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一種神經干細胞凍存液及其使用方法.pdf

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一種 神經 干細胞 凍存液 及其 使用方法
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摘要
申請專利號:

CN201810004241.1

申請日:

20180103

公開號:

CN107996559A

公開日:

20180508

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N1/02 主分類號: A01N1/02
申請人: 吉林省拓華生物科技有限公司
發明人: 畢薇薇,李超,姜麗君
地址: 136001 吉林省四平市鐵東區石嶺鎮塔子溝村
優先權: CN201810004241A
專利代理機構: 北京戈程知識產權代理有限公司 代理人: 程偉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201810004241.1

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種神經干細胞凍存液及其使用方法。該凍存液包含DMEM/F12基礎培養基、二甲基亞砜、血清、白蛋白、添加劑、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子。該凍存液不僅成本低,而且解決了神經干細胞凍存后復蘇活率低的問題,采用本發明公開的神經干細胞凍存液及凍存方法凍存細胞一年后,細胞活率依然高達95%以上,且不影響神經干細胞屬性及分化能力。

權利要求書

1.一種神經干細胞凍存液,其特征在于,所述神經干細胞凍存液包含細胞培養基、二甲基亞砜、血清、白蛋白、添加劑、表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子。2.根據權利要求1所述的神經干細胞凍存液,其特征在于,按體積百分比計,在神經干細胞凍存液中細胞培養基占50-60%,二甲基亞砜占10-20%,血清占10-20%,白蛋白的溶液占10-40%,添加劑占1-2%;表皮生長因子在神經干細胞凍存液中的濃度為20-30ng/ml,堿性成纖維細胞生長因子在神經干細胞凍存液中的濃度為20-30ng/ml。3.根據權利要求2所述的神經干細胞凍存液,其特征在于,按體積百分比計,在神經干細胞凍存液中白蛋白的溶液占10-20%。4.根據權利要求2所述的神經干細胞凍存液,其特征在于,按體積百分比計,在神經干細胞凍存液中細胞培養基占50%,二甲基亞砜占10%,血清占20%,白蛋白的溶液占18%,添加劑占2%;表皮生長因子在神經干細胞凍存液中的濃度為20ng/ml,堿性成纖維細胞生長因子在神經干細胞凍存液中的濃度為20ng/ml。5.根據權利要求2至4中任一項所述的神經干細胞凍存液,其中白蛋白的溶液中的蛋白質的質量體積百分比濃度為20%。6.根據權利要求1至4中任一項所述的神經干細胞凍存液,其中白蛋白為人血白蛋白,表皮生長因子為人表皮生長因子,堿性成纖維細胞生長因子為人堿性成纖維細胞生長因子。7.根據權利要求1至4中任一項所述的神經干細胞凍存液,其中所述血清為胎牛血清。8.根據權利要求1至4中任一項所述的神經干細胞凍存液,其中所述的細胞培養基為DMEM/F12基礎培養基。9.使用權利要求1至8中任一項所述的神經干細胞凍存液的方法,其包括:收集神經干細胞的神經球;木瓜蛋白酶消化神經干細胞,形成單細胞的神經干細胞懸液;過濾神經干細胞,計數,離心收集神經干細胞;按凍存神經干細胞所需的濃度1.5-2.5×10個細胞/ml凍存液,加入預冷的如權利要求1至8中任一項所述的神經干細胞凍存液;充分混勻后,轉移至凍存管,凍存。

說明書

技術領域

本發明屬于細胞技術領域,具體公開了一種神經干細胞凍存液及其使用方法。

背景技術

神經干細胞(Neural stem cell,NSC)作為干細胞的一種,近年來越來越多地受到神經科學領域的重視,實行細胞替代治療是新發展起來并具有廣闊應用前景的治療戰略。神經干細胞的發現及其體外培養的成功,使今后有效地治療中樞神經系統損傷和神經退行性疾病成為可能。

由中樞神經系統損傷如腦梗死、腦出血、腦外傷、脊髓外傷等和神經變性疾病如帕金森病、肌萎縮側索硬化癥等所致的功能性喪失,是目前臨床治療領域的難題。傳統的手術和藥物治療,只能夠終止或預防外傷所致的繼發損傷,但不能修復或補償已經損傷丟失的神經細胞。對于神經變性進展性疾病,藥物的療效不佳,且長期服用易引起其他不良反應。許多向發育中和成年中樞神經系統內植入含有神經干細胞的胚胎腦組織以治療帕金森氏病、腦外傷和垂體功能低下等的實驗,已證明能夠部分重建神經環路和功能。

目前神經干細胞的凍存只要有兩種形式:第一種為凍存神經球,以直徑80~100μm的神經干細胞球為標準進行凍存,凍存液為體積分數70%的DMEMF12、體積分數20%的血清、體積分數10%的DMSO組成。但是神經干細胞間的親密聯系和信號與直徑尺寸共同作用,影響著神經干細胞的凍存復蘇效果,且很難確定細胞數量,復蘇后活率僅能到達80%左右;第二種為凍存單個神經干細胞,凍存液為體積分數70%的DMEMF12、體積分數20%的血清、體積分數10%的DMSO組成。由于凍存液組成相對單一,缺少必要的維持因子等,復蘇后細胞活率也只能到達70%左右。

因此,尋找一種有效的保持高活性神經干細胞凍存液和操作方法是本領域技術人員亟待解決的技術問題。

發明人對人NSC成功地進行了凍存、復蘇及復蘇后再培養,為神經干細胞移植的擇期手術和建立“神經干細胞庫”提供了方法學基礎。還可避免由于神經干細胞傳代次數增加而導致的細胞退化、衰老、甚至突變的可能。

發明內容

本發明的目的是提供一種高活性神經干細胞凍存液及其使用方法,建立一種長期低溫保存神經干細胞的方法,以保持細胞的最大存活率,開展有效的干細胞移植及建立干細胞庫。

在一個方面,本發明提供了一種神經干細胞凍存液,其包含細胞培養基、二甲基亞砜、血清、白蛋白、添加劑、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子。

其中,二甲基亞砜(DMSO)的作用機制是在降溫過程中透過細胞膜進入細胞內,降低細胞內、外未結冰溶液中電解質濃度,從而保護細胞免受高濃度電解質損傷,避免細胞脫水褶皺;血清能夠提高細胞復蘇后的活率。在本發明的實施方案中,添加了人血白蛋白作為細胞凍存穩定劑使用,有利于調節細胞復蘇時調節滲透壓,具有保護細胞的作用,可進一步提高凍存細胞的存儲穩定性;在凍存液中添加添加劑、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子等神經干生長所必須的因子,可以維持凍存微環境,提供必要的營養物質。

在一個具體的實施方案中,按體積百分比計,在神經干細胞凍存液中細胞培養基占50-60%,二甲基亞砜占10-20%,血清占10-20%,白蛋白的溶液占10-40%,添加劑占1-2%;表皮生長因子在神經干細胞凍存液中的濃度為20-30ng/ml,堿性成纖維細胞生長因子在神經干細胞凍存液中的濃度為20-30ng/ml。

在一個具體的實施方案中,按體積百分比計,在神經干細胞凍存液中白蛋白的溶液占10-20%。

在一個更具體的實施方案中,按體積百分比計,在神經干細胞凍存液中細胞培養基占50%,DMSO占10%,血清占20%,白蛋白的溶液占18%,添加劑占2%;表皮生長因子在神經干細胞凍存液中的濃度為20ng/ml,堿性成纖維細胞生長因子在神經干細胞凍存液中的濃度為20ng/ml。

在一個具體的實施方案中,其中白蛋白的溶液中的蛋白質的質量體積百分比濃度為20%。

在一個具體的實施方案中,其中白蛋白為人血白蛋白,表皮生長因子為人表皮生長因子,堿性成纖維細胞生長因子為人堿性成纖維細胞生長因子。

在一個具體的實施方案中,其中所述血清為胎牛血清。

在一個具體的實施方案中,其中所述的細胞培養基為DMEM/F12基礎培養基。

在另一方面,本發明提供了使用如上所述的神經干細胞凍存液的方法,其包括:

收集神經干細胞的神經球;

木瓜蛋白酶消化神經干細胞,形成單細胞的神經干細胞懸液;

過濾神經干細胞,計數,離心收集神經干細胞;

按凍存神經干細胞所需的濃度1.5-2.5×107個細胞/ml凍存液,加入預冷的上述的神經干細胞凍存液;

充分混勻后,轉移至凍存管,凍存。

在具體的實施方案中,所述的神經干凍存液的使用方法是,低速離心收集神經球,細胞球大小約為200μm至400μm時進行凍存收集,去上清,保留細胞球沉淀;加入木瓜蛋白酶消化液,輕輕吹散神經干細胞沉淀,37℃水浴搖床孵育5分鐘;輕輕吹打神經干細胞懸液,顯微鏡鏡下觀察細胞球狀態,如未消化完全,繼續37℃水浴搖床孵育5分鐘;加入10ml DMEM/F12基礎培養基,輕輕吹打神經干細胞懸液至形成單細胞,BD 45μm濾膜過濾神經干細胞;計數,高速離心收集神經干細胞。按凍存細胞所需的濃度2×107個細胞/ml凍存液,定量加入預冷的神經干細胞凍存液,充分混勻后,將細胞懸液轉移至凍存管內,每管1ml,封口,粘貼標簽,凍存掃碼后,放入程序降溫盒內;分級冷凍細胞:4℃,20min;-20℃,30min;-80℃,過夜;次日轉入液氮內長期保存。

本發明提供的凍存方法在收集細胞時采用低速離心,收集細胞球,丟棄漂浮的單細胞或者死細胞;消化酶采用木瓜蛋白酶,此酶是一種含巰基肽鏈內切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性,有較廣泛的特異性,對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強的水解能力,但幾乎不能分解蛋白胨,能夠很好的保持細胞完整性。另外,消化后的單細胞中會存在一些死細胞團活細胞片,必須經濾膜過濾后才能計數、凍存,以保證凍存前的細胞活率。

本發明的主要優勢在于本發明提供的凍存液中添加人血白蛋白作為細胞凍存穩定劑使用,有利于調節細胞復蘇時調節滲透壓,保護細胞的作用,可進一步提高凍存細胞的存儲穩定性;另外,在凍存液中添加添加劑、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子等神經干生長所必須的因子,可以維持凍存微環境,提供必要的營養物質,可以保證神經干細胞復蘇后活力高達95%以上,大幅度提高復蘇后的擴增能力,更不會出現丟失分化潛能的現象。

附圖說明

圖1A至圖1C:測試例1中檢測神經干細胞的表型的實驗結果,流式細胞術檢測巢蛋白(Nestin)、SOX2、Pax6的表面標志的表達。

圖2:測試例3中神經干細胞的細胞周期中S期比例檢測的實驗結果。

具體實施方式

下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發明。本領域技術人員公知,在不背離本發明精神的情況下,可以對本發明做出許多修改,這樣的修改也落入本發明的范圍。如無特別說明,所使用的實驗材料均可從商業公司獲取。

以下實施例中所采用的實驗材料:

DMEM/F12基礎培養基:購自Gibco,貨號:11330-032;

二甲基亞砜(DMSO):購自:Sigma,貨號:D5879;

胎牛血清:購自:Hyclone,貨號:SH30070.03;

人血白蛋白:購自:廣東雙林生物制藥有限公司,批準文號:國藥準字S10970069,蛋白質的質量體積百分比濃度20%(每瓶含蛋白質10g,每瓶50ml);

添加劑:購自Gibco,貨號:17504-044;

人表皮生長因子(無動物成分):購自PeproTech,貨號:96-AF-100-15-500;

人堿性成纖維細胞生長因子(無動物成分):購自PeproTech,貨號:96-AF-100-18B-100。

各實施例選用的細胞及細胞來源:從腦組織中提取、誘導多能干細胞(IPSC)誘導得到神經干細胞,或市售的神經干細胞系。

實施例1:

在本實施例中的凍存液由DMEM/F12基礎培養基、二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清、人血白蛋白、添加劑、表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子混合配制,其中:DMEM/F12基礎培養基的添加量占凍存液的體積百分比為50%;DMSO的添加量占凍存液的體積百分比為10%;胎牛血清的添加量占凍存液的體積百分比為20%;人血白蛋白溶液的添加量占凍存液的體積百分比為18%;添加劑溶液的添加量占凍存液的體積百分比為2%;在凍存液中含有濃度為20ng/ml的表皮生長因子;在凍存液中含有濃度為20ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子(表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子的體積可忽略不計,或與DMEM/F12基礎培養基共同占凍存液的體積百分比的50%)。

細胞凍存:

1.從腦組織中分離單個神經干細胞,進行細胞培養;

2.培養至第五代細胞球時收集低速離心(400rpm/min,5min)收集神經球,加入木瓜蛋白酶(Solarbio,G8430)進行消化至單細胞;

3.45μm濾膜(購自BD)過濾神經干細胞;計數,高速離心(2500rpm/min,5min)收集神經干細胞;

4.按2×107個細胞/ml凍存液進行凍存,1ml/管;

5.標記名稱后,4℃,20min;-20℃,30min;-80℃,過夜;次日轉入液氮內長期保存;

6.凍存3個月、6個月、12個月后進行復蘇,計算細胞數量及活率。

細胞復蘇:

1.無菌工作臺內,15ml離心管內加入10ml DMEM/F12培養基;

2.從液氮中迅速取出預復蘇的神經干細胞,置于37℃水浴鍋內,不斷搖晃,讓細胞與管壁脫離時(約30秒),迅速取出;

3.打開凍存管,巴氏吸管吸取細胞懸液置DMEM/F12培養基中;

4.輕輕吹打細胞懸液,高速離心(2500rpm/min,5min)后,棄上清,DMEM/F12培養基重懸細胞,計算數量及活率。

實施例2:

在本實施例中的凍存液由DMEM/F12基礎培養基、DMSO、胎牛血清、人血白蛋白、添加劑、表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子混合配制,其中:DMEM/F12基礎培養基的添加量占凍存液的體積百分比為50%;DMSO的添加量占凍存液的體積百分比為10%;胎牛血清的添加量占凍存液的體積百分比為18%;人血白蛋白的添加量占凍存液的體積百分比為20%;添加劑的添加量占凍存液的體積百分比為2%;在凍存液中含有濃度為20ng/ml的表皮生長因子;在凍存液中含有濃度為20ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子。

選用的細胞與實施例1相同,細胞凍存、凍存時間及復蘇過程如實施例1所述。

實施例3:

在本實施例中的凍存液由DMEM/F12基礎培養基、DMSO、胎牛血清、人血白蛋白、添加劑、表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子混合配制,其中:DMEM/F12基礎培養基的添加量占凍存液的體積百分比為60%;DMSO的添加量占凍存液的體積百分比為10%;胎牛血清的添加量占凍存液的體積百分比為15%;人血白蛋白的添加量占凍存液的體積百分比為13%;添加劑的添加量占凍存液的體積百分比為2%;在凍存液中含有濃度為20ng/ml的表皮生長因子;在凍存液中含有濃度為20ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子。

選用的細胞與實施例1相同,細胞凍存、凍存時間及復蘇過程如實施例1所述。

實施例4:

在本實施例中的凍存液由DMEM/F12基礎培養基、DMSO、胎牛血清、人血白蛋白、添加劑、表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子混合配制,其中:DMEM/F12基礎培養基的添加量占凍存液的體積百分比為50%;DMSO的添加量占凍存液的體積百分比為10%;人血白蛋白的添加量占凍存液的體積百分比為38%;添加劑的添加量占凍存液的體積百分比為2%;在凍存液中含有濃度為20ng/ml的表皮生長因子;在凍存液中含有濃度為20ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子。

選用的細胞與實施例1相同,細胞凍存、凍存時間及復蘇過程如實施例1所述。

對比例:

采用常規細胞凍存液的配置方法,凍存液由DMEM/F12基礎培養基、DMSO、胎牛血清混合配制,其中:DMEM/F12基礎培養基的添加量占凍存液的體積百分比為60%;DMSO的添加量占凍存液的體積百分比為10%;胎牛血清的添加量占凍存液的體積百分比為30%。

選用的細胞與實施例1相同,細胞凍存、凍存時間及復蘇過程如實施例1所述。

測試例1:復蘇后細胞活率

活率檢測:采用臺盼藍染色法進行活率鑒定。

1.制備單細胞懸液,進行細胞稀釋(106/ml);

2.染色:細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以1:1均勻混合;

3.計數:三分鐘內用計數板計數活細胞數和死細胞數;

4.統計:細胞活率(%)=活細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100。

具體結果參見下表1:

表1:

測試例2:神經干細胞的表型鑒定

選取的實施例1中凍存12個月細胞,復蘇后一周流式細胞儀對神經干細胞的表型鑒定:神經球復蘇培養一周后,再次成球,酶消化成單細胞后進行神經干表型檢測。檢測指標:巢蛋白、Sox2、Pax6。

實驗過程:

1、收集細胞懸液,分裝5管(1×106/管);

2、3000rpm/min離心5min,后加入固定液A(FIX&PERM GAS-3)混勻,室溫放置30min;

4、3000rpm/min離心5min,去上清,后加入破膜劑B(FIX&PERMGAS-3)混勻,同時加入抗體1管為空白管,2管為巢蛋白(BD,561230)測試管,3管為Sox2(BD,562195)測試管,4管為Pax6對照管,5管為Pax6(BD,561664)測試管室溫避光放置30min;

5、第4管、第5管3000rpm/min離心5min,去上清,加入300μlPBS和二抗(Abcam,ab96895),室溫避光放置30min;

6、加入PBS清洗一次,3500rpm/min離心5min,去上清,加入300μl PBS混勻;

7、上機檢測,結果參見圖1A至圖1C。

結果顯示:復蘇后的細胞三種指標均高表達,表達率近乎100%,其中巢蛋白陽性細胞占98.4%、Sox2陽性細胞占97.1%、Pax6陽性細胞占99.2%。

可見,本發明提供的凍存液有益于神經干細胞的長期穩定保存。

測試例3:神經干細胞的細胞周期S期比例檢測

細胞周期(cell cycle)是指細胞從第一次分裂結束產生新細胞到第二次分裂結束所經歷的全過程,分為間期與分裂期兩個階段。其中S期是細胞周期的關鍵時刻,DNA經過復制而含量增加一倍,使體細胞成為4倍體,每條染色質絲都轉變為由著絲點相連接的兩條染色質絲。S期值越大,細胞分裂越活躍,增殖能力越強。選取的實例1中凍存12個月的細胞,復蘇后一周,采用流式細胞儀對神經干細胞的細胞周期S期比例檢測:

神經球復蘇培養一周后,再次成球,酶消化法成單細胞后,70%乙醇固定,4℃放置1小時,加入RNAaseA(beyotime,ST579),37℃孵育1小時降解RNA。加入PI標記DNA。流式細胞技術檢測細胞周期,參見圖2結果顯示G1比例為56.59%,S期比例為33.07%,G2比例為10.4%細胞分裂活躍,增殖能力強。此種凍存方法益于神經干細胞的復蘇后再培養,保持著原有增殖能力及活力。

以上示例性實施方式所呈現的描述僅用以說明本發明的技術方案,并不想要成為毫無遺漏的,也不想要把本發明限制為所描述的精確形式。顯然,本領域的普通技術人員根據上述教導作出很多改變和變化都是可能的。選擇示例性實施方式并進行描述是為了解釋本發明的特定原理及其實際應用,從而使得本領域的其它技術人員便于理解、實現并利用本發明的各種示例性實施方式及其各種選擇形式和修改形式。本發明的保護范圍意在由所附權利要求書及其等效形式所限定。

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