鬼佬大哥大
  • / 22
  • 下載費用:30 金幣  

治療白介素6相關疾病的方法.pdf

關 鍵 詞:
治療 白介素 相關 疾病 方法
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201110077747.3

申請日:

20040428

公開號:

CN102172403A

公開日:

20110907

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K45/06,A61K39/395,A61P1/04,A61P1/18,A61P7/00,A61P7/06,A61P13/12,A61P17/06,A61P19/02,A61P19/04,A61P29/00,A61P37/00,A61P43/00,A61K31/519 主分類號: A61K45/06,A61K39/395,A61P1/04,A61P1/18,A61P7/00,A61P7/06,A61P13/12,A61P17/06,A61P19/02,A61P19/04,A61P29/00,A61P37/00,A61P43/00,A61K31/519
申請人: 中外制藥株式會社
發明人: 奧田修,吉田憲彰,R·N·馬伊尼
地址: 日本東京
優先權: 0309619.5
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 代理人: 羅菊華
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201110077747.3

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及治療白介素-6(IL-6)相關疾病的藥物組合物,包括白介素-6拮抗劑(IL-6拮抗劑)和免疫抑制劑。IL-6拮抗劑優選抗白介素-6受體(IL-6R)的抗體。

權利要求書

1.治療IL-6相關疾病的藥物組合物,包含白介素6拮抗劑(IL-6拮抗劑)和免疫抑制劑。2.包含免疫抑制劑的藥物組合物,用于增強使用IL-6拮抗劑治療IL-6相關疾病的效果。3.包含免疫抑制劑的藥物組合物,用于在以IL-6拮抗劑治療IL-6相關疾病中減少或預防變態反應。4.以高劑量給藥的治療劑,其包含IL-6拮抗劑。5.包含高劑量IL-6拮抗劑的藥物組合物,用于減少或預防IL-6相關疾病治療中的變態反應。6.權利要求1-5任一項的藥物組合物,其中所述IL-6拮抗劑是抗白介素-6受體的抗體(IL-6R抗體)。7.權利要求6的藥物組合物,其中所述IL-6R抗體是抗IL-6R的單克隆抗體。8.權利要求6或7的藥物組合物,其中所述抗IL-6R抗體是抗人IL-6R的單克隆抗體。9.權利要求6或7的藥物組合物,其中所述抗IL-6R抗體是抗小鼠IL-6R的單克隆抗體。10.權利要求6-9任一項的藥物組合物,其中所述抗IL-6R抗體是重組抗體。11.權利要求8的藥物組合物,其中所述人抗IL-6R單克隆抗體是PM-1抗體。12.權利要求9的藥物組合物,其中所述小鼠IL-6R單克隆抗體是MR16-1抗體。13.權利要求6-12任一項的藥物組合物,其中所述抗IL-6R抗體是抗IL-6R的嵌合抗體、人源化抗體或人型抗體。14.權利要求13的藥物組合物,其中所述抗IL-6R的人源化抗體是人源化PM-1抗體。15.權利要求1-14任一項的藥物組合物,其中所述IL-6相關疾病是類風濕性關節炎、漿細胞增多癥、高免疫球蛋白血癥、貧血、腎炎、惡病質、多發性骨髓瘤、Castleman氏病、腎小球膜增殖性腎炎、系統性紅斑狼瘡、Crohn氏病、潰瘍性結腸炎、胰腺炎、銀屑病、幼年型特發性關節炎或系統性幼年型特發性關節炎、血管炎、以及Kawasaki病。16.權利要求1-3和6-15任一項的藥物組合物,它是包含免疫抑制劑的所述藥物組合物或者包含抗體和免疫抑制劑的所述藥物組合物,其中抗IL-6R抗體的劑量為0.02-150mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。17.權利要求16的藥物組合物,其中抗IL-6R抗體的劑量為0.5-30mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。18.權利要求17的藥物組合物,其中抗IL-6R抗體劑量為2-8mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。19.權利要求4-15任一項的藥物組合物,其是包含抗IL-6R抗體的用于以高劑量給藥治療IL-6相關疾病的所述治療劑或者其是包含高劑量的抗IL-6R抗體的所述藥物組合物,其中抗IL-6R抗體劑量是4mg/kg/4周或更高或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。20.權利要求19的藥物組合物,其中抗IL-6R抗體劑量是6-16mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。21.權利要求20的藥物組合物,其中抗IL-6R抗體劑量是6-10mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。22.權利要求1-3和6-21任一項的藥物組合物,其中所述免疫抑制劑是氨甲蝶呤(MTX)。23.權利要求22的藥物組合物,其中所述MTX的劑量是1-100mg/個體/周。24.權利要求23的藥物組合物,其中所述MTX的劑量是4-50mg/個體/周。25.權利要求24的藥物組合物,其中所述MTX的劑量是7.5-25mg/個體/周。26.權利要求1-3和6-25任一項的藥物組合物,用于將所述抗IL-6抗體和所述免疫抑制劑同時施用。27.權利要求1-3和6-25任一項的藥物組合物,用于將所述抗IL-6抗體和所述免疫抑制劑在時間上間隔施用。28.白介素-6拮抗劑(IL-6拮抗劑)和免疫抑制劑在制備用于治療IL-6相關疾病的藥物組合物中的用途。29.IL-6拮抗劑在制備包含免疫抑制劑的藥物組合物中的用途,其中該藥物組合物用于增強使用IL-6拮抗劑治療IL-6相關疾病的效果。30.IL-6拮抗劑在制備包含免疫抑制劑的藥物組合物中的用途,其中所述藥物組合物用于在用IL-6拮抗劑治療IL-6相關疾病時減少或預防變態反應。31.IL-6拮抗劑在制備包含IL-6拮抗劑的、以高劑量給藥的IL-6相關疾病治療劑中的用途。32.IL-6拮抗劑在制備包含高劑量抗IL-6R抗體的藥物組合物中的用途,其中該藥物組合物用于在IL-6相關疾病治療中減少或預防變態反應。33.權利要求28-32任一項的用途,其中所述IL-6拮抗劑是抗白介素-6受體的抗體(IL-6R抗體)。34.權利要求28-33任一項的用途,其中所述IL-6R抗體是抗IL-6R單克隆抗體。35.權利要求28-34任一項的用途,其中所述抗IL-6R抗體是抗人IL-6R單克隆抗體。36.權利要求28-34任一項的用途,其中所述抗IL-6R抗體是抗小鼠IL-6R單克隆抗體。37.權利要求28-36任一項的用途,其中所述抗IL-6R抗體是重組抗體。38.權利要求35的用途,其中所述人抗IL-6R單克隆抗體是PM-1抗體。39.權利要求36的用途,其中所述小鼠抗IL-6R單克隆抗體是MR16-1抗體。40.權利要求32-39任一項的用途,其中所述抗IL-6R抗體是抗IL-6R的嵌合抗體、人源化抗體或人型抗體。41.權利要求40的用途,其中所述抗IL-6R人源化抗體是人源化PM-1抗體。42.權利要求21-41任一項的用途,其中所述IL-6相關疾病是類風濕性關節炎、漿細胞增多癥、高免疫球蛋白血癥、貧血、腎炎、惡病質、多發性骨髓瘤、Castleman氏病、腎小球膜增殖性腎炎、系統性紅斑狼瘡、Crohn氏病、胰腺炎、銀屑病、幼年型特發性關節炎或系統性幼年型特發性關節炎。43.權利要求28-30和33-42任一項的用途,它是用于制備包含免疫抑制劑的藥物組合物或包含抗IL-6抗體和免疫抑制劑的藥物組合物的所述用途,其中抗IL-6R抗體劑量是0.02-150mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。44.權利要求43的用途,其中抗IL-6R抗體劑量是0.5-30mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。45.權利要求44的用途,其中抗IL-6R抗體劑量是2-8mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。46.權利要求31-45任一項的用途,它是用于制備包含抗IL-6R抗體、以高劑量給藥治療IL-6相關疾病的治療劑或包含高劑量抗IL-6R抗體的所述藥物組合物的所述用途,其中抗IL-6R抗體劑量是4mg/kg/4周或更高或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。47.權利要求46的用途,其中抗IL-6R抗體劑量是6-16mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。48.權利要求47的用途,其中抗IL-6R抗體劑量是6-10mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。49.權利要求28-30和33-48任一項的用途,其中所述免疫抑制劑是氨甲蝶呤(MTX)。50.權利要求49的藥物組合物,其中所述MTX的劑量是1-100mg/個體/周。51.權利要求50的藥物組合物,其中所述MTX的劑量是4-50mg/個體/周。52.權利要求51的藥物組合物,其中所述MTX的劑量是7.5-25mg/個體/周。53.權利要求28-30和34-52任一項的用途,用于將所述抗IL-6抗體和所述免疫抑制劑同時施用。54.權利要求28-30和34-52任一項的用途,用于將所述抗IL-6抗體和所述免疫抑制劑在時間上間隔施用。

說明書

?

本申請是申請日為2004年4月28日、申請號為200480011401.1(國際申請號PCT/JP2004/006211)的同名申請的分案申請。?

發明背景?

1.發明領域

本發明涉及通過將白介素-6拮抗劑(IL-6拮抗劑),特別是抗白介素-6受體(IL-6R)的抗體(抗-IL-6R抗體)與免疫抑制劑組合,并以高劑量給予抗IL-6R抗體來治療白介素-6(IL-6)相關疾病的方法。

2.相關背景技術

IL-6是一種細胞因子,也被稱為B細胞刺激因子-2(BSF2)或干擾素β2。已經發現IL-6作為分化因子參與B淋巴細胞系細胞的活化(Hirano,T.等,Nature,324:73-76,1986),并且后來證明IL-6是影響多種細胞功能的多功能細胞因子(Akira,S.等,Adv.in?Immunology,54:1-78,1993)。據報道,IL-6誘導T淋巴細胞系細胞成熟(Lotz,M.等,J.Exp.Med.,167:1253-1258,1988)。

IL-6通過細胞上兩種類型的蛋白傳導其生物活性。一種是IL-6受體,該蛋白是分子量約為80kD的配體結合蛋白,IL-6與它結合(Taga,T.等,J.Exp.Med.,166:967-981,1987;Yamasaki,K.等,Science,241:825-828,1987)。除了貫穿細胞膜并在細胞膜上表達的膜結合類型,IL-6受體也可以是主要包含其胞外區的可溶形式的IL-6受體。

國際公開WO?92/19759描述了多種類型的抗IL-6R抗體,例如:人源化抗IL-6R抗體和嵌合抗IL-6R抗體。WO?96/11020描述了主要成分是IL-6拮抗劑例如抗IL-6R抗體的類風濕性關節炎治療劑和滑膜細胞生長抑制劑。WO96/12503描述了對由IL-6產生而引起的疾病的治療,所述疾病例子有漿細胞增?多癥、高免疫球蛋白血癥、貧血、腎炎、惡病質、類風濕性關節炎、Castleman氏癥以及系膜增殖性腎炎。WO?98/42377描述了與敏化的T細胞相關的疾病例如:多發性硬化癥、葡萄膜炎、慢性甲狀腺炎、遲發性過敏、接觸性皮炎以及遺傳過敏性皮炎的預防/治療劑,其中活性成分是抗IL-6R抗體。

WO?98/42377描述了系統性紅斑狼瘡的治療劑,其中活性成分是抗IL-6R抗體。WO?99/47170描述了Crohn氏病的治療劑,其中活性成分是抗IL-6R抗體。WO?00/10607描述了胰腺炎的治療劑,其中活性成分是抗IL-6R抗體。WO?02/3492描述了銀屑病的治療劑,其中活性成分是抗IL-6R抗體。另外,WO?02/080969描述了幼年型特發性關節炎的治療劑,其中活性成分是抗IL-6R抗體。

發明概述

如上所述,已經知道其活性成分是抗IL-6R抗體的多種預防或治療劑。然而,還不知道抗IL-6R抗體與免疫抑制劑,例如氨甲蝶呤(methotrexate,MTX)組合在治療IL-6相關疾病中可獲得協同作用,不知道在與抗IL-6R抗體一起治療類風濕性關節炎時免疫抑制劑,例如氨甲蝶呤(MTX)能降低或預防變態反應,不知道在以抗IL-6抗體治療類風濕性關節炎時高劑量抗IL-6R抗體能降低或預防變態反應。

因此,本發明提供了治療IL-6相關疾病的藥物組合物,包括白介素-6拮抗劑(IL-6拮抗劑)和免疫抑制劑。

本發明還提供了包括免疫抑制劑的藥物組合物,以增強使用IL-6拮抗劑治療IL-6相關疾病的效果。

本發明還提供了包括免疫抑制劑的藥物組合物,以預防或降低用IL-6拮抗劑治療IL-6相關疾病時的變態反應。

本發明進一步提供了用于高劑量給藥的IL-6相關疾病治療劑,該治療劑包括IL-6拮抗劑。

本發明進一步提供了包含高劑量IL-6拮抗劑的藥物組合物,以預防或降低?IL-6相關疾病治療中的變態反應。

IL-6拮抗劑優選是抗IL-6R抗體。抗IL-6R抗體優選是抗IL-6R的單克隆抗體。優選,抗IL-6R抗體是抗人IL-6R的單克隆抗體。或者優選,抗IL-6R抗體是抗小鼠IL-6R的單克隆抗體。優選,抗IL-6R抗體是重組型抗體。優選,人抗IL-6R單克隆抗體是例如PM-1抗體。優選,小鼠抗IL-6R單克隆抗體是例如MR16-1抗體。進一步地,抗體可以是抗IL-6R的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。特別優選抗IL-6R抗體是例如人源化的PM-1抗體。

當IL-6拮抗劑,特別是抗IL-6R抗體與免疫抑制劑組合時,IL-6拮抗劑,特別是抗IL-6R抗體的劑量,例如在靜脈輸注的情況下是0.02-150mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量,優選0.5-30mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量,更優選2-8mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。

當高劑量給予IL-6拮抗劑,特別是抗IL-6R抗體時,IL-6拮抗劑,特別是抗IL-6R抗體的劑量是,例如在靜脈輸注的情況下不低于4mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量,優選6-16mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量,更優選6-10mg/kg/4周或顯示出與其等同的血液抗IL-6R抗體濃度的劑量。

當MTX用作免疫抑制劑時,MTX的劑量是,例如1-100mg/個體(body)/周或顯示出與其等同的血液MTX濃度的劑量,優選4-50mg/個體/周或顯示出與其等同的血液MTX濃度的劑量,特別優選10-25mg/個體/周或顯示出與其等同的血液MTX濃度的劑量。

顯示出所述血藥(如:抗IL-6R抗體MTX)濃度的劑量,是指產生等同療效的劑量,即使血液濃度的轉換隨給藥方法如靜脈注射和皮下注射而變化時,只要療效等同,該劑量就被認為是顯示出所述血藥(如抗IL-6R抗體或MTX)濃度的劑量。

IL-6相關疾病的例子包括,

急慢性炎癥和自身免疫疾病:腎炎、腎小球膜增殖性腎炎(mesangial?proliferative?nephritis)、Crohn氏病、潰瘍性結腸炎、胰腺炎、幼年型特發性關節炎或系統性幼年型特發性關節炎、血管炎、Kawasaki氏病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡(systemic?erythematosus)、銀屑病、Sjogren綜合癥、成人Still氏病;

腫瘤疾病:多發性骨髓瘤、Castleman氏病、惡性淋巴瘤、腎癌;

感染性疾病:HIV感染、EBV感染;

惡病質(cachexia):惡病質;

其它:漿細胞增多癥,高免疫球蛋白血癥,貧血等,優選類風濕性關節炎,漿細胞增多癥,高免疫球蛋白血癥,貧血,腎炎,惡病質,多發性骨髓瘤,Castleman氏病,腎小球膜增殖性腎炎,系統性紅斑狼瘡,Crohn氏病,胰腺炎,銀屑病,幼年型特發性關節炎,或系統性幼年型特發性關節炎。

本發明的藥物組合物可以口服或胃腸外以及全身或局部給藥。例如,可以選擇靜脈注射,如滴注,肌肉注射,腹腔注射,皮下注射,栓劑,結腸注射,口服腸衣藥等。給藥方法可以根據患者年齡和狀況適當選擇。實際劑量的上下限受給藥頻率影響,例如:給藥間隔長時每劑藥的劑量增加,給藥間隔短時每劑藥的劑量減少。

對于抗IL-6受體的抗體的優選劑量和給藥方式,例如使血液中存在游離抗體的量是有效劑量。作為具體的例子,有分為一至幾次給藥的方法,例如,利用靜脈注射,如滴注和皮下注射的方法,按照如下給藥方案進行:2次/周,1次/周,1次/2周,1次/4周,1次/6周,1次/8周等。隨著觀察疾病情況和血液的實驗數據的變化,給藥方案可以進行調整,例如延長給藥間隔從2次/周或1次/周到1次/2周,1次/3周,1次/4周,1次/6周以及1次/8周。

當與MTX組合給藥時,例如在治療類風濕性關節炎的情況下,典型地,抗?IL-6R抗體的劑量高于0.5mg/kg/周或者是顯示出等同或更多抗風濕效果的劑量。例如,當1次/4周進行靜脈給藥時,劑量為0.02-150mg/kg,優選0.5-30mg/kg,更優選2-8mg/kg。

抗IL-6R抗體與免疫抑制劑可以同時給藥或間隔一段時間給藥。

免疫抑制劑還包括抗風濕劑,腎上腺皮質激素劑等,并包括例如下列藥物:

A.免疫抑制劑,抗風濕劑,腎上腺皮質激素劑

免疫抑制劑

烷化劑

環磷酰胺

代謝拮抗劑

硫唑嘌呤,甲氨蝶呤,咪唑立賓

T細胞活性抑制劑

環孢菌素,他克莫司

抗風濕劑:

羥氯喹,柳氮磺吡啶(sulfasalazine),來氟米特,依那西普,英夫利昔單抗(infliximab),阿達木單抗(adalimumab),D-青霉胺,可口服金化合物,可注射金化合物(肌肉注射),米諾環素,硫代蘋果酸金鈉,金諾芬,D-青霉胺,氯苯扎利,布西拉明,阿克他利;

腎上腺皮質激素劑:

可的松,氫化可的松類

醋酸可的松,氫化可的松,氫化可的松磷酸鈉,氫化可的松琥珀酸鈉,醋酸氟氫可的松

潑尼松龍,潑尼松龍類

潑尼松龍,潑尼松龍琥珀酸鈉,潑尼松龍磷酸鈉,醋酸鹵潑尼松

甲基潑尼松龍類

甲基潑尼松龍,醋酸甲基潑尼松龍,甲基潑尼松龍琥珀酸鈉

曲安西龍類

曲安西龍,醋酸曲安西龍,曲安西龍錒(triamcinolone?actinide)

地塞米松類

地塞米松,醋酸地塞米松,地塞米松磷酸鈉,地塞米松棕櫚酸酯

倍他米松類

倍他米松(倍他米松磷酸鈉),倍他米松,倍他米松磷酸鈉

帕拉米松類

醋酸帕拉米松

免疫抑制劑的劑量,例如:在組合MTX治療類風濕性關節炎時,例如在口服給藥的情況下,為1-100mg/個體/周,優選4-50mg,更優選7.5-25mg/個體。

此外,抗IL-6R抗體的高劑量是指能預防或減少變態反應的劑量,該劑量等于或高于治療IL-6相關疾病的最小有效劑量。例如,在治療類風濕性關節炎且每4周進行靜脈滴注的情況下,該劑量包括4mg/kg或更多,優選6-16mg/kg,更優選6-10mg/kg。

上述的給藥方法、給藥間隔以及給藥劑量是優選實例的舉例。可以適當選擇顯示出相似療效的給藥方法、間隔和劑量。例如,可以通過測量血液中各種藥物的濃度來選擇與上述優選實例具有相似效果的給藥方法、間隔和劑量。本發明包括可達到與上述實例具有等同血液濃度的給藥方法、間隔和劑量。

具體實施方式

用在本發明中的IL-6拮抗劑不需要考慮它的來源、類型、形式,只要它展示預防或治療IL-6相關疾病的效果就可以。

IL-6拮抗劑是抑制IL-6生物學活性的物質。IL-6拮抗劑優選是具有抑制與IL-6,IL-6R,或gp130的結合的效果的物質。IL-6拮抗劑包括抗IL-6抗體、?抗IL-6R抗體、抗gp130抗體、經修飾的IL-6、經修飾的可溶性IL-6R,或IL-6或IL-6R的部分肽,以及展示相似活性的低分子物質。

用在本發明中的抗IL-6抗體可以用本領域已知的方法以單克隆或多克隆抗體的形式獲得。就本發明中所用的抗IL-6抗體來說,優選來自哺乳動物的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體包括雜交瘤生產的抗體和通過基因工程技術用包含抗體基因的表達載體轉化的宿主細胞生產的抗體。該抗體可通過與IL-6結合來抑制IL-6與IL-6受體的結合,從而阻斷IL-6生物學活性信號傳導進入細胞。

這樣的抗體包括MH166(Matsuda,T.et?al.,Eur.J.Immunol.,18:951-956,1988)和SK2(Sato,K.et?al.,The?21s?t?Proceedings?of?the?Japanese?Society?for?Immunology,21:166,1991)。

產生抗IL-6抗體的雜交瘤可以基本按如下使用本領域已知的技術制備。即,雜交瘤可以根據標準免疫方法用IL-6作為致敏抗原進行免疫,然后將得到的免疫細胞用標準的細胞融合方法與本領域已知的親本細胞進行融合,并用標準篩選方法篩選生產單克隆抗體的細胞而得到。

具體地,抗IL-6抗體可以如下制備。例如,可以通過公開在Eur.J.Biochem.,168:543-550,1987;J.Immunol.,140:1534-1541,1988或者Agr.Biol.Chem.,54:2685-2688,1990的IL-6基因/氨基酸序列,獲得用作致敏抗原以獲得抗體的人IL-6。

將IL-6基因序列插入本領域已知的表達載體中,然后將其轉化至合適的宿主細胞中,接著用本領域已知的方法從細胞或培養上清液中純化目標IL-6蛋白,純化的IL-6蛋白可以用作致敏抗原。同樣,IL-6與其它蛋白的融合蛋白也可以用作致敏抗原。

用在本發明中的抗IL-6受體抗體可以通過本領域已知的方法以單克隆或多克隆抗體的形式獲得。就用于本發明的抗IL-6受體抗體而言,優選來自哺乳?動物的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體包括雜交瘤生產的抗體和通過基因工程技術用包含抗體基因的表達載體轉化宿主細胞而生產的抗體。該抗體可以通過與IL-6受體結合來抑制IL-6與IL-6受體的結合而阻斷IL-6生物活性信號傳導進入細胞。

這樣的抗體包括MR16-1抗體(Tamura,T.et?al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11924-11928,1993)、PM-1抗體(Hirata,Y.et?al.,J.Immunol.,143:2900-2906,1989)、AUK-12-20抗體、AUK64-7抗體或AUK146-15抗體(國際專利申請公開No.WO?92-19759)。其中,特別優選的抗體包括PM-1抗體。

生產PM-1抗體的雜交瘤細胞系作為PM-1,已經基于布達佩斯條約以保藏編號FERM?BP-2998于1989年7月12日在國際專利生物保藏單位(AIST?Tsukuba?Central?6,1-1,Higashi?1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki?Pref.)作出國際保藏。生產MR16-1抗體的雜交瘤細胞系作為大鼠-小鼠雜交瘤MR16-1(Rat-mouse?hybridoma?MR16-1),已基于布達佩斯條約以保藏編號FERMBP-5875于1997年3月13日在國際專利生物保藏單位(AIST?Tsukuba?Central6,1-1,Higashil-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki?Pref.)作出國際保藏。

生產抗IL-6受體單克隆抗體的雜交瘤可以基本通過本領域已知的技術按如下制備。即,雜交瘤可以根據標準免疫方法用IL-6受體作為致敏抗原進行免疫,然后將得到的免疫細胞用標準的細胞融合方法與本領域已知的親本細胞進行融合,用標準篩選方法篩選生產單克隆抗體的細胞而得到。

具體地,抗IL-6受體抗體可以如下制備。例如,用作致敏抗原以獲得抗體的人IL-6受體可以通過分別公開在歐洲專利申請公開No.EP325474和JP-A-3-155795的IL-6受體基因/氨基酸序列而獲得。

IL-6受體蛋白有兩種類型,即,一種表達在細胞上,一種與細胞膜分離(可溶性IL-6受體)(Yasukawa,K.et?al.,J.Biochem.,108:673-676)。可溶性IL-6受體基本上由IL-6受體的胞外區構成,它與膜結合IL-6受體的區別?在于沒有跨膜區或沒有跨膜區及胞內區。只要被用作致敏抗原生產用于本發明的抗IL-6受體抗體,兩種IL-6受體蛋白都可以使用。

將IL-6受體的基因序列插入本領域已知的表達載體,轉化其至合適的宿主細胞,接著用本領域已知的方法從細胞或培養上清液純化目標IL-6受體蛋白,純化的IL-6受體蛋白可以用作致敏抗原。同樣,表達IL-6受體的細胞和IL-6受體與其它蛋白的融合蛋白也可以用作致敏抗原。

質粒pIBIBSF2R包括編碼人IL-6受體的cDNA,包含該質粒的大腸桿菌HB101-pIBIBSF2R已基于布達佩斯條約以保藏號FERM?BP-2232于1989年1月9日起在國際專利生物保藏單位(AIST?Tsukuba?Central?6,1-1,Higashil-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki?Pref.)進行國際保藏。

用在本發明中的抗gp130抗體可以通過本領域已知的方法以單克隆或多克隆抗體的形式獲得。就用于本發明的抗gp130抗體來說,優選來自哺乳動物的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體包括雜交瘤生產的抗體和通過基因工程技術用包含抗體基因的表達載體轉化宿主細胞而生產的抗體。該抗體可以通過與gp130結合來抑制IL-6/IL-6受體復合物與gp130的結合從而阻斷IL-6的生物活性信號傳導進入細胞。

這樣的抗體包括AM64抗體(JP-A-3-219894)、4B11抗體和2H4抗體(US5571513)、B-S12抗體以及B-P8抗體(JP-A-8-291199)。

生產抗gp130單克隆抗體的雜交瘤可以基本通過本領域已知的技術按如下制備。即,雜交瘤可以根據標準免疫方法用gp130作為致敏抗原進行免疫,將得到的免疫細胞用標準的細胞融合方法與本領域已知的親本細胞進行融合,用標準篩選方法篩選生產單克隆抗體的細胞而得到。

具體地,單克隆抗體可以如下制備。例如,用作致敏抗原以獲得抗體的gp130可以通過使用公開在歐洲專利申請公開No.EP?411946的gp130基因/氨基酸序列而獲得。

將gp130的基因序列插入本領域已知的表達載體系統,轉化其至合適的宿主細胞,接著用本領域已知的方法從細胞或培養上清液純化目標gp130蛋白,純化的gp130蛋白可以用作致敏抗原。同樣,表達gp130的細胞和gp130蛋白與其它蛋白的融合蛋白也可以用作致敏抗原。

用致敏抗原免疫的哺乳動物沒有特別的限制,但優選在考慮與用于細胞融合的親本細胞的相容性的情況下進行選擇。一般來說,使用嚙齒類動物如小鼠、大鼠和倉鼠。

用致敏抗原免疫動物可以通過本領域已知的方法進行。作為常規方法,可以通過腹膜內或皮下給動物注射致敏抗原進行。特別是,優選致敏抗原適當地用PBS(磷酸緩沖鹽水)或鹽水稀釋和懸浮,其與適量的標準佐劑,例如弗氏完全佐劑混合,乳化,接著以間隔4-21天的方式幾次給予哺乳動物。另外,可以在用致敏抗原免疫時使用合適的載體。

動物按照上述方式免疫,然后確認所需抗體的血清水平是增加的。接著,從哺乳動物中取出免疫細胞用于細胞融合。優選地,用于細胞融合的免疫細胞特別包括脾細胞。

就作為與上述免疫細胞融合的伙伴親本細胞的哺乳動物骨髓瘤細胞來說,可以適當使用本領域已知的細胞系,例如:P3X63Ag8.653(Kearney,J.F.et?al.,J.Immunol.,123:1548-1550,1979)、P3X63Ag8U.1(Current?Topics?in?Microbiology?and?Immunology,81:1-7,1978)、NS-1(Kohler,G.and?Milstein,C.,Eur.J.Immunol.,6:511-519,1976)、MOC-11(Margulies?D.H.et?al.,Cell,8:405-415,1976),SP2/0(Shulman,M.et?al.,Nature,276:269-270,1978)、FO(de?St.Groth,S.F.et?al.,J.Immunol,Methods,35:1-21,1980)、S194(Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.,148:311-323,1978)、R210(Galfre,G.et?al.,Nature,277:131-133,1979)。

上述免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合可以基本通過本領域已知的方法,?例如:milstein氏方法(Kohler?G.and?Milstein?C.,Methods?Enzymol.,73:3-46,1981)進行。

更具體地,上述細胞融合可以例如在細胞融合促進劑存在時于標準營養培養基中進行。就細胞融合促進劑來說,例如:聚乙二醇(PEG),仙臺病毒(HVJ)等都可以使用。可以根據需要進一步加入/使用輔助劑,例如:二甲亞砜以提高融合效率。

免疫細胞與骨髓瘤細胞的應用比例優選為例如免疫細胞為骨髓瘤細胞的1-10倍。作為用于上述細胞融合的培養基,可以使用RPMI?1640培養基、適宜骨髓瘤細胞系生長的MEM培養基,以及可用于該類型細胞培養物的其他標準培養基,而且可以進一步與血清補充物,例如:胎牛血清(FCS)組合。

為了細胞融合,可通過將上述免疫細胞與骨髓瘤細胞以給定量在上述培養基中徹底混合,加入PEG溶液,例如:加入在37℃預熱的標準濃度30-60%(w/v)的平均分子量約1000-6000的PEG溶液,并混合,以形成目的融合細胞(雜交細胞瘤)。隨后,可以通過重復相繼地添加適宜培養基和離心除上清的操作而去除對雜交瘤生長不利的細胞融合劑等。

雜交瘤可以通過在標準篩選培養基中,例如在HAT培養基(含次黃嘌呤,氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的培養基)中培養而篩選。典型地,在HAT培養基中的培養持續幾天至幾周,足夠的時間期限直至除了目的雜交瘤以外的其他細胞(非融合細胞)滅絕。然后采用標準極限稀釋方法篩選和克隆生產目的抗體的雜交瘤。

此外,除了通過用抗原免疫除人類以外的其它動物獲得上述雜交瘤以外,也可以通過在體外用抗原蛋白或表達抗原的細胞致敏人淋巴細胞,然后將致敏B淋巴細胞與人骨髓瘤細胞,例如U266細胞(參見JP-B-1-59878)融合而獲得具有對期望抗原或表達該抗原的細胞的結合活性的所需人抗體。而且,也可以將抗原或抗原表達細胞給予含有人抗體基因所有組成部分的轉基因動物,根據上?述方法來獲得所需人抗體(參見國際專利申請公開Nos.WO?93/12227,WO92/03918,WO?94/02602,WO?94/25585,WO?96/34096,WO?96/33735)。

以該方法制備的產生單克隆抗體的雜交瘤可以培養在標準培養基中,也可以長期貯存在液氮中。

為了從雜交瘤獲得單克隆抗體,可以使用以下方法:按標準方法培養雜交瘤,然后以培養上清液的形式獲得單克隆抗體;或者將雜交瘤施用予相容的哺乳動物以增殖,然后以腹水形式獲得單克隆抗體。前一方法適合獲得高純度抗體,后一方法適合大規模生產抗體。

例如,可以用JP-A-3-139293公開的方法制備產生抗IL-6受體抗體的雜交瘤。所以實施如下方法:將產生PM-1抗體的雜交瘤腹膜內注射到BALB/c小鼠以獲得腹水,然后從該腹水純化PM-1抗體,其中產生PM-1抗體的雜交瘤基于布達佩斯條約以保藏號FERM?BP-2998于1989年7月12日國際保藏在國際專利生物保藏單位(AIST?Tsukuba?Central?6,1-1,Higashil-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki?Pref.)。而且,可以實施如下方法:將此雜交瘤培養在合適的培養基中,例如:培養在RPMI?1640培養基、雜交瘤SFM培養基(GIBCO-BRL提供)、或者含有10%胎牛血清和5%BM-Condimed?H1(Boehringer?Mannheim提供)的PFHM-II培養基(GIBCO-BRL提供)中,然后從它的培養上清液純化PM-1抗體。

在本發明中,就單克隆抗體來說,可以用按如下方式制備的重組型抗體:從雜交瘤中克隆抗體基因,將該基因插入合適的載體,將其導入至宿主細胞以及采用基因工程技術(參見,例如,Borrebaeck,C.A.K.和Larrick,J.M.,Therapeutic?Monoclonal?Antibodies,Macmillan出版社在英國出版,1990)。

具體地,可以從產生目的抗體的細胞,例如雜交瘤分離編碼抗體可變區(V)的mRNA。為了分離mRNA,可通過本領域已知的方法,例如胍超離心法(Chirgwin,J.M..et?al.,Biochemistry,18:5294-5299,1979)、AGPC法(Chomczynski,P.et?al.,Anal.Biochem.,162:156-159,1987)制備總RNA,然后使用?mRNA純化試劑盒(Pharmacia提供)制備mRNA。同樣,mRNA也可以通過QuickPrepmRNA純化試劑盒(Pharmacia提供)直接制備。

可以從獲得的mRNA用逆轉錄酶合成抗體V區的cDNA。也可以使用AMV逆轉錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒等合成cDNA。同樣,5′-Ampli?FINDER?RACE試劑盒(Clontech提供)和使用PCR的5′-RACE法(Frohman,M.A.et?al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8998-9002,1988;Belyavsky?A.et?al.,Nucleic?Acids?Res.,17:2919-2932,1989)也可以用于合成和擴增cDNA。從所獲的PCR產物純化目的DNA片段,然后連接至載體DNA。接著,將這種方法制備的重組載體導入至大腸桿菌,篩選菌落以制備所需重組載體。可以用本領域已知的方法,例如脫氧法證實目的DNA的堿基序列。

如果獲得了編碼目的抗體V區的DNA,那么可以將該DNA與編碼所需抗體的恒定區(C區)的DNA連接,然后將其摻入表達載體中。或者,也可以將編碼抗體V區的DNA摻入含有抗體C區的表達載體中。

為了制備用于本發明的抗體,可以將抗體基因摻入表達載體以便在表達調控區,例如在下文中描述的增強子和啟動子的調節下表達。接著,將該表達載體轉化至宿主細胞以表達抗體。

在本發明中,可以用人工修飾的基因重組抗體,例如:嵌合抗體、人源化抗體和人抗體以降低對人的同種異體抗原性。這些修飾抗體可以用已知方法制備。

嵌合抗體可以通過待導入宿主進行生產的將上述獲得的編碼抗體V區的DNA與編碼人抗體C區的DNA連接,然后摻入表達載體中而獲得(參見歐洲專利申請公開No.EP?125023,國際專利申請公開No.WO92/19759)。利用這些已知方法,可以獲得用在本發明中的嵌合抗體。

例如,含有編碼PM-1嵌合抗體L鏈和H鏈V區的DNA的質粒分別命名為Escherichia?coli?DH5?pPM-k3和Escherichia?coli?DH5pPM-h1,同時,含有這些質粒的大腸桿菌已基于布達佩斯條約于1991?年2月12日分別以NCIMB?40366、NCIMB?40362國際保藏在國立工業和海洋微生物保藏有限公司(23?St.Machar?Drive,Aberdeen?AB21RY,蘇格蘭,英國)。

人源化抗體也稱重構的人抗體,它是非人哺乳動物例如小鼠的抗體的互補決定區(CDR)植入人抗體互補決定區的抗體,其常規基因重組方法也是已知的(參見歐洲專利申請公開NO.EP?125023,國際專利申請公開No.WO92/19759)。

具體地,由在末端具有重疊部分的幾個寡核苷酸通過PCR合成設計用于將小鼠抗體CDR與人類抗體構架區(FR)連接的DNA序列。所獲DNA與編碼人抗體C區的DNA連接,然后摻入表達載體,將該載體導入宿主細胞以產生人源化抗體(參見歐洲專利申請公開EP?239400,國際專利申請公開WO?92/19759)。

就經由CDR連接的人抗體FR來說,選擇使互補決定區形成良好抗原結合位點的FR。抗體可變區的構架區氨基酸,如果需要,可以進行替代,以使重構的人抗體的互補決定區形成正確的抗原結合位點(Sato,K.et?al.,Cancer?Res.,53:851-856,1993)。

人抗體C區可以用于嵌合抗體和人源化抗體。人抗體C區包括Cγ,例如,Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4都可以使用。可以修飾人抗體C區來提高抗體穩定性或其產量。

嵌合抗體由源自非人哺乳動物的抗體的可變區和源自人抗體的C區構成。人源化抗體由源自非人哺乳動物抗體的互補決定區和源自人抗體的構架區和C區構成。因此這些抗體降低了在人體內的抗原性,從而可被用作本發明的抗體。

用于本發明的人源化抗體的優選具體實例包括人源化PM-1抗體(參見國際專利申請公開No.WO?92-19759)。

同樣,作為獲得人抗體的方法,除了上述方法以外,利用人抗體文庫通過淘選獲得人抗體的技術也是已知的。例如,人抗體的可變區可以通過噬菌體展示方法作為單鏈抗體(scFv)表達在噬菌體表面,然后篩選結合抗原的噬菌體。?分析篩選出的噬菌體的基因,可以確定編碼結合抗原的人抗體的可變區的DNA序列。如果闡明了結合抗原的scFv的DNA序列,那么可以通過合適表達載體操作該序列以獲得人抗體。這些方法已經是已知的且可以引用WO?92101047、WO92/20791、WO?93/06213、WO?93/11236、WO??93/19172、WO?95/01438和WO95/15388。

上述構建的抗體基因可以用本領域已知的方法表達和獲得。當使用哺乳動物細胞時,抗體基因可以由功能性地連接了常用啟動子、要表達的抗體基因以及3’下游poly?A信號的DNA來表達,也可以由含有它們的載體來表達。例如:啟動子/增強子可以包括人巨細胞病毒立即早期啟動子/增強子。

同樣,對于能夠用于本發明抗體的表達的其它啟動子/增強子,可以使用反轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)的病毒啟動子/增強子和源自哺乳動物細胞人延伸因子1α(HEF1α)的啟動子/增強子。

例如,可以根據Mulligan等的方法(Mulligan,R.C.et?al.,Nature,277:108-114,1979)在使用SV40啟動子/增強子的情況下進行表達,或可以根據Mizushima等的方法(Mizushima,S?and?Nagata,S.,Nucleic?Acids?Res.,18:5322,1990)在使用HEF1α啟動子/增強子的情況下進行表達。

對于大腸桿菌,可以通過功能性地連接常用啟動子、抗原分泌信號序列和要表達的抗體基因來表達抗體基因。例如,啟動子可以包括lacZ啟動子和araB啟動子。在使用lacZ啟動子和araB啟動子的情況下,可以分別采用Ward等的方法(Ward,E.S.et?al.,Nature,341:544-546,1989;Ward,E.S.et?al.,FASEB?J.,6:2422-2427,1992)和Better等的方法(Better,M.et?al.,Science,240:1041-1043,1988)。

作為抗體分泌信號序列,當在大腸桿菌周質中生產的情況下,可以使用pelB信號序列(Lei,S.P.et?al.,Bacteriol.,169:4379-4383,1987)。分離生產于周質中的抗體,接著進行適當的抗體結構重折疊以便使用抗體(參見,?例如:WO?96/30394)。

可以用源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)的復制起點。另外,為了在宿主細胞系統中擴增基因拷貝數,表達載體可以包括氨基糖苷磷酸轉移酶(APH)基因,胸苷激酶(TK)基因,大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因以及二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為篩選標記。

為了生產用于本發明的抗體,可以使用任選的生產系統。有制備抗體的體外和體內生產系統。體外生產系統包括使用真核細胞的生產系統和使用原核細胞的生產系統。

在使用真核細胞的情況下,存在使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞的生產系統。作為動物細胞已知(1)哺乳動物細胞,例如:CHO、COS、骨髓瘤細胞、BHK(幼倉鼠腎細胞)、HeLa、Vero等,(2)兩棲動物細胞,例如:爪蟾卵母細胞,或者(3)昆蟲細胞,例如:sf9、sf21、Tn5等。作為植物細胞已知,源自煙草(Nicotiana?tabacum)的細胞,它可以作為愈傷組織培養。作為真菌細胞已知酵母,例如酵母屬(Saccharomyces),如釀酒酵母(Sacchromyces?cerevisiae),和絲狀真菌,例如曲霉屬(Aspergillus),如黑曲霉(Aspergillus?niger)。

當使用原核細胞時,存在使用細菌細胞的生產系統。作為細菌細胞,已知大腸桿菌(E.coli)和枯草桿菌(Bacillus?sabtilis)。

抗體可以通過將靶抗體基因經過轉化導入這些細胞,然后體外培養轉化的細胞而獲得。培養可以根據本領域已知的方法進行。例如,可以用DMEM、MEM、RPMI?1640以及IMDM作為培養基,而且也可以與血清補充物,例如:胎牛血清(FCS)組合使用。抗體可以通過將導入抗體基因的細胞轉移至動物腹膜腔內而體內生產。

另一方面,體內生產系統包括使用動物的生產系統和使用植物細胞的生產系統。當使用動物細胞的情況下,有使用哺乳動物和昆蟲的生產系統。

作為哺乳動物,可使用山羊,豬,綿羊,小鼠,牛及其它動物(Vicki?Glaser,Spectrum?Biotechnology?Applications,1993)。同樣,作為昆蟲,可以使用蠶。當使用植物的情況下,例如,可以使用煙草。

將抗體基因導入這些動物或植物,在動物或植物體內生產抗體,然后收集。例如,抗體基因可以通過插入編碼天然產生在奶中的蛋白,例如山羊β酪蛋白的基因的中游,以融合基因形式制備。將包含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段注射至山羊胚胎,然后轉移至雌性山羊。所需抗體可以從接受該胚胎的山羊生出的轉基因山羊或其子代山羊的羊奶中獲得。為了增加含所需抗體的奶的量,可以給轉基因山羊使用合適的激素(Ebert,K.M.et?al.,Bio/Technology,12:699-702,1994)。

當使用蠶的情況下,用插入了靶抗體基因的桿狀病毒感染蠶,然后從蠶體液獲得所需抗體(Maeda,S.et?al.,Nature,315:592-594,1985)。進一步,當使用煙草的情況下,將靶抗體基因插入植物表達載體,例如:pMON?530,然后將該載體導入細菌,例如:根癌土壤桿菌。用這些細菌感染煙草,例如Nicotiana?tabacum,從該煙草的葉子得到所需抗體(Jul?ian,K.C.,Ma,etal.,Eur.J.Immunol.,24:131-138,1994)。

在用如上所述體外或體內生產系統生產抗體時,編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA可以分開摻入表達載體,可將這些載體同時轉化宿主細胞,或者將編碼H鏈和L鏈的DNA摻入單個表達載體,可以用該載體轉化宿主(參見國際專利申請公開No.WO?94-11523)。

用在本發明中的抗體可以是抗體片段或其修飾物,只要抗體適合使用就可以。例如,抗體片段包括例如:Fab,F(ab′)2,Fv或者單鏈Fv(scFv),在ScFv中由合適接頭連接H鏈和L鏈的Fv。

具體地,可以用酶,例如:木瓜蛋白酶、胃蛋白酶處理抗體以產生抗體片段,或可以構建編碼抗體片段的基因,將該基因導入表達載體,然后在合適宿?主細胞中表達(參見,例如:Co,M.S.et?al.,J.Immunol.,152:2968-2976,1994;Better,M.&?Horwitz,A.E.,Methods?in?Enzymology,178:476-496,1989;Plueckthun,A.&?Skerra,A.,methods?in?Enzymology,178:476-496,1989;Lamoyi,E.,Methods?in?Enzymology,121:652-663,1989;Rousseaux,J.et?al.,Methods?in?Enzymology,121:663-66,1989;Bird,R.E.et?al.,TIBTECH,9:132-137,1991)。

通過連接H鏈V區與L鏈V區獲得scFv。在該scFv中,H鏈V區和L鏈V區優選通過接頭,特別是肽接頭連接(Huston,J.S.et?al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)。scFv中H鏈V區和L鏈V區可以來自如上所述的任何抗體。對于連接V區的肽接頭,可以使用例如由12-19個氨基酸殘基構成的給定單鏈肽。

以編碼上述抗體的H鏈或H鏈的V區以及L鏈或L鏈的V區的DNA為模板,使用定義編碼期望氨基酸序列的DNA部分的末端的引物,通過PCR方法擴增模板中編碼期望氨基酸序列的DNA部分;然后進一步組合定義待與H和L鏈連接的肽接頭部分兩端的引物,擴增編碼肽接頭部分及所述兩端的DNA,由此獲得編碼scFv的DNA。

此外,一旦獲得編碼scFv的DNA,可根據標準方法獲得含有它的表達載體以及用該表達載體轉化的宿主,然后可根據標準方法使用宿主獲得scFv。

對這些抗體片段來說,它們的基因可以如同以上一樣獲得,并通過宿主表達和生產。本發明所說的“抗體”包括這些抗體片段。

作為對抗體的修飾,也可以用與各種分子諸如聚乙二醇(PEG)結合的抗體。本發明所說的“抗體”包括這些抗體修飾物。要獲得這樣的抗體修飾物,可以通過對獲得的抗體進行化學修飾。這些方法在本領域中已經建立。

如上述生產和表達的抗體可以從細胞內和細胞外及宿主內和宿主外分離,并純化成均質的。可以用親和層析進行用于本發明的抗體的分離和純化。用于?親和層析的柱子包括,例如:蛋白A柱和蛋白G柱。用于蛋白A柱的載體包括Hyper?D、POROS、Sepharose?F.F.等。用于常規蛋白的其它分離/純化方法都可以使用,對所用方法沒有限制。

例如,可以適當選擇和組合上述親和層析以外的層析、過濾、超濾、鹽析以及透析等,以分離和純化用于本發明的抗體。層析的例子包括:離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾等。這樣的層析可以應用于HPLC(高效液相層析)。另外,也可以使用反相HPLC。

可以通過測吸光度或通過ELISA測量上述所獲的抗體濃度。即,當測吸光度時,用PBS(-)適當稀釋抗體,接著測在280nm的吸光度,以1.35OD=1mg/ml計算濃度。當使用ELISA時,可如下進行測量。即,用0.1M碳酸氫鹽緩沖液(pH?9.6)將山羊抗人IgG(TAG公司提供)稀釋至1μg/ml,加入100ml此IgG至96孔板中(Nunc公司提供),然后4℃過夜溫育使抗體固定。封閉之后,加入100μl適當稀釋的本發明抗體或含抗體的樣本,或者作為標準的人IgG(Cappel公司提供),然后室溫溫育1小時。

洗滌之后,再加入100μl稀釋5000倍的堿性磷酸酶標記的抗人IgG(Bio?Source公司提供),然后室溫溫育1小時。洗滌后,加入底物溶液,溫育,接著用Microplate?Reader?Model?3550儀(Bio-Rad提供)測量405nm的吸光度以計算靶抗體濃度。

用于本發明中的經修飾的IL-6是具有IL-6受體結合話性但是不能傳遞IL-6生物活性的物質。即,雖然經修飾的IL-6可與IL-6競爭性地結合IL-6受體,但是由于它不能傳遞IL-6的生物學活性,所以它可以阻斷IL-6的信號轉導。

可以通過替代IL-6氨基酸序列中的氨基酸殘基引入變異來獲得經修飾的IL-6。作為經修飾的IL-6的來源的IL-6可以獲自任何來源,但考慮到抗原性優選人IL-6。

具體地,IL-6的修飾可以用本領域已知的分子建模程序,例如WHATIF?(Vriend?et?al.,Mol.Graphics,8:52-56,1990)預測IL-6氨基酸序列二級結構,進一步評價要替代的氨基酸殘基對整個蛋白的影響而進行。在確定合適的將要替代的氨基酸殘基之后,用含有編碼人IL-6基因的堿基序列的載體作為模板,通過常規PCR法導入使氨基酸被替代的變異,而獲得經修飾的IL-6的編碼基因。通過將該編碼基因摻入合適的所需載體中,然后再進行上文中記載的重組抗體表達、生產和純化方法,可以獲得經修飾的IL-6。

修飾的IL-6的具體例子公開在Brakenhoff?et?al.,J.Biol.Chem.,269:86-93,1994和Savino?et?al.,EMBO?J.,13:1357-1367,1994,WO?96/18648和WO?96/17869。

用于本發明的IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽分別具有結合IL-6受體或IL-6的活性,并且是不傳遞IL-6的生物活性的物質。即,IL-6部分肽或IL-6受體部分肽分別通過結合和俘獲IL-6受體或IL-6而特異性地抑制IL-6與IL-6受體的結合。結果,由于它們不傳遞IL-6生物活性,所以它們可以阻斷由IL-6引起的信號傳導。

IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽是由IL-6或IL-6受體的氨基酸序列中參與IL-6與IL-6受體結合的部分或全部氨基酸序列組成的肽。這樣的肽通常由10-80個氨基酸殘基組成,優選20-50個,更優選20-40個。IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽可以通過確定IL-6或IL-6受體的氨基酸序列中參與和IL-6或IL-6受體結合的區域,然后用已知的常規方法,例如:基因工程技術或肽合成法合成其部分或全部氨基酸序列來制備。

為了通過基因工程技術獲得IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽,可以將編碼所需肽的DNA序列插入至表達載體,然后再進行上文中記載的重組抗體表達、生產和純化的方法即可。

為了通過肽合成法制備IL-6的部分肽或IL-6受體的部分肽,可以用肽合成的典型方法,例如:固相合成法或液相合成法。

具體地,可以根據Zoku?Iyakuhin,Kaihatu?Vol.14Peptide?Gosei,(Ed.,Yajima,H.,Hirokawa?Shoten,1991)記載的方法進行合成。對于固相合成方法來說,例如,可以使用如下方法:通過將對應于將要合成的肽的C末端的氨基酸結合至不溶于有機溶劑的支持物上,然后交替地重復從氨基酸C末端至N末端方向順序地縮合一個(氨基酸氨基酸中以合適的保護基團保護了α-氨基基團及側鏈官能基團)的反應,以及消除樹脂上附著的氨基酸或肽的α-氨基基團的保護基團的反應,而使肽鏈延伸。固相合成法根據所用的保護基團的類型可粗略地分為Boc法和Fmoc法。

在靶肽以這種方法合成之后,再進行去保護反應和肽鏈從支持物上斷裂下來的反應。在肽鏈的斷裂反應中,典型地在Boc法和Fmoc法中茴香醚分別使用氟化氫或者三氟甲烷磺酸和TFA。在Boc法中,上述保護的肽-樹脂在茴香醚存在下用氟化氫處理,然后進行保護基團的去除和肽從支持物上的斷裂分離以回收肽。將肽冷凍干燥產生粗制肽。另一方面,在Fmoc法中,例如:在TFA中,以上述相同的操作方法進行去保護反應和肽鏈從支持物分離的斷裂反應。

將獲得的粗制肽用HPLC分離和純化。在最佳的條件下用典型用來純化蛋白的水-乙腈溶劑洗脫。收集并且冷凍干燥所獲層析圖中的對應于峰的級分。上述方法純化得到的肽級分可以通過質譜分子量分析、氨基酸構成分析或氨基酸序列分析進行鑒定。

IL-6和IL-6受體的部分肽的具體實例公開于JP-A-2-188600,7-324097和8-311098,以及美國專利5210075。

本發明的藥物組合物根據其給藥方式可以含有藥學上可接受的載體和添加劑。載體和添加劑的例子包括:水、藥學上可接受的有機溶劑、膠原蛋白,聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、精氨酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂糖、雙甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡?士林、石蠟、十八烷醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、作為藥物添加劑的可接受的表面活性劑等。根據劑型,所用添加劑可以從上文適當選擇或適當的組合選擇,但并不局限于此。

實施例

本發明在下文通過實施例和參考實施例具體描述,但本發明并不局限于此。

實施例1:

MRA是重組人源化的IgG1亞類抗人白介素-6受體的單克隆抗體,它可以抑制細胞因子白介素-6(IL-6)的功能。在日本和歐洲的早期研究中,MRA顯示了治療類風濕性關節炎的前景,而且它有很好的耐受性。

本實施例是確定MRA單獨給藥和與氨甲蝶呤組合給藥治療類風濕性關節炎時MRA的最佳劑量的I?I期大型試驗。在盡管已用氨甲蝶呤治療過規定的一段時期的活性類風濕性關節炎患者中,對MRA靜脈重復給藥(單獨治療和與氨甲蝶呤組合治療)的潛在功效進行了評估,并且將該功效與氨甲蝶呤單獨治療進行了比較。評估了MRA的有效性、安全性及耐受性。

方法:

研究對象:入選了基于美國風濕病學會(ACR)的1987疾病分類而診斷出的為期至少6個月的類風濕性關節炎患者。患者必須患有活動性疾病,并且他們對以至少12.5mg/周或10mg/周劑量(在非耐受性情況下)施用至少6個月的MTX無充足應答或有疾病的突發。

研究設計:通過中心隨機法進行雙盲、隨機、平行組研究

劑量和給藥方式:七組:0mg/kg(安慰劑)+MTX、2mg/kg?MRA+MTX、4mg/kgMRA+MTX、8mg/kg?MRA+MTX、2mg/kg?MRA+MTX安慰劑、4mg/kg?MRA+MTX安慰劑和8mg/kg?MRA+MTX安慰劑。MRA或安慰劑通過靜脈輸注以4周為間隔進行給藥。MTX或MTX安慰劑通過口服,每周1次,10-25mg/周給藥。

研究方法:將指定劑量通過靜脈輸注以4周為間隔共給藥4次,每隔2周?直到16周評估功效和安全性,并在第20周隨訪觀察。功效研究的第一終點(primary?endpoint)為在第16周(最后給藥之后4周)的ACR?20比率。第二終點(secondary?endpoint)包括在第16周(最后給藥之后4周)ACR?50和ACR?70的比率。

ACR改善標準:當在以下7項中,腫脹關節數和疼痛關節數改善20%或更多而且在剩余5項的3項中觀察到20%或更大的改善時,這種病例被確定為20%或更高的ACR改善標準。此外,50%和70%改善的病例是指上述20%改善的部分分別被改善了50%和70%的病例。

(1)腫脹關節數

(2)觸痛關節數

(3)患者對疼痛的評估

(4)患者對疾病活動的總體性評估

(5)醫師對疾病活動的總體性評估

(6)患者對生理功能的評估

(7)CRP或ESR

表1

???2mg/kg?MRA ??4mg/kg?MRA ??8mg/kg?MRA ??MTX ??ACR?20 ??30.8% ??61.1% ??62.7% ??40.8% ??ACR?50 ??5.8% ??27.8% ??41.2% ??28.6% ??ACR?70 ??1.9% ??5.6% ??15.7% ??16.3% ???2mg/kgMRA+MTX ??4mg/kg?MRA+MTX??8mg/kg?MRA+MTX???ACR?20 ??64.0% ??63.3% ??73.5% ???ACR?50 ??32.0% ??36.7% ??53.1% ???ACR?70 ??14.0% ??12.2% ??36.7% ?

與對照組相比,除了MRA單獨給藥的2mg/kg組以外,在所有組中都觀察到統計學顯著較高的ACR?20改善率。在MRA?8mg/kg+MTX組中,ACR50和70?改善率分別是53.1%和36.7%,統計學顯著高于對照組的改善率,對照組的改善率分別是28.6%和16.3%。在MRA單獨給藥組中,在ACR20改善率中觀察到統計學顯著性的劑量依賴性。此外,對ACR50和ACR70改善率而言,在MRA單獨給藥和與MTX組合給藥組中均觀察到統計學顯著的劑量依賴反應。

腫脹關節計數減少(表2)

平均腫脹關節計數在所有治療組中于基線都是相似的。

隨著所有七個治療組的藥物暴露持續時間的增加,平均腫脹關節計數從基線起累積減少。MRA?8mg/kg組的腫脹關節計數的平均減少量與MTX組的減少相比具有統計學顯著性(p=0.010)。在第16周,MRA?8mg/kg組與MTX組的平均差異(95%CI)是-2.31(-4.07,-0.55)。在MRA單獨治療組之間具有統計學顯著性的線性劑量關系(p<0.001)。MRA?8mg/kg+MTX組的腫脹關節計數的平均減少量與MTX組的減少相比,具有統計學顯著性(p<0.001)。MRA?8mg/kg+MTX組與MTX組的平均差異(95%CI)是-3.62(-5.39,-1.84)。在MRA組合治療組之間存在統計學顯著性的線性劑量關系(p=0.004)。

表2

在359名入選的患者中,安全評估組、完全分析組及PPS(每方案組,perprotocol?set)分別是359人、354人和307人。總共入選了359名患者,299個完成了研究,60個退出。在退出的患者中,33個因為不良反應,1個因為并發其它疾病,7個因為不良反應,7個因為使用了禁止伴隨使用的藥物,5個因為知情同意(informed?consent)的撤消,1個因為錯過了隨訪,22個因為缺乏效果(包括多種原因)。

在不能否認因果關系的嚴重不良反應中,報道有5例感染。即,報道在2mg/kg?MRA組中有1個患者患腳膿腫和骨髓炎,在8mg/kg?MRA+MTX組中有1個患者出現胸部感染和胸膜炎,以及有1個患者患敗血病,在8mg/kg?MRA+MTX組中有1個患者患敗血病,以及在8mg/kg?MRA+MTX組中有1個患者患關節感染。此外,還有5例作為不能否認因果關系的嚴重不良反應報道的過敏,即,報道在2mg/kg?MRA組中有4個患者過敏,在4mg/kg?MRA組中有1個患者過敏。所有這些過敏事件都發生在不與MTX組合的情況下第3次或第4次MRA給藥后。

就肝功實驗室數據值而言,雖然作為MRA用藥的結果,觀察到ALT和AST水平升高,但是這些升高與在其它類風濕性關節炎患者中觀察到的相當。在MRA組中觀察到了脂質(總膽固醇,HDL膽固醇和甘油三酯)相關實驗室數據的增加。不過,致動脈硬化指數(Atherogenic?Index)總體沒有變化。

在一些患者中發生了嗜中性粒細胞計數的輕微暫時減少。觀察到疾病活動參數,即CRP和ESR的減少以及血紅蛋白的升高以劑量依賴方式發生臨床顯著變化。

輸注反應

輸注反應定義為所研究的藥物施用24小時內發生的不良反應。每一治療組中出現輸注反應的患者的數量提示MRA的可能的反劑量反應(inverse?dose-response)。

抗-MRA抗體

檢測了抗-MRA抗體的產生。在8mg/kg治療組(單獨治療或與MTX組合治療)中沒有抗體產生。在2或4mg/kg治療組中,MTX組合治療組比MRA單獨治療組出現較少的抗體產生事件。

結果

在MRA單獨治療及MRA與氨甲蝶呤的組合治療中,均觀察到了明顯的劑量反應。在MRA單獨治療和MRA與氨甲蝶呤組合治療中均證實了MRA治療類風濕性關節炎患者的有效性。比外,也在MRA單獨治療和MRA與氨甲蝶呤組合治療中證實MRA的安全性。

參考實施例1.?可溶性人IL-6受體的制備

可溶性IL-6受體是使用按照Yamasaki等人的方法(Yamasaki,K.et?al.,Science,241:825-828,1988)獲得的含有編碼IL-6受體的cDNA的質粒pBSF2R.236通過PCR法制備的。將質粒pBSF2R.236用限制性酶Sph1消化獲得IL-6受體cDNA,然后將該cDNA插入mp18(Amersham提供)。使用設計用來在IL-6受體的cDNA中導入終止密碼子的合成寡聚引物通過體外突變系統(Amersham提供)以PCR法將變異導入IL-6受體cDNA。該操作在氨基酸345位置上導入終止密碼子以獲得編碼可溶性IL-6受體的cDNA。

將可溶性IL-6受體cDNA與質粒pSV(Pharmacia提供)連接,獲得質粒pSVL344以便在CHO細胞中表達該cDNA。將HindIII-SalI消化過的可溶性IL-6受體cDNA插入含有dhfr的cDNA的質粒pECEdhfr中以獲得CHO細胞表達質粒pECEdhfr344。

使用磷酸鈣沉淀法(Chen,C.et?al.,Mol.Cell?Biol.,7:2745-2751,1987),將10μg的pECEdhfr344質粒轉染到dhfr-CHO細胞系DXB-11(Urlaub,G.et?al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220,1980)中。將轉染的CHO細胞在含有1mM谷氨酰胺、10%透析的FCS、100U/ml青霉素?以及100μg/ml鏈霉素且不含核苷的αMEM選擇培養基中培養3周。

用極限稀釋法篩選選定的CHO細胞,得到CHO細胞的單克隆。將該CHO克隆用濃度20nM-200nM的氨甲蝶呤擴增,以獲得生產人可溶性IL-6受體的CHO細胞系5E27。將CHO細胞系5E27在含有5%FBS的Iscove氏改良Dulbecco培養基(IMDM,Gibco提供)中培養。收集培養上清液,用ELISA測量培養上清液中可溶性IL-6受體濃度。結果,證實培養上清液中存在可溶性IL-6受體。

參考實施例2.?抗人IL-6抗體的制備

用10μg重組IL-6(Hirano,T.et?al.,Immunol.Lett.,17:41,1988)及弗氏完全佐劑一起免疫BALB/c小鼠,每隔一周繼續免疫,直到血清中檢測到抗IL-6抗體。從局部淋巴結獲得免疫細胞,用聚乙二醇1500將該免疫細胞與骨髓瘤細胞系P3U1融合。用HAT培養基按照Oi等的方法(Selective?Methods?in?Cellular?Immunology,W.H.Freeman?and?Co.,San?Francisco,351,1980)篩選雜交瘤,建立產生抗人IL-6抗體的雜交瘤。

對產生抗人IL-6抗體的雜交瘤按如下方法進行IL-6結合分析。即,將柔韌的聚乙烯96孔微量板(Dynatech?Laboratories,Inc.,Alexandra,VA提供)用100μl山羊抗小鼠Ig(10μl/ml;Cooper?Biomedical?Inc.提供,Malvern,PA)在0.1M碳酸氫鹽-碳酸鹽緩沖液(pH?9.6)中在4℃包被過夜。接著,在室溫下用100μl含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS處理平板2小時。

用PBS洗滌該平板,接著將100μl雜交瘤培養上清液加入每孔,在4℃溫育過夜。洗滌平板,接著將125I標記的重組IL-6加入每孔至2000cpm/0.5ng/孔,然后再洗滌平板,隨后用γ計數器(Beckman?Gamma?9000,Beckman?Instruments,Fullerton,CA)測量每孔的放射性。結果,在IL-6結合分析中216個雜交瘤克隆中有32個是陽性。在這些克隆中,最后獲得穩定克隆MH166.BSF2。由該雜交瘤產生的抗IL-6抗體MH166是IgG1κ亞型。

接著,用IL-6依賴性的小鼠雜交瘤克隆MH60.BSF2針對雜交瘤生長檢測?MH166抗體的中和活性。將MH60.BSF2細胞以1×104/200μl/孔分配,加入含MH166抗體的樣品,接著培養48小時,再加入0.5μCi/孔3H胸苷(New?England?Nuclear,Boston,MA)。在另外再培養6小時之后,將細胞放置在玻璃濾紙上,用自動收集儀(Labo?Mash?Science?Co.,Tokyo,Japan)處理。兔抗IL-6抗體用作對照。

結果,MH166抗體以劑量依賴的方式抑制了由IL-6誘導的MH60.BSF2細胞對3H胸苷的吸收。這表明MH166抗體中和了IL-6的活性。

參考實施例3.?抗人IL-6受體抗體的制備

將按照Hirano等的方法(Hirano,Y.et?al.,J.Immunol.,143:2900-2906,1989)制備的抗IL-6受體抗體MT18與根據所附方案以CNBr激活的瓊脂糖4B(Pharmacia?Fine?Chemicals提供;Piscataway,NJ)結合,以此純化IL-6受體(Yamasaki,K.et?al.,Science,241:825-828,1988)。用1mM含1%毛地黃皂苷(Wako?Chemicals公司提供),10mM乙醇胺(pH?7.8)和1.5M?NaCl的1mm對氨基苯基甲磺酰氟鹽酸鹽(Wako?Chemicals公司提供)(毛地黃皂苷緩沖液)將人骨髓瘤細胞系U266溶解,與結合在瓊脂糖4B珠上的MT18抗體混合。接著,將小珠用毛地黃皂苷緩沖液洗滌6次,使之作為部分純化的IL-6受體用于免疫。

用從3×109個U266細胞獲得的上述部分純化的IL-6受體每10天4次對BALB/c小鼠進行免疫,接著用標準方法制備雜交瘤。用下列方法在來自生長陽性孔的雜交瘤上清液中進行IL-6受體結合活性檢查。5×107個U266細胞用35S-甲硫氨酸(2.5mCi)標記,用上述毛地黃皂苷緩沖液溶解。將體積0.04ml的結合在瓊脂糖4B珠上的MT18抗體與溶解的U266細胞混合,接著用毛地黃皂苷緩沖液洗滌6次,再用0.25ml毛地黃皂苷緩沖液(pH?3.4)洗脫35S-甲硫氨酸標記的IL-6受體,用0.025ml的1M?Tris(pH?7.4)中和。

將雜交瘤培養上清(0.05ml)與0.01ml蛋白G瓊脂糖(Pharmacia提供)?混合。洗滌之后,將瓊脂糖與0.005ml上述制備的35S-甲硫氨酸標記的IL-6受體溶液溫育。用SDS-PAGE分析免疫沉淀物,檢測與IL-6受體反應的雜交瘤培養上清。從而,建立了陽性反應雜交瘤克隆PM-1(FERM?BP-2998)。雜交瘤PM-1產生的抗體是IgGκ亞型。

用人骨髓瘤細胞系U266就雜交瘤PM-1產生的抗體對IL-6與人IL-6受體結合的抑制活性進行了檢測。從大腸桿菌制備人重組IL-6(Hirano,T.et?al.,Immunol.Lett.,17:41-45,1988),并用Bolton-Hunter試劑(New?England?Nuclear,Boston,MA)進行125I標記。

將U266細胞以4×105與70%(v/v)雜交瘤PM-1培養上清以及14000cpm的125I標記的IL-6一起培養。將樣品(70μl)鋪在400μl的微離心聚乙烯管中的300μl?FCS上,離心,測量細胞放射性。

結果,雜交瘤PM-1產生的抗體顯示可抑制IL-6與IL-6受體的結合。

參考實施例4.?抗小鼠IL-6受體抗體的制備

通過Saito,T.et?al.,J.Immunol.,147:168-173,1991記載的方法制備抗小鼠IL-6受體的單克隆抗體。

將可產生小鼠可溶性IL-6受體的CHO細胞在含有10%FCS的IMDM培養基中培養,用Affigel?10凝膠(Biorad提供)上固定了抗小鼠IL-6受體抗體RS12(參見上文Saito,T.et?al.)的親和柱,從培養上清純化小鼠可溶性IL-6受體。

將得到的小鼠可溶性IL-6受體(50μg)與弗氏完全佐劑混合,將其注射至Wistar大鼠腹腔。兩周后,用弗氏不完全佐劑開始再次免疫。在第45天,取大鼠脾細胞,用50%的PEG1500(Boehringer?Mannheim提供)按標準方法將2×108個細胞與1×107個小鼠骨髓瘤P3U1細胞融合,接著在HAT培養基中篩選雜交瘤。

將雜交瘤培養上清液加入至用兔抗大鼠IgG抗體(Cappel提供)包被的平?板中,然后與小鼠可溶性IL-6受體反應。接著,用兔抗小鼠IL-6受體抗體和堿性磷酸酶標記的綿羊抗兔IgG通過ELISA法篩選產生抗小鼠可溶性IL-6受體的抗體的雜交瘤。將確認產生該抗體的雜交瘤克隆亞克隆兩次,獲得雜交瘤單克隆。將該克隆命名為MR16-1。

通過使用MH60.BSF2細胞(Matsuda,T.et?al.,J.Immunol.,18:951-956,1988)對3H胸苷的吸收,檢測該雜交瘤產生的抗體對小鼠IL-6信號傳導的中和活性。將MH60.BSF2細胞在96孔平板中制備成1×104細胞/200μl/孔。在平板中加入10pg/ml的小鼠IL-6和12.3-1000ng/ml的MR16-1抗體或RS12抗體,接著在5%CO2,37℃下培養44小時,接著再加入1μCi/孔的3H胸苷。4小時后,測定3H胸苷的吸收。結果,MR16-1抗體抑制了MH60.BSF2細胞對3H胸苷的吸收。

因此,雜交瘤MR16-1(FERM?BP-5875)產生的抗體被證實可以抑制IL-6與IL-6受體的結合。

關于本文
本文標題:治療白介素6相關疾病的方法.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6765716.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大