病人依從性好、 耐藥率低的理想治療方案。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供殼聚糖的新用途,即殼聚糖在制備抗幽門螺桿菌 或幽門螺桿菌引起的胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍的產品中的應用,它能有效抗擊幽 門螺桿菌,擾亂其新陳代謝。

本發明的第二個目的在于提供殼聚糖衍生物的新用途,即殼聚糖衍生物在制 備抗幽門螺桿菌或幽門螺桿菌引起的胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍的產品中的應用, 它們能有效抗擊幽門螺桿菌,擾亂其新陳代謝。

所述產品為藥品、保健品、添加劑或生物制劑。

所述殼聚糖衍生物為羧甲基殼聚糖。

本發明的第三個目的在于提供殼聚糖對幽門螺桿菌感染胃黏膜局部的免疫 調節作用。

本發明的第四個目的在于提供殼聚糖及其衍生物作為添加劑加入到口腔衛 生用品、食物或飲料用于防治幽門螺桿菌感染。

本發明的第五個目的在于提供殼聚糖及其衍生物與一種附加的抗菌制劑結 合在一起服用。

殼聚糖在抗幽門螺桿菌的作用機理為:①殼聚糖分子中的-NH+3基團與幽門螺 桿菌外膜的帶負電荷的物質相互作用,破壞其結構、功能和通透性,使細菌內 容物滲出,細菌破裂;②殼聚糖通過破損的細胞外膜進入幽門螺桿菌內,與胞 質作用,擾亂其代謝;③在生物體內殼聚糖調節胃黏膜局部免疫反應參與了其 抗幽門螺桿菌的機理。

為了更好地理解本發明的實質,下面以實驗和結果來證明殼聚糖的用途。

本發明分殼聚糖體外抗幽門螺桿菌作用和體內抗幽門螺桿菌作用兩部分。 第一部分:殼聚糖體外抗幽門螺桿菌作用

A、材料與方法

一、主要材料與儀器

1、試劑

空腸彎曲菌瓊脂基礎,(中國腹瀉病控制上海試劑供應中心產品)

布氏肉湯培養基礎(中國腹瀉病控制上海試劑供應中心產品);

無菌綿羊血(上海畜牧養殖場產品);

CO2、N2(南昌氣體廠產品);

70%脫乙酰度殼聚糖(DD70殼聚糖)、88.5%脫乙酰度殼聚糖(DD88.5)及羧甲基殼 聚糖(上海其勝生物制品有限公司產品);

羧甲基纖維素(新西蘭進口分裝);

磺化殼聚糖(自制)

冰乙酸(分析純,廣東西隴化工廠產品)

葡萄糖檢測試劑(四川省邁克科技有限責任公司產品)

天門冬氨酸氨基轉移酶試劑盒(上海華科-東菱診斷用品有限公司產品)

幽門螺桿菌國際標準菌株NCTC11639、NCTC11637和SS1(由中國幽門螺桿菌菌 株庫提供)

2、儀器

MCO-175M型三氣培養箱(日本三洋公司產品):

電熱干燥箱(上海醫療器械廠產品);

湘儀-島津-200型電子分析天平(湘儀天平儀器廠進口組裝);

MDF-U281-80℃低溫冰箱(日本三洋公司產品);

YJ-1003A型超凈工作臺(蘇州凈化設備公司產品),

TE-A型微量振蕩儀(江蘇泰倉醫療器械廠產品);

貝克曼5700核酸分析儀(美國貝克曼公司產品)

HITACHI7150全自動生化分析儀(日本日立公司產品)

pHS-3C型酸度計(廈門分析儀器廠產品)

HITACHI?S-570掃描電鏡(日本日立公司產品)

HITACHI?H-600透射電鏡(日本日立公司產品)

二、實驗方法

(一)、殼聚糖及其衍生物抗幽門螺桿菌作用的體外研究

1、不同濃度和pH值的殼聚糖及其衍生物溶液的配制

(1)、不同濃度和pH值羧甲基殼聚糖的配制:稱取羧甲基殼聚糖分別溶于滅菌 的蒸餾水、0.5%和1%冰乙酸溶液中,羧甲基殼聚糖的濃度分別為1%、2%、3%、 4%、5%,共3類15種溶液;無冰乙酸和含0.5%、1%冰乙酸的羧甲基殼聚糖溶液 的pH值分別為6、5、4;

(2)、不同濃度和pH值的70%和88.5%脫乙酰度殼聚糖的配制:稱取70%和88.5% 脫乙酰度殼聚糖分別溶于滅菌的1%、2%、3%冰乙酸溶液,兩種殼聚糖的濃度分 別為0.5%、1%、1.5%和2%,共6類24種溶液,含1%、2%和3%的冰乙酸的殼聚 糖溶液的pH值分別為6、5、4,放置24小時,待殼聚糖完全溶解后使用;

(3)、不同濃度和pH值羧甲基纖維素溶液的配制:稱取羧甲基纖維素,分別溶 于滅菌蒸餾水、0.5%和1%冰乙酸溶液,濃度分別為1%、2%、3%、4%,共3類12 種溶液,無冰乙酸和含0.5%、1%冰乙酸的羧甲基纖維素溶液的pH值分別為6、 5、4。

2、幽門螺桿菌培養

將幽門螺桿菌標準菌株11637、11639、SS1接種在含7.5%無菌羊血的空腸彎 曲菌選擇性瓊脂培養基礎上,微需氧條件下(O25%、CO210%、N285%),37℃培養 2-3天后,用布氏肉湯洗脫收集細菌,并在660nm波長下測細胞密度,1吸光度 (OD值)為108CFU/ml(CFU:集落形成單位)。

3、抑菌試驗

取直徑8cm培養皿,培養基厚約6mm,取0.5ml含幽門螺桿菌5×108CFU/ml 的布氏肉湯菌液,均勻涂布于培養基上待干燥后,在培養基上打810個 [(24+15+12+3)*5*3]直徑4mm孔,分別向各孔加入上述不同pH值、不同濃度 和不同類型的殼聚糖及其衍生物溶液,加入量為加平每孔,對照孔分別加入以 滅菌蒸餾水配制的pH值分別為6,5,4的乙酸溶液,培養3天,用游標卡尺測 量抑菌環直徑,每種溶液做5個孔,取其平均值。

(二)、殼聚糖及其衍生物誘發幽門螺桿菌內容物滲漏試驗

1、根據上述抑菌試驗結果,選擇了7種抑菌作用較好的殼聚糖及其衍生物溶液, 進一步做細菌內容物滲漏試驗。這7種殼聚糖溶液見表1。

??????????????????表1??滲漏實驗中7種殼聚糖溶液的配制 殼1 殼2 殼3 殼4 殼5 殼6 殼7 對照組 殼聚糖種類 殼聚糖濃度 pH值 羧甲基殼聚糖 2% 4 DD70殼聚糖 1 6 DD88.5殼聚糖 0.5 6 DD70殼聚糖 1 5 DD88.5殼聚糖 1 5 DD70殼聚糖 1.5 4 DD88.5殼聚糖 1 4 無 0 6

以5mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)配制上述溶液。以5mmol/L磷酸緩沖液(pH?6.0) 為對照。

2、幽門螺桿菌與不同殼聚糖溶液混合培養

以5mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)配成相應濃度和pH值的溶液(見表1)。培養 2-3天的幽門螺桿菌用5mmol/L磷酸緩沖液洗脫,并洗滌3次后,加入上述殼聚 糖溶液中,細菌濃度為108CFU/ml,將每種殼聚糖-幽門螺桿菌混合液加入24孔 培養板,每孔2ml,每種溶液做5孔,在37℃和微需氧條件下,120rpm振蕩, 48小時后取出孔內液,1000g離心10分鐘后,取上清液分別測葡萄糖含量和天 門冬氨酸氨基轉移酶(AST)活性。

(三)、殼聚糖及其衍生物對幽門螺桿菌形態及超微結構影響試驗

與滲漏實驗相似,當殼聚糖及其衍生物與幽門螺桿菌作用24小時后,離心 取細菌沉渣,制成電鏡片,在透射和掃描電鏡下幽門螺桿菌的形態和結構。

三、統計學處理

所有數據應用公用的統計軟件包SPSS10.0系統統計,均以X±SD表示,采 用t檢驗和單因素方差分析F-q及q’檢驗。

B、結果

一、殼聚糖及其衍生物對幽門螺桿菌的生長抑制作用

(一)殼聚糖及其衍生物對幽門螺桿菌標準菌株SS1、11637、11639的抑菌作用

1、羧甲基殼聚糖對幽門螺桿菌標準菌株SS1、11637、11639的抑菌作用 pH值為5和6的羧甲基殼聚糖對3株幽門螺桿菌均無抑菌作用,pH值為4的 羧甲基殼聚糖溶液對3株幽門螺桿菌的抑菌作用見表2

表2??pH值為4的羧甲基殼聚糖溶液對幽門螺桿菌三種菌株作用的比較 ????濃度 ????(%) ????????????????抑菌環直徑(mm,n=5) ??F ???????????????????????????P ??①SS1 ??②11637 ??③11639 ????0 ????1 ????2 ????3 ????4 ????5 ??0 ??10.728±0.355 ??12.108±1.087 ??11.472±1.018 ??11.352±1.453 ??11.868±1.459 ??0 ??10.636±0.506 ??12±1.092 ??12.064±0.998 ??11.452±1.044 ??12.112±0.935 ??0 ??14.236±1.197 ??15.628±0.792 ??15.078±1.016 ??12.44±0.861 ??12.638±1.684 ??34.81 ??21.305 ??18.293 ??0.707 ??0?398 ①/②P>0.05 ①/②P>0.05 ①/②P>0.05 ?????P>0.05 ?????P>0?05 ①/③P<0?01 ①/③P<0.01 ①/③P<0.01 ②/③P<0.01 ②/③P<0.01 ②/③P<0.01

由表2可見羧甲基殼聚糖溶液在1%、2%、3%濃度時,對11639菌株的作用 強于另兩種菌株(P<0.01)而對SS1和11637菌株作用無差異(P>0.05)。

2、70%脫乙酰度殼聚糖對幽門螺桿菌標準菌株SS1、11637、11639的抑菌作用見 表3。

表3??70%脫乙酰度殼聚糖對幽門螺桿菌三種菌株作用的比較 ??pH值 ??濃度(%) ?????????????????????????抑菌環直徑(mm,n=5) ??F ????P ??①SS1 ?②11637 ????③11639 ??6 ????0 ????0.5 ????1 ????1.5 ????2 ??0 ??12.052±2.961 ??12.476±2.699 ??11.312±2.166 ??11.636±2.033 ?0 ?13.148±1.870 ?12.896±2.289 ?12.552±2.127 ?11.024±0.971 ????0 ????13.172±1.723 ????13.776±3.439 ????14.816±2.348 ????12.188±1.041 ??0.395 ??0.607 ??3.214 ??0.826 ????P>0.05 ????P>0.05 ????P>0.05 ????P>0.05 ????P>0.05 ? ? ? ??5 ? ? ? ????0 ????0.5 ? ????1 ? ????1.5 ????2 ??0 ??18.908±0.644 ? ??17.992±0.451 ? ??17.864±1.160 ??17.128±0.840 ?0 ?18.504±1.992 ? ?19.024±3.100 ? ?20.776±4.675 ?18.636±2.871 ????0 ????17.520±1.285 ? ????16.332±0.947 ? ????16.288±1.625 ????15.548±1.889 ? ??1.267 ? ??3.582 ? ??3.010 ??2.784 ????P>0.05 ????P>0.05 ????①/③P<0.05 ????①/②P<0.05 ????②/③P<0.05 ????P>0.05 ????P>0.05 ? ? ??4 ? ? ????0 ????0.5 ????1 ????1.5 ????2 ??0 ??22.492±1.054 ??22.076±3.207 ??22.160±1.301 ??22.116±1.351 ?0 ?20.120±2.648 ?22.652±1.294 ?21.392±2.953 ?21.024±1.762 ????0 ????20.952±2.549 ????23.612±3.984 ????22.044±3.644 ????21.904±3.990 ??1.486 ??0.324 ??0.109 ??0.241 ????P>0.05 ????P>0.05 ????P>0.05 ????P>0.05 ????P>0.05

由表3可見,除pH值為5的1%濃度殼聚糖溶液對幽門螺桿菌菌株之間作用 有差異外(P<0.05),其余均無差異(P>0.05)。

3、88.5%脫乙酰度殼聚糖對幽門螺桿菌標準菌株SS1、11637、11639的抑菌作用 見表4

表4??88.5%脫乙酰度殼聚糖對幽門螺桿菌三種菌株作用的比較 ????pH值 ??濃度(%) ???????????????????抑菌環直徑(mm,n=5) ??F ??P ??①SS1 ??②11637 ??③11639 ? ? ? ? ? ????6 ? ? ? ? ??0 ??0.5 ? ??1 ? ??1.5 ? ? ??2 ? ??0 ??12.372±1.697 ? ??11.464±1.150 ? ??11.232±0.824 ? ? ??11.076±0.943 ? ??0 ??11.056±1.539 ? ??10.064±0.917 ? ??9.700±0.403 ? ? ??9.464±0.513 ? ??0 ??11.780±1.183 ? ??11.404±0.867 ? ??10.988±0.915 ? ? ??11.148±1.143 ? ? ??0.980 ? ??3.224 ? ??6.055 ? ? ??5.534 ? ??P>0.05 ??P>0.05 ? ??P>0.05 ??①/②P<0.05 ??①/③P<0.05 ??②/③P<0.05 ??①/②P<0.05 ??①/③P<0.05 ??②/③P<0.05 ? ? ????5 ? ? ??0 ??0.5 ??1 ??1.5 ??2 ??0 ??18.440±4.750 ??18.456±5.51 ??18.128±3.296 ??15.536±2.023 ??0 ??15.348±1.527 ??17.080±2.052 ??13.904±2.244 ??16.504±1.378 ??0 ??15.740±1.501 ??15.944±3.039 ??14.424±1.736 ??15.112±1.929 ??1.566 ??0.542 ??4.208 ??0.786 ??P>0.05 ??P>0.05 ??P>0.05 ??P>0.05 ??P>0.05 ? ? ????4 ? ? ??0 ??0.5 ??1 ??1.5 ??2 ??0 ??20.836±4.715 ??21.800±3.892 ??23.312±2.971 ??23.892±4.265 ??0 ??20.172±1.400 ??20.180±1.194 ??18.892±0.82 ??20.584±2.655 ??0 ??18.620±1.688 ??20.456±0.793 ??19.824±1.466 ??20.768±1.192 ??0.718 ??0.655 ??6.916 ??1.944 ??P>0.05 ??P>0.05 ??P>0.05 ??P>0.05 ??P>0.05

由表4可見,除pH值為6的1.5%和2%濃度殼聚糖溶液對幽門螺桿菌菌株之 間作用有差異外(P<0.05),其余均無差異(P>0.05)。

4、羧甲基纖維素對幽門螺桿菌標準菌株SS1、11637、11639的抑菌作用

在pH值為4、5、6的條件下,羧甲基纖維素溶液對3株幽門螺桿菌均無抑 菌作用。

(二)、濃度與pH值對殼聚糖抑菌作用的影響

表5??不同濃度與pH值的70%脫乙酰度殼聚糖對幽門螺桿菌抑菌作用比較 ?濃度(%) ??????????????????????抑菌環直徑(mm,n=15) ??F ????P ????pH6 ????pH5 ????pH4 ?0(對照組) ?0.5 ?1 ?1.5 ????0 ????12.785±2.159* ????12.383±4.023* ????12.893±2.542* ????11.616±1.415* ????0 ????18.311±1.445* ????17.783±2.093* ????18.309±3.329* ????17.097±2.303* ????0 ????21.188±2.283* ????22.780±2.895* ????21.865±2.625* ????21.681±2.489* ??68.592 ??42.04 ??37.585 ??84.623 ????P>0.05 ????P<0.01 ????P<0.01 ????P<0.01 ????P<0.01 ?F ?P ????39.412 ????P<0.01 ????69.907 ????P<0.01 ????89.628 ????P<0.01

注:*為與對照組比較P<0.01

表6??不同濃度與pH值的88.5%脫乙酰度殼聚糖對幽門螺桿菌抑菌作用比較 濃度(%) ????????????????????????抑菌環直徑(mm,n=15) ??F ????P ??pH6 ??pH5 ??pH4 0(對照組) 0.5 1.5 ??0 ??11.736±1.486* ??10.977±1.132* ??10.640±0.982* ??10.563±1.162* ??0 ??16.509±3.128* ??17.160±3.694* ??15.485±3.032* ??15.717±1.772* ??0 ??19.876±2.941* ??20.812±2.335* ??20.676±2.691* ??21.748±3.176* ? ??36.475 ??54.574 ??65.153 ??96.767 ????P>0.05 ????P<0.01 ????P<0.01 ????P<0.01 ????P<0.01 F P ??25.103 ??P<0.01 ??37.164 ??P<0.01 ??68.83 ??P<0.01

注:*為與對照組比較P<0.01

由表5、6可見,3種不同pH值的殼聚糖溶液對幽門螺桿菌的抑菌作用有顯 著差異(P<0.01),進一步進行q檢驗發現,各pH值之間的抑菌作用均有顯著 差異(P<0.01)。殼聚糖的抑菌作用各濃度組與對照組比較有顯著差異(P<0.01), 但各濃度之間的抑菌作用無顯著差異(P>0.05)。

對于羧甲基殼聚糖,pH值為4的溶液與pH值為6和5的溶液比較有顯著差 異(P<0.01),在pH值為4時各濃度組與對照組比較有顯著差異(P<0.01),而 各濃度之間無顯著差異(F=2.431,P>0.05)。

(三)、不同脫乙酰度殼聚糖對幽門螺桿菌抑菌作用的比較

表7??不同脫乙酰度殼聚糖對幽門螺桿菌抑菌作用的比較 pH值 ????濃度(%) ????????抑菌環直徑(mm,n=15) ??P ?DD70殼聚糖 ??DD88.5殼聚糖 ? ? ??6 ? ? ????0.5 ????1 ? ????1.5 ????2 ?12.785±2.159 ?12.383±4.023 ? ?12.893±2.542 ?11.616±1.415 ??11.736±1.486 ??10.977±1.132 ? ??10.640±0.982 ??10.563±1.162 ??P>0.05 ??P>0.05 ? ??P>0.05 ??P>0.05 ? ? ??5 ? ? ????0.5 ????1 ? ????1.5 ????2 ?18.311±1.445 ?17.783±2.093 ? ?18.309±3.329 ?17.097±2.303 ??16.509±3.128 ??17.160±3.694 ? ??15.485±3.032 ??15.717±1.772 ??P>0.05 ??P>0.05 ? ??P>0.05 ??P>0.05 ??4 ????0.5 ????1 ????1.5 ????2 ?21.188±2.283 ?22.780±2.895 ?21.865±2.625 ?21.681±2.489 ??19.876±2.941 ??20.812±2.335 ??20.676±2.691 ??21.748±3.176 ??P>0.05 ??P>0.05 ??P>0.05 ??P>0.05

由表7可見,70%脫乙酰度殼聚糖的抗幽門螺桿菌作用稍強于88.5%脫乙酰度 殼聚糖,但無統計學差異(P>0.05)。

(四)、各種殼聚糖及其衍生物之間抗幽門螺桿菌作用比較

對幽門螺桿菌有抑菌作用的殼聚糖分別為羧甲基殼聚糖、70%、88.5%脫乙酰 度殼聚糖,其中羧甲基殼聚糖殼聚糖僅在pH值4時對幽門螺桿菌有抑制作用, 這3種殼聚糖的抑菌作用見表8。

???????????????????????表8??不同殼聚糖抑菌作用比較 ????????????????抑菌環直徑(mm,n=60) ??F ??P ??DD70殼聚糖① ??DD88.5殼聚糖② ??羧甲基殼聚糖③ ??12.59±2.27a??17.88±2.28b??21.88±2.58c ??10.98±1.26a??16.22±2.99b??20.78±2.81c ??12.37±1.74c??12.37±1.74c??12.37±1.74c ??14.383 ??96.731 ??331.517 ??①/②,②/③p<0.01,①/③p>0.05 ??P<0.01 ??①/②p<0.05,①/③,②/③p<0.01

注:a:為pH6;b:為pH5;c:為pH4

由表8可見DD70和DD88.5殼聚糖在pH值為6時對幽門螺桿菌的抑菌作用 不比pH值為4時羧甲基殼聚糖的抑菌作用強,其中DD88.5殼聚糖抑菌作用還 弱于后者(P<0.01);pH值為4和5時,DD70和DD88.5殼聚糖對幽門螺桿菌的抑 菌作用均明顯大于羧甲基殼聚糖在pH值為4時的抑菌作用(P<0.01);在三種 pH值條件下DD70殼聚糖作用均大于DD88.5殼聚糖的抑菌作用(P<0.01)。

二、殼聚糖溶液對Hp內容物滲漏實驗結果

表9??7種殼聚糖溶液作用幽門螺桿菌后上清液中AST活性和Glu含量比較 殼聚糖 ???????????????????AST(IU/L) ?????????????????????????Glu(mg/L) ?SS1 ?11639 ??11637 ????SS1 ?11639 ?11637 殼1 殼2 殼3 殼4 殼5 殼6 殼7 對照8 ?7.8±0.447 ?3.2±0.837 ?7.4±1.140 ?10±0.707 ?6±1.414 ?5.6±1.140 ?9.2±1.483 ?0.8±0.837 ?10.6±0.548 ?10±0.07 ?16.8±0.447 ?20±0.707 ?9.6±1.342 ?15.8±1.095 ?16.6±1.673 ?3.4±0.548 ??4.8±0.837 ??6.6±0.548 ??6.6±0.894 ??8±0.707 ??3±0.707 ??4±0.707 ??4.4±1.516 ??0 ????3.0±0.886 ????16.4±4.870 ????10.6±2.348 ????7.4±1.50 ????10.5±2.924 ????14.1±1.760 ????11.4±1.718 ????1.8±1.059 ?7.9±2.444 ?15.9±2.248 ?9.0±0.752 ?15.4±3.091 ?9.9±0.788 ?19.4±2.966 ?19±0.525 ?3.1±1.159 ?10.1±4.555 ?15.7±3.40 ?22.4±2.256 ?19.7±2.334 ?13.5±2.974 ?17.6±1.271 ?17.3±2.164 ?6.4±2.930 F ? P* ? ?42.363 ?P<0.05或 ? ?<0.01 ?152.286 ? ?P<0.01 ? ??61.71 ? ??P<0.01 ? ????17.702 ????①/⑧P>0.05余 ? ????P<0.01 ?42.272 ?①/⑧P>0.05余 ? ?p<0.01 ?15.997 ?①/⑧P>0.05余 ? ?P<0.05或<0.01

注:*為q’檢驗。AST:天門冬氨酸氨基轉移酶;Glu:葡萄糖。

由表9可見,七種殼聚糖溶液上清液中AST活性與對照組比較有顯著差異 (P<0.05或<0.01),Glu含量除殼I溶液外(P>0.05),其余6種溶液與對照組 比較有顯著性差異(P<0.05或<0.01)。

三、殼聚糖對幽門螺桿菌形態和超微結構的影響

1、透射電鏡結果

(1)、對照組:細胞切面多呈桿狀,細胞壁、細胞膜完整,胞質均勻,電子密 度中等。

(2)、藥物組:幽門螺桿菌形態多樣,以球形體為主,并可見V形、U形和不規 則形;幽門螺桿菌細胞壁變薄不完整,有的菌體細胞壁部分或全部脫落消失,細 菌輪廓模糊,結構不清,且發生不同程度的凹陷變形,甚至穿孔和破碎;胞漿 內容物稀疏,空隙明顯擴大。細菌內部結構消失或分布異常,胞質不均勻或密 度下降,出現高電子密度顆粒。各種殼聚糖溶液作用組均可見上述變化。

2、掃描電鏡結果

(1)、對照組:細菌呈螺桿狀,表面光滑。

(2)、藥物組:幽門螺桿菌形態多樣,以球形體為主,并可見U形和不規則形, 細菌表面廣泛改變,黏附有可折射物質,外觀呈毛刺狀,提示殼聚糖附著在細 菌外膜上,并與其作用,各種殼聚糖溶液作用組均可見上述變化。

第二部分:殼聚糖體內抗幽門螺桿菌作用

雖然體外試驗證實了殼聚糖及其衍生物具有抗幽門螺桿菌作用,但是由于 胃內的特殊環境,許多物質在體外有抗幽門螺桿菌作用,在體內卻無抗幽門螺 桿菌作用,只有在體內外都具有抗幽門螺桿菌作用的物質才能夠用于幽門螺桿 菌感染的治療與預防,因此進行了殼聚糖體內抗幽門螺桿菌的試驗,從而完成 本發明。

A、材料與方法

一、材料

1、主要儀器

湘儀-島津200型電子分析天平(湘儀天平儀器廠進口組裝);

MDF-U281-80℃低溫冰箱(日本三洋公司產品);

YJ-1003A型超凈工作臺(蘇州凈化設備公司生品);超聲粉碎儀(日本);

MCO-175M型三氣培養箱(日本三洋公司產品);病理顯微圖像分析儀;

2135型病理切片機(德國萊卡公司產品);貝克曼低溫超速離心機(美國);

Olympus顯微鏡(日本Olympus公司產品);450型酶標儀(美國Bio-Rad公司);

自動病理組織脫水機(湖北孝感電子儀器廠產品)

YB-6型生物組織包埋機(湖北孝感亞光醫用電子技術研究所產品)

2、主要試劑

空腸彎曲菌瓊脂基礎(中國腹瀉病控制上海試劑供應研究中心產品);

布氏肉湯培養基礎(中國腹瀉病控制上海試劑供應研究中心產品);

幽門螺桿菌國際標準菌株SS1(由中國幽門螺桿菌菌株庫提供);

羥氨芐青霉素(珠海聯邦制藥股份有限公司中山分公司生產);鄰苯二胺;

雌性清潔級BALB/c小鼠,6-8周齡,平均體重22.5克;小牛血清白蛋白;

胎牛血清(上海江南生物技術工程有限公司產品);96孔聚乙稀酶標板;

洛賽克Mups(Astrazeneca公司生產);CO2、N2(南昌氣體廠產品);

殼聚糖(上海其勝生物有限公司生產);無菌綿羊血(上海畜牧養殖場產品);

過氧化氫酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白A(IgA)抗體(ZYMEDLABORATORIES?INC);

過氧化氫酶標記的羊抗鼠血清免疫球蛋白G(IgG)(SIGMA-ALDRICH,INC.)、IgG1、 IgG2a抗體(ZYMEDLABORATORIES?INC);

鼠白介素2、白介素4、白介素10(IL2、IL4、IL10)定量ELISA試劑盒(Bender MedSystems);

二、方法

1、幽門螺桿菌的培養

將幽門螺桿菌標準菌株11637、11639、SS1接種在含7.5%無菌羊血的空腸彎 曲菌選擇性瓊脂培養基礎上,微需氧條件下(O25%、CO210%、N285%),37℃培養 2-3天后,用布氏肉湯洗脫收集細菌,并在660nm波長下測細胞密度,10D值為 108CFU/ml。

2、BALB/c小鼠幽門螺桿菌感染動物模型的建立

采用6-8周齡的清潔級的BALB/c小鼠,給予含2×109/ml的SS1(sydney strain)幽門螺桿菌液,0.5ml/只/次灌胃,隔日一次,共5次。末次灌胃12周 后,取4只小鼠殺死后取胃粘膜進行病理檢查和幽門螺桿菌培養,二者皆證實幽 門螺桿菌感染模型建立。

3、實驗分組

已確立幽門螺桿菌感染的小鼠,隨機分為以下8組,每組12只。(1)、空白 對照組:僅給予5%阿拉伯數膠溶液;、(2)、藥物對照組1:洛賽克(PPI);(3) 藥物對照組2:羥氨芐青霉素(AM);(4)藥物對照組3:羥氨芐青霉素加洛賽 克;(5)實驗1組:殼聚糖;(6)實驗2組:殼聚糖加洛賽克;(7)實驗3組: 殼聚糖加羥氨芐青霉素;(8)實驗4組:殼聚糖加羥氨芐青霉素加洛賽克。

4、給藥量的計算

已建立幽門螺桿菌感染的小鼠,分別稱重,算出平均重量,根據以下公式計 算給藥量:[(成人劑量×0.0026/20)×小鼠平均重量],洛賽克0.06mg/次/ 只,羥氨芐青霉素2.9mg/次/只,殼聚糖12.5mg/次/只。

5、各組藥物體內抗幽門螺桿菌實驗

已建立幽門螺桿菌感染的小鼠在末次灌菌14周時,分別按上述分組的劑量, 將藥物混懸在藥物賦形劑5%的阿拉伯樹膠中,每次灌胃0.6ml,每日2次灌胃, 共2周。停藥后4周,取唾液,血液和胃黏膜測定有關指標。

6、胃粘膜內幽門螺桿菌的測定

采用定量幽門螺桿菌培養和病理改良吉姆薩(Giemsa)染色法測定。二者皆 陰性表示Hp已被根除,兩者之一陽性表示根除失敗。

7、血清、唾液和胃黏膜內抗幽門螺桿菌抗體測定:采用間接酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)測定。

8、胃黏膜內輔助性T淋巴細胞1細胞因子(TH1)IL-2和輔助性T淋巴細胞2 細胞因子(TH2)IL-4、IL-10檢測:用鼠IL-2、IL-4、IL-10定量ELISA試劑 盒測定。

9、胃粘膜病理學檢測:胃粘膜常規石蠟包埋切片,伊紅-蘇木素(HE)染色。

10、胃黏膜內非特異性分泌型免疫球蛋白A(sIgA)測定:采用過氧化酶標記的 鏈霉卵白素免疫組織化學染色法(SP免疫組化法)測定。

三、統計學處理

計數資料采用卡方檢驗(精確概率法)和等級相關秩和檢驗,計量資料采 用F-q檢驗。應用公用的統計軟件包SPSS11.0和SAS6.12處理,P值<0.05為有 統計學差異。

B、結果

一、幽門螺桿菌根除情況

???????????????表10??各組幽門螺桿菌根除率比較 分組 ????N ????HP+ ????HP- ????根除率(%) ①對照組 ②PPI ③AM ④AM+PPI ⑤殼聚糖 ⑥殼聚糖+PPI ⑦殼聚糖+AM ⑧殼聚糖+AM+PPI ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ???12 ????12 ????12 ????7 ????5 ????5 ????4 ????2 ????1 ????0 ????0 ????5 ????7 ????7 ????8 ????10 ????11 ????0 ????0 ????41.7a????58.3b????58.3b????66.7b????83.3c????91.7c,d ???????????????????????????P<0.001

注:與①和②組比較,a為P<0.05,b為P<0.01,c為P<0.001;d為與③ 組比較P<0.05。

由表10可見,以上各組之間幽門螺桿菌根除率有顯著差異(P<0.001)。進一 步進行兩兩比較,發現③~⑧組的HP根除率顯著高于①和②組(P<0.05~001), ⑧組的幽門螺桿菌根除率顯著高于③組(P<0.05)。

二、胃黏膜炎癥情況

??????????????表11??各組胃黏膜炎癥程度比較 分組 ????N ?????????????炎癥程度 ????0 ????1 ????2 ????3 ①對照組 ②PPI ③AM ④AM+PPIa,f,g⑤殼聚糖b,c,d⑥殼聚糖+PPIb,e,h⑦殼聚糖+AMb,e,d⑧殼聚糖+AM+PPIb,c,d ????12 ????12 ????12 ????12 ? ????12 ????12 ????12 ????12 ????0 ????0 ????0 ????0 ? ????1 ????0 ????1 ????1 ????0 ????1 ????2 ????4 ? ????7 ????6 ????5 ????7 ????4 ????4 ????6 ????3 ? ????4 ????5 ????6 ????4 ????8 ????7 ????4 ????5 ? ????0 ????1 ????0 ????0 ??????????????????????H值=37.6470,P<0.001

注:a為P<0.05vs①組;b為P<0.001vs①組;c為P<0.001vs②組; d為P<0.01vs③組;e為P<0.05vs③組;f為P<0.05vs⑦組;g為P<0.01 vs⑤、⑧組;h為P<0.01vs②組。

由表11可見,各組之間炎癥程度有顯著差異(P<0.001),進一步進行兩兩 比較,發現含殼聚糖組的炎癥程度多低于不含殼聚糖組(P<0.001~0.05)。

三、體液免疫反應結果

1、血清抗幽門螺桿菌IgG1、IgG2a,IgG結果

表12??各組血清抗幽門螺桿菌IgG1、IgG2a.IgG含量比較 組別 ????N ????????????????????????????X±SD ????IgG1????IgG2a????IgG ①對照組 ②PPI ③AM ④AM+PPI ⑤殼聚糖 ⑥殼聚糖+PPI ⑦殼聚糖+AM ⑧殼聚糖+AM+PPI ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ????11 ????12 ????12 ????3.68±1.67 ????3.19±1.69 ????2.75±0.95 ????3.62±1.60 ????2.94±0.80 ????3.69±1.43 ????3.23±0.86 ????3.78±1.22 ????11.79±8.90 ????9.58±8.69 ????9.60±8.01 ????11.47±9.74 ????11.80±9.42 ????13.22±8.15 ????10.94±9.80 ????13.54±9.59 ????6.56±3.50 ????5.86±3.63 ????7.59±4.15 ????7.60±5.60 ????8.38±5.94 ????6.27±2.74 ????8.47±5.04 ????9.37±5.32 F值 ????1.021 ????0.305 ????0.812 P值 ????0.422 ????0.950 ????0.580

由表12可見,各組之間血清中抗幽門螺桿菌IgG、IgG1和IgG2a含量無顯 著差異。

2、唾液和胃黏膜內抗幽門螺桿菌IgA結果

???????????表13??各組唾液和胃黏膜內抗幽門螺桿菌IgA含量比較 組別 ???????????N ????????????????????X±SD ????唾液 ????胃黏膜 ????唾液IgA ????胃IgA ①對照組 ②PPI ③AM ④AM+PPI ⑤殼聚糖 ⑥殼聚糖+PPI ⑦殼聚糖+AM ⑧殼聚糖+AM+PPI ????12 ????12 ????9 ????10 ????12 ????11 ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ????1.03±0.35 ????0.99±0.18 ????1.06±0.26 ????1.11±0.33 ????1.06±0.66 ????1.30±0.84 ????1.02±0.45 ????1.05±0.39 ????15.56±6.24 ????21.37±7.30 ????23.17±7.38 ????18.78±11.30 ????33.64±18.54a,b,c,e????24.65±12.39 ????31.37±15.50a,b,d????28.86±14.10a,d F值 ????0.456 ????3.099 P值 ????0.864 ????0.006

注:a為P<0.01vs①組;b為P<0.05vs②組;c為P<0.05vs③組;d 為P<0.05vs④組;e為P<0.01vs④組。

由表13可見,各組唾液抗HPIgA含量無統計學差異。胃黏膜內抗HPIgA含 量各組間有顯著差異(P<0.01)。進一步分析發現含殼聚糖各組顯著高于無殼聚 糖組,以單純殼聚糖和殼聚糖+AM組最為明顯。

3、胃黏膜內非特異性sIgA結果

???????表14??各組胃黏膜內非特異性sIgA含量比較 組別 ????N ????X±SD ①對照組 ②PPI ③AM ④AM+PPI ⑤殼聚糖 ⑥殼聚糖+PPI ⑦殼聚糖+AM ⑧殼聚糖+AM+PPI ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ????12 ????9.58±6.52 ????8.83±7.92 ????9.42±6.10 ????9.17±6.34 ????18.50±10.12a,c,e????20.08±13.43a,d,f????21.25±11.89b,d,f????19.67±14.40a,d,e ????F值=3.874,P值<0.001

注:a為P<0.05vs①和⑧組;b為P<0.01vs①和③組;c為P<0.05vs ②組;d為P<0.01vs②組;e為P<0.05vs④組;f為P<0.01vs④組。

由表14可見,各組胃黏膜內非特異性有顯著差異(P<0.001),進一步分析 含殼聚糖各組均顯著高于無殼聚糖組(P<0.01~0.05)。

五、胃黏膜內細胞因子結果

?????????????表15??各組胃黏膜內IL-2、IL-4和IL-10含量比較 組別 ??????????????N ??????????????????????????X±SD(pg/mg胃組織) ????IL-2 ????IL-4 ???IL-10 ????IL-2 IL-4 ??IL-10 ①對照組 ②PPI ③AM ④AM+PPI ⑤殼聚糖 ⑥殼聚糖+PPI ⑦殼聚糖+AM ⑧殼聚糖+AM+PPI ????8 ????9 ????9 ????9 ????9 ????10 ????9 ????8 ????9 ????9 ????11 ????10 ????10 ????11 ????10 ????9 ????9 ????9 ????9 ????9 ????9 ????9 ????9 ????9 ????52.58±38.94 ????92.66±68.13 ????95.82±63.33 ????80.40±57.43 ????67.84±44.28 ????57.36±48.54 ????91.38±60.87 ????81.17±40.58 7.61±6.83 10.68±6.70 10.25±8.71 11.27±6.57 20.43±7.19a,b,d20.62±14.42a,b,d23.17±12.60a,c,d26.51±13.72a,c,e ??174.63±133.76 ??194.95±157.18 ??186.82±161.59 ??180.95±111.32 ??375.03±96.95f??362.23±212.33f??353.30±151.52f??423.59±227.20g F值 ????0.824 4.691 ??3.847 P值 ????0.571 <0.001 ??0.002

注:a為P<0.01vs①組;b為P<0.05vs②、③組;c為P<0.01vs②、 ③組;d為P<0.05vs④組;e為P<0.01vs④組;f為P<0.05vs①~④組; g為P<0.01vs①~④組。

由表15可見,各組IL-2含量無顯著差異(P>0.05)。各組間胃黏膜內IL-4 和IL-10含量有顯著差異(P<0.001-0.002)。進一步分析發現含殼聚糖各組IL-4 和IL-10含量均顯著高于無殼聚糖組(P<0.05-0.01)。

綜上所述,本發明經體外實驗證實,(1)、殼聚糖及其衍生物:羧甲基殼聚 糖在體外對幽門螺桿菌有普遍的抑菌作用;(2)、殼聚糖及其衍生物的抗幽門螺桿 菌作用受多種因素影響,其中pH值對殼聚糖抗菌作用的影響最為明顯,在pH 值6-4范圍內,殼聚糖的抗菌活性隨著pH值的下降而顯著增強;(3)、殼聚糖 的脫乙酰度、結構(化學修飾)及分子量也影響殼聚糖的抗菌活性,不同的細 菌所要求的脫乙酰度、修飾基團和分子量有著明顯的差異;(4)、殼聚糖及其衍 生物在體外通過以下兩種機制發揮抗幽門螺桿菌作用:①殼聚糖分子中的-NH+3基團與幽門螺桿菌外膜的帶負電荷的物質相互作用,破壞其結構、功能和通透性, 使細菌內容物滲出,細菌破裂;②殼聚糖通過破損的細胞外膜進入幽門螺桿菌內, 與胞質作用,擾亂其代謝;體內實驗證實,(1)殼聚糖在體內具有抗幽門螺桿菌 作用,并且與羥氨芐青霉素具有協同作用;(2)、殼聚糖除了抗幽門螺桿菌作用 外,還可減輕胃黏膜的炎癥反應,促進胃黏膜局部的特異性抗幽門螺桿菌IgA和 非特異性sIgA的分泌,說明殼聚糖對幽門螺桿菌感染胃黏膜局部的免疫調節作 用;(3)、殼聚糖可上調TH2細胞因子IL-4和IL-10的表達,這在其抗幽門螺桿 菌和減輕胃黏膜炎癥反應中起一定作用。

具體實施方式

下面結合實施例作進一步詳細說明本發明,但應理解本發明的范圍并非僅 限于這些實施例的范圍。

實施例1:

用本技術領域公知的方法,以羧甲基殼聚糖為原料,制成殼聚糖藥片。

實施例2:

用本技術領域公知的方法,以pH值為4或5、濃度為1.5%的70%脫乙酰度 殼聚糖溶液為原料,制成殼聚糖口服液。

實施例3:

用本技術領域公知的方法,以pH值為4、濃度為2%的88.5%脫乙酰度殼聚 糖溶液為原料,制成殼聚糖藥片。

實施例4:

用本技術領域公知的方法,以88.5%脫乙酰度殼聚糖或羧甲基殼聚糖與其它 抗幽門螺桿菌抗菌素(如:羥氨芐青霉素、克拉霉素)合用制成片劑。

實施例5:

用本技術領域公知的方法,以70%脫乙酰度殼聚糖或羧甲基殼聚糖為添加劑 用于口腔衛生用品、食物或飲料。

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